«Н.П.ИВАНОВ доктор ветеринарных наук, профессор, академик НАН РК К.А.ТУРГЕНБАЕВ доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. КОЖАЕВ кандидат ветеринарных наук ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ЖИВОТНЫХ Том 1 Общая эпизоотология Алматы, ...»

Чтобы предотвратить поглощение потока электронов воздухом, на период работы в электронном микроскопе создают вакуум порядка 10-4 – 10-5. Воздух из микроскопа откачивают вакуум насосом.

Препараты для просматривания в электронном микроскопе готовят на очень тонких коллоидных пленках (раствор коллодия в амилацетате).

Контрастность препарата повышают напылением чрезвычайно тонкого (7 ) слоя хрома, золота или палладия. Поэтому многие детали, незаметные без покрытия их металлом, становятся видимыми.

Люминесцентная микроскопия с применением флуоресцирующих (меченых) глобулинов. Этот метод основан на свойстве некоторых красителей люминесцировать в ультрафиолетовых лучах, а также на способности иммунных глобулинов, окрашенных определенными типами люминесцентных красителей, образовывать специфические комплексы с гомологическими антигенами. Таким образом, в отличие от микроскопии при помощи обычного светового и электронного микроскопов описываемый метод представляет собой строго специфическую иммунобиологическую реакцию; кроме того, этот метод дает возможность проводить морфологическое исследование.

Для люминесцентной микроскопии используют специальный микроскоп.

Принцип метода люминесцентной микроскопии заключается в том, что некоторые органические люминесцирующие красители (например, флуоресцеинизоцианат, флуоресцеинтиоизоцианат и др.) химически присоединяются к иммунным глобулинам, причем последние в результате этого не теряют своих иммуноспецифиче-ских свойств. Обработанные (конъюгированные) такими флуорохромами иммунные глобулины или иммунные сыворотки называют «мечеными». (В некоторых случаях можно «метить» цельную иммунную сыворотку, не прибегая к выделению из нее глобулинов).

Если такой меченый иммунный глобулин привести во взаимодействие с гомологичным ему антигеном, то антитело специфически прочно фиксируется антигеном. Эта прочность настолько велика, что преципитировавшееся антигеном антитело не элиминируется, если препарат промывают водой или изотоническим раствором хлористого натрия.

В том случае, если антиген не является гомологичным взятому флуоресцирующему (меченому) глобулину, комплекс антиген-антитело не образуется, и последующие промывки препарата легко удаляют с антигена гетерогенный для него иммунный флуоресцирующий глобулин.

Существует два способа подготовки исследуемых объектов для люминесцентной микроскопии: прямой и непрямой. Прямой метод в основном используют для обнаружения бактерийных антигенов (иногда вирусов).

Непрямой, или многоступенчатый, метод чаще применяют для микроскопии вируссодержащих материалов.

Сущность прямого метода заключается в том, что на предметное стекло с фиксированным на нем материалом, содержащим антиген, наносят небольшое количество (I - 2 капли) меченых глобулинов и выдерживают препарат во влажной камере в течение 15 - 30 минут с последующей промывкой его изотоническим.раствором хлористого натрия. Высушенный препарат просматривают под иммерсионной системой с нефлуоресцирующим иммерсионным маслом (обычное кедровое масло и его заменители обладают собственной флуоресценцией, что, естественно, исключает возможность получения дифференцированной картины.

Если антиген и глобулины гомологичны, то при микроскопии препарата будет отчетливо видно выраженное свечение (люминесценция) антигена, на котором преципитировались антитела. Если же антиген по отношению к глобулинам гетерогенен, свечения его под люминесцентным микроскопом не будет.

Прямым методом можно обнаруживать оспенный антиген в тканевых культурах, тельца включения при бешенстве и в некоторых других случаях.

Сущность непрямого метода заключается в том, что фиксированный мазок сначала обрабатывают гомологичной предполагаемому в мазке антигену иммунной (нефлуоресцирующей) сывороткой или глобулинами (первая ступень). Если в мазке есть гомологичный антисыворотке антиген, образуется комплекс антиген-антитело. Однако полученный комплекс невидим. Чтобы его обнаружить в люминесцентном микроскопе, препарат обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулинами (вторая ступень).

Антивидовые сыворотки или глобулины получают путем иммунизации кролика иммунной сывороткой или глобулинами того вида животного, к которому принадлежит донор-продуцент (его сыворотку использовали в первой ступени).

В результате антивидовая сыворотка фиксируется на комплексе антигенантитело первой ступени. Поскольку антивидовая сыворотка или глобулины флуорохромнрованы, образовавшийся комплекс антиген-антитело - антивидовая сыворотка легко обнаруживается при люминесцентной микроскопии.

Естественно, что если в первой ступени компоненты гетерогенны, комплекс антиген-антитело будет отсутствовать, во второй ступени при микроскопии не обнаружится свечения антигена.

В некоторых случаях непрямой метод используют в так называемом антикомплементарном варианте, представляющем собой по существу РСК на предметном стекле, в которой роль гемолитической системы играет меченая антикомплементарная сыворотка.

Препарат из исследуемого материала обрабатывают иммунными глобулинами (или сывороткой) и комплементом, В случае, если, как и в пробирочной РСК, антиген гомологичен иммунным глобулинам, образуется комплекс антиген-антитело, на который адсорбируется комплемент. Чтобы обнаружить этот комплекс, препарат обрабатывают флуоресцирующей антикомплементарной сывороткой, получаемой путем иммунизации кроликов нативной свежей сывороткой морской свинки. Антикомплементрная флуоресцирующая сыворотка придает всему комплексу способность светиться в ультрафиолетовых лучах, что и обнаруживают в люминесцентном микроскопе.

Непрямой метод более чувствителен по сравнению с прямым.

Вопросы для самопроверки:

1. Различия действия электронного и светового микроскопов.

2. Кратность увеличения в электронном микроскопе.

3. Сущность люминисцентной микроскопии.

4. Отличительные особенности прямого и непрямого метода люминесцентной микроскопии.

17.5.3.3 МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ ЭЛЕМЕНТАРНЫХ ТЕЛЕЦ И

ТЕЛЕЦ-ВКЛЮЧЕНИЙ ПРИ ПОМОЩИ СВЕТОВОГО

МИКРОСКОПА

ознакомить слушателей с некоторыми методами микроскопиЦель занятия:

Для некоторых вирусов закономерным признаком является образование в клетках особых телец-включений. Внутриклеточные тельца включения обнаруживают при бешенстве, борнасской болезни лошадей н некоторых других вирусных заболеваниях. Специальные методы окраски препаратов позволяют видеть эти включения в обычном световом микроскопе. Поскольку все тельцавключения специфичны для определенных заболеваний, обнаружение их значительно облегчает и уточняет дифференциальный диагноз.

Наиболее часто микроскопические исследования для обнаружения телецвключений используют при диагностике бешенства.

Исходным патологическим материалом является ткань аммонова рога, полушарий мозга и продолговатого мозга, из которой готовят гистологические препараты и препараты-отпечатки.

Методы изготовления и окраски препаратов-отпечатков. Метод Муромцева. Кусочки аммонова рога растирают в фарфоровой ступке до получения гомогенной массы и пестиком этой же ступки делают 4 - 5 мазков на хорошо обезжиренных стеклах. Мазки не просушивают, а фиксируют в метиловом спирте или спирт-эфире в течение 2 часов. Затем мазок ополаскивают в дистиллированном воле и погружают в синьку Мансона (1:40) на 8 - 10 минут;

непромытый мазок выдерживают в 10%-ном растворе танина до тех пор, пока мазок не приобретет вместо сине-фиолетового цвета голубую окраску. После этого мазок промывают, высушивают между листами фильтровальной бумаги или на воздухе в вертикальном положении и выдерживают в течение нескольких секунд в этиловом спирте или в смеси его с ацетоном (1:1).

При микроскопическом исследовании тельца Негри обнаруживают как таких случаях протоплазма клеток имеет светлоголубой цвет, ядро клеток - синий, тельца Негри фиолетово-розовый. С тельцами Негри нельзя Окраска по Муромцеву требует большой пунктуальности сохранения всех режимов.

Метод окраски элементарных телец по Романовскому. Препаратыотпечатки высушивают на воздухе фиксируют 10 - 15 минут в метиловом спирте. Затем их погружают в раствор краски Романовского - Гимза (1 капля основного раствора краски на 1 см3 дистиллированной воды) на 48 часов. Тельца Пашена окрашиваются в красный цвет. Перед разведением краски определяют рН воды, так как воду используют только со строго нейтральной реакцией.

Метод окраски элементарных телец по Морозову. Для окраски применяют три реактива:

1) жидкость Руге (в 100 см3 дистиллированной воды растворяют 1 см3 ледяной уксусной кислоты и 2 см3 40%-ного формальдегида);

2) протрава (в 100 см3 дистиллированной воды растворяют 5 г танина и см3 жидкого фенола);

3) красящий раствор (в 100 см3 дистиллированной воды растворяют 5 г азотнокислого серебра и в этот раствор по каплям добавляют 25%-ный раствор аммиака. Появляющийся вначале бурый осадок самопроизвольно растворяется.

Аммиак прибавляют до опалесценции раствора).

При выпадении осадка в первом и во втором реактивах растворы следует профильтровать. Аммиачный раствор азотнокислого серебра хранят в темной склянке, герметически закупоренной стеклянной пробкой. Перед употреблением раствор серебра разводят дистиллированной водой 1:10. Все растворы хорошо сохраняются и могут быть заготовлены впрок.

При окраске поступают следующим образом. Мазок или отпечаток, просушенный на воздухе, погружают на 2 - 3 минуты в кюветку с дистиллированной водой, а затем на 1 минуту на него поливают раствор Руге.

Потом препарат промывают, наливают на 1 - 2 минуты протраву и подогревают (вместе с реактивом) до появления паров. На обработанный таким образом и тщательно промытый дистиллированной водой препарат наливают на 1 - минуты раствор серебра и слегка подогревают, пока препарат не примет темнокоричневую окраску.

После этого препарат основательно промывают и высушивают на воздухе.

При микроскопировании элементарные тельца лежат, на светло-коричневом фоне в виде темно-коричневых округлых зерен. Они могут быть расположены группами, поодиночке или в виде цепочек.

Для дифференциальной диагностики инфекционных болезней, выделение возбудителя, изучения его биологических свойств (патогенности, вирулентности, иммуногенности и др).

Для поддержания культуры возбудителя в живом состоянии путем пассажей и некоторых других исследований применяют биопробу – экспериментальное заражение животных.

Вопросы для самопроверки:

1. Метод изготовления препаратов для обнаружения телец-включений.

2. Методы окраски препаратов-отпечатков для обнаружения телецвключений.

17.5.3.4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ЗАРАЖЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ

ЖИВОТНЫХ (БИОПРОБА)

ознакомить слушателей с методами экспериментального Цель занятия:

заражения лабораторных животных для диагностики вирусных болезней и выделения патогенных вирусов.

В лабораторной практике довольно часто ставят биологическую пробу, т.

е. заражают исследуемым материалом лабораторных животных. К этому прибегают для установления или подтверждения диагноза; для выделения чистой культуры возбудителя болезни из исследуемого материала, когда он загрязнен посторонними микробами (мокрота, гной, загнивший трупный материал); для установления патогенности, вирулентности и антигенных свойств определенного штамма микробов.

В случае необходимости материал перед введением его животному обрабатывают: эмульгируют, растирают в ступке с физиологическим раствором поваренной соли или центрифугируют.

Лабораторными животными являются кролики, морские свинки, голуби, белые мыши и крысы. Собак, кошек, кур используют реже.

Для проведения опыта берут здоровых животных средней упитанности.

Морские свинки должны быть весом не менее 250 - 300 г, белые мыши - 15г.

Перед опытом животных взвешивают, у них измеряют температуру тела.

Термометрию затем в течение опыта проводят ежедневно. Нормальная температура тела у животных (в градусах) следующая:

Перед заражением животных метят - мышей и крыс анилиновыми красками, более крупным животным вставляют в ухо металлические бляшки с номерами.

При введении исследуемого материала животное фиксируют в особом станке или же, его держит помощник. Животное должно быть фиксировано совершенно неподвижно.

На месте инъекции выстригают или выбривают шерсть, кожу дезинфицируют спиртом, спирт-эфиром или 2%-ной карболовой кислотой, а затем; йодной настойкой.

Шприцы, иглы и другие инструменты стерилизуют кипячением до и после инъекции.

Наиболее удобными являются комбинированные шприцы Провац-Рекорд, которые благодаря бегунку позволяют точно дозировать материал. При инъекции в кровяное русло лучше пользоваться шприцем Люэра со стеклянным поршнем. В шприц осторожно набирают исследуемый материал, перевертывают шприц иглой вверх, надевают на конец иглы кусочек ваты, смоченный дезинфицирующим раствором и, надавливая на поршень, удаляют из шприца пузырьки воздуха.

Необходимо тщательно следить за тем, чтобы материал при всех проводимых манипуляциях не разбрызгивался. Материал, оставшийся после заражения животных, сжигают или автоклавируют.

Способы заражения животных. Подкожное заражение - применяется наиболее часто. У кроликов производится под кожу спины, у морских свинок под кожу живота, у крыс и мышей - у корня хвоста. Кожу захватывают в складку, вводят в нее примерно до половины иглу. Медленно инъецируют необходимую дозу материала, накладывают на иглу вату, смоченную дезинфицирующим раствором и быстро извлекают иглу. Мышей можно заражать исследуемым материалом при помощи пипетки с тонко оттянутым концом.

Внутрикожное заражение. Иглу вводят отверстием вверх в толщу кожи под очень острым углом к ее поверхности. Если игла введена правильно, то инъецируемая жидкость поднимает верхний эпителиальный слой и на месте инъекции образуется трудно рассасывающийся пузырек.

Накожное заражение. При этом способе материал втирают шпателем или стеклянной палочкой и выбритый и скарифицированный участок кожи.

Внутримышечное заражение. Кроликам и морским свинкам материал вводят в толщу мышц бедра (с внутренней стороны), птицам – в грудную мышцу.

Внутрибрюшинное заражение. Животное фиксирую головой вниз, так чтобы сместился кишечник. Инъекцию проводят короткой тупой иглой в нижней трети живота, сбоку от средней линии.

Заражение в кровяное русло у кроликов проводится в краевую ушную вену. Вену зажимают пальцами у корня уха, шерсть на месте инъекции выщипывают и кожу протирают спиртом или ксилолом (повторного воздействия ксилола нужно избегать, так как оно ведет к некрозу кожи). Под влиянием раздражения нервных окончаний вены быстро набухают и становятся хорошо видны. Тонкую иглу вводят по направлению тока крови и медленно инъецируют материал. Показателем того, что игла в вене, служит свободное движение шприца и отсутствие набухания кожи вокруг иглы.

Мышам и крысам вводят материал в хвостовую вену. Морских свинок заражают непосредственно в сердце. При этом иглу вкалывают в межреберный промежуток у левого края грудины, там, где особенно ясно прощупывается сердечный толчок. Когда в шприце покажется кровь, начинают медленно вводить материал.

Во избежании воздушной эмболии необходимо строго следить за тем, чтобы вместе с жидкостью в кровь не попали пузырьки воздуха.

Заражение через пищеварительный канал. Инфицированный материал смешивают с кормом и скармливают животному или вводят в желудок через специальный эластичный катетер.

Кроме описанных, существуют способы заражения в переднюю камеру глаза, под твердую оболочку мозга, внутриназально и др.

Зараженных животных сажают в клетки или стеклянные банки с этикеткой, на которой помечают дату заражения и номер экспертизы. Лучше зараженных животных содержать в отдельной сухой и теплой комнате, с температурой не ниже 12-15С. Животные должны получать полноценную пищу и достаточное количество воды. При наблюдении за животными отмечают все отклонения от нормы: отсутствие аппетита, вялость, понос и т.п.

При работе с животными необходимо все царапинки и другие ранения прижигать йодной настойкой. После работы руки надо мыть под сильной струей воды и дезинфицировать.

Вопросы для самопроверки:

1. Что предусматривают проведением биопробы.

2. Как готовят животных для постановки биопробы.

3. Способы заражения животных.

17.5.3.5 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРУПА

ЛАБОРАТОРНОГО ЖИВОТНОГО И ПАТОЛОГИЧЕСКОГО

МАТЕРИАЛА

ознакомить слушателей с микробиологическими исследоваЦель занятия:

ниями трупа лабораторного животного и патологического материала Животных погибших от экспериментальной инфекции, вскрывают и подвергают бактериологическому исследованию. Вскрытие нужно производить как можно скорее после смерти. До вскрытия труп хранят на холоду.

Вскрытие производят на особом столе. Труп животного кладут животом вверх на пробковую или деревянную покрытую оберточной бумагой доску, вытягивают конечности и прикрепляют их к доске металлическими шпильками или гвоздями. Шерсть на груди и животе обильно смачивают спиртом или раствором карболовой кислоты.

Вскрытие производят стерильными инструментами со строгим соблюдением правил асептики. Инструменты кипятят в 3%-ном растворе соды и после остывания погружают в станки со спиртом. Перед употреблением инструменты обжигают на пламени. Использованные инструменты должны лежать на той же доске, где приколот труп.

Начиная вскрытие острым стерильным скальпелем делают продольный разрез кожи по средней сагиттальной линии и отпрепаровывают кожу с обеих сторон. Затем протирают обнаженную поверхность смоченным в спирте тампоном и вскрывают грудную полость. Для этого делают надрез над мечевидным отростком, вставляют в него тупую брашну ножниц и, перерезав ребра, откидывают отрезанную часть кверху.

Осматривают грудную полость, отмечают видимые изменения. Если есть экссудат, насасывают его стерильной пипеткой и делают посев на питательные среды. Затем разрезают сердечную сумку, прижигают раскаленным шпателем поверхность правого желудочка или предсердия и через прижженное место вводят стерильную пастеровскую пипетку, предварительно обломив ее запаянный конец. Если пипетка попала в полость сердца, кровь сама поступит в неё. Кровь засевают на питательные среды, а из остатка делают мазки на предметных стеклах.

Затем вскрывают брюшную полость и после её осмотра производят посевы из селезенки и печени. Для этого прижигают поверхность органа раскаленным шпателем, делают небольшой надрез, вводят в него петлю, соскабливают ею немного ткани и засевают на агар и бульон. При подозрении на анаэробную инфекцию кусочки органов, отрезанные стерильными ножницами, слегка обжигают на пламени горелки и целиком вносят в МППБ. После посева из органов делают мазки. При этом кусочком органа проводят по предметному стеклу, слегка касаясь его, или делают ряд отпечатков.

Выделение культур вируса проводят путем заражения культурой ткани или эмбрионов.

Для вирусологического исследования патологический материал консервируют в стерильном 3-5-%-ном глицерине и сохраняют на холоду.

При вскрытии трупа необходимо предупредить всякую возможность заражения окружающей обстановки, работающих и присутствующих лиц. Следует также избегать загрязнения посевов из трупа посторонними микробами.

После вскрытия труп сжигают или автоклавируют. Доску протирают тампоном со спиртом и обжигают или погружают на сутки в дезинфицирующий раствор. Инструменты и гвозди стерилизуют кипячением.

Клетки, где содержались зараженные животные, тщательно чистят и дезинфицируют. Металлические клетки прожигают паяльной лампой, а затем обмывают. Деревянные клетки моют кипятком, а затем дезинфицируют и высушивают. Стеклянные банки заливают дезинфицирующим раствором. Навоз и остатки корма сжигают.

Патологический материал, присланный из хозяйств, исследуют по той же схем: из него делают мазки, высевы на искусственные питательные среды и производят заражение лабораторных животных. После окончания исследования материал сжигают.

При посылке материала в лабораторию необходимо соблюдать следующие правила:

1. Материал должен быть свежим.

2. Материал следует брать при условиях исключающих возможность заражения людей и животных и загрязнения окружающей обстановки.

3. Материал нужно упаковывать в непроницаемую тару. Если материал помещен в стеклянную посуду, то последняя должна быть упакована в деревянный ящик или корзину.

Вопросы для самопроверки:

1. Как готовят инструменты, предназначенные для вскрытия животных и как технически проводят вскрытие трупов?

2. Порядок вскрытия животных.

3. В чем консервируют патологический материал?

4. Что делают с трупом после его вскрытия и как обрабатывают инструменты и террариумы?

5. По какой схеме исследуют патологический материал, присланный из хозяйств?

6. Какие правила необходимо соблюдать при посылке материала 17.5.3.6 ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ ОДНОСЛОЙНОЙ КУЛЬТУРЫ ознакомить слушателей с некоторыми методами получения Цель занятия:

Культурой ткани называют кусочки ткани млекопитающих и возникающие из них участки клеточного роста, находящиеся в специальной питательной среде. В такой культуре могут содержаться клетки различного или однородного гистологического строения. Культурой клеток принято называть систему более или менее однородных клеток, полученных из ткани специальными методами.

Культуры тканей и клеток растут в специальных питательных средах в виде монослоя, прикрепленного к стеклу, или в суспензии. Если ткань вне организма осуществляет обмен веществ, но не размножается, её называют переживающей; ткань с активно размножающимися клетками называют культурой растущей ткани.

Чаще всего применяют культуры растущих однослойных тканей. Чтобы получить однослойную культуру ткани, кусочек исходного материала диспенгируют до отдельных клеток, которые затем суспендируют в специальной стандартной питательной среде. Для диспенгирования кусочка ткани используют фермент поджелудочной железы – трипсин (иногда панкреатин или другой протеолитический фермент) в небольших концентрациях в фосфатных буферных растворах. Если исходным материалом для культуры ткани была ткань животного или его эмбриона, то такую культуру называют первичной или первично– трипсинизированной.

Первичные культуры получают в основном трипсинизацией по методу Дюльбекко и Фогг (1954) в модификации Янгера. Разные ткани по-разному поддаются диспенгированию их ферментами. Лучше всего диспенгируются ткани эмбрионов. Для этой цели используют 7-11-дневный куриный эмбрион. На процесс трипсинизации большое влияние оказывает температура раствора трипсина (оптимальной является 32-35°С). Значительно медленнее этот процесс протекает при более низких температурах, однако трипсинизацию можно проводить при 4°С. Время обработки ткани трипсином зависит от многих причин: качества, концентрации и температуры трипсина, возраста и строения ткани и т.д.

Обработку ткани и посев клеток проводят в стерильной комнате или боксе, соблюдая при каждой манипуляции максимум осторожности (чтобы меньше травмировать клетки) и полную стерильность при каждой операции; ко всем растворам и питательным средам добавляют антибиотики (натриевую соль пенициллина или бензилпенициллин и хлоркальциевый комплекс стрептомицина по 100-200 ЕД на каждый миллилитр среды).

Подготовка куриного эмбриона. Куриные эмбрионы 7-11-дневной инкубации овоскопируют, на скорлупе простым карандашом отмечают воздушное пространство. Поверхность скорлупы протирают йодированным спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу над пугой, стерильным пинцетом разрывают скорлупную и хорионаллантоисную оболочки, извлекают эмбрион (и помещают его в стерильную чашку Петри. У эмбриона отрезают голову, конечности и отделяют внутренние органы. Оставшийся кожно-мышечный мешок промывают буферным раствором (Хэнкса или др.) и измельчают глазными ножницами или зажатыми в пинцет Пеана бритвенным лезвием на кусочки величиной 2-4 мм. Полученную массу помещают в колбу для трипсинизации, 2- раза промывают от слизи и кровяных элементов буферным раствором из пипетки или помешивают на магнитной мешалке по 2-3 минуты. Промывную жидкость отсасывают или осторожно сливают в специальную чашку.

Трипсинизация. К отмытым кусочкам эмбриона наливают 20-25 мл подогретого до 35°С 0,25%-ного раствора трипсина и выдерживают в нем кусочки при помешивании пипетированием или на мешалке 3-5 минут. Скорость вращения и величину магнитика регулируют заранее так, чтобы при вращении его не наступало вспенивания содержимого колбы.

Трипсин со взвешенным в нем клетками сливают через стерильную воронку с 1-2 слоями марли в колбу-приемник. Последний помещают в тающий лед для прекращения действия трипсина на отделившиеся клетки, а к кусочкам ткани в колбу для трипсинизации наливают несколько раз до полного истощения ткани, что определяют по белесоватому оттенку кусочков и по их разбуханию.

Отделение клеток от трипсина. Суспензия клеток в растворе трипсина, находящаяся в колбе-приемнике, представляет собою гомогенную, мутную, без крупных частиц, взвесь. Эту клеточную взвесь разливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют 7-10 минут при 800-100 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок встряхивают, а затем ресуспендируют в небольшом, лучше заведомо известном, количестве питательной среды, подогретой до 37°С. Клеточную взвесь из всех пробирок объединяют, пропуская её через 1-2 слоя стерильной марли. Из объединенной взвеси легкого, но тщательного пипетирования отбирают 1-2 мл для подсчета клеток.

Подсчет клеток проводят в счетной камере Горяева. Точный подсчет клеток необходим потому, что хороший монослой в культуре можно получить лишь при определенной оптимальной посевной дозе их. Посев малого количества клеток не дает сплошного роста в культуре, а посев чрезмерно большого количества их приводит к очень быстрому окислению среды и истощению её. Для клеток куриного эмбриона оптимальная посевная доза – 250-500 тысяч в 1 мл.

Посев клеток. Объединенную клеточную взвесь разводят той же питательной средой до нужного концентрации с учетом добавления 10%-ной стерильной сыворотки крупного рогатого скота. Разведенную клеточную суспензию, соблюдая стерильность, при постоянном перемешивании вносят в пробирки по 0,5-1, мл. В чашки Карреля, матрацы, плоские флаконы или в иную посуду с плоской поверхностью вносят столько клеточной взвеси, чтобы толщина слоя питательной среды над полезной поверхностью была 5-6 мм. Посуду с посеянной тканью закрывают плотно стерильными резиновыми пробками (для поддержания постоянства газовой среды) и помещают в термостат при температуре 37°С. Причем пробирки укладываю наклонно под углом в 5-6°С.

Рост клеток будет заметен уже через 12-14 часов после посева, но сплошной слой их, пригодный для работы с вирусом, образуется через 2-4 дня.

Вопросы для самопроверки:

1. Тканевые культуры.

2. Первичные культуры клеток.

3. Необходимость добавления антибиотиков к питательным средам и солевым растворам?

4. Трипсинизация ткани, сущность метода.

5. Отделение клеток от раствора трипсина.

17.5.3.7 ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СУБКУЛЬТУР.

ПЕРЕВИВАЕМЫЕ ТКАНИ. ЗАРАЖЕНИЕ ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР

ВИРУСОМ

ознакомить слушателей с методом получения тканевых субЦель занятия:

культур и культивирования перевиваемых клеток, а также с Если первичную ткань пересевают в свежую питательную среду (то есть производят пассаж) и в ней образуется рост культуры, то ее называют тканевой субкультурой. Практически субкультуры удается получить из любой первичной ткани, но количество пассажей ткань выдерживает не больше 4-5, редко до 20.

В результате подбора специальных питательных сред, режима пассажирования удается адаптировать отдельные ткани к определенной питательной среде и пассажировать их (перевивать) очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассажированию, называются перевиваемыми.

Перевиваемые клетки легче получить из злокачественных тканей (клетки Hela получены из карциномы шейки матки женщины, клетки НеР-2 – из карциномы гортани человека и др.), но в настоящее время широко культивируются перевиваемые клетки «нормальных» тканей (БЭП, СОЦ, ВКР и т.д.). Однако существует мнение, что перевиваемые ткани «нормального» происхождения вследствие приобретенной возможности к бесконечному размножению злокачественно перерождаются.

В вирусологической практике перевиваемые ткани имеют некоторые преимущества: они свободны от скрытых вирусов, тогда как первичные ткани могут быть носителями латентного вируса; обладают более широким спектром чувствительности к разным вирусам; кроме того, детально изучена их морфология и чувствительность к различным вирусам.

Но перевиваемые клетки имеют и ряд недостатков, которые ограничивают в известной степени их применение: они склонны к малигнизации, то есть к злокачественному перерождению независимо от их происхождения; необходимость постоянного поддержания их; у них появляется неспецифическая дегенерация, изменяется морфология клеток и снижается чувствительность к вирусам. В последние года в вирусологии, особенно в биопромышленности, применяют штаммы клеток с диплоидным набором хромосом, так называемые диплоидные клетки.

Такие штаммы клеток сохраняют хромосомный набор, типичный для исходных тканей. Диплоидные клетки обладают чувствительностью к вирусам, как и исходные клетки, свободны от латентных вирусов и не обладают канцерогенными свойствами. Недостаток диплоидных клеток – ограниченная возможность их пассажирования (редко более 50 пересевов).

Получение субкультур или перевивание клеток проводят следующим образом).

Снятие клеточного слоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путем (соскоб), или воздействием 0,02%-ного раствора версена (натриевая соль этилен-диамин-тетрауксусной кислоты или 0,25%-ного раствора трипсина.

Из сосудов с выросшим клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют в них подогретый до 37С раствор версена (в количестве, примерно вдвое меньшем, чем было среды) и выдерживают в термостате 20-30 минут (иногда больше); при этом сосуд несколько раз покачивают. Версен связывает двухвалентные катионы магния и кальция, в результате ткань разделяется на отдельные клетки и отслаивается от стекла.

Отделение клеток от диспенгируемого вещества. Взвесь клеток в диспенгирующем веществе (в версене) помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800-100 об/мин в течение 7-10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Затем берут 1-2 мл клеточной взвеси и подсчитывают клетки.

Посев клеток. После подсчета клеток в 1 мл исходную клеточную взвесь разводят питательной средой до нужной концентрации. При этом учитывают добавление к общему объему среды стерильной сыворотки крупного рогатого скота в количестве 10%. Подготовленную взвесь вносят при помешивании (на мешалке или пипетированием) в специально подготовленную для культивирования клеток посуду и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток в пробирке по 80-100 тыс. в 1 мл; в сосуды с плоской поверхностью (матрацы, флаконы) – 25тыс. на 1см2 полезной площади сосуда.

Засеянные клетки выращивают в термостате при температуре 37С в течение 3-4 суток. За это время обычно образуется монослой, пригодный для работы с вирусом.

Перевиваемые штаммы клеток обычно пересеваются через каждые 6- дней.

Заражение клеточных культур вирусом проводят в стерильном боксе. Перед заражением все клеточные культуры микроскопируют и отбирают пробирки или матрацы только с хорошим, типичным монослоем. Культуры с неполным монослоем, с признаками дегенерации клеток или с нетипичным клеточным и ростом бракуют.

В качестве вируссодержащего материала для заражения клеток используют фильтраты (прошедшие через бактерийный фильтр) или свежевзятый (в стерильных условиях) нативный материал с добавлением антибиотиков (о взятии, пересылке и подготовке патологического материала см. занятие 3). Заражать ткани можно пассажным вирусом на культуре ткани. В этом случае используют среду от культур с типичным для данного вируса цитопатогенным эффектом.

Методика заражения. Из отобранных культур отсасывают или сливают (не менее четырех) оставляют в качестве контроля; в них вносят по 0,1 мл свежей питательной среды без сыворотки. В другие 4-6 пробирок с клеточным монослоем вносят по 0,1 мл вируссодержащего материала. Все культуры в пробирках (контрольные и опытные) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37С 20-30 минут. Затем в них добавляют по 0,9 мл питательной среды без сыворотки, ставят в термостат и ежедневно наблюдают за ними, сравнивая под микроскопом опытные культуры клеток с контрольными.

Необходимо иметь ввиду, что при внесении вируса и при последующем его выращивании пробирки выдерживают в термостате под углом в 5-6 так, чтобы клеточный слой был покрыт питательной средой. Поэтому на пробирках принято делать продольные прямые линии цветным карандашом. Пробирки укладывают всегда линией вверх.

Учет результатов заражения. В контрольных культурах клеток обычно в течение недели морфологических изменений не отмечают. В опытных культурах под воздействием вируса видимые изменения в клетках могут наступить уже или через 10-12 часов, или через несколько дней (иногда через несколько недель), или заметной деструкции клеток не наступит. Все это зависит от восприимчивости ткани к данному вирусу, свойств и дозы вируса, условий культивирования и т.д. кроме того, следует учитывать также, что морфологически клетки могут изменяться под воздействием токсических веществ, содержащихся в исследуемом материале.

Чтобы убедиться в отсутствии действия вируса на клетки или подтвердить специфичность этого действия, а также убедиться в том, что наступившая дегенерация клеток не является результатом действия токсических веществ, из зараженных тканей отсасывают культуральную жидкость и заражают свежую культуру ткани, то есть проводят пассаж. Повторение морфологических изменений в пассажах указывает на наличие и размножение вируса. Если в первом посеве дегенерация клеток наступала, а в пассаже она отсутствует, то предполагают наличие в материале токсических веществ.

Отсутствие каких ибо видимых изменений в клетках, в первом заражении и в пассажах окончательно, не исключает наличия вируса в исследуемом материале, так как некоторые вирусы (вирус чумы свиней и др.) не способны вызывать деструкции клеток.

Порядок проведения занятий. Студенты просматривают под малым увеличением микроскопа в слегка затемненном поле культуры ткани, полученные на предыдущем занятии; микроскопическую картину зарисовывают. Совместно с преподавателем отбирают пробирки и матрацы с хорошим монослоем для получения субкультур и для заражения ткани вирусом.

Преподаватель демонстрирует метод перевивания ткани и заражения вирусом тканевой культуры.

Несколько студентов заражают культуру ткани вирусом болезни Ньюкасла (вакцинный штамм Н или В1).

Вопросы для самопроверки:

1. Субкультуры.

2. Перевиваемые ткани, их достоинства и недостатки.

3. Пассаж тканевых культур.

4. Патологический материал и его обработка для заражения культур ткани.

5. Дифференциация действия вирусов и токсических веществ на ткань.

17.5.3.8 ЦИТОПАТОГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ ознакомится с цитопатогенным действием вирусов и принЦель занятия:

ципами практического использования ЦПД, а также изучить технику постановки реакции гемадсорбции и реакции торможения гемадсорбции.

Механизм взаимодействия вируса с клеткой во многом еще не выяснен, но в нем отличают следующие фазы: адсорбция вируса на поверхности клетки, проникновение вируса и его нуклеиновой кислоты в клетку, синтез в клетке вирусных компонентов и нового поколения вирусов, выделение вируса из клетки.

В результате такого сложного взаимодействия в клетках могут наступать различные изменения вплоть до полного разрушения их.

Способность вируса вызывать определенные морфологические изменения клеточных элементов в культивируемых тканях принято называть цитопатогенным действием вируса (ЦПД).

Один и тот же вирус на разные клетки оказывает различное действие, в одних и тех же клетках разные вирусы вызывают различные морфологические изменения. Наступившие видимые морфологические изменения в клетке называют цитопатогенным эффектом (ЦПЭ). ЦПЭ наступает через определенный инкубационный период после заражения ткани. Характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на следующие группы (по О.Г. Анджапаридзе): 1) очаговое мелкозернистое перерождение; 2) мелкозернистое перерождение по всему монослою; 3) очаговое гроздевидное скопление округлившихся клеток; 4) равномерная зернистость клеток; 5) объединение клеток в гигантские многоядерные клетки – симпласты; 6) отсутствие какихлибо видимых морфологических изменений. Последнее проявление ЦПД, однако, не говорит о невосприимчивости данной ткани к вирусу, так как вирусная инфекция тканевых культур может быть латентной наоборот, как уже отмечалось, деструкция тканевой культуры может наступить не от вируса, а от токсических веществ, что легко установить отсутствием ЦПЭ в пассажах.

Оценку цитопатогенного действия проводят только в сравнении с контролем.

ЦПД вирусов используется при титровании вирусов и антител Установить вирусную природу деструктивных изменений в клетке можно при помощи реакции гемадсорбции. Сущность этой реакции заключается в том, что многие вирусы легко адсорбируются на отмытых эритроцитах кур, морских свинок и других животных, а клетки ткани, содержащие вирус, адсорбируют на себе эритроциты.

Этот феномен позволяет выявить наличие вируса даже в очень мало заметно дегенерированной ткани (иногда меньше 40% клеток), различить специфическую и неспецифическую дегенерацию, а так же установить титр вируса и антител.

Постановка реакции гемадсорбции. Из 2-4 пробирок с тканью, инфицированной вирусом, и такого же количества культур, не инфицированных вирусом, сливают питательную среду, а пробирки вносят по 0,1-0,2 мл 0,5%-ной взвеси в растворе Хэнкса предварительно отмытых куриных эритроцитов. Пробирки выдерживают 5-20 минут в наклонном положении при комнатной температуре, затем их слегка встряхивают или промывают осторожно раствором Хэнкса и просматривают под малым увеличением микроскопа. В контрольных пробирках, а также в пробирках с дегенерацией клеток невирусной природы возле клеток скоплений эритроцитов не отмечают, отдельные эритроциты в этих пробирках «плывут» в жидкости. В пробирках, содержащих вирус, отдельные клетки или их группы окружены скоплением эритроцитов. По количеству адсорбированных эритроцитов реакцию оценивают по четырехкрестовой системе.

Реакция гемадсорбции помогает выяснить вирусную причину морфологических изменений в клетках, а также установить наличие вируса в клетках еще до появления видимых цитопатогенных изменений в зараженных культурах.

Для диагностики применяют реакцию задержки гемадсорбции. В этой реакции в качестве контроля берут пробирки с положительной реакцией гемадсобции.

Постановка реакции задержки гемадсорбции (по В.Д. Соловьеву и Ю.Н.

Мастюковой) (1958). Зараженные культуры инкубируются в термостате в течение срока, необходимого для появления положительной гемадсобции. Из пробирок удаляют питательную среду, а культуру промывают раствором Хэнкса. Затем в часть пробирок добавляют по 0,2 мл неразведенной или разведенной 1:10 специфической сыворотки и по 0,8 мл раствора Хэнкса. В несколько других пробирок (контроль) вносят только по 1,0 мл раствора Хэнкса. После 15-30 минутного контакта при комнатной температуре во все пробирки вносят по 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов, оставляют их в наклонном положении еще на 15-20 минут и после легкого встряхивания учитывают результаты.

При положительной реакции гемадсорбции, то есть в случае специфичности взятой сыворотки и исследуемого вируса, в культурах, обработанных иммунной сывороткой, гемадсорбция отсутствует; в контрольных пробирках (без сыворотки) гемадсорбция ясно выражена.

При помощи реакции задержки гемадсорбции с заведомо известным вирусом можно обнаружить наличие специфических антител в испытуемой сыворотке.

Методы количественного изучения (титрование) вирусов и антител в культуре ткани. Для теоретических и практических целей необходимо точное количественное исследование степени вирулентности вируса, подбор точных доз вируса в опыт, определение количества антител в иммунной сыворотке, в сыворотке больного и выздоровевшего организма. В основе этих исследований лежит титрация вируса по ЦПД50 (то есть установление этого эффекта в 50% проверенных проб). Для титрования антител используют реакцию нейтрализации с учетом предела подавления антителами ЦПД специфического вируса. Основные методы титрования вирусов и антител следующие.

Титрование антител в культуре ткани по цитопатогенному действию. Для опыта отбирают хороший монослой клеток, чувствительных к данному вирусу.

Соединяют равные объемы последовательных разведений испытуемой сыворотки и постоянной дозы стандартного вируса и смесь выдерживают в пробирке 1- часа при комнатной температуре, затем каждую смесь вводят в пробирки с растущими клетками и добавляют питательную среду. Реакцию учитывают через 5дней; культуры просматривают под малым увеличением микроскопа. Титром сыворотки считают то наименьшее ее количество, которое предотвращает дегенерацию клеток (от ЦПД вируса) в половине инокулированных пробирок.

Титрование методом цветной реакции. Принцип реакции заключается в изменении цвета среды (индикатор фенолрот) в кислую среду (переход красного цвета в желтый) при сохранении жизненных функций посеянных клеток. Если под влиянием вируса наступит дегенерация и гибель клеток, цвет среды останется красным или оранжевым. В пробирки вносят испытуемую сыворотку (соответствующего разведения), постоянную дозу вируса и установленную клеточную суспензию; кроме того, в них добавляют одинаковые количества стерильного вазелинового масла. Пробирки помещают в термостат на 5-7 дней, после чего учитывают результат. В пробирках, где произошла нейтрализация вируса, цвет среды желтый (за счет окисления среды живыми клетками). В пробирках с малым количеством сыворотки нейтрализация вируса будет неполной или совсем не наступит, вирус окажет цитопатогенное действие на клетки и разрушит их, поэтому в этих пробирках цвет среды останется красным.

Титром сыворотки признается ее максимальное разведение, которое предотвращает подавление метаболической активности определенной дозы вируса (например, 100 ЦПД 50%).

Титрование методом бляшек по Дюльбекко. Принцип этого метода заключается в том, что при культивировании многих вирусов в многослойных культурах тканей (под агаровым покрытием, окрашенным нейтральоратом) в местах ЦПД вируса на общем красном фоне прижизненно окрашенных нейтральротом клеток образуются обесцвеченные участки (пятна, бляшки). Эти негативные пятна появляются обычно через 48 или более часов и представляют собой деструктивные клетки, разрушенные вирусом, не способные (в противоположность живым клеткам) окрашиваться нейтральротом. Автор метода утверждал (1952), что образование одной бляшки вызывается одной частицей вируса. Было введено понятие «одна бляшкообразующая доза», однако ее нельзя признать соответствующей одному корпускулу вируса. метод оказался вполне прогрессивным. Оказалось, что, помимо технических удобств и возможности количественного изучения вирусов, этот метод весьма удобен для получения изолированных колоний и чистых линий вируса; кроме того, он способствует углубленному изучению закономерностей реакции нейтрализации вируса антителами.

Вопросы для самопроверки:

1. Взаимодействие вируса с клеткой.

2. Изменения в клетке при действии на нее вируса.

3. Сущность и методика постановки реакции гемадсорбции.

4. Методы титрования вирусов и антител по цветному показателю и методу бляшек.

В РАЗВИВАЮЩЕМСЯ КУРИНОМ ЭМБРИОНЕ

ознакомить слушателей с методами заражения куриных эмЦель занятия:

Заражение развивающихся куриных эмбрионов используют в качестве биологической пробы для диагностики и в биологическое промышленности для изготовления вакцин. Куриные эмбрионы заражают также для получения антигенов, используемых в серологических реакциях.

Для заражения берут свежие оплодотворенные яйца, инкубированные при 38°С.

Все отобранные яйца (лучше с белой скорлупой) обязательно овоскопируют (просвечивают) в темной комнате. Это позволяет выявить неоплодотворенные яйца и отличить живые эмбрионы от мертвых. Неоплодотворенные яйца прозрачны. В оплодотворенных и инкубированных яйцах заметно движение эмбриона, а также хорошо видно наполнение кровеносных сосудов хорионаллантоисной оболочки.

При просвечивании отбирают яйца с живым эмбрионом, на скорлупе отмечают простым карандашом расположение головки эмбриона, участок в пространстве между кровеносными сосудами (место для заражения на хорионаллантоисную оболочку), а также обводят границу пуги (воздушной пространство со стороны тупого конца яйца). Приготовленные таким образом КЭ переносят в комнату для заражения.

Материал для заражения эмбрионов зависит от биологии вируса; для выделения вируса болезни Ньюкасла используют кровь, головной мозг и ткани других органов; для вируса орнитоза – печень, селезенку, почки, воздухоносные мешки; для вируса бешенства – суспензию из растертой мозговой ткани. Исследуемый материал растирают в фарфоровой ступке, суспендируют в мясопептонном бульоне (1:10) и освобождают от грубых частиц - фильтруют через 3-4 слоя стерильной марли.

Чтобы предотвратить попадание различных бактерий в вируссодержащий материал, к нему добавляют смесь растворов пенициллина и стрептомицина (100-200МЕ пенициллина и 100-150МЕ стрептомицина на 1 мл суспензии ткани).

Для заражения эмбрионов необходимы стерильные условия. Поэтому работу лучше проводить в боксе – специальной комнате с остекленнеными перегородками. Предварительно в боксе производят дезинфекцию – обильно распыляют внутри него специальным пульверизатором 5%-ный раствор карболовой кислоты, а затем включают стерилизующие бактерицидные лампы.

Методы заражения. Чаще всего вирусы культивируют в аллантоисной полости и на хорионаллантоисной оболочке.

Для заражения в аллантоисную полость используют эмбрионы 10-11дневной инкубации поверхность скорлупы со стороны пуги дезинфицируют тампоном, смоченным спиртом, смазывают настойкой йода, стерильным копьем (или иглой для взятия крови) прокалывают скорлупу и в полученное отверстие однограммовым стерильным шприцем через иглу вводят инфицированный материал в дозе 0,05-0,1 мл (рис.23, 24) затем пастеровской пипеткой отверстие заклеивают горячим (расплавленным) парафином или заклеивают кусочком пластыря. При заражении на хорионаллантоисную оболочку скорлупу дезинфицируют, как и в предыдущем методе, но только в двух местах (со стороны пуги и участок сбоку, отмеченный карандашом при просвечивании). Делают два прокола - в центре тупого конца яйца и сбоку. Через отверстие первого прокола резиновым баллончиком («грушкой») слегка отсасывают воздух, при этом хорионаллантоисная оболочка отходит от подскорлупной оболочки в месте второго бокового отверстия. Через это отверстие на оболочку наносят вируссодержащий материал (0,05-0,1 мл). оба отверстия заливают парафином или заклеивают пластырем.

Для специальных исследований применяют и другие методы заражения куриных эмбрионов - в желточный мешок, амниотическую полость в мозг эмбриона, в тело зародыша, в вену.

Зараженные эмбрионы инкубируют (в инкубаторах или термостатах) при температуре 36-37,5°С. Для поддержания определенной влажности в термостат помещают кюветку, дно которой покрывают гигроскопической ватой и заливают водой. Продолжительность развития вируса в эмбрионе у разных вирусов различна, зависит от активности самого вируса. Изменения в оболочках эмбрионов при поражении вирусом обычно уже заметны к 48-96-му часу, затем наступает гибель эмбриона. За зараженным эмбрионом ведут наблюдение: ежедневно ( или 2 раза в день) овоскопируют переворачивают каждый раз другой стороной.

Погибшие эмбрионы сразу же вскрывают (ввиду того, что к расписанию учебных занятий невозможно приурочить гибель эмбрионов, допускается их сохранение в холодном месте при температуре +4°С).

Погибшие эмбрионы вскрывают. Скорлупу обеззараживают (спиртом или настойкой йода) и срезают маленькими ножницами по границе воздушного мешка. Затем разрезают скорлупную и хорионаллантоисную оболочку и стерильной пастеровской пипеткой отсасывают в пробирку аллантоисную и амниотическую жидкость; содержимое выливают в чашку Петри.

Чаше всего поражается вирусом оболочка. Поражения, вызванные вирусом чумы птиц, вирусом болезни Ауески, отмечают на хорионаллантоисной оболочке. В результате культивирования вируса бешенства микроскопическим следованием обнаруживают в хорионаллантоисной оболочке, в мозговой ткани эмбриона тельца Негри; при культивировании вируса оспы тельца Пашена находят как в эмбриональной жидкости, так и на оболочке.

Порядок проведения занятия. Преподаватель демонстрирует методы заражения куриных эмбрионов. Студенты овоскопируют яйца, отмечают карандашом места проколов и проводят заражение одним из описанных выше методов.

Для заражения эмбрионов используют вакцинный штамм вируса псевдочумы птиц или вируса болезни Ауески. Яйца помещают в инкубатор или термостат. Наблюдение за эмбрионами ведет преподаватель ли лаборант кафедры. Погибшие эмбрионы сохраняют в холодильнике до следующего занятия.

Вопросы для самопроверки:

1. Отбор и подготовка эмбрионов для заражения.

2. Методы заражения эмбрионов.

3. Заражение эмбриона в аллантоисную полость.

4. Заражение эмбриона на хорионаллантоисную оболочку.

5. Культивирование вирусов на куриных эмбрионах.

6. Патологический материал, используемый для диагностики вирусных инфекций.

17.5.4. ПОЛИМЕРАЗНО-ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) Цельзанятия : Ознакомить слушателей с техникой постановки ПЦР В начале 1970-х годов Хьеллю Клеппе предположил, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. она была существенно улучшена. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Маллис работал в компании Цетус (en:Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании ХофманЛа Рош (en:Hoffmann-La Roche) за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taqполимераза была охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в 1980 году, в связи с чем компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г.

Внедрение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в клинической лабораторной диагностике в последнее десятилетие. Метод ПЦР поднимает диагностику на принципиально иной уровень - уровень определения ДНК или РНК, что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. С помощью ПЦР одна молекула ДНК может быть обнаружена в присутствие миллионов других молекул ДНК. Возможности ПЦР -анализа образно можно представить себе на примере поиска "иголки в стоге сена".

В настоящее время ПЦР представляет собой процесс, протекающий в одной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекулы ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть выявлены обычными методами детекции. Одним из ключевых компонентов реакции являются "праймеры"- синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 20-30 оснований, комплементарных "сайтам "(участкам) отжига (присоединения) на идентифицируемой матричной ДНК.

Принцип метода ПЦР.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является универсальным носителем генетической информации у всех существующих на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие микроорганизмы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соединенных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5’концу одной нити соответствует 3’-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов - гираз происходит расплетение спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (“+” или смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении - от 5’-конца к 3’-концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплиментарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - небольшого начального двух-цепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, называемого праймером, с комплиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-” или антисмысловой), только наращивание цепи происходит в обратном направлении. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная.

Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии:

1) расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация);

2) присоединение праймеров;

3) достраивание цепи дочерней нити.

В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме.

Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93-95°С происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу - присоединению или “отжигу” праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65°С. Далее смесь нагревают до 70-72 °С - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова.

Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера:

один для “+”-цепи, второй для “–”-цепи. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным звеном в создании диагностикума. Требуется подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене. При этом длина такого фрагмента должна составлять 15-30 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы, использующие информацию о нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов или генов человека. Получить подобную информацию можно из международных компьютерных банков данных (Gen bank, EMBL) через сеть Internet. Синтез праймера по заданной последовательности нуклеотидов не представляет технической сложности и осуществляется в автоматических синтезаторах.

Остальные компоненты ПЦР: дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ) в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм; магний, необходимый для работы taq-полимеразы (2-3 мМ); трис-HCl-буфер рН 6,8-7,8.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающие при различных температурных режимах.

1 этап: денатурация ДНК. Протекает при 93-950С в течение 30-40 сек.

2 этап: отжиг праймеров. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50С. Время отжига 20-60 сек.

3 этап: достраивание цепей ДНК. Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.

Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70-720С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК - ампликона. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2 n, где n - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Возможности ПЦР-реакции активно расширяются и уже разработаны методики, основанные на принципе молекулярной амплификации:

- ПЦР с геноспецифическими праймерами. В первом варианте ПЦР-анализ можно называть классическим, когда применяют два разных праймера, специфичных к известной нуклеотидной последовательности, для выявления гена, для увеличения количества исследуемого фрагмента, для последующего анализа.

- ПЦР с неспецифическими (произвольными) праймерами. Этот модифицированный метод ПЦР с использованием коротких фрагментов ДНК генетически неспецифичных исследуемой ДНК, называется RAPD-PCR (randomamplifiedpolimorphicDNA). Суть метода состоит в том, что в роли праймера используется произвольный олигонуклеотид, способный гибридизироваться с исследуемой ДНК и амплифицировать её. В настоящее время RAPDтехнология широко используется в изучении генома (конструирование генетических карт, анализ генетической структуры популяций, генотипирование, маркирование признаков).

- Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов.

Сочетание двух актуальных молекулярно-генетических методов исследований дало начало новому методу — полиморфизму длин амплифицированных фрагментов AFLP (amplified sequence polymorphism). Этот метод обладает важным преимуществом: для его использования не требуется знать ни первичной последовательности ДНК, ни нуклеотидной последовательности праймеров. Метод включает в себя: рестрикцию — на этом этапе геномная ДНК расщепляется ферментами рестрикции, включение олигонуклеотидного праймера с ДНКрестриктами. Образование ДНК-ДНК участка на концах рестриктных фрагментов является универсальной мишенью для амплификации, которая идёт по всем рестриктным фрагментам. Таким образом, варьируя нуклеотидной последовательностью праймеров и применяя различные рестриктазы, можно добиться амплификации лишь нескольких фрагментов, которые могу быть использованы как фингерпринт («отпечаток пальцев»).

Метод AFLP применяется для исследований полиморфизма ДНК, который может быть использован как при картировании генома, так и при получении геномного отпечатка конкретного индивидуума.

- ПЦР-ПДРФ. Актуальным методом изучения полиморфизма ДНК стал метод ПЦР-ПДРФ, который, в отличие от метода AFLPs, сначала амплифицирует исследуемую ДНК, а потом её подвергает действию различных рестриктаз. Данный метод широко применяется при геномной «дактилоскопии» организмов, при анализе точковых мутаций, приводящих к различным наследственным порокам, а также напрямую или косвенно связанных с хозяйственно-полезными признаками.

Метод ПЦР имеет ряд преимуществ:

1. Прямое определение наличия возбудителей инфекционных болезней.

Многие традиционные методы диагностики выявляют белковые маркёры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что даёт лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. ПЦР даёт выявление специфической ДНК и прямо указывает на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая чувствительность. ПЦР-методы дают возможность обнаруживать патогенные бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими и др.) их выявление невозможно.

Чувствительность амплифицированных тест-систем составляет около 10 клеток в пробе, достигая максимально возможных значений — 1 клетка в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микробиологических тестов колеблется в пределах до миллиона клеток.

3. Высокая специфичность. Абсолютная специфичность метода обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя, фрагмент ДНК.

4. Быстрота получения продукта. За счёт автоматизации процесс амплификации занимает всего 2-3 часа, а с учётом времени, затрачиваемого на обработку проб и регистрацию результатов, определение возбудителя обычно осуществляется в течение одного рабочего дня.

5. Работа с любым биологическим материалом. Метод ПЦР позволяет проводить определение возбудителя непосредственно в материале, полученном от больного животного (кровь, сыворотка, мазки, смывы, соскобы, слюна, мокрота, желудочный сок, биопсийный материал). Для определения не требуется культивирование возбудителя.

6. Возможность количественного учёта реакции. Метод позволяет осуществлять как качественное, так и количественное определение возбудителя. Изменение динамики числа копий возбудителя в пробе даёт возможность контролировать виремию или бактериемию в процессе лечения и однозначно решать вопрос об эффективности терапии.

7. Безопасность работы с исследуемым материалом, так как он может быть дезинфицирован химической и термической обработкой в момент его забора, что исключает инфицированность специалистов в процессе проведения ПЦР.

8. Одномоментность выявления различных возбудителей в одной пробе.

9. Простота исполнения за счёт полной автоматизации.

Разработка методик ПЦР и проведение испытания приборов и оборудования — это один из этапов большой работы по внедрению ПЦР-методов в практику диагностических лабораторий. В связи с возрастающим интересом к практической ПЦР-диагностике, внедрение методов ПЦР в систему государственной ветеринарной службы — дело сегодняшнего дня. Необходимо отметить, что перспективными направлениями ПЦР являются определение антибиотикорезистентности клинических штаммов возбудителей, возможность количественного учёта результатов для контроля динамики инфекционного процесса, правильного выбора тактики лечения и оценки эффективности применяемых лекарственных средств.

К настоящему времени ветеринарными специалистами уже разработаны тест-системы для диагностики методом ПЦР таких заболеваний как туберкулёз, сибирская язва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных; классическая чума свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней; сальмонеллез, стафилококкоз, микоплазмоз.

болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, инфекционный бронхит птиц, Ньюкаслская болезнь; чума мясоедных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят.

Однако, при всех указанных достоинствах, у метода ПЦР есть, к сожалению, и недостатки:

-Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма.

Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Обычно этот интервал составляет 4-8 недель.

-Возможность перекрестной реакции. Подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме данного и сходных микроорганизмов.

Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа.

-Изменчивость микроорганизмов. Хотя при конструировании тест-системы фрагмент генома, используемый для амплификации, выбирается из высоко консервативной области, изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким образом, становиться неуловимыми данной тест-системой.

Последние два пункта важны для разработчиков ПЦР-диагностикумов. В настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя), которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок.

Вопросы для самопроверки:

1. Сущность ПЦР 2. Компоненты для постановки ПЦР 3. Диагностическая ценность ПЦР и недостатки

18 МЕРОПРИЯТИЯ ПО ОТНОШЕНИЮ К МЕХАНИЗМУ

ПЕРЕДАЧИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНИ (ДЕЗИНФЕКЦИЯ,

ДЕЗИНСЕКЦИЯ, ДЕРАТИЗАЦИЯ)

ознакомить слушателей с мерами по ликвидации механизма Цель занятия:

Дезинфекция - это способ обеззараживания объектов внешней среды, направленный на уничтожение в них патогенных микроорганизмов. Воздействуя на возбудителей инфекционных болезней, дезинфекция ограничивает или полностью исключает из эпизоотического процесса его вторую биологическую движущую силу — механизм передачи возбудителя инфекции. Поэтому в комплексе противоэпизоотических мероприятий дезинфекция является обязательной мерой в профилактике, оздоровлении хозяйств и ликвидации любой инфекционной болезни.

Передача возбудителя от зараженного животного здоровому может осуществляться как инфицированными объектами неживой природы (факторы передачи), так и живыми посредниками — переносчиками (насекомые, клещи, мышевидные грызуны и др.).

Дезинфекция, дезинсекция, дератизация как меры, направленные против распространения заразных болезней, имеют исключительно важное значение в профилактике и ликвидации инфекционных болезней животных и человека. Поэтому их проводят не только в животноводческих хозяйствах, но и на предприятиях по убою животных и переработке сырья животного происхождения (мясокомбинаты, бойни, кожзаводы и т. д.), на транспорте и пр.

Уничтожая патогенные микроорганизмы во внешней среде, дезинфекция не устраняет источники и резервуар возбудителя, не повышает устойчивость восприимчивых животных. Поэтому дезинфекцию следует проводить не изолированно, а в общем комплексе мероприятий, предусматривающих воздействие на все звенья эпизоотической цепи. Только при соблюдении принципа комплексности дезинфекция как целенаправленная противоэпизоотическая мера может сыграть значительную роль в профилактике болезней и оздоровлении неблагополучных хозяйств.

Виды дезинфекции. С учетом эпизоотологического значения дезинфекция может быть профилактической (предупредительной) и вынужденной, которая, в свою очередь, делится на текущую и заключительную.

Профилактическую дезинфекцию проводят в благополучных хозяйствах с целью предупреждения инфекционных болезней. Такая дезинфекция снижает общую микробную обсемененность помещений и препятствует накоплению и распространению возбудителей инфекций в окружающей животных внешней среде, на предприятиях по переработке и хранению продуктов и сырья животного происхождения.

При проведении профилактической дезинфекции учитывают не только возможность заноса и накопления в хозяйстве возбудителей отдельных заразных болезней, но и опасность возникновения болезней, вызываемых ассоциациями бактерий и вирусов, а также убикваторными (вездесущие) микробами из группы условнопатогенных. Такие микроорганизмы обусловливают важную эпизоотологическую проблему в промышленном животноводстве — массовые смешанные алиментарные и респираторные инфекции с участием ассоциаций эшерихий, сальмонелл, пастерелл, вульгарного протея, микоплазм, синегнойной палочки и ряда вирусов.

В современном животноводстве в профилактической дезинфекции различают: предпусковую и технологическую — в процессе эксплуатации фермы.

Предпусковую дезинфекцию проводят после завершения строительства животноводческих объектов или их первой очереди, накануне ввода в помещения животных или завоза кормов. Дезинфицируют все здания и сооружения, обращая особое внимание на помещения для содержания животных, хранения кормов и кормоприготовления. Технологическая дезинфекция зависит от размера хозяйства и особенностей технологии производства животноводческой продукции.

Она может быть подразделена на профилактическую дезинфекцию мелких животноводческих ферм с экстенсивной системой животноводства и крупных специализированных хозяйств и комплексов, производящих животноводческую продукцию на промышленной основе. Технологические приемы дезинфекции в этих хозяйствах различные.

На мелких животноводческих фермах профилактическую дезинфекцию, как правило, проводят не реже двух раз в год: весной, после выгона скота на пастбище, и осенью, перед постановкой его на стойловое содержание; в откормочных хозяйствах — после каждого съема группы животных на убой; в родильных отделениях, свинарниках-маточниках, телятниках-профилакториях — не реже одного раза в месяц; стойла (станки) родильных отделений, клетки для телят дезинфицируют перед постановкой в них животных, а также после их освобождения. Профилактическую дезинфекцию также необходимо проводить после массовых противоэпизоотических мероприятий (туберкулинизация, взятие крови, вакцинация и др.) и в местах временного массового скопления животных и птицы (выставки, ярмарки, базары и т. п.). Ее проводят также не менее двух раз в год на предприятиях по заготовке, хранению и переработке животного сырья, перед началом и после окончания переработки животных на скотоубойных предприятиях, перед и после загрузки холодильников.

В крупных хозяйствах промышленного типа сроки и кратность проведения профилактической технологической дезинфекции отдельных объектов и секторов в процессе эксплуатации определяются циклограммой их использования.

Программирование и плановое выполнение санитарных работ по очистке, дезинфекции и дезинсекции в таких хозяйствах являются строго обязательными, так как от этого зависит успех самого производства. В комплексах по выращиванию и откорму молодняка крупного рогатого скота перед приемом телят каждую секцию механически очищают и дезинфицируют. После 115,-дневного пребывания (первый период) телят переводят в секции второго периода для откорма. В это время секции первого периода в течение двух суток оставляют свободными и до заполнения новым поголовьем их очищают и дезинфицируют. В секциях второго периода откорма дезинфекцию проводят через 277 дней, т. е. после отгрузки откормленных животных на мясокомбинат. Коридоры и галереи дезинфицируют ежедневно в конце смены, а пол промывают водой каждый раз после прогона партии животных. Помещения для поступающих телят дезинфицируют после каждого поступления животных из хозяйств-поставщиков.

Дезинфекцию помещений на комплексах по выращиванию телок и нетелей проводят по схеме, принятой,в комплексах по выращиванию и откорму молодняка крупного рогатого скота с учетом некоторых особенностей технологии выращивания племенных животных.

Технологическую дезинфекцию на молочных комплексах выполняют с учетом системы содержания коров, конструкции полов, кратности дойки, планирования растелов и других особенностей.

В секциях помещения для содержания дойных и сухостойных коров, кормовые проходы и боксы дезинфицируют через каждые 2 мес. В родильном отделении стойла дезинфицируют после освобождения и перед постановкой в них коров для отела; навозные решетки и проходы дезинфицируют ежедневно. Центральную галерею (проход), преддоильные и последоильные площадки очищают от навоза и моют ежедневно, а дезинфицируют через каждые две недели.

В свиноводческих комплексах с законченным циклом воспроизводства, выращивания и откорма свиней и работающих на завозном поголовье сроки и кратность дезинфекции отдельных объектов и секторов в процессе эксплуатации также определяются циклограммой их использования. В помещениях для содержания холостых и супоросных свиноматок ежедневно дезинфицируют отдельные группы станков по мере их освобождения и нового заполнения вновь поступивших технологических групп животных. В остальных производственных помещениях комплекса дезинфекцию проводят посекционно, соблюдая принцип «пусто-занято».

В крупных птицеводческих хозяйствах один раз в месяц устраивают санитарный день, в который проводят текущий санитарный ремонт, удаляют помет и остатки корма. Все объекты промывают горячим 1—2%-ным р-ром кальцинированной соды и дополнительно дезинфицируют по установленному графику с учетом технологии производства и комплектования хозяйства птицей.

В крупных овцеводческих хозяйствах ежегодно весной после перевода овец на летние пастбища проводят тщательную механическую очистку кошар и дезинфекцию, обязательно сочетающуюся с дезинсекцией.

Осенью, перед постановкой овец на стойловое содержание, кошары вновь дезинфицируют и дезинсицируют, что обеспечивает надежную гарантию полного освобождения помещений от патогенной микрофлоры и накожных паразитов — клещей и насекомых.

Вынужденную дезинфекцию проводят в хозяйствах при возникновении инфекционных болезней среди животных. Такая дезинфекция делится на текущую и заключительную.

Текущую дезинфекцию проводят систематически (в определенные для каждой болезни сроки) со времени появления в хозяйстве первого случая заболевания и всякий раз при обнаружении и выделении вновь заболевшего животного, а также при очередном обследовании неблагополучного скота в сроки, предусмотренные инструкциями по борьбе с заразными болезнями. Текущая дезинфекция направлена на своевременное уничтожение возбудителя конкретной болезни, выделяемого больными животными и микробоносителями в течение всего неблагополучия хозяйства. Ее проводят в помещениях с подозреваемыми в заражении животными, а также в изоляторах (ежедневно при утренней уборке) с животными, явно больными или подозрительными по заболеванию. При наличии больных животных дезинфицирующие средства, наносимые на поверхности стен, пола и инвентаря, не проникают в подполье, навозные каналы и другие труднодоступные пространства, и они остаются необеззараженными. С учетом всего этого в комплекс мер, направленных на полную ликвидацию эпизоотического очага, входит также и заключительная дезинфекция.

Заключительную дезинфекцию проводят перед снятием карантина (или ограничительных мероприятий) после оздоровления хозяйства. Эта заключительная оздоровительная мера направлена на полное уничтожение возбудителя во внешней среде эпизоотического очага. При заключительной дезинфекции обязательно обеззараживают все помещения и территорию вокруг, транспортные средства, инвентарь, одежду, навоз и т. д. Особое внимание уделяют дезинфекции пола и почвы под ним. Деревянный настил пола полностью снимают, непригодные доски сжигают, а остальные обильно 2—3 раза орошают дезраствором, высушивают на открытом воздухе, снова дезинфицируют, высушивают и обстругивают. Верхний слой почвы под полом на глубину пропитывания его мочой снимают и обеззараживают. Оставшийся грунт орошают 2 %-ным р-ром формальдегида (2 л/м2) и перекапывают на глубину 20—25 см, прикатывают и засыпают до первоначального уровня свежей землей и утрамбовывают. Таким же образом обеззараживают и глинобитные полы.

Объекты дезинфекции. Ими являются животноводческие помещения и территория вокруг ферм; предприятия по переработке и склады для хранения продуктов и сырья животного происхождения; оборудование и все предметы, с которыми соприкасались животные, навоз, жижа и прочие выделения животных;

используемые для перевозки животных или трупов транспортные средства; места временного скопления животных; животное сырье; спецодежда, инструменты, перевязочный материал и т. д.

Вопросы для самопроверки:

1. Понятие «дезинфекция»?

2. Виды дезинфекции?

18.1 МЕТОДЫ И СРЕДСТВА ДЕЗИНФЕКЦИИ

ознакомить слушателей с методами и средствами дезинфекЦель занятия:

Различие объектов, подлежащих дезинфекции, обусловливает необходимость применения разнообразных методов и средств, обеспечивающих их обеззараживание. Существуют 3 основных метода обеззараживания различных предметов: физический, химический и биологический. Каждый из них используют в практике либо как самостоятельный, либо в сочетании с другим.

Физический метод дезинфекции заключается в обезвреживании объектов внешней среды с помощью физических средств: механической очистки, лучистой энергии, высушивания, высокой температуры, токов высокой частоты и ультразвука.

Механическая очистка. В качестве механических приемов дезинфекции используются механическое удаление возбудителя инфекционной болезни с навозом, пылью, остатками корма, подстилкой и т. д., вентиляция и проветривание помещений, фильтрация воздуха и воды. Очистку объекта проводят или с помощью механических средств (лопаты, метлы, скребки и др.) — механическая очистка, или путем удаления загрязнений обмыванием или сильной струей воды — санитарная очистка. Механическую и санитарную очистку проводят до такого состояния, когда отчетливо видны структура и цвет материала обрабатываемой поверхности. Лучший способ санитарной очистки—это струя теплой (35—40 °С) воды (под давлением), в которой растворено 1 — 2% едкого натра, демпа или кальцинированной соды.

Мерами, способствующими снижению микробного загрязнения воздуха помещений, являются вентиляция и проветривание. Они особенно важны для предупреждения появления и распространения респираторных инфекций.

Довольно часто применяют фильтрацию при очистке питьевой воды и сточных вод, а иногда и воздуха от посторонних примесей и микроорганизмов.

К механическим приемам обеззараживания также относятся побелка, покраска, обстругивание, стирка и др. Поддержание порядка и содержание в чистоте помещений и территорий ферм, пастбищ и мест нахождения животных, регулярная очистка кожного покрова животных имеют большое профилактическое значение и способствуют получению качественных в санитарном отношении продуктов животного происхождения.

Лучистая энергия. Из естественных источников лучистой энергии наибольшее значение имеет солнце, а из искусственных — газосветовые ртутные лампы. Прямой солнечный свет, а частично и рассеянный, оказывают губительное действие на микробы. Особенно чувствительны к нему вегетативные формы возбудителей инфекционных болезней; споровые формы также погибают, но через сравнительно длительное время (например, сибирской язвы — через дней).

Для дезинфекции помещений обычно используют искусственные источники ультрафиолетового излучения с длиной волны 254— 257 нм, бактерицидные лампы типа БУВ-15, БУВ-30 (мощностью 15 и 30 Вт), БУВ-ЗО-П и БУВ-60-П (мощностью 30 и 60 Вт), а также облучатели типа Н-60 (настенный) и П-60 (потолочный). Циркуляцию воздуха во время горения ламп необходимо поддерживать в пределах замены 3 — 5 объемов его в помещении в течение часа.

Высушивание неблагоприятно влияет на жизнедеятельность микроорганизмов. В обезвоженной среде изменяется рН, и размножение микробов резко ослабевает. Вегетативные формы возбудителей погибают или претерпевают такие изменения, что становятся слабовирулентными или безвредными при попадании в организм животного. Высушивание применяют при обеззараживании кож, шерсти, заболоченных участков и т. п.

Действие высоких температур используется для обеззараживания кипячением, горячим паром, сухим жаром, обжиганием огнем. Высокая температура в виде сухого или влажного жара является сильным средством обеззараживания. Под действием сухого и влажного жара (70 °С) свертывается растворимый белок протоплазмы клетки, и микроб погибает. Сухой жар в практике обеззараживания не получил широкого распространения, так как требуется большая экспозиция (48 ч), что ведет к порче объектов (обугливанию). Он может быть использован для обеззараживания хлопчатобумажных тканей, войлока, лабораторной посуды, инструментов в сушильных шкафах. Влажный жар эффективен при утюжении, воздействии кипящей водой и водяным паром.

Утюжение — хорошее вспомогательное средство при дезинфекции, его применяют в тех случаях, когда для обработки нет специальных камер. С помощью утюжения обеззараживают белье, халаты, спецодежду, перевязочный материал.

Кипящая вода в зависимости от продолжительности действия вызывает гибель неспоровых и споровых микроорганизмов (свертывает протоплазму).

Большинство вегетативных форм бактерий и вирусы при кипячении гибнут за — 30 мин, а споровые формы —за 45 мин — 2ч. Благодаря простоте и дешевизне этот метод используется широко в различных условиях для обеззараживания инструментов, спецодежды, посуды. Кипятить можно в кастрюлях, чугунах, котлах или чанах-бучильниках, полностью погружая предметы в холодную воду, которую затем доводят до кипения. Начало кипения воды считается началом дезинфекции.

Водяной пар — одно из основных и надежных дезинфицирующих средств. Он более бактерициден, чем сухой пар; используется под давлением в автоклаве для стерилизации. При давлении 1,5 — 2 атм и температуре 115 — °С достигается полное уничтожение микробов, вирусов, грибов. Продолжительность обеззараживания зависит от вида возбудителя, инфицированного материала. Кроме автоклавов, используют обычные парообразователи кормоцехов и специальные паровые камеры (камера Крупина, подвижная паровая дезинфекционная камера).

Огонь как дезинфицирующее средство используют для сжигания зараженных микробами подстилки, навоза, остатков корма, трупов животных; дезинфицируют участки почвы, инвентарь, металлическую посуду, а также обеззараживают помещения для собак, птичники, клетки и т. п. Обжиганием можно обеззараживать лабораторное оборудование, столы для вскрытия, коновязи, телеги для перевозки трупов и т. п. Дерево обжигают до побурения. Для дезинфекции огнем чаще пользуются паяльной лампой. Она дает длинное (до 70 см) пламя с температурой 400 —600 °С.

Гамма-лучи являются надежным средством обеззараживания и могут применяться для дезинфекции различных объектов. Их действие имеет преимущество перед другими способами дезинфекции: гибель микроорганизмов происходит мгновенно после получения летальной дозы. Гамма-лучи используют для дезинфекции шерсти, кожевенного сырья и др. Для дезинфекции пищевых продуктов их применять не рекомендуется. Для обеззараживания пищевых продуктов применяют электронные лучи, они глубоко проникают и не оставляют наведенную радиацию.

Ультразвук способен механически разрушать микроорганизмы. Его используют в особых случаях для стерилизации жидких сред и сохранения антигенных свойств микробов.

Химический метод дезинфекции. Химический метод дезинфекции сводится к применению различных химических средств, чаще в виде водных растворов, реже в виде твердых или сыпучих веществ, газа, аэрозоля. Химические средства наиболее доступны и широко применяются в практике для дезинфекции животноводческих помещений, почвы, пастбищ, оборудования.

Водные растворы дезинфектантов чаще применяют в виде орошения (влажный способ) с помощью различных опрыскивателей, ДУКа, ЛСД и др. Для полного орошения бревенчатых, дощатых, бутовых или кирпичных поверхностей расходуют 1 л/м2 раствора; саманных, глинобитных, земляных и пр.—2 л/м2; поверхностей, покрытых плиткой и масляной краской, — меньше 1 л/м2.

В промышленном животноводстве широкое распространение получил метод дезинфекции путем мелкокапельного опрыскивания. Дезраствор подают направленно на обеззараживаемый объект в виде широкого плотного факела мелких капелек (диаметром 0,1 — 0,5 мм). Это позволяет равномерно оросить всю поверхность предмета при небольшом расходовании раствора (0,2—0,5 л/м2).

Одним из путей совершенствования химического метода дезинфекции является применение аэрозолей — искусственного тумана, образующегося при распылении дезсредств. Этот способ рекомендуется для дезинфекции закрытых животноводческих помещений, инкубаторов, а также для одновременной дезинфекции и дезинсекции. Особенно широко аэрозольную дезинфекцию применяют в птицеводческих хозяйствах. При использовании аэрозолей достигается одновременное обеззараживание поверхностей и воздуха помещений, при этом расход дезинфицирующего средства сокращается в 3 — 5 раз. Однако дезинфекционный эффект аэрозоля зависит от герметичности помещения. Температура внутри помещения должна быть не ниже +15°С, относительная влажность в пределах 60—95 %. Аэрозоль дезсредства получают с помощью установок и специальных генераторовраспылителей (ТАН, ПВАН, АГ-УД-2).

Обработанное помещение оставляют на определенное время закрытым.

Экспозиция (время воздействия химического вещества) зависит от концентрации и бактёрицидности дезсредства и вида микроорганизма. После экспозиции помещение проветривают, кормушки и поилки моют водой.

Весьма важен выбор дезсредств и метода дезинфекции с учетом специфики промышленного животноводства, особенностью которого является значительная металлоемкость, насыщенность технологическим оборудованием и контрольноизмерительной аппаратурой. В этих условиях необходимо учитывать не только антибактериальные свойства дезсредств, их биологическую активность, но и решать вопрос о защите оборудования от коррозии, особенно оцинкованного металла.

Многие дезсредства (хлорная известь, гипохлорид натрия, кислоты) обладают выраженной коррозионной активностью в отношении цинка и приводят к частичному или полному разрушению цинкового покрытия. Едкий натр, демп и гипохлор вызывают незначительную коррозию оцинкованного железа, которой в практике можно пренебречь, а формальдегид не оказывает на оцинкованную жесть никакого влияния. При выборе химических дезсредств нужно учитывать также, чтобы применяемое средство обладало достаточной бактерицидностью и широким спектром действия, не имело стойкого неприятного запаха, не портило предметы, хорошо растворялось в воде, проявляло дезинфицирующее и моющее действие в любой среде, было дешевым и траснпортабельным, не накапливалось в организме животного и т. д.

Химические средства дезинфекции делятся на несколько групп: щелочи, кислоты, хлорсодержащие препараты, фенолы, соли тяжелых металлов, формалин и др.

Щелочи — хорошо растворимые в воде основания, создающие в водном растворе большую концентрацию гидроксильных ионов. К щелочным препаратам, используемым в ветеринарной дезинфекции, относятся едкий натр (NaOH), едкое кали (КОН), гашеная известь Са(ОН)2, зола, сода (Na2CO3), каспос, поташ.

Механизм дезинфицирующего действия щелочей в значительной степени зависит от свойств среды объекта. В кислой среде щелочи сразу же вступают в реакцию нейтрализации. Протоплазма микробной клетки под влиянием щелочей претерпевает большие изменения: за счет увеличения рН среды происходят гидролиз белков, образование коллоидных частиц, омыление жиров и расщепление углеводов. Это нарушает нормальную жизнедеятельность клетки, а при значительных изменениях наступает ее гибель. В слабых растворах щелочей жизнеспособность многих микроорганизмов повышается. Только концентрированные растворы щелочей препятствуют развитию микробов и убивают их (в основном вегетативные формы).

Меры предосторожности. Нельзя брать голыми руками едкий натр и другие щелочи, так как они разъедают органическую ткань, образуя глубокие ожоги, а затем рубцы. При попадании внутрь организма щелочи вызывают отравление, сопровождающееся рвотой, поносом с кровью, сильными болями и затрудненным мочеиспусканием (противоядие — слабые органические кислоты). При переливании растворов нужно работать в очках. При соприкосновении едких щелочей с водой повышается температура, что может вызвать воспламенение органических веществ. Поэтому NaOH нужно хранить в сухом месте, в герметических железных барабанах, изолированно от воды. При использовании горячих растворов необходимо тщательно проветрить помещение (образуется большое количество аммиака).

Едкий натр (каустическая сода) в продажу поступает в виде натрового щелока (жидкий препарат), который содержит не менее 42 % NaOH, или в твердом виде. Твердый едкий натр обычно содержит 92 — 95 % NaOH и примеси (поваренная соль и сода). Это очень гигроскопичное кристаллическое вещество, легко поглощает влагу воздуха (принимает вид ледяной глыбы); разъедает большинство соприкасающихся с ним материалов. Едкий натр хорошо растворяется в воде с выделением большого количества тепла. Бактерицидное действие едкого натра обусловливается его сильнощелочными свойствами. Едкий натр — самое распространенное и широко применяемое дезинфицирующее средство.

Применяется 2 —3%-ный горячий (70 °С) раствор как универсальный дезинфектант при большинстве бактериальных и вирусных инфекций.

Едкое кали (гидроокись калия) для дезинфекции может быть использовано в тех же случаях и при тех же условиях, что и едкий натр, но в силу его высокой стоимости он редко применяется в ветеринарной практике.

Известь получается путем обжига известняка (СаО). Первоначально получаемая негашеная известь небактерицидна, бактерицидность она приобретает только после гашения.

Гашеная известь Са(ОН)2 — пушонка, получается, когда для гашения извести расходуют воды 70—100% к массе извести. При увеличении количества воды получают известковую взвесь (известковое молоко). Различают 10- и 20 %ную взвесь:

10 %-ная — 1 кг негашеной извести +1 л воды (гасят) +9 л воды;

20 %-ная — 1 кг негашеной извести + 1 л воды (гасят) + 4 л воды.

Взвесь готовят перед применением (на один день), так как она поглощает углекислоту воздуха и теряет свои качества как дезинфектант.

Гашеную известь в виде известкового молока применяют для побелки стен, потолков, станков, деревянных полов, корыт, кормушек, а в виде пушонки — для посыпки кормовых проходов. Насыщенный раствор (водный) гашеной извести называют известковой водой, она обладает щелочными свойствами.

Сода. Различают соду: кальцинированную (углекислую) — Na2CO3; двууглекислую (питьевую) — NaHCO3; кристаллическую — Na2CO3- 10H2O.

Кальцинированная сода является основным материалом, из которого получают каустик, питьевую соду и кристаллическую соду.