«Н.П.ИВАНОВ доктор ветеринарных наук, профессор, академик НАН РК К.А.ТУРГЕНБАЕВ доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. КОЖАЕВ кандидат ветеринарных наук ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ЖИВОТНЫХ Том 1 Общая эпизоотология Алматы, ...»

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 см3 сыворотки + 4 см3 физиологического раствора), инактивируют и разливают по 0,2 см в два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:10 или 1:20) в возрастающих дозах от 0,02 см3 до 0,2 см3 с интервалом 0,02 см3 и недостающее до 0,2 см3 (в каждой пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2см3 антигена в рабочем разведении, а во второй ряд – по 0,2 см3 физиологического раствора. Пробирки ставят в водяную баню при температуре 37ОС на 20 минут. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 см3 гемолитичесой смеси встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 минут, после чего учитывают результат.

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной сыворотки), представлена в таблице 5.

Таблица 5 - Схема титрования комплемента в бактериолитической системе Компоненты ребирок в разведении 1:20 второй 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0, Недостающее ко- первый 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 личество физиологического рас- второй 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 твора Примечание. Условные обозначения. Здесь и далее ПГ - полный гемолиз; ЧГ - частичный гемолиз; НГ - нет гемолиза.

Для удобства в работе и более точной дозировки в начале рекомендуется приготовить необходимые разведения комплемента в 10-кратных объемах в отдельных пробирках. Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят комплемент, разведенный 1:20, в дозах 0,2; 0,4; 0,6 см3 и т.д. до 2,0 см3, добавляют в каждую пробирку недостающее до 2,0 см3 количество физиологического раствора, то есть соответственно 1,8; 1,6; 1,4 см3 и т.д. Из первой пробирки этого ряда переносят по 0,2 см3 жидкости в первые пробирки с сыворотками, взятыми для титрования, из второй пробирки - соответственно во вторые пробирки с сыворотками и т.д. Работу можно выполнять аппаратом Флоринского.

Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без антигена, а также в пробирках с позитивной и испытуемой сывороткой без антигена в течение 20 минут в водяной бане при 37-38°С, при задержке гемолиза в пробирках с бруцеллезной сывороткой и антигеном.

Схема определения титра комплемента показана в таблице 6.

Таблица 6 - Схема определения титра комплемента Если в пробирках с испытуемой сывороткой и антигеном отмечают задержку гемолиза более чем на один интервал по сравнению с этой же сывороткой без антигена, это означает, что для титрования была взята положительная сыворотка. В таких случаях определение титра комплемента проводят по ряду пробирок без антигена.

В примере, приведенном в таблице 5 и 6 титр комплемента в бактериолитической системе равен 0,1 или 0,005. Рабочий титр комплемента для главного опыта на 0,02 больше, в данном случае 0,12.

Расчет количества неразведенного комплемента, необходимого для главного опыта, делают по формуле:

X - количество неразведенного комплемента;

A - рабочий титр комплемента;

B - количество пробирок в опыте;

20 (10) - основное разведение комплемента (1:10 или 1:20).

Так как, количество комплемента в рабочем разведении, требующееся для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 см3 (0,12х100), то к 0, см3 неразведенного комплемента следует добавить 19,4 см3 физиологического раствора.

При постановке РСК периодически проводят титрацию и других компонентов реакции, в частности, гемолизина и антигена.

Титрацию гемолизина проводят при участии в реакции кроме названного препарата следующих компонентов (таблица 7):

- комплемента - эритроцитов барана - физиологического раствора Таблица 7 - Схема титрования гемолизина Компоненты 1:500 1:1000 1:1500 1:2000 1:2500 1:3000 1:3500 1: Комплемент в 1: Эритроциты взвесь) Физиологический раствор Примерный

ПГ ПГ ПГ ЧГ ЧГ ЧГ ЧГ ЧГ

результат Титром гемолизина считают наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 минут 0,2 см3 2,5-3%-ной взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 см3 комплемента, разведенного 1:10 - 1:20. В приведенной таблице титр гемолизина равен 1:1500.

Рабочий титр гемолизина для РСК в 2 раза и для РДСК в 3 раза выше. Так, если титр гемолизина равен 1:1500, то рабочий раствор в РСК будет 1:750, в РДСК-1:500.

Разведения гемолизина готовят из основного (1:100) по схеме указанной в таблице 8.

Таблица 8 - Схема разведения гемолизина Основное разведение Физиологический расПолучаемые разведения гемолизина 1:100 (см3) твор (см3) Эритроциты барана - 2,5 %-ная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе для РСК и 3 %-ная для РДСК.

Для приготовления гемолитической смеси соответствующую взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в термостате при 37°С в течение 15-20 минут. При смешивании гемолизин вливают во взвесь эритроцитов.

Для получения эритроцитов кровь у барана (овцы) берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в сосуд со стеклянными или фарфоровыми бусами (для дефибринирования) или в сосуд с налитым в него раствором Алсивера в количестве, равном объему крови (для дефибринирования и консервирования).

Для консервирования дефибринированной крови применяют раствор стрептомицина (1 г стрептомицина, растворенного в 20 см3 физиологического раствора, на 100,0 см3 крови).

Дефибринированная кровь пригодна для исследования в течение трех дней, консервированная стрептомицином или раствором Алсивера в течение 12 дней.

Приготовление раствора Алсивера: в 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 18,7 г глюкозы, 4,2 г хлорида натрия, 8 г лимоннокислого натрия, 0, г лимонной кислоты. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве (при 103-105 °С в течение 30 минут).

Для приготовления суспензии эритроцитов крови барана берут свежую дефибринированную или консервированную кровь, центрифугируют при 1500об/мин в течение 15 минут жидкую часть сливают, а осадок 2-3 раза отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования в указанном порядке до полного обесцвечивания надосадочной жидкости.

Физиологический раствор - 0,85 %-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН = 7,3-7,4 или физиологический раствор, содержащий, кроме ионов натрия, ионы магния и кальция.

При этом основные растворы солей магния и кальция готовят следующим образом: 1 г хлорида магния (хч) растворяют в 11,8 см3 и 1 г хлорида кальция (хч) - в 54,4 см3 дистиллированной воды. Основные растворы этих солей хранят в холодильнике.

Перед постановкой реакции берут на 1000 см3 физиологического раствора хлорида натрия по 1,2 см3 основных растворов хлорида магния и хлорида кальция.

Смесь кипятят, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр и доводят рН до 7,3-7,4 прибавлением едкого натрия или соляной кислоты.

Титрацию антигена в РСК (РДСК) проводят по квадратной схеме. С этой целью готовят разведения антигена (таблица 9), а затем в четыре ряда штатива размещают пробирки (Флоринского или другие серологические) по 8-10 штук в каждом (таблица 10). Во все пробирки первого и второго рядов (кроме последних) вливают 0,2 см3 позитивной сыворотки, соответственно, в разведениях 1:10 и 1:20.

В последние пробирки каждого ряда помещают двойной объем сыворотки (0, см3) без антигена. Они служат контролем сыворотки на наличие самосвязывающих свойств (в каждом взятом разведении).

В пробирки третьего ряда разливают аналогично предыдущим негативную сыворотку в разведении 1:5.

3атем штатив с пробирками и разлитыми в них сыворотками помещают в водяную баню при температуре 60-62°С (РСК), или 62-64°С (РДСК) на 30 минут (для инактивации). После этого в каждую пробирку первых трех рядов (кроме тех, которые служат контролем сыворотки на самосвязывающие свойства) вливают антиген в последовательно увеличивающихся разведениях (как это указано в схеме). В последний (четвертый) ряд пробирок антиген вливают в тех же разведениях, но в двойной дозе (без сыворотки)-это контроль антигена на антикомплементарность.

Следующим во все пробирки четырех рядов добавляют комплемент в рабочем титре (РСК) или в разведении 1:20 -1:30 (РДСК) по 0,2, после чего штативы с пробирками выдерживают 20 минут в водяной бане при 37-38 °С. Затем, во все пробирки вливают гемолитическую смесь в дозе 0,4 см3 (РСК) или в оттитрованном объеме (РДСК). Штативы с пробирками помещают в водяную баню при 37С на 15 минут. По истечении этого времени штативы с пробирками извлекают из водяной бани и проводят учет результатов реакции.

Кроме того, ставится контроль на антикомплементарность антигена в каждом разведении (двойная доза антигена без сыворотки). Антиген не должен обладать антикомплементарными свойствами.

Результаты реакции учитывают в крестах:

# (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов - (минус) - полный гемолиз эритроцитов.

Таблица 9 - Схема приготовления разведений антигена при его титрации Исходное Кол-во исходного раствора Кол-во физраствора Последующие разведения готовят из исходного 1: Таблица 10 - Схема титрования антигена Сыворотка позитивная (негативная) в каждый ряд взя- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0, тых разведений Антиген (в разведениях титрации) Комплемент в рабочем титре (или 1:20-в РДСК) Водяная баня при 37-38°С 20 минут (РСК) или 16-18 часов при 0-4ОС и 20 минут при комнатной температуре Гемолитическая система (оттитрованная доза в РДСК) Постановка РСК (проведение главного опыта).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), при массовом исследовании реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (таблица 11).

Таблица 11 - Схема постановки главного опыта РСК При массовом исслеДля повторного исследования Испытуемая сыворотка Физиологический раствор Антиген в рабочем титре Комплемент в Гемолитическая Примечание. Допускается смешивание перед разливом равных объемов антигена и комплемента.

Необходимые разведения сывороток рекомендуется готовить следующим образом.

При исследовании в одной пробирке берут 0,04 см3 испытуемой сыворотки и добавляют 0,16 см3 физиологического раствора (разведение 1:5). Допускается при работе с аппаратом Флоринского к 0,05 см3 испытуемой сыворотки добавлять 0,2 см3 физраствора.

При постановке реакции в трех пробирках в первую наливают 0,1 см 3 испытуемой сыворотки и добавляют 0,4 см3 физиологического раствора (разведение 1:5). Из первой пробирки 0,2 см3 переносят во вторую пробирку, 0,1 см3 – в третью, в которую затем добавляют 0,1 см3 физиологического раствора (разведение 1:10).

Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, как было указано выше. Разлив сывороток, физиологического раствора и других компонентов реакции производят при помощи пипеток или аппарата Флоринского.

Главный опыт сопровождается следующими контролями:

- негативная и специфическая позитивная в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);

- гемолитическая система (0,6 см3 физиологического раствора и 0,4 см3 гемолитической системы).

Вопросы для самопроверки:

1. В чем заключается сущность реакции связывания комплемента?

2. Что является лимитирующим фактором в РСК?

3. При каком температурном режиме проводят РСК?

4. Какие контроли ставят при проведении РСК?

5. Как проводится учет результатов РСК?

17.5.1.1.13 РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ Цель занятия:

Реакция длительного связывания комплемента на холоде проводят в пробирках в объеме сыворотки, антигена и комплемента по 0,2 см3, гемолитической системы - в оттитрованной рабочей дозе.

Последовательность постановки РДСК.

Первый день. Разлив испытуемых и контрольных сывороток для главного опыта и для титрования гемолитической смеси. Инактивирование сывороток.

Контроль компонентов реакции на антикомплементарность и гемотоксичность.

Разлив антигена и комплемента.

Приготовление гемолитической смеси.

Помещение пробирок в холодильник.

Второй день. Выдерживание пробирок главного опыта и гемолитической системы при комнатной температуре 20 минут.

Титрование гемолитической системы.

Определение рабочей дозы гемолитической системы.

Главный опыт.

Разлив гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками.

Учет и оценка результатов реакции.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном.

Одновременно разливают сыворотки для титрования гемолитической системы. Необходимые разведения сывороток готовят в порядке, как указано выше.

Инактивирование разведенных сывороток крови проводят при 62-64°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:30 (при титре в гемсистеме, указанном биопредприятием - 0,19 - 0,22).

Примечание - Если титр комплемента в гемсистеме неизвестен, перед постановкой реакции определяют его рабочее разведение согласно схеме приведенной в таблице 12.

Таблица 12 - Схема определения рабочего разведения комплемента для РДСК Комплементы Комплемент в разведении 1: Физиологический Полученное разведение Комплемент в разведениях Физиологический Гемолитическая система В данном примере полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:50, рабочее разведение его 1:30.

Розлив компонентов и последовательность постановки реакции осуществляют по схеме, указанной в таблице 13.

Таблица 13 - Схема постановки РДСК Испытуемая сыворотка Физиологический Антиген в рабочем Комплемент в раб.

разведении Гемолитическая система Контроли реакции:

- негативная и позитивная (бруцеллезная или овисная) сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена;

- гемолитическая система без сыворотки, антигена и комплемента.

Перед розливом гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками проводят титрование гемолитической системы на трех сыворотках негативной (свежей или консервированной), позитивной -(специфической) и одной из числа исследуемых по схеме согласно таблице 14. Показан результат по результатам позитивной сыворотки. Результат по негативной сыворотке аналогичен данным второго ряда.

Таблица 14 - Схема титрования гемолитической системы Компоненты реакбирок в ции Позитивная и нега- первый 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0, тивная или испытуемая сыворотка второй 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0, в разведении 1: Комплемент в рабочем разведении второй 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0, Примерный Примечание - Условные обозначения. ПГ – полный гемолиз, ЧГ – частичный гемолиз, НГ – отсутствие гемолиза.

Если в пробирках с испытуемой сывороткой и антигеном гемолиз будет отсутствовать, это означает, что для титрования гемсистемы была взята положительная сыворотка. В таких случаях при определении титра гемсистемы следует учитывать показания реакции в пробирках без антигена.

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной и испытуемой сыворотками и в безантигенном ряду с позитивной сывороткой. Рабочий титр на один интервал ниже (например: при титре гемолитической системы 0, см3, рабочий титр - 0,5 см3).

По данной схеме допускается постановка РСК. В этом случае реакция осуществляется в один день. Пробирки с разлитыми в них сыворотками, антигеном и комплементом помещаются в водяную баню при 37-38 °С на 20 минут.

Читку результатов реакции проводят по такой же схеме, как указано при описании РСК.

Вопросы для самопроверки:

1. В чем заключается сущность реакции длительного связывания комплемента?

2. Что является лимитирующим фактором в РДСК?

3. При каком температурном режиме проводят РДСК?

4. Какие контроли ставят при проведении РДСК?

5. Как проводится учет результатов РДСК?

17.5.1.1.14 РЕАКЦИЯ САЙДУЛДИНА (РС), РЕАКЦИЯ

СВЯЗЫВАНИЯ КОНГЛЮТИНИРУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА (РСКК)

Цель занятия:

Реакцию Сайдулдина (РС) или реакцию связывания конглютинирующего комплекса (РСКК) применяют при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота с целью диагностики бруцеллеза. При применении вакцины из штамма 19 исследование сыворотки крови в РСКК не проводят, а также при ревакцинации коров шт. 82 до истечения 6 месячного поствакцинального срока.

PC основана на взаимодействии комплемента, фиксированного на комплексе антиген-антитело с конглютинином. Источником конглютинина является сыворотка крови крупного рогатого скота (конглютинирующая сыворотка). При образовании комплекса антиген-антитело комплемент и конглютинин (конглютинирующий комплекс) соединяются с ним и индикаторная система (эритроциты барана, сенсибилизированные гемолизином) остается без изменения. В случае отсутствия специфических антител в исследуемой сыворотке, конглютинирующий комплекс соединяется с индикаторной системой, в результате чего происходит конглютинация (склеивание) эритроцитов.

Компоненты реакции:

- антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК и РС в рабочем титре, указанном на этикетке;

- позитивная бруцеллезная сыворотка для РСК (биофабричного производства или от больного животного);

- негативная сыворотка крови крупного рогатого скота (свежая или консервированная);

- сухая конглютинирующая сыворотка крупного рогатого скота;

- гемолитическая сыворотка (гемолизин в утроенном титре);

- эритроциты барана – 2%-ная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе, полученных из свежей дефибринированной или консервированной крови. Для приготовления взвеси эритроцитов кровь центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 10-15 минут, жидкую часть сливают, а осадок 2-3 раза отмывают в физиологическом растворе путем центрифугирования в указанном порядке до полной прозрачности надосадочной жидкости. Для получения индикаторной системы 2%-ную взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем, т.е. утроенном титре, смешивают в равных объемах и выдерживают при 37-38°С 15-20 минут;

- испытуемая сыворотка крови крупного рогатого скота - свежие или консервированные по принятым методам, без признаков гемолиза и помутнения;

- физиологический раствор, применяемый для разведения всех компонентов - 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде, рН 7,2-7,4.

Техника постановки РСКК Титрование конглютинирующей сыворотки Конглютинирующую сыворотку титруют перед каждой постановкой главного опыта. Во флакон (ампулу) с лиофилизированной сывороткой вносят физиологический раствор в количестве, указанном на этикетке и растворяют ее путем легкого встряхивания. Затем готовят основное разведение сыворотки 1:10, для чего к 0,5 см3 сыворотки добавляют 4,5 см3 физиологического раствора и тщательно перемешивают. Из основного разведения в два ряда пробирок вносят пипеткой по 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40 см 3 и добавляют в каждую пробирку недостающее до 0,5 см3 количество физиологического раствора. Затем в первый ряд пробирок вносят по 0,25 см3 физиологического раствора, а во второй - по 0,25 см3 бруцеллезного антигена в рабочем разведении. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37-38°С на 30 минут, после чего во все пробирки добавляют по 0,25 см3 индикаторной системы, встряхивают и вновь выдерживают в водяной бане при 37-38°С в течение 1 часа. Результаты титрования учитывают сразу после выемки штатива из бани.

За титр конглютинирующей сыворотки принимают ее наименьшее количество, вызывающее полную конглютинацию эритроцитов. Рабочая доза на один интервал (0,05 см3) больше титра.

Разница в результатах реакции при наличии антигена и без него допустима в пределах одной дозы и может отличаться только по степени конглютинации.

Конглютинирующую сыворотку считают непригодной для РСКК, если эта разница составляет 1 интервал (0,05 см3) или более. В случае получения титра более 0,4 см3 конглютинирующая сыворотка также непригодна для постановки реакции.

Расчет количества не разведенной конглютинирующей сыворотки, необходимой для главного опыта, делают по формуле:

X - количество не разведенной конглютинирующей сыворотки;

A - рабочая доза конглютинирующей сыворотки;

B - количество пробирок в опыте;

10 - основное разведение конглютинирующей сыворотки (1:10).

Так как, количество конглютинирующей сыворотки в рабочем разведении, требующееся для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 25,0 см (0,25 см3 100), то к 2,0 см3 не разведенной конглютинирующей сыворотки следует добавить 23,0 см3 физиологического раствора.

Главный опыт. Реакцию проводят в водяной бане в объеме 1,0 см3. Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена. При массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (таблица 15).

Таблица 15 - Схема главного опыта постановки РСКК Компоненты реакции Инактивация в водяной бане при 61-62°С - 30 минут Водяная баня 37-38°С при комнатной температуре - 1 час Примечание - При постановке реакции в трех пробирках после смешивания сыворотки с физиологическим раствором из третьей пробирки 0,25 см 3 удаляют. Допускается смешивание перед разливом равных объемов антигена и конглютинирующей сыворотки.

Контроли главного опыта Одновременно с главным опытом ставят следующие контроли:

а) позитивной бруцеллезной сыворотки в разведении 1:5 без антигена, а также в разведениях 1:5 и до предельного титра с бруцеллезным антигеном;

б) негативной сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);

в) антигена в двойной дозе 0,5см3, конглютинирующей сыворотки в рабочем разведении и индикаторной системе по 0,25 см3 (на антикомплементарность антигена);

г) конглютинирующей сыворотки в рабочем разведении и индикаторной смеси по 0,25 см3, физиологического раствора - 0,5 см Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают в течение трех часов выдерживания при комнатной температуре. Постановку реакции считают правильной и учет результатов проводят в случае, если в пробирках с позитивной бруцеллезной сывороткой и антигеном (контроль «А») взвесь эритроцитов остается гомогенной во всех разведениях до предельного титра сыворотки, а в пробирках со всеми контролями «Б», «В», «Г» и контролем «А» без антигена произойдет полная конглютинация.

Реакцию учитывают визуально по степени конглютинации эритроцитов:

- задержка конглютинации - эритроциты оседают на дно пробирки в виде «пуговки» и при встряхивании образуют равномерную взвесь;

- частичная конглютинация - эритроциты оседают на дно пробирки в виде «пуговки», вокруг которой образуется слабый «зонтик». При встряхивании появляются мелкие хлопья на фоне свободных эритроцитов, просветление жидкости частичное;

- полная конглютинация - эритроциты оседают на дно пробирки в виде «зонтика», при встряхивании образуются крупные хлопья на прозрачном фоне.

Диагностическая оценка результатов реакции. При постановке реакции в одной пробирке сыворотку крови, с которой получена задержка конглютинации или частичная конглютинация, исследуют повторно в тот же день или на следующий, в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.

Реакцию считают положительной - при задержке конглютинации в разведении исследуемой сыворотки 1:5, сомнительной – при частичной конглютинации в одном или двух разведениях сыворотки, отрицательной – при полной конглютинации в разведениях 1:5 и более.

Вопросы для самопроверки:

1. Сущность реакции Сайдулдина.

2. Компоненты, используемые в реакции Сайдулдина.

3. Диагностическая оценка результатов РС.

17.5.2 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ознакомить слушателей с правилами бактериологической Цель занятия:

работы, дать основы бактериологических исследований Работник бактериологических лаборатории постоянно должен помнить, что он имеет дело с инфицированным материалом и при неосторожном обращении с ним может заразиться сам или стать источником распространения инфекции. Поэтому при бактериологической работе необходимо всегда соблюдать следующие правила:

1. Работать в лаборатории в наглухо застегнутом халате.

2. Не курить и не принимать пищи в помещении лаборатории;

3. Пользоваться только своим рабочим местом и прикрепленным оборудованием.

4. Соблюдать чистоту и опрятность в работе. После окончания работы тщательно мыть и дезинфицировать руки.

5. Инструменты (пинцеты, шпатели, пипетки, петли и др.) предметные и покровные стекла и т.д. должны после использования погружаться в дезинфицирующую жидкость или прожигаться на пламени.

6. Все использованные материалы, трупы животных, отработанные культуры и т.д. нужно сжигать или обеззараживать стерилизацией в автоклаве.

7. Предметы, случайно загрязненные бактериальной культурой или другим инфекционным материалом, необходимо тщательно дезинфицировать.

8. После работы бактериальные культуры и другой материал должны быть убраны в безопасное место, а рабочее место приведено в надлежащий порядок.

Бактериальные исследования включают следующие этапы: микроскопия, выделение чистой культуры и её идентификация, постановка биопробы.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие правила необходимо соблюдать при бактериологической работе?

2. Какие этапы включает бактериологическое исследование?

научить слушателей проводить микроскопию исследуемого Цель занятия:

Микроскопия патматериала проводится с целью обнаружения возбудителя болезни. при этом необходимо пользоваться чистыми, обезжиренными предметными и покровными стеклами.

Обезжиривание стекол, бывших в употреблении, достигается погружением их на 2 часа в концентрированную серную кислоту, последующим кипячением в щелочи и промыванием водой. Новые стекла кипятят в 1%-ном растворе соды, ополаскивают водой, затем слабым раствором соляной кислоты (подкисленной водой) и, наконец, хорошо промывают. Хорошее обезжиривание стекол получают при выдерживании их в течение нескольких минут в горячем водном растворе 10%-ного едкого натрия или калия, после чего стекла ополаскивают водой.

Чистые стекла хранят в 96О-ном этиловом спирте с притертой пробкой, либо в смеси Никифорова (96О спирт и эфир в равных соотношениях).

Изготовление кляч препарата осуществляют путем касания с тканью животного, а при других бактериальных работах пользуются бактериальными петлями, пастеровскими пипетками, стеклянными или металлическими шпателями.

Удобнее всего делать мазки пользуясь бактериальной петлей, представляющей собой платиновую или нихромовую проволоку, впаянную в стеклянную палочку-ручку загнутую на свободном конце в виде кольца. При работе петля держится в правой руке между большим, указательным и средним пальцем (так же как ручка при письме).

Пробирку с культурой, из которой следует сделать мазок, кладут почти в горизонтальном положении на указательный и средний палец повернутой вверх ладонью левой руки и придерживают большим пальцем. Приступая к работе, прежде всего прокаливают петлю в пламени горелки до красного каления, держа её почти отвесно, так, чтобы пламя охватило всю петлю и часть ручки. Затем мизинцев и безымянным пальцем правой руки вынимают из пробирки ватную пробку и держат её концом вниз так, чтобы бывшая в пробирке часть пробки не касалась руки.

Слегка обжигают на пламени край пробирки, отводят её несколько влево и вперед от горелки и, проведя еще раз бактериологическую петлю через пламя, вводят её в пробирку.

Если культура бактерий жидкая, то петлей захватывают капельку ее и наносят на предметное стекло. Затем прокаливают петлю и, продолжая держать её в правой руке, опять обжигают край пробирки, проводят через пламя пробку, над пламенем же закрывают пробирку и ставят её в штатив.

Круговым движением петли каплю культуры распределяют по стеклу тонким равномерным слоем и тотчас же хорошо прокаливают петлю. Только после этого петлю можно поставить в штатив или предназначенный для неё стакан.

Если мазок делают из культуры микробов, растущих на плотной питательной среде, то вначале на стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора поваренной соли, затем, захватив петлей немного материала, размешивают его в капле и делают мазок, придерживаясь вышеописанной методики.

Мазок высушивают на воздухе или в термостате. Подогревать мазок нельзя, так как при быстрой отдаче влаги происходит грубое свертывание белков и клетки теряют свою первоначальную структуру. Для ускорения высыхания препарат можно держать в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Если высушивают мазок из культуры патогенных микробов, то его следует накрыть стеклянным колпаком, во избежание разноса заразного материала мухами.

Высушенный мазок фиксируют над пламенем горелки (проводят 3-4 раза с 5-6 секундными промежутками) или специальными жидкостями – фиксаторами:

смесью равных объемов спирта и эфира (препарат погружают на 10-15 минут), ацетоном (препарат выдерживают в этом растворе 5 минут), метиловым спиртом (препарат фиксируют в течение 2-3 минут) и др.

При фиксации происходит обеззараживание микробов и приклеивание их к стеклу. Фиксированный мазок окрашивается легче, так как мертвый белок более восприимчив к окраске, чем живой.

Фиксированный мазок подвергают окрашиванию одним из следующих методов окраски микробов.

На рабочем столе микробиолога кроме набора рабочих растворов красок, всегда должна иметься бутыль с дистиллированной водой для ополаскивания мазков и сливная чашка с подставкой-мостиком. Мостик представляет собой две стеклянные палочки одинаковой длины, концы которых соединены резиновыми трубками.

Если окрашивание мазка производится без подогревания, то предметное стекло, на которое нанесен мазок, помещается на подставку-мостик и на мазок наливается краска; при окраске с подогреванием стекло захватывается пинцетом Корнэ и выдерживается определенное время над пламенем горелки. Если мазок необходимо окрашивать продолжительное время, то его погружают в раствор краски, налитый в стаканчик или кюветку.

Применяют простую или сложную окраску микроорганизмов.

Простая окраска. При окрашивании простым способом на мазок наливают несколько капель краски, чаще всего метиленовой синьки или разведенного фуксина. Окрашивание длится 2-3 минуты, затем мазок промывают легкой струей воды и высушивают фильтровальной бумагой. Приготовленный таким способом мазок рассматривают под иммерсионным объективом микроскопа.

Сложная окраска. Благодаря различному строению ткани микроба разные виды бактерий по разному окрашиваются одними и теми же красками и неодинаково интенсивно отдают краску при последующем обесцвечивании спиртом, кислотами и другими реагентами. В ряде случаев различные составные части микробной клетки избирательно реагируют на воздействие различных красящих растворов. На этом свойстве основаны сложные способы окраски микробов, применяющиеся как для дифференциации одних видов микробов от других, так и для изучения структуры микробной клетки.

Одной из таких дифференциальных окрасок является окраска по Грамму.

Окраска по Грамму.

1. На фиксированный мазок в течение 2 минут действуют карболовым генцианвиолетом. Практически это осуществляют так: на мазок наливают несколько капель воды и кладут заранее окрашенную генцианвиолетом фильтровальную бумажку (модификация по Синеву). Для окрашивания фильтровальной бумаги последнюю расстилают в один слой на стекле и обливают раствором краски, приготовленной по следующей прописи:

генцианвиолета…………………………… 1 г спирта……………………………………… 100 см глицерина (не обязательно)………………. 5 см Краска стойкая, годна к употреблению долгое время.

Окрашенную бумагу высушивают, режут на полоски размером 20х40мм и хранят в темной банке с притертой пробкой.

Генцианвиолет можно заменять кристаллвиолетом, метилвиолетом или викториабляу.

2. Бумажку удаляют и на мазок наливают раствор Люголя, который выдерживают на препарате 2 минуты (до почернения препарата) (раствор Люголя готовят по прописи: 1 г кристаллического йода, 2 г йодистого калия, 300 см дистиллированной воды. Вначале растворяют йодистый калий в 5-7 см3 воды, затем добавляют йод; когда йод полностью растворится, приливают остальную воду).

3. Сливают раствор Люголя и действуют на мазок 96%-ным спиртом 30 секунд (до тех пор, пока спирт перестанет окрашиваться краской).

4. Промывают водой.

5. Дополнительно препарат окрашивают разведенным фуксином Циля (Пфейфера) в течение 2-3 минут (или разведенным сафранином, нейтральротом также 2-3 минуты).

6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

По отношению окраски по Грамму все бактерии делятся на две группы.

Одни виды бактерий прочно удерживают йодные соединения генцианвиолета и не обесцвечиваются при обработке спиртом. Это свойство зависит от присутствия в клетке магниевой соли рибонуклеиновой кислоты. Такие бактерии окрашены в фиолетовый цвет и носят название грамположительных.

Другие виды бактерий при действии спирта очень быстро теряют первоначальную окраску. Они окрашены в красный цвет и называются грамотрицательными.

При длительном или слишком кратковременном воздействии спиртом можно получить неправильные результаты окраски. Поэтому начинающим лучше пользоваться йодированным спиртом (на 100 см3 спирта добавляется 2-4 см 10%-ной йодной настойки). Грамотрицательные микробы обесцвечиваются йодированным спиртом в течение 5 секунд, в то время как грамположительные не обесцвечиваются при экспозиции в 1 час.

Грамположительные и грамотрицательные бактерии отличаются друг от друга еще рядом свойств, например, отношением к пенициллину. Бактериостатическое действие пенициллина распространяется лишь на грамположительных бактерий; грамотрицательные – не чувствительны к этому антибиотику.

К грамположительным бактериям относятся почти все виды патогенных кокков, возбудитель сибирской язвы, палочка рожи свиней, многие анаэробы и др.; грамотрицательным – палочка сапа, бруцеллы, бактиерии кишечнотифозной группы и др.

Отношение к окраске по Грамму является важным диагностическим признаком и обязательно упоминается при характеристике микробного вида.

В результате наличия плотной оболочки споры обычными методами не окрашиваются. Для их окрашивания необходимо предварительно изменить структуру оболочек спор с тем, чтобы сделать их более проницаемыми для краски.

Это достигается предварительной обработкой препарата протравами (хромовой кислотой, соляной кислотой) или окрашиванием карболовыми растворами красок при подогревании. Окрасившись, споры с трудом отдают краску даже при воздействии на них кислотами. На этом свойстве основаны все методы окраски спор.

При окраске спор вначале интенсивно прокрашивают весь препарат, затем обесцвечивают вегетативные формы и дополнительно окрашивают их в контрастный цвет.

Существует несколько методов окрашивания спор.

Метод Златогорова.

1. На фиксированный мазок через полоску фильтровальной бумаги наносят карболовый фуксин и красят при подогревают до отхождения паров 5-10 минут.

Можно положить на мазок фильтровальную бумажку, заранее окрашенную карболовым фуксином, налить на нее несколько капель воды и подогревать мазок (по мере испарения воду необходимо приливать, чтобы препарат не высыхал).

2. Мазок обесцвечивают 3-процентным водным раствором серной кислоты в течение 5-10 секунд.

3. Обильно промывают водой.

4. Окрашивают дополнительно метиленовой синькой в течении 2-5 минут.

5. Промывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: споры красные, вегетативные формы синие.

Долгое время во всех руководствах по микробиологической технике рекомендовался метод окраски спор по Мюллеру, который отличается от метода Златогорова тем, что на препарат предварительно действуют 5-процентным водным раствором хромовой кислоты.

Метод Пешкова.

1. На фиксированный препарат наливают раствор щелочной метиленовой синьки, доводят его до кипения, держа препарат над пламенем горелки и кипятят 15-20 секунд.

2. Смывают синьку водой и препарат докрашивают 0,5 % водным раствором нейтральрота в течение 30 секунд.

3. Промывают дистиллированной водой, высушивают.

Микроскопическая картина: споры окрашены в голубой или синий цвет;

протоплазма вегетативных форм – в розовый.

При обычных методах окраски споры обнаруживаются в виде бесцветных круглых или овальных образований внутри тел бактерий.

Споры бактерий бывают довольно хорошо видны и в неокрашенном препарате благодаря тому, что они сильно преломляют свет. В таком препарате они имеют вид блестящих круглых или овальных телец.

Окраска жгутиков Жгутики (тонкие, эластичные нити) являются органами движения бактерий. По числу и расположению жгутиков все бактерии делятся на три типа:

1) монотрихии – бактерии с одним жгутиком, расположенном на одном из концов тела клетки;

2) лофотрихии – бактерии, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков;

3) перитрихии – бактерии с большим числом жгутиков, покрывающих тело клетки.

Жгутики бактерий очень тонкие образования, толщина которых не превышает 0,1 М при обычных методах окраски их нельзя увидеть. Поэтому при окраске жгутиков применяют специальные способы обработки, благодаря которым жгутики разбухают, на них оседает краска и они становятся видимыми под микроскопом.

При изготовлении препарата жгутики могут оторваться от бактериальной клетки, поэтому все операции, связанные с окраской, требуют особой тщательности и осторожности.

Существуют много методов окраски жгутиков, наиболее употребительные из них следующие.

Окраска жгутиков серебрением (модификация по Морозову). Для окраски необходимы три реактива:

1. 40 процентный формалин (продажный) – 1 см Дистиллированная вода – 100 см Дистиллированная вода – 100 см Карболовая кислота (расплавленная) – 1 см 3. Раствор аммиачного серебра (4 г азотнокислого серебра растворяют в см дистиллированной воды. К этому раствору по каплям до полного растворения осадка добавляют крепкий 25-процентный раствор аммиака. Перед окраской реактив разбавляют 1:10 дистиллированной водой).

1. В пробирку наливают 0,1 – 0,2 см3 первого реактива (1-процентный раствор формалина). С агаровой культурой бактерий на границе с конденсационной водой осторожно захватывают петлей немного бактериальной массы и легким движением петли распределяют ее в жидкости реактива. Приготовленную эмульсию ставят в термостат на 2 часа.

2. В маленькую чашечку или бюксу наливают 3-4 см3 дистиллированной воды и в нее очень тонкой пипеткой вносят одну каплю формалиновой бактериальной взвеси. Берут 5-6 капель этой взвеси, не размазывая, маленькой петлей наносят на центральную часть безукоризненно чистого стекла. Дают каплям высохнуть на воздухе.

3. На препарат наливают второй реактив (протраву) и подогревают мазок до появления паров 1,5-2 минуты. Тщательно отмывают протраву дистиллированной водой и действуют на препарат третьим реактивом при легком подогревании в продолжении 2-2,5 минут.

После этого препарат хорошо промывают водой и высушивают на воздухе.

Микроскопическая картина: тела бактерий окрашены в черный цвет, жгутики – в коричневый или черный цвет в виде тонких волнообразных извитых нитей.

Метод Лефлера.

1. Берут 18-24-часовую агаровую культуру бактерий. Совершенно остывшей петлей захватывают немного материала вблизи конденсационной воды и осторожно погружают его в пробирку, содержащую 5-6 см3 стерильной водопроводной воды. Ждут, когда бактерийная масса разойдется (разбалтывать нельзя).

2. Хорошо обезжиренное покровное стекло прогревают на пламени горелки. Когда стекло остынет, на него наносят каплю кислотоустойчивых бактерий из пробирки. Высушивают на воздухе.

3. Действуют протравой 10-15 минут.

Состав протравы: (Протрава готовится за несколько суток до употребления. Перед употреблением её фильтруют). 1 см3 насыщенного спиртового раствора фуксина, смесь из 10 см3 25%-ного водного раствора танина и 5 см3 насыщенного водного раствора сернокислого железа.

4. Препарат тщательно промывают водой, высушивают.

5. Докрашивают основным карболовым фуксином 3-5 минут.

6. Промывают водой, высушивают.

Окраска кислотоустойчивых бактерий В особую группу кислотоустойчивых бактерий выделены микроорганизмы, обладающие ясно выраженной резистентностью к минеральным кислотам.

Так, в 5-10%-ных растворах серной или соляной кислоты они сохраняются довольно долго.

Кислотоустойчивые бактерии обычными красками окрашиваются плохо и поэтому при их окрашивании применяют концентрированные растворы красок и подогревание. Но, восприняв ту или иную окраску, они не обеспечиваются даже при воздействии спирта (исключение представляют некоторые виды сапрофитных кислотоустойчивых бактерий, которые обесцвечиваются спиртом) и крепких растворов минеральных кислот. Это свойство кислотоустойчивых бактерий используют для их дифференциальной диагностики.

Объясняют кислотоустойчивость бактерий присутствием в их теле жировых и воскоподобных веществ. Кислотоустойчивость всегда сопровождается способностью бактерий окрашиваться положительно по Граму.

К кислотоустойчивым бактериям относят возбудителей туберкулеза, паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота, палочку проказы, а также ряд сапрофитных бактерий, найденных в молоке, масле, почве, навозе, на различных злаках, в организме холоднокровных животных и т.д.

Кислотоустойчивые патогенные бактерии содержатся в материале, который часто загрязнен другими микробами (гной, мокрота, молоко, каловые массы). При исследовании такого материала применяют особые методы, при которых кислотоустойчивые бактерии окрашиваются иначе, чем остальная микрофлора. Наиболее часто применяют окраску по Циль-Нильсену.

Метод Циль-Нельсена.

1. Материал (культуру бактерий, творожистые комочки из мокроты и др.) наносят на предметное стекло, ближе к одному из его краев. Накрывают другим предметным стеклом так, чтобы у обоих стекол остались свободными противоположные концы, и, плотно прижимая стекла к друг другу, раздвигают их в разные стороны. При этом получают мазки на обоих стеклах.

2. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют.

3. Окрашивают карболовым фуксином при подогревании до отхождения паров 5 минут. (Удобно накладывать на мазок заранее пропитанную фуксином и высушенную полоску фильтровальной бумаги, предварительно нанеся на мазок 2-3 капли воды.) 4. Обесцвечивают препарат 5%-ной серной кислотой до желтоватого оттенка мазка 3-5 секунд.

5. Тщательно промывают водой.

6. Ополаскивают 96О этиловым спиртом и снова промывают водой.

7. Докрашивают мазок метиленовой синькой 3-5 минут.

8. Промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: кислотоустойчивые палочки рубиновокрасные, остальная микрофлора имеет синюю окраску.

Способом Циль-Нильсена можно окрашивать и споры бактерий. При этом споры окрашиваются в красный, а вегетативные формы в синий цвет.

Окраска капсул.

Некоторые виды бактерий способны образовывать вокруг своего тела капсулы – слизистые чехлы, по своим размерам иногда превышающие величину самой бактерийной клетки. Капсула является видоизмененной оболочкой, ослизненной и разбухшей. Химическое строение капсул у разных видов бактерий различно: у одних она состоит из комплекса белков, у других (чаще всего) в капсуле преобладают полисахариды. Капсула дает реакцию на муцин и окрашивается неодинаково с цитоплазмой клетки.

У патогенных бактерий капсула является одним из факторов агрессии микробной клетки, она как бы охраняет бактерию от воздействия защитных приборов организма. Патогенные бактерии образуют капсулы только в организме животного и иногда на искусственных питательных средах, к которым добавлена кровь или сыворотка крови. К капсулообразующим патогенным микробам относятся сибиреязвенная палочка – Bac.anthracis, ланцетовидный диплококк Diplococcus lanceolatus – и некоторые другие виды бактерий.

Для изучения капсул делают мазки из селезенки и крови мыши, павшей от сибирской язвы. Павшее животное вскрывают, с соблюдением всех правил асептики и личной профилактики, отрезают небольшой кусочек селезенки, захватывают его пинцетом и только что отрезанной поверхностью кусочка легко проводят по предметному стеклу. Лучше делать ряд отпечатков, касаясь стекла кусочками органа.

Мазки высушивают на воздухе (беречь от мух!) и фиксируют в смеси (1:1) спирта с эфиром.

Если мазки делают из крови животного, то насасывают кровь пастеровской пипеткой из сердца и наносят каплю крови на предметное стекло, ближе к одному из их краев. Затем к капле крови подводят под углом 45 О покровное или предметное стекло с отшлифованным краем. В силу капиллярности кровь тотчас же растекается по краю стекла. После этого стекло быстро и равномерно передвигают так, чтобы капля непрерывно тянулась за его краем, располагалась тонким слоем по предметному стеклу. Получается ровный, тонкий мазок. После того как мазок высохнет, его фиксируют в 96%-ном спирте 15 минут.

Существует несколько методов окраски капсул.

Метод Михина.

1. На мазок действуют метиленовой синькой при подогревании до отхождения паров 2-3 минуты.

2. Краску быстро смывают сильной струёй воды, мазок высушивают.

Микроскопическая картина: тела бактерий синие, капсулы розовые.

Метод Бурцева.

1. На мазок действуют карболовым фуксином, вдвое разведенным дистиллированной водой, 5 минут.

2. Краску смывают водой.

3. Мазок ополаскивают 60О спиртом, подкисленным уксусной кислотой.

4. Промывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: на кирпично-красном фоне видны палочки красного цвета с розовой капсулой.

Метод Бурцева применяют для окраски сибиреязвенных палочек.

1. На мазок наливают свежеприготовленный 2-3%-ный раствор сафранина (растворить в горячей воде!). Красят при легком подогревании 1-3 минуты.

2. Промывают водой.

3. Не высушивая мазка, накладывают на него покровное стекло (следят за тем чтобы между покровным и предметным стеклами была вода, сверху покровное стекло должно быть совершенно сухим). Исследуют под иммерсионным объективом микроскопа.

Микроскопическая картина: тела бактерий красные, капсулы желтые.

1.Каплю исследуемого материала смешивают с каплей туши на краю предметного стекла и, пользуясь шлифованным стеклом, изготовляют тонкий мазок по типу мазков крови.

2. Мазок фиксируют на пламени и окрашивают водным раствором фуксина или сафранина.

Микроскопическая картина: на черном фоне резко выделяются окрашенные в красный цвет бактерии, окруженные бесцветными капсулами.

Исследование микробов в живом состоянии Подвижность является одним из важных диагностических признаков и всегда упоминается при характеристике вида микробов. Для определения подвижности необходимо исследовать под микроскопом живых бактерий.

Подвижность лучше выражена в молодых (18-24 часа роста) бульонных культурах; в старых культурах и культурах с плотных питательных сред подвижность может быть выражена слабо или отсутствовать совсем.

Подвижность микробов исследуется методом висячей и раздавленной капли.

Метод висячей капли.

1. Берут предметное стекло с лункой и вокруг лунки наносят тонкий слой вазелина.

2. На чистое обезжиренное покровное стекло помещают небольшую каплю культуры. Если исследуют культуру бактерий с плотной питательной среды, то её предварительно эмульгируют в физиологическом растворе на стерильном часовом стекле.

3. Предметное стекло берут лункой вниз, плотно прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в середине лунки и быстро переворачивают.

Капля должна свободно свисать, но не соприкасаться с дном и краями лунки.

4. Под малым увеличением микроскопа в затемненном поле зрения при суженной диафрагме и опущенном конденсоре отыскивают край капли.

5. Стекло фиксируют зажимами и каплю исследуют под сильным объективом сухой или иммерсионной системы микроскопа.

При такой методике создаётся влажная герметически закрытая камера.

Капля долго не высыхает, и бактерии сохраняют в ней свою подвижность.

Метод раздавленной капли.

На середину предметного стекла наносят каплю исследуемой культуры и осторожно накрывают её покровным стеклом так, чтобы не образовалось пузырьков воздуха. Исследуют в затемненном поле зрения.

Активно движущиеся бактерии проплывают через всё поле зрения, перегоняют друг друга, меняют направление, совершают вращательные и круговые движения. Если каплю нагреть или остудить, то активное движение прекращается.

Активное движение бактерий необходимо отличать от молекулярного броуновского движения, а также от механического или пассивного движения.

При броуновском движении бактерии как бы качаются или беспорядочно толкаются на одном месте. Броуновское движение наблюдается и в убитой культуре бактерий.

Пассивное или механическое движение можно увидеть в высыхающей капле, когда в ней возникают токи жидкости, увлекающие микробов.

Прижизненная окраска микробов. Живые микробные клетки можно окрасить, применяя сильно разведенные растворы красок. Наиболее распространенные методы окраски следующие.

1. К 1мл насыщенного водного раствора нейтральрота добавляют 100 мл физиологического раствора поваренной соли. Одну каплю, таким образом приготовленной краски, на предметном стекле смешивают с одной каплей культуры, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.

Микробы постепенно окрашиваются в розовый цвет.

2. Предметное стекло смачивают кипящим насыщенным раствором синьки, дают краске высохнуть, после чего протирают стекло чистой салфеткой до светло-голубого цвета. Если на такое стекло нанести каплю культуры, то микробы постепенно окрашиваются в голубой цвет.

Вопросы для самопроверки:

1. Чем характеризуется простое окрашивание микроорганизмов?

2. Чем характеризуется сложное окрашивание микроорганизмов?

3. Методы окрашивания мазков.

4. Способы окрашивания спор.

5. Способы окрашивания жгутиков.

6. Исследование микробов в живом состоянии (метод висячей капли, метод раздавленной капли).

7. Прижизненная окраска микробов.

17.5.2.2 ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ И ЕЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯ Выделение чистой культуры и ее идентификация требует наличия необходимых для этого питательных сред. Для того чтобы патогенные микробы росли и размножались вне организма им создают условия близкие к естественным.

17.5.2.2.1.1 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ дать слушателям общие сведения о питательных средах Цель занятия:

Питательные среды применяют для выращивания микробов, выделения их в чистой культуре, изучения ряда свойств микробов и длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур. Бактериологическая диагностика инфекционных заболеваний и производство бактерийных препаратов часто зависят от полноценности состава примененных питательных сред: это касается прежде всего содержания в питательной среде пластического материала для построения тела микробных клеток, а также источников энергии.

Для построения белков клетки требуется азот, углерод, водород, кислород.

Снабжение водородом и кислородом осуществляется за счет воды. Источники углерода многочисленны и многообразны. На первом месте стоят сахара, многоатомные спирты и кислоты. Углерод является также составной частью всех органических соединений, в том числе белков, пептонов, аминокислот. Поэтому в составе питательных сред специальные источники углерода не нужны.

Основное внимание следует уделить источникам азота. Все искусственные питательные среды, как самостоятельно изготовляемые в лабораториях, так и выпускаемые централизованно (сухие питательные среды), имеют в своей основе вещества, содержащие азот. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного происхождения - мясо (преимущественно говяжье), рыба, мясо-костная мука, казеин. С таким же успехом применяют для этой цели заменители полноценного мяса - плаценту, кровяные сгустки, а также дрожжи; можно использовать и белки растительного происхождения (соевые бобы, горох, ячмень и т. п.).

Так как бактериальная клетка усваивает лишь растворимые продукты, то для ее жизнедеятельности необходима вода как основной растворитель питательных веществ; количество воды в бактериальных клетках относительно постоянно (75 - 90% от влажной массы).

Микробам для нормального развития нужны минимальные количества некоторых металлов (железо, медь, марганец и др.). Эти микроэлементы участвуют в образовании коферментов, посредством которых такие сложные вещества, как белки, жиры и полисахариды, подвергаются гидролизу до более простых и растворимых в воде соединений. Например, крахмал гидролизуется до мальтозы, белки - до аминокислот, жиры - до глицерина и жирных кислот. Такие низкомолекулярные продукты гидролиза растворимы в воде и уже в водорастворимом состоянии ассимилируются микробами. Так как все микробные клетки состоят из сложного комплекса не только органических, но и минеральных соединений, для построения цитоплазмы, а также для создания необходимых для жизни микробных клеток физико-химических условий питательные среды должны содержать и неорганические вещества - соединения хлора, фосфора, натрия, калия, кальция, магния и некоторых других.

Кроме основных компонентов питательной среды (пластических, энергетических, зольных), для нормального развития микробов, особенно патогенных, необходимы еще добавочные вещества, которые носят название «факторов роста». Они имеют для микробов то же значение, что витамины для высших организмов. Ростовые вещества, которыми в основном являются витамины группы В, играют важную роль регуляторов и стимуляторов обмена веществ у микробов, главным образом для построения активных групп ферментов. Отсутствие их ведет к нарушению обмена и прекращению роста.

Мясо-пептонные среды, а также гидролизаты мяса, казеина и ряд других основных сред содержат в большинстве случаев достаточное количество факторов роста. В качестве примесей последние имеются также в агаре.

Кроме того, большинство микробов способно самостоятельно синтезировать необходимые им факторы роста. Для тех же микроорганизмов, которые не обладают такой способностью, необходимо вносить в питательную среду готовые факторы роста, например дрожжевой лизат, никотиновую кислоту и др. У различных видов микробов потребность в факторах роста различна. Вместе с тем не все ростовые вещества имеют одинаковое значение. Некоторые нужны лишь ограниченному числу микроорганизмов, другие являются более универсальными. К числу последних относятся никотиновая кислота, которая содержится в мясных экстрактах, тиамин (витамин B1), рибофлавин (витамин В2) и другие витамины комплекса В. Для роста некоторых видов микробов в питательные среды необходимо добавлять углеводы, нативные белки (кровь, сыворотку).

Синтетическими питательными средами называются такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. В них в качестве источника азота обычно используют различные аминокислоты. Преимущество синтетических питательных сред состоит в том, что они воспроизводимы, так как имеют постоянный состав.

Различные потребности микробов отдельных видов обусловливают большое разнообразие питательных сред. Для многих видов бактерий существуют специальные среды, так как химический состав микробной клетки в основном зависит от того субстрата, на котором она размножается и растет.

Реакция среды. Для роста разных видов микробов требуется определенная реакция среды, которая выражается показателем концентрации водородных ионов (рН). При кислой реакции концентрация водородных (Н) ионов больше концентрации гидроксильных (ОН) ионов, при щелочной реакции - наоборот, при нейтральной - количество тех и других равно. Для большинства бактерий рН среды устанавливают в пределах 6,8 - 8,0. Реакция питательных сред определяется двумя методами: колориметрическим и электрометрическим (рН-метрия).

Колориметрическим способом реакцию определяют с помощью шкалы Михаэлиса, представляющей собой стандартный набор пробирок с окрашенными жидкостями соответственно разным величинам рН и компаратора Уолпола. По этому способу в качестве индикатора рН среды в пределах 6,8 - 8,4 применяют 0,3% водный раствор метанитрофенола (одного из индикаторов Кларка).

Методика определения рН. Сначала ориентировочно определяют реакцию среды бумажкой, пропитанной раствором одного из индикаторов, меняющих свой цвет в пределах указанного рН. Очень удобен индикатор крезоловый красный'. Цвет этой бумажки желтый. В кислой среде бумажка светлеет и принимает лимонный оттенок. При слабощелочной реакции (рН 7,1 - 7,2) начинают розоветь только края бумажки, а при рН 7,4 - 7,5 она розовеет вся. По мере увеличения щелочности среды (начиная с рН 7,6) индикаторная бумажка приобретает малиновый цвет, при дальнейшем повышении рН появляется характерный фиолетовый оттенок. По степени интенсивности этого оттенка можно судить о степени щелочности среды.

К питательной среде прибавляют небольшими порциями щелочь до тех пор, пока бумажка не покажет слабощелочной реакции (розовый оттенок); когда грубо установлена слабощелочная реакция среды по бумажке, можно приступить к точному определению рН по компаратору. Все пробирки в компараторе по диаметру и цвету стекла не должны отличаться от стандартных пробирок с растворами метанитрофенола. Для подщелачивания среды пользуются 2% раствором едкого натра; можно подщелачивать также насыщенным раствором карбоната натрия. Подкисление производят 20% раствором хлористоводородной кислоты. Щелочь и кислоту приливают осторожно. После установления нужной реакции среду обязательно следует прокипятить. Необходима проверка окончательного рН среды после стерилизации.

Для определения реакции среды электрометрическим способом пользуются потенциометром. Описание этого метода имеется в инструкции, приложенной к прибору. Преимущество метода состоит в том, что он лишен субъективности оценки; рН-метрия используется при определении и установлении рН в жидких питательных средах и буферных растворах.

Для успешного роста микробов недостаточно правильно установить первоначальную реакцию питательной среды. Микробы в процессе роста образуют ряд кислот, что делает реакцию среды кислой и является основной причиной прекращения роста. Во избежание этого необходимо создать условия, препятствующие резкому изменению реакции среды. Отчасти эту роль выполняют как было указано выше, азотистые вещества, имеющиеся в среде. Чем больше аминокислот в субстрате, тем большими буферными свойствами обладает среда. В настоящее время ко многим питательным средам прибавляют еще фосфатные буферные смеси.

Индикаторы. Индикаторы, меняющие свой цвет при изменении рН среды, используют не только для определения реакции среды. Их вводят также в состав специальных сред, которые служат для выявления биохимических свойств микробов. Изменение цвета среды указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной деятельности микробов. Известны индикаторы, приобретающие ту или иную окраску лишь при щелочной или кислой реакции; вне этой реакции они бесцветны. Таковы, например, индикаторы, приведенные в таблице 16.

Таблица 16 - Изменение окраски индикаторов в зависимости от рН Более удобны двухцветные индикаторы, имеющие разную окраску в кислой и щелочной среде. Лакмусовая настойка, например, при кислой реакции приобретает розовую окраску, при щелочной - синюю. Часто применяют розоловую кислоту, которая в кислой среде до рН 6,2 - 6,5 - имеет желтую окраску, а начиная от рН 6,5 приобретает бледно-розовый цвет, переходящий в интенсивно-розовый при щелочной реакции (начиная от рН 7,2). Наиболее широко распространены индикаторы Кларка. Они имеют различную окраску в кислой и щелочной среде, а также хорошо выраженные переходные тона. Кроме того, диапазон чувствительности этих индикаторов весьма широк.

Способы приготовления различных индикаторов.

Розоловая кислота. Этот индикатор применяют в виде спиртово-водного раствора: 0,1 г розоловой кислоты растворяют в 10 мл чистого спирта, а затем добавляют 70 мл дистиллированной воды.

Индикатор Андреде: кислого фуксина 1 г, дистиллированной воды см, раствора едкого натра 64 см3. После приготовления сутки выдерживают в термостате, 2 сут на свету. Сохраняют в темной бутыли. В кислой среде краснеет.

Индикаторы Кларка (таблица 17). Готовят в виде спиртовых и водных растворов. Спиртовые растворы (1,6 %) используют при приготовлении специальных питательных сред. Для определения реакции применяют водные растворы, так как они более чувствительны, чем спиртовые. Для приготовления водного раствора 0,1 г индикатора в порошке перетирают в агатовой ступке с 1/20 N раствором едкого натра. Разные индикаторы растворяют в разных количествах едкого натра: для фенолового красного требуется 5,7 см3, для метилового красного - 7,4 см3, для крезолового красного - 5,3 см3, для бром крезолового красного - 3,7 см3, для бромтимолового синего - 3,2 см3, для тимолового синего - 4,3 см3.

После растворения добавляют воды до 25 см3 и получают 0,4% основные растворы, которые хранят впрок. Для определения реакции основные растворы разводят дистиллированной водой соответственно концентрации рабочего раствора (0,04 - 0,02% и т. д.).

Предложен ряд комбинированных индикаторов, которые удобны в тех случаях, когда оттенки перехода от одного цвета к другому при изменении рН в определенных границах у одного индикатора недостаточно отчетливы. В сухих питательных средах применяют индикатор ВР - смесь водного голубого и розоловой кислоты. В кислой среде он имеет синюю окраску, в щелочной - красную, при нейтральной реакции - бесцветен. Индикатор действует в пределах рН 4,5 Е. Д. Равич-Биргер и В. Н. Мешалова предложили следующую комбинацию индикаторов: 100 мл раствора Андреде +0,4 г тимолового синего. Этот комбинированный индикатор характеризуется оранжевым цветом в кислой среде (не ниже рН 3,0), желтым - в нейтральной и слабощелочной, фиолетовым - в щелочной среде.

Таблица 17 - Наиболее распространенные индикаторы Кларка БромСиний вый Лимонно-желтый фио- От слабо-фиолетового до интенсивно-фиолетового 6,0-9 0, Универсальный индикатор (Государственного Шосткинского завода химических реактивов) представляет собой смесь нескольких индикаторов и имеет розово-красную окраску при рН 2,0, оранжевую - при рН 3,0 - 4,0, желтую - при рН 5,3 - 6,7, зеленую - при рН 6,9 - 8,0, синюю - при рН 9,0 и выше. Диапазон чувствительности этого индикатора очень широкий - от рН 2,0 до рН 9,0, но точность невелика (около 1,5 - 2,0 единиц рН). Поэтому его используют лишь для ориентировочного определения. Способ приготовления указан на этикетке.

Фильтрование сред. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, предварительно смоченный водой, или через фильтровальное полотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полотняные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны для употребления в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократно. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды. Предварительная обработка нового фильтровального полотна: новое полотно кипятят 30 мин в воде с прибавлением небольшого количества едкого натра для смягчения полотна; промывают тщательно теплой водой и затем кипятят 15 мин в дистиллированной воде. После употребления полотно промывают водой и кипятят.

Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруют через ватно-марлевый фильтр, который готовят следующим образом: стеклянную воронку покрывают марлевой салфеткой такой величины, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим. Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный горячей дистиллированной водой. Желательно фильтрацию производить быстро в теплом помещении.

Розлив сред. Разливку сред производят в посуду, предварительно тщательно вымытую и высушенную. Посуда должна быть стерильной, если налитые в нее среды стерилизуют текучим паром или при давлении не более 0,5 атм. Если же последующую стерилизацию сред в посуде проводят под давлением не менее 1 атм (сверх воздушной), то предварительная стерилизация необязательна.

Для разливки питательных сред в пробирки пользуются воронкой или бюреткой, на нижний конец которой надета короткая резиновая трубка с маленьким стеклянным наконечником. На резиновую трубку накладывают зажим Мора. При разливке во флаконы можно пользоваться мерными цилиндрами или лучше мерными стаканами. При разливке необходимо тщательно следить, чтобы края пробирок или горлышки флаконов не были смочены питательной средой, в противном случае ватная пробка присохнет к стеклу и, смоченная бульоном, может прорасти микроорганизмами.

Среды разливают в пробирки по 5 - 10 см3 и во флаконы по 50 - 100 - 200 см3.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие основные компоненты должны содержать питательные среды?

2. Какие среды называют синтетическими?

3. Оптимум кислотно-щелочной реакции питательной среды.

4. Какие индикаторы используют при установлении кислотно-щелочной реакции?

5. Как проводят фильтрацию и разливку питательных сред?

17.5.2.2.1.2 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ МИКРОБОВ ознакомить слушателей с питательными средами для микроЦель занятия:

Белковой основой всех сред является питательный бульон; в зависимости от состава среды остальные ингредиенты добавляют к питательному бульону.

Существует два способа приготовления основного питательного бульона: 1) на мясной воде с добавлением готового пептона, который представляет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свертывающихся при нагревании (альбумозы, пептоны, пептиды, незначительное количество аминокислот), это так называемый мясо-пептонный бульон; 2) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина - бульон Хоттингера, пепсина бульон Мартена) или кислот; среды этой группы богаче аминокислотами.

От азотистого состава мясо-пептонных сред и от степени расщепления белка в мясных и прочих гидролизатах зависит содержание в среде общего и аминного азота. Отношение количества аминного азота к количеству общего выражает степень расщепления общего азота. Обычно эта величина выражается в процентах. При изготовлении питательных сред необходимо определять количество обшего и аминного азота как основных показателей качества. Количество общего и аминного азота в полуфабрикатах питательных сред показано в таблице 18.

Таблица 18 - Содержание общего и аминного азота в полуфабрикатах Мясной перевар по Хоттингеру 1,1-1,2 0,65-7,0 55- Триптический казеиновый перевар Для хорошего роста большинства микробов необходимо содержание в см бульона не менее 250 - 300 мг общего азота при наличии в этом количестве 25 - 30% аминного азота (аминокислот). Принимая во внимание, что для приготовления питательного бульона полуфабрикаты разводят в несколько раз, необходимо доводить гидролиз основного сырья (мяса, казеина и прочих субстратов) до максимального накопления общего азота.

Вопросы для самопроверки:

1. Что является основой для микробиологических питательных сред?

2. Что показывает отношение общего белка к аминному азоту и в чем оно выражается?

17.5.2.2.1.2.1 ПОЛУФАБРИКАТЫ И ОСНОВНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ

СРЕДЫ ИЗ НИХ

ознакомить слушателей с основными характеристиками Цель занятия:

ингредиентов питательных сред для микроорганизмов Мясная вода. Мясо, очищенное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку и заливают двойным количеством холодной водопроводной воды, т.

е. на 1 кг мяса берут 2 л воды. При желании уменьшить объем мясной воды (для хранения) можно мясо и воду взять в отношении 1:1. Такую концентрированную мясную воду в дальнейшем для приготовления бульона надо развести в 2 раза.

Если мясо низкого качества, то последующего разведения не требуется. Мясную воду вместе с мясом ставят на огонь и кипятят 1 ч. Накипь снимают шумовкой до начала кипения. Настаивание мясной воды с мясом продолжительное время до кипячения не рекомендуется во избежание размножения бактерий. По окончании кипения дают мясной воде немного отстояться, фильтруют через полотно или фильтровальную бумагу, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1 атм (120°С) мин. После стерилизации на стенках и на дне бутыли образуется осадок из свернувшихся белков. Поэтому перед приготовлением бульона мясную воду снова фильтруют. Мясная вода (мясной экстракт) содержит минеральные вещества, углеводы, витамины.

Мясо-пептонный бульон. К мясной воде прибавляют 1 % пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят при помешивании. После растворения пептона устанавливают рН 20 % раствором едкого натра с учетом того, что среда становится после стерилизации более кислой. Например, для получения в готовом бульоне рН 7,5 - 7,6 надо до стерилизации установить рН не ниже 8,0. Если бульон предназначается для приготовления сахарного бульона или плотной среды (агара), следует устанавливать первоначальный рН не ниже 8,2 - 8,4. Для стабилизации рН рекомендуется к бульону добавлять фосфатные буферные смеси. Кипятят бульон на огне 30 - 40 мин в сосуде, закрытом крышкой. Отмечают уровень бульона и при выкипании приливают дистиллированную воду до первоначального объема.

Можно сразу прилить 10% дистиллированной воды на выкипание. После окончательного установления реакции кипятят вторично; последнее кипячение лучше заменить автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин, для чего рекомендуется бульон разлить по бутылям. При этом очень хорошо осаждаются белки, что обеспечивает прозрачность бульона при последующей стерилизации. После кипячения или автоклавирования среду оставляют для отстаивания (до просветления жидкости), после чего осторожно сливают с осадка и фильтруют через полотняный фильтр или через 3 - 4 слоя фильтровальной бумаги. Осадок на фильтр не выливают. Разливать бульон сразу не рекомендуется. После автоклавирования его лучше оставить на некоторый срок в бутылях; за время хранения он хорошо отстаивается. По мере надобности бульон фильтруют, разливают по пробиркам или флаконам и стерилизуют 30 мин под давлением 1 атм. После стерилизации, как и во всех остальных средах необходима проверка окончательного рН.

Фосфатная буферная смесь. Готовят M растворы фосфата калия однозамещенного и фосфата натрия двузамещенного (выветренного) по следующей прописи: KH2PO4 - 9,078 г на 1 л дистиллированной воды и Na2HPO4·2H2O на 1 л дистиллированной воды. Растворы смешивают в определенных объемах в зависимости от рН, который необходимо получить (таблица 19).

Таблица 19 - Приготовление фосфатной буферной смеси Соотношение Триптические перевары. Приготовление бульона из переваров по Хоттингеру является более экономичным, чем применение мясо-пептонных сред; из одного и того же количества мяса получают в 5 - 10 раз больше бульона. Кроме того, для переваривания можно использовать заменители мяса. Наконец, присутствие в переварах значительного количества аминокислот создает буферность, а следовательно, и большую стабильность рН-среды.

Перевар по Хоттингеру. Мясо (1 кг), очищенное от жира и сухожилий, нарезают кусками примерно 1 - 2 см и опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей водопроводной воды; кипятят 15 - 20 мин, пока мясо не станет серым, что указывает на то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и пропускают через мясорубку.

Устанавливают в жидкости рН 8,0. Опускают фарш в жидкость и охлаждают до 40°С в открытой кастрюле, затем добавляют поджелудочную железу (очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку) в количестве 10% к взятой жидкости (на 1 л жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5% и выше в зависимости от его активности. Хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают смесь до рН 7,8 - 8 и повторяют такое подщелачивание через 30 мин. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления указывает на недоброкачественность фермента. После установления рН смесь переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы 1/3 бутыли оставалась свободной. Добавляют 1 - 3% хлороформа - 10 - мл на 1 л жидкости (в холодное время года меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают так, чтобы хлороформ перемещался от дна бутыли к пробке и обратно, после чего на минуту вынимают пробку для освобождения от избытка паров хлороформа. Через 1 - 2 ч после добавления фермента опять проверяют реакцию и устанавливают рН 7,4 - 7,6. При этой реакции оставляют смесь для переваривания на 7 - 10 - 16 дней при комнатной температуре. Первые 3 - 4 дня переваривания ежедневно проверяют и исправляют реакцию. В эти дни также встряхивают перевар не менее 3 раз в сутки. В дальнейшем проверку реакции производить нецелесообразно, а встряхивать можно реже; за 1 - 2 дня до окончания переваривания встряхивания совсем прекращают, чтобы перевар отстоялся.

Конец переваривания характеризуется следующими признаками: 1) на дне бутыли собирается пылевидный осадок; 2) жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет; 3) перевар легко фильтруется; 4) реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3 - 4 см3 фильтрованного перевара, добавляют 3 - 4 капли бромной воды), при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет (сравнивают с контрольной пробиркой, где к перевару не прибавлена бромная вода); 5) гидролизат перевара доведен до содержания в нем 1100 - 1200 мг % общего азота. По окончании гидролиза перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бутыли и стерилизуют 30 мин при 1 атм (120°С) для хранения впрок. Перед употреблением фильтруют.

Перевар из плаценты. Свежую плаценту очищают от оболочек, хорошо промывают водопроводной водой от сгустков крови, нарезают кусочками и заливают полуторным количеством водопроводной воды. Дальше поступают, как при приготовлении перевара из мяса.

Казеиновый перевар. Пищевой кислотный казеин в виде сухого желтоватого порошка является отходом молочной промышленности, характеризуется полноценным составом аминокислот и высокой питательностью. Казеиновый перевар можно готовить двумя способами: ферментативным и кислотным.

При ферментативном способе нагревают водопроводную воду до 45°С, подщелачивают в открытом сосуде до рН 8,2, прибавляют 7 - 10% сухого казеина, высыпая его постепенно при непрерывном помешивании. После прибавления казеина снова устанавливают прежнюю реакцию. Размешивание и подщелачивание производят несколько раз через 30 мин, пока казеин не разбухнет. Тогда добавляют 7 – 10 % фарша из поджелудочной железы или сухой панкреатин в количестве 0,5 % и выше (в зависимости от его активности), хорошо размешивают и снова подщелачивают до прежней реакции. Через 30 мин опять устанавливают реакцию и переливают смесь в бутыль. В дальнейшем поступают так же, как при изготовлении перевара из мяса. Переваривание казеина при комнатной температуре продолжается 16 - 20 дней.

Для приготовления кислотного гидролизата казеин отмывают 0,2% раствором уксусной кислоты в течение 6 - 10 дней (25 см3 80% уксусной кислоты на л воды). В первый день раствор меняют 3 раза, а в последующие 5 - 6 дней по разу в день. Затем казеин промывают дистиллированной водой, хорошо отжимают и высушивают при температуре 60 - 70°С или при комнатной температуре.

Гидролиз сухого казеина проводят под давлением с помощью крепкой хлористоводородной кислоты (химически чистая с отн. плотностью 1,19). Для этого в стеклянной посуде (колба или бутыль вместимостью 2 л) смешивают 400 г казеина, 400 см3 хлористоводородной кислоты и 200 см3 дистиллированной воды.

Бутыль закрывают ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком. Смесь автоклавируют при 127°С в течение 3 - 4 ч. После автоклавирования гидролизат двукратно разводят в дистиллированной воде и фильтруют через ткань или бумагу. Затем объем фильтрата доводят дистиллированной водой до 3 л и осветляют активированным углем. Для этого добавляют 50 г угля на 1 л фильтрата.

Смесь кипятят в течение 10 мин и пропускают через бумажный фильтр. Из указанного количества казеина получается примерно 3 л гидролизата, который представляет собой прозрачную жидкость слегка желтоватого цвета. После фильтрации в готовом гидролизате определяют количество аминного азота. Гидролизат можно хранить при комнатной температуре под хлороформом (0,5%) в течение нескольких месяцев. Высокая кислотность гидролизата позволяет хранить его и без хлороформа.

Перевар из кровяных сгустков. Среды из кровяных сгустков характеризуются высокой питательностью и значительной буферностью. Кровяные сгустки промывают на решетке водой и дают воде стечь. Сгустки взвешивают. Наливают в кастрюлю тройное по массе сгустков количество водопроводной воды и доводят ее до кипения. В кипящую воду постепенно опускают сгустки и кипятят 20 мин до просветления жидкости; образующуюся пену снимают шумовкой. После кипячения сгустки вынимают из жидкости и нарезают ножом на мелкие кусочки. Заливают в открытом сосуде отваром из расчета на 1 кг сгустков 3 л отвара, подщелачивают до рН 8,0 - 8,2. Выкипевшее количество жидкости доливают дистиллированной водой. Смесь охлаждают до 37 - 40°С. В дальнейшем поступают, как указано для мясного перевара.

Среды из трипсиновых переваров, особенно из казеина, обладают достаточной буферностью, и реакцию после стерилизации не меняют.

Бульон из перевара. Для приготовления бульона сле дует развести фильтрованный трипсиновый перевар любого субстрата дистиллированной водой в зависимости от количественного содержания в нем общего азота. Добавляют к смеси 0,5% хлорида натрия. Реакцию устанавливают такую, какая необходима в готовом бульоне. В остальном поступают, как указано для мясо-пептонного бульона, за исключением того, что кипячение на голом огне не следует заменять автоклавированием.

Пищевые или кормовые дрожжи находят широкое применение при изготовлении питательных сред либо в качестве основного полуфабриката для плотных агаровых сред, Либо как комплекс витаминов В в качестве биостимулятора к средам различного состава для повышения роста некоторых микроорганизмов, требовательных к наличию этих витаминов.

Дрожжевой аутолизат используют для приготовления основного питательного субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40 - 60% азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствующих их самоперевариванию. При аутолизе дрожжей образуются продукты, характерные для триптического переваривания животных белков. Дрожжевые среды обеспечивают пышный рост, несмотря на низкое содержание общего азота и слабую степень его расщепления.

Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы аутолизат занимал около '/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей в 20-литровую бутыль). Бутыль с дрожжами ставят на 2 сут в термостат при температуре около 60°С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равномерного прогревания содержимого (1 - 2 раза в сутки). Конец аутолиза характеризуется полным разжижением дрожжей. Аутолизат должен иметь коричневый оттенок и приятный запах.

Качество аутолизата ухудшается, если процесс протекает при температуре ниже 58°С. По окончании аутолиза добавляют в бутыль тройное (по исходной массе дрожжей) количество теплой водопроводной воды (на 4 кг дрожжей 16 л воды). Разведенный аутолизат помещают в автоклав для стерилизации при 1 - 1, атм. (120 - 123°С) на 30 мин. Оставляют на несколько дней (не меньше 5 - 7) для отстаивания.

Экстракт дрожжей. Прессованные хлебные дрожжи, лучше кормовые, в количестве 1 кг размельчают и размешивают в 825 см3 дистиллированной воды.

Взвесь нагревают до 90 - 92°С и сразу же фильтруют через складчатый бумажный фильтр (или центрифугируют). Фильтрат или центрифугат стерилизуют, пропуская через фильтр Зейтца или свечи. Для проверки стерильности 2 - 3 см дрожжевого экстракта засевают в 10 мл мясо-пептонного бульона и выдерживают 3 сут при 20 - 30°С. Дрожжевой экстракт необходимо хранить в холодном месте (5 - 7°С). Сохраняется до 12 мес. Имеется промышленный выпуск сухого витаминного препарата (ЭКД) из кормовых дрожжей.

Диализат дрожжей. Свежие хлебные дрожжи (прессованные) в количестве 1 кг размешивают в 1 л дистиллированной воды до состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок завязывают, обмывают под струей водопроводной воды, а затем дистиллированной водой и погружают в эмалированную посуду (кастрюлю, бак), в которую предварительно наливают 1,3 л дистиллированной воды. Мешок должен быть полностью погружен в жидкость. Диализ ведут 6 ч при 60 - 80°С (за это время количество жидкости в кастрюле должно уменьшиться примерно в 2 раза); затем жидкость из кастрюли переливают в стерильную бутыль.

Для повышения выхода диализа можно повторить диализ этих же дрожжей, для чего мешок с дрожжами заливают второй раз таким же количеством дистиллированной воды, нагретой до 70°С; сосуд, в котором проводят диализ, с целью сохранения тепла накрывают и оставляют на ночь. На следующий день жидкость из кастрюли смешивают с первой порцией, добавляют хлороформ (0,5%) и сохраняют при 5 - 7°С до 3 мес. Мешки можно использовать повторно.

Пептон Мартена и бульон из него. Берут свиные желудки, желательно со слизью (промывать не следует). С желудков снимают жир, пропускают и через мясорубку, взвешивают. Четырехкратное (по массе фарша) количество водопроводной воды нагревают до 50°С. Прибавляют 1 % дымящей хлористоводородной кислоты (отн. плотность 1,19) и этим раствором заливают разложенный по бутылям фарш (на 250 г фарша - 1 л воды и 10 см3 кислоты). Бутыли хорошо встряхивают. Смесь оставляют в стеклянных бутылях для переваривания при - 48°С до тех пор, пока фарш не превратится в порошковидную массу, покрывающую дно бутыли на 1 - 1,5 см, и не даст положительной реакции на триптофан. В среднем переваривание продолжается 48 ч. Действие фермента останавливают нагреванием на водяной бане при 80°С в течение 10 мин либо стерилизацией текучим паром 30 мин под ватно-марлевой пробкой. Для консервирования лучше прибавить 2% хлороформа и хранить на холоду при температуре не выше 10°С. В этих условиях пептон может храниться и без стерилизации.

В готовом пептоне Мартена определяют содержание хлоридов аргентометрическим методом (по Мору). Для этого к 5 см3 раствора (пептона Мартена) добавляют 3 - 5 капель 10% раствора бихромата калия (К2С2О4) и 0,1 Н раствора нитрата серебра (AgNO3) до появления неисчезающего красноватого окрашивания. Исходя из того, что 1 см3 0,1 N раствора AgNO3 соответствует 0,0058 г NaCl, содержание в растворе хлорида натрия вычисляют следующим образом:

если на титрование 2 мл испытуемого перевара израсходовано 3 5 см3 0,1 N раствора AgNO3, то содержание NaCl составит:

Для приготовления бульона Мартена жидкость отсасывают из бутыли сифоном или пипеткой Мора большой емкости. Жидкий пептон нагревают до 80°С, прибавляют 0,1% раствор ледяной уксусной кислоты, кипятят 5 мин при помешивании, устанавливают рН 8,0 - 8,2 прибавлением 20% раствора едкого натра. После установления реакции кипятят 10 мин, затем фильтруют через вату и смешивают в равных частях с мясной водой. Добавляют хлорида натрия с учетом содержания в пептоне хлоридов. После добавления хлорида натрия хлориды должны составлять в готовой среде 0,5%; устанавливают необходимый рН, кипятят 15 мин, фильтруют через полотно или фильтровальную бумагу и разливают в пробирки, колбы или бутыли. Бульон окончательно стерилизуют при 0, атм 30 мин или текучим паром 3 дня по 30 мин.

Вопросы для самопроверки:

1. Характеристика мясных компонентов питательных сред.

2. Характеристика переваров входящих в состав питательных сред.

3. Характеристика дрожжевых компонентов питательных сред.

17.5.2.2.1.2.2 ПЛОТНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Цель занятия:

Питательные свойства плотной среды зависят исключительно от состава питательного бульона, из которого она изготовлена путем добавления агар-агара или желатина. Последние служат как желирующие вещества для создания плотности среды.

К мясо-пептонному бульону или бульону Хоттингера (рН 8,2 - 8,4) добавляют 2 - 2,5% мелко нарезанного агар-агара.

К дрожжевому аутолизату необходимо добавить и 0,5% NaCl. Концентрация агара в большой степени зависит от качества агар-агара. Поэтому при употреблении новой партии агара необходимо проверить его желирующую способность. Если агар влажный, его следует до употребления подсушить.

Кастрюлю с бульоном и агаром ставят на огонь и кипятят до полного растворения агара, постоянно помешивая во избежание пригорания. По окончании кипячения следует восстановить объем среды добавлением горячей дистиллированной воды. Проверяют и, если нужно, исправляют реакцию. При определении реакции в агаре или желатине температура этих сред должна быть не ниже 80°С, так же как и температура воды, прибавляемой в пробирки компаратора. В противном случае агар или желатин очень быстро становятся плотными, что затрудняет определение. После установления реакции агар кипятят. Дают ему отстояться в теплом месте, после чего фильтруют в горячем состоянии через ватномарлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Разливают в посуду, стерилизуют 30 мин при 1 атм.

При изготовлении больших количеств агара (более 10 л) можно пользоваться другим способом его варки: кастрюлю с агар-агаром на любой питательной основе помещают в автоклав под текучий пар (100°С) на 1 ч. Текучим паром можно варить агар также к текучепаровом аппарате. Затем оставляют для медленного и равно мерного отстаивания в теплом месте (можно оставить в автоклаве с потушенной горелкой) на 1 ч, после чего проверяют рН, исправляют его и агар фильтруют.

Можно после отстаивания дать агару застыть и на другой день срезать и удалить нижнюю его часть с осадком. Прозрачный слой измельчают ножом и расплавляют текучим паром при 100°С (1 - 11/2 ч), после чего устанавливают реакцию и фильтруют. Если после расплавления срезанного агара в нем будет заметна муть, дают ему вновь отстояться в теплом месте, после чего осторожно сливают с осадка. Надо избегать подщелачивания готового агара, так как не исключена возможность выпадения осадка после подщелачивания при последующей стерилизации.

Прозрачный и светлый агар получают также путем просветления его яичным белком или кровяной сывороткой. На каждые 1 - 2 л агара, остуженного до 50°С, прибавляют белок одного куриного яйца или 25 - 30 см3 кровяной сыворотки. Яичный белок нужно предварительно хорошо размешать с двойным объемом холодной воды. Употребляют только свежие яйца, в противном случае агар может сделаться еще более мутным. После прибавления белка или сыворотки агар тщательно размешивают и кипятят 10 - 15 мин. Добавленный белок свертывается и адсорбирует взвешенные частицы. Крупнохлопчатый осадок легко отделяется фильтрованием. Фильтрованный агар разливают в посуду, стерилизуют 30 мин при 1 атм. После стерилизации питательный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком, если он приготовлен не для немедленного использования, или скашивают (косой агар) для непосредственного употребления. Для скашивания пробирки с горячим агаром укладывают на покатой поверхности или под верхнюю часть пробирок подкладывают резиновую (стеклянную) трубку. После остывания на агаровой среде собирается конденсационная жидкость, которая сохраняется некоторое время, если среду хранить в прохладном месте.

Рост микробов на влажном агаре лучше, чем на сухом. Последний надо расплавить и дать ему застыть, тогда выделится снова конденсационная вода. Однако многократное кипячение агара и особенно стерилизация снижают его плотность.

Для разливки в чашки Петри пользуются агаром из флаконов или пробирок. Непосредственно перед разливкой агар следует расплавить на водяной бане или текучепаровом аппарате, а затем остудить до 50 - 55°С. Чашки Петри должны быть стерильны. Срок годности чашек со средой до 48 ч. Хранить их следует на холоду.

Вопросы для самопроверки:

1. Что определяет плотность питательной среды?

2. Как осуществляют варку плотной питательной среды?

3. Как производят просветление питательной среды?

4. Методы использования плотной питательной среды?

17.5.2.2.1.2.3 СУХИЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ознакомить слушателей с приготовлением питательЦель занятия:

В последние годы в бактериологии широко пользуются сухими питательными средами. Это избавляет лаборатории от громоздкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сравнимые результаты в разных лабораториях и, наконец, приближает к разрешению вопроса о стандартности питательных сред. Значение сухих сред возрастает в экспедициях и полевых условиях. Сухие питательные среды следует хранить герметически закрытыми и по возможности не на свету, так как препараты гигроскопичны и светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о порче.

Технология приготовления питательных сред из сухих препаратов проста.

Навеску, указанную на этикетке, всыпают в стеклянную колбу или бутыль с холодной дистиллированной водой. Смесь следует хорошо размешать до полного смачивания порошка водой. Затем на водяной бане или лучше в текучепаровом аппарате смесь нагревают до кипения, периодически помешивая. Кипятят до тех пор, пока порошок окончательно не растворится. Растворение на открытом огне возможно, но требует большого внимания, чтобы не допустить пригорания среды. Перед разливкой среду хорошо перемешивают. Выпускаются основные, элективные и дифференциальные сухие среды.

Сухой питательный агар (рН 7,3 - 7,6). К растворенному сухому агару (5 г сухого агара на 100 см3) рекомендуется добавлять в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого аутолизата, мясной воды или неразведенного триптического перевара мяса (около 1/3 растворяющей жидкости). Для выявления валообразования палочки паратифа В, а также расщепления бактерий Зонне на круглые и плоские варианты сухой агар растворяют дистиллированной водой, содержащей триптический перевар, в соотношении 2:1. Если после растворения агар недостаточно прозрачен, его фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по пробиркам или флаконам. Стерилизуют 20 мин при 1 атм.

Сухой питательный агар Д имеет в своем составе дрожжевой экстракт в качестве фактора роста. Прибавления дополнительных факторов роста не требуется. Способ приготовления не отличается от описанного для предыдущей среды.

Вопросы для самопроверки:

1.Технология приготовления питательных сред из сухих препаратов.

2. Какие существуют сухие препараты для питательных сред?

17.5.2.2.1.2.4 СРЕДЫ ДЛЯ БАКТЕРИЙ КИШЕЧНОЙ ГРУППЫ ознакомить слушателей с питаельными средами для микробов Цель занятия: