«Н.П.ИВАНОВ доктор ветеринарных наук, профессор, академик НАН РК К.А.ТУРГЕНБАЕВ доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. КОЖАЕВ кандидат ветеринарных наук ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ЖИВОТНЫХ Том 1 Общая эпизоотология Алматы, ...»

Трупы таких животных утилизируют путем сжигания (при сибирской язве), обеззараживая в биотермических ямах с соблюдением установленных мер профилактики, или направляют на утилизационные заводы. Материал от трупов животных, павших внезапно от неизвестных причин, с неясной клинической картиной и при подозрении на сибирскую язву исследуют перед вскрытием бактериологически.

Трупы животных, павших от других (не зооантропонозов) болезней, перерабатывают на ветеринарно-санитарных утилизационных заводах, сжигают, обеззараживают в биотермических ямах или зарывают на скотомогильниках.

Вскрывают трупы при дневном свете в специальных помещениях (комнатах) или на специальных площадках возле биотермических ям или других утилизационных установках где их потом утилизируют. Пол в таких помещениях делают бетонированным. Обязательно должны быть закрываемый люк для сброса частей расчлененного трупа, дезинфицирующие растворы (2-3%-ный раствор карболовой кислоты, хлорная известь или 4-10%-ный горячий раствор гидроокиси натрия, хлорамина). Наилучшие условия для вскрытия – в секционных залах ветеринарных институтов, лабораторий, утилизационных заводов. Запрещено вести вскрытие в животноводческих помещениях во избежание возможного разноса возбудителей инфекционных болезней.

Для вскрытия трупов необходимо иметь минимальный набор инструментов (анатомический набор). Необходимо строго соблюдать меры личной гигиены и техники безопасности. Для этого вскрывающий надевает специальную одежду:

халат темного цвета, резиновые перчатки по размеру кисти рук, полотняную шапочку или косынку, защитные очки.

Перед работой руки смазывают вазелином или жиром, подногтевые пространства и ссадины обрабатывают спиртовой настойкой йода. При вскрытии соблюдают осторожность: не разбрасывают органы и их части, не разбрызгивают кровь и другие жидкости, не допускают к трупу посторонних лиц и животных. После вскрытия руки моют водой, дезинфицируют 2-3%-ным раствором карболовой кислоты, обмывают теплой водой и обрабатывают 3-4%-*ным раствором креолина, хлорамина. Трупы утилизируют согласно установленным правилам. Помещение или площадку после вскрытия моют водой и дезинфицируют 3-4%-ным раствором едкого натрия или 20%-ным раствором хлорной извести.

Перед вскрытием ветеринарный работник собирает подробный анамнез (данные истории болезни, опрос обслуживающего персонала). Это позволяет в процессе вскрытия выделить главные изменения, точнее определить болезнь и причины её возникновения.

Труп осматривают, определяют возраст, массу, телосложение, упитанность, трупные изменения, состояние кожи и видимых слизистых оболочек, поверхностных лимфатических узлов, скелетных мышц, костей, суставов. Затем вскрывают брюшную и грудную полости, исследуют извлеченные органы, вскрывают носовую и придаточную полости, шею, череп и позвоночник, извлекают и исследуют головной и спинной мозг.

Наружный осмотр. Начинают его с определения возраста, вида, пола, масти, породы, массы, размеров(длина и высота) тела.

Возраст обычно устанавливают по зубам. Массу определяют ориентировочно, при необходимости труп можно взвесить. Телосложение определяют как крепкое, пропорциональное или слабое, непропорциональное.

При обнаружении отклонений в телосложении отмечают, в чем конкретно состоит (искривление конечностей и др.). Обращают внимание на форму и размер живота (увеличен, подтянут). Упитанность устанавливают, как правило, после снятия кожи по состоянию подкожного жира и скелетных мышц. В случае истощения жир отсутствует, четко выступают ребра, позвоночник, маклоки. В случае ожирения заметное количество жира скапливается под кожей, между мышцами и вокруг почек.

При регистрации изменений обращают внимание на охлаждение, окоченение, разложение, трупные пятна.

При осмотре кожи отмечают состояние волосяного, шерстяного или перьевого покрова: блеск или тусклость, взъерошенность, наличие и характер лишенных волос участков и т.д. Регистрируют цвет, эластичность, целостность кожи, наличие на ней эрозий, язв, рубцов, пустул, афт, кровоизлияний. Исследуют костные образования (рога, когти, копыта), а также гребень, сережки, бородку (у птиц). На них могут быть ссадины, деформации. После внешнего осмотра трупа обращают внимание на естественные отверстия (рот, глаза, анус, клоаку), которые бывают закрыты или открыты.

Устанавливают состояние слизистых оболочек – цвет, блеск, характер повреждений, наложений, выделений (кровянистое, гнойное, нечистое). У самцов осматривают половой член, мошонку, препуций, отмечая изменения.

После внешнего осмотра снимают с трупа кожу, для этого кладут его на спину и разрезают кожу от нижней челюсти по средней линии тела вдоль трахеи, грудной кости, по белой линии до препуция и вымени. Дальше кожу разрезают, обходя названные органы, затем разрез снова соединяется и заканчивается у основания хвоста, анус и наружные половые органы самки обходят. От продольного разреза в области груди и паха кожу разрезают с внутренней стороны передних и задних конечностей и заканчивают разрезом вокруг плюсневых пястных костей. Снимают кожу с головы, отделяя круговыми разрезами от губ, глаз, основания рогов; хрящ ушной раковины отрезают и оставляют вместе с кожей. Затем последовательно снимают кожу с шеи, груди и остальных частей туловища.

Хвост отрезают в области 3 – 4-го хвостового позвонка, оставляя его также вместе с кожей.

При осмотре наружных лимфатических узлов (подчелюстных, заглоточных, поверхностных шейных, паховых), отмечают их величину, консистенцию, цвет, степень кровенаполнения, состояние окружающей ткани. Обращают внимание на величину, форму, цвет, консистенцию молочной железы, строении её на разрезе, характер вытекающей жидкости, состояние сосков.

Исследуя скелетные мышцы, отмечают степень их развития (атрофию, гипертрофию), цвет, консистенцию, рисунок волокон на продольном разрезе, состояние межмышечной соединительной ткани. Одновременно определяют состояние сухожилий и сухожильных влагалищ – прочность, цвет. Отмечают целостность, величину, консистенцию (твердая, мягкая) костей, вид надкостницы, костной ткани, костного мозга, а также форму суставов, состояние их капсулы, характер содержимого суставной сумки.

Внутренний осмотр. Перед вскрытием полостей и извлечением органов трупу придают соответствующее положение. Крупных животных вскрывают в боковом левом (крупный рогатый скот) или правом (лошади) положении, мелких животных (свиней, собак и др.) – в спинном положении.

Труп крупного рогатого скота кладут на левый бок. Удаляют переднюю и заднюю правые конечности, разрезая мышцы, связки, сосуды. Вскрывают брюшную полость, делая продольный разрез от мечевидного хряща грудной кости до лонного сращения и два поперечных разреза по краю правого подреберья от мечевидного отростка до поперечных отростков поясничных позвонков.

В брюшной полости определяют положение органов, количество и характер содержимого, запах, цвет (в жидкости), отмечают состояние брюшины, сальника, брыжейки, положение диафрагмы.

Вскрывают и просматривают грудную полость. Для этого разрезают диафрагму в месте соединения ее с ребрами и удаляют правую грудную стенку, рассекая хрящи, соединяющие ребра с грудной костью и перепиливая ребра на 5см выше позвоночника. В грудной полости обращают внимание на положение органов, характер содержимого, состояние серозной оболочки. В полости сердечной сумки исследуют ее содержимое, положение в ней сердца, вид серозной оболочки.

Далее приступают к извлечению органов. Сначала удаляют сальник, приподнимая его за задний свободный край и отсекая по ходу двенадцатиперстной кишки, большей кривизны сычуга, книжки и правой борозды рубца. Потом извлекают желудок вместе с селезенкой (последняя соединена с рубцом), для чего предварительно накладывают лигатуры на пищевод и двенадцатиперстную кишку.

Кишечник вынимают вместе с брыжейкой и брыжеечными лимфоузлами, предварительно наложив по лигатуры на двенадцатиперстную и прямую кишки.

Матку, мочевой пузырь, а также наружные половые органы самцов удаляют, перерезав ткани, соединяющие их с костями таза. Печень отделяют вместе с частью двенадцатиперстной кишки и поджелудочной железой, пересекая связки в местах соединения с диафрагмой. Почки извлекают вместе с надпочечниками и мочеточниками, циркулярно разрезая брюшину и забрюшинную клетчатку.

Органы ротовой полости, шеи и грудной полости удаляют в комплексе, начиная с языка. Для этого разрезают все мышцы в подчелюстном пространстве с той и другой стороны, затем все ткани вокруг глотки, гортани, трахеи и пищевода у входа в грудную полость отпрепаровывают и, подтягивая на себя, подрезают ткани у позвоночника.

Легкие отсоединяют от других органов, перерезая бронхи в области бифуркации. Голову отделяют в месте соединения ее с атлантом, перерезая капсулы суставов, связки, продолговатый мозг.

Труп лошади кладут на правый бок. Отделяют грудную и тазовую левые конечности. Продольно (по белой линии) разрезают брюшную стенку, ведут разрез от мечевидного хряща по краю костной дуги к паху вдоль поперечных отростков позвонков; левую брюшную стенку отрезают. Обращают внимание на положение органов в брюшной полости, диафрагмы (в норме – на уровне 7-го ребра), характер содержимого, состояние брюшины, серозной оболочки кишечника, брыжейки.

Грудную полость вскрывают также, как и у крупного рогатого скота, отмечая положение органов, содержимое, состояние костальной плевры. Извлекают органы брюшной полости, начиная с кишечника. Большую ободочную кишку со слепой отклоняют на правую сторону, а малую ободочную – на левую. Сначала удаляю тонкий кишечник, отделяя его от брыжейки и подвздошную кишку, отрезая её у места впадения в слепую кишку. Затем извлекают малую ободочную кишку, наложив на оба конца лигатуры. Большую ободочную кишку оттягивают от позвоночника, перерезают брыжейку и удаляют вместе со слепой, при этом соблюдают осторожность, чтобы не повредить поджелудочную железу и другие органы. Прямую кишку извлекают вместе с органами тазовой полости, почки с надпочечниками, затем желудок, печень. Органы ротовой полости, шеи, груди вынимают в комплексе, как у крупного рогатого скота.

При вскрытии полостей черепа, носа и позвоночного канала сначала снимают кожу с головы и срезают височные мышцы. Делают один поперечный и два боковых распила. У рогатого скота поперечный распил делают на уровне верхнего края глазных отростков, у лошади – на 1,5 – 2 см позади них, а у свиней на 2 см впереди глазных отростков. Боковые распилы начинают от затылочной кости и ведут до краёв поперечного распила.

Черепная крышка становится несколько подвижной и с помощью долота легко открывается. Осматривают внутреннюю поверхность черепной крышки, твердую мозговую оболочку (снаружи), отрезают и исследуют её внутреннюю поверхность, а также мягкую мозговую оболочку и полушария мозга. С помощью указательного и среднего пальцев левой руки и ручки скальпеля отводят лобные доли мозга, а вместе с ними обонятельные луковицы от основания черепа. Рассекают перекрест зрительных нервов, ножки гипофиза и мозг извлекают из черепной коробки. Осматривают внутреннюю поверхности основания черепа, делают по краям углубления кольцевой разрез твердой мозговой оболочки и пинцетом вынимают гипофиз. После извлечения мозга вскрывают носовую полость. Проводят продольный распил головы, несколько отступая (на 0,5 см) от средней линии. Осматривают и удаляют носовую перегородку, исследуют осторожно содержимое носовой полости, состояние слизистой оболочки, носовые раковины и ходы, лобные пазухи и решетчатую кость.

Глаза удаляют изогнутыми ножницами с притупленными концами.

Разрезают соединительнотканную оболочку, мышцы, глазной нерв, осматривают глазное яблоко снаружи, потом разрезают его посередине на две половины.

Позвоночный канал вскрывают, если есть на то показания. Позвоночник вначале отсоединяют от конечностей, тазовых костей, рёбер; кладут его на стол, очищают от мягких тканей. Пилой или при помощи долота и молотка рассекают дужки позвонков между отростками с обеих сторон до тех пор, пока остистые отростки станут подвижными. Костными щипцами захватывают дужки позвонков и резко оттягивают их кверху. На вскрытом позвоночном канале осматривают спинной мозг с поверхности, потом перерезают его поперёк, захватывают пинцетом твёрдую мозговую оболочку, оттягивают в сторону, пересекают корешки спинномозговых нервов, вынимают спинной мозг вместе с оболочкой и межпозвоночными ганглиями и осматривают позвоночный канал.

Трупы мелких животных (свиней, овец, собак, кошек и др.) вскрывают в спинном положении. Все органы ротовой полости, шеи, грудобрюшной и тазовой полостей извлекают единым комплексом. Сначала подрезают передние и задние конечности в местах их сочленения с туловищем и отклоняют их в стороны. Делают продольный и два поперечных разреза брюшной стенки и осматривают брюшную полость в том же порядке, что и у крупных животных.

В грудной полости разрезают диафрагму вместе прикрепления её к грудной стенке, удаляют грудную кость пересечением хрящей, соединяющих её с рёбрами, и грудную стенку так же, как у крупных животных. Извлекают органы из всех полостей с сохранением естественной связи между ними, начиная с ротовой полости. Исследуют органы в такой же последовательности, как их извлекали, не разъединяя их между собой.

Осмотр органов ротовой полости и шеи. Сначала осматривают язык, отмечая состояние его слизистой оболочки и мышечной ткани на разрезе (рисунок волокон, цвет, консистенция). Затем исследуют миндалины, обращая внимание на их величину, вид слизистой оболочки, крипт, наличие гнойников, наложений. Разрезают ножницами глотку и пищевод, определяя состояние слизистой оболочки, а потом стенку гортани, трахеи и крупных бронхов, отмечая состояние слизистой оболочки, характер содержимого (кровянистая или пенистая жидкость, слизь, гной, наложения и т.д.). осматривают щитовидную, паращитовидную и зобную железы.

Исследование органов грудной полости. Осмотр начинают с легких, определяя их объем, консистенцию, состояние плевры (цвет, блеск, тусклость), наличие спаек, наложений, кровоизлияний, узелков, рисунок дольчатого строения, эластичность, плавучесть (воздушность). Кусочки воспаленной ткани тонут или тяжело плавают в воде, отечные легкие плавают, эмфизематозные плавают на поверхности воды.

Консистенция органа может быть плотной (воспаление, ателектаз), тестоватой (отек), крепитирующей (эмфизема). Осматривают бронхиальные и средостенные лимфоузлы. Делают продольные и поперечные разрезы обоих лёгких, определяя на разрезе цвет, кровенаполнение, характеры выделений из альвеол, бронхов, сосудов, наличие очагов уплотнения или размягчения. Присутствие пузырьков воздуха в вытекающей жидкости говорит о наличии воздуха в ткани, выделение светлой, пенистой жидкости указывает на отёк, кровянистой – на гиперемию, мутной, с примесью крови – на воспаление. При выявлении в легких очагов уплотнения или размягчения описывают локализацию, величину, консистенцию, цвет, вид на разрезе и т.д.

Осмотр сердца начинают со вскрытия сердечной сорочки. Определяют состояние перикарда, содержимое (транссудат, экссудат, инородные предметы).

Отмечают форму сердца, состояние эпикарда, жировой клетчатки (при истощении – студневидная,) наличие кровоизлияний. Затем ножом делают два разреза таким образом, чтобы можно было осмотреть все полости сердца, эндокард, миокард, клапаны. Один разрез проходит через правый желудочек и правое предсердие, другой – через левый желудочек и левое предсердие. В полостях отмечают количество крови, её свертываемость, цвет, состояние эндокарда, клапанов, наличие шероховатостей, толщину стенок желудочков, консистенцию и цвет миокарда (серый, глинистый, тигроидный), рисунок волокон.

Исследование органов брюшной полости. Осмотр начинают с селезенки.

Определяют её величину (края острые или округлые), консистенцию (плотная, мягкая, дряблая), напряжение капсулы, цвет с поверхности и на разрезе, состояние пульпы, фолликулов, трабекул (в норме - в виде белых точек или полосок, при гиперплазии – затушеваны, при атрофии – утолщены, отчетливы.

При осмотре печени определяют размеры, вид краёв (острые или притупленные), консистенцию (плотная, дряблая), цвет (коричневый, глинистый, желтый), характер поверхности (гладкая, зернистая, узловатая). В воротах печени исследуют вену артерии, желчные протоки и портальные лимфоузлы.

Делают поперечные разрезы в каждой доле, отмечая кровенаполнение, консистенцию, цвет, рисунок дольчатого строения.

Затем вскрывают жёлчный пузырь и его протоки. Определяют количество желчи, цвет, консистенцию, наличие постороннего содержимого, прозрачность, состояние слизистой оболочки и т.д.

Осмотром поджелудочной железы устанавливают форму, величину, цвет, консистенцию, рисунок ткани, степень кровенаполнения.

При исследовании надпочечников обращают внимание на размер, форму, консистенцию на поперечном разрезе – на толщину коркового мозгового слоя, цвет (в норме корковый слой жёлтый, мозговой - коричневый), а при исследовании почек – на их величину, форму, консистенцию, состояние капсулы, цвет с поверхности. Разрезают капсулу и орган по выпуклой стороне.

Пинцетом захватывают капсулу за край и снимают её; смотрят, насколько легки она отделяется от органа. На разрезе отмечают выраженность границы между слоями (чёткая, сглаженная), цвет, консистенцию, кровенаполнение, кровоизлияние, рисунок ткани, объём полости лоханки, содержимое её, состояние слизистой оболочки.

Мочевой пузырь осматривают с поверхности, определяя его объём, состояние слизистой оболочки, а при вскрытии – количество, цвет, прозрачность мочи; толщину стенки, состояние слизистой оболочки.

При исследовании желудка жвачных сначала разрезают соединения между книжкой и сеткой, книжкой, рубцом и сычугом. Сычуг и преджелудки расправляют и делают разрез стенки. Сычуг вскрывают по малой кривизне, потом разрез продолжают по большой кривизне книжки и наружной кривизне сетки так, чтобы не повредить пищевод. Далее вскрывают конец пищевода и рубец по верхней и нижней кривизне. Определяют характер содержимого во всех отделах желудка, количество, цвет, запах, состояние слизистой оболочки. У лошадей, свиней, собак желудок вскрывают по малой кривизне.

Осмотр кишечника начинают с тощей и заканчивают прямой кишкой.

Перед вскрытием отделяют брыжейку, а кишечными ножницами разрезают стенку кишечника. В каждом отделе определяют количество, характер содержимого (цвет, консистенция, запах, наличие слизи), состояние слизистой оболочки (цвет, складчатость, набухание, кровоизлияния, наложения, эрозии, язвы, рубцы и т.д.), пейровых бляшек и лимфоидных фолликулов (в норме они слабозаметны, при патологии увеличены, набухшие).

При исследовании половых органов у женских особей осматривают влагалище, яичники, яйцеводы и матку. Устанавливают состояние серозной слизистой оболочек, содержимое матки, состояние карункулов, плода и оболочек, а также форму, цвет яичников с поверхности и на разрезе, консистенцию, наличие желтых тел кист и т.п. У самцов осматривают препуций, половой член, мочеиспускательный канал, на разрезе исследуют пещеристые тела, семенники, простату.

Головной мозг исследуют сначала с поверхности, затем продольным разрезом рассекают его на две части. Вскрывают и осматривают боковые желудочки (отмечая количество и вид содержимого в них, состояние сосудистого сплетения), продолговатый мозг, мозжечок, четверохолмие, аммоновы рога, полосатое тело, эпифиз.

Спинной мозг осматривают после снятия твердой мозговой оболочки с поверхности и на поперечном разрезе. Отмечают четкость границы серого и белого вещества, цвет, влажность, кровенаполнение, консистенцию, состояние межпозвоночных узлов.

Вскрытие трупов птиц, как и млекопитающих, включает в себя внешний и внутренний осмотр.

Наружный осмотр начинают с регистрации вида птицы, породы, пола, возраста, упитанности, номера. Состояние упитанности определяют по степени развития грудных мышц (насколько сильно выступает гребень грудной кости) и по окружности живота (жировые отложения под кожей).

Трупные изменения те же, что и у других домашних животных, но трупных пятен (гипостазы) у птиц не бывает. Трупное разложение устанавливают по специфическому запаху и зеленоватой окраске брюшных кожных покровов и кожи в области зоба.

При осмотре оперения обращают внимание на чистоту пера, его эластичность, сухость, блеск или матовость, а также на наличие объединенных концов пера.

При исследовании кожи обращают внимание не её цвет, наличие кровоизлияний, пустул, струпьев, подкожных инфильтратов, новообразований, инкапсулированных, нередко обызвествленных подкожных клещей.

Затем осматривают гребень и сережки. При этом определяют их цветоформу, наличие припухлостей, струпьев, ссадин.

При осмотре глаз обращают внимание на форму зрачка, состояние век, наличие под ними творожистой массы, её количество, характер изменения конъюнктивы, третьего века, роговицу, радужную оболочку, форму подглазничных синусов. Надавливая на носовую полость пальцами, выясняют, не выделяется ли из носового отверстия какое-либо содержимое. Одновременно с этим осматривают слизистую оболочку клоаки и оперение вокруг неё.

При осмотре костей и суставов обращают внимание на наличие искривлений костей, утолщений на них, на их целостность, на форму суставов.

Внутренний осмотр. Труп птицы после частичного или полного удаления пера кладут на спину или прикрепляют в спинном положении к доске при помощи булавок, или помещают его в большую эмалированную кювету.

Однотипной, всеми принятой методики вскрытия трупов птиц нет. Каждый ветеринарный специалист применяет ту методику, которую считает привычной и удобной для исследования.

Так, после соответствующей укладки трупа птицы в спинном положении скальпелем или ножницами разрезают кожу и мышцы с обеих сторон паховой области, отводя в разные стороны ноги птицы до горизонтального положения.

Затем разрезают кожу со средней линии тела от клюва до клоаки. Особенно точно надо делать разрез в области шеи, так как в противном случае можно легко повредить зоб. Далее освобождают от кожи как можно большую поверхность тела и частично ног. В области шеи кожу отделяют целиком, чтобы в последующем было исследовать головной мозг.

При вскрытии грудобрюшной полости пальцами левой руки захватывают брюшную стенку и, оттягивая её вверх, делают небольшой разрез, а затем, удлиняя его, рассекают брюшные и грудные стенки посередине боковых поверхностей туловища.

После перерезки ребер и ключиц осторожно подрезают сердечную сумку в области верхушки сердца и отгибают к переди грудную кость.

После вскрытия грудобрюшной полости осматривают воздухоносные мешки, сердце и другие внутренние органы.

Воздухоносные мешки. Осмотру подлежат один непарный и четыре парных воздухоносных мешка: непарный межклеточный воздухоносный мешок лежит между ключицами, частично охватывает сердце и сообщается с плечевой костью, парные шейные мешки располагаются над трахеей и пищеводом, краниальные грудные находятся под легкими и простираются до последнего ребра, каудальные грудные прилегают к печени, желудку и кишечнику, брюшные воздухоносные мешки свободно лежат в полости тела, простираясь до клоаки. При вскрытии воздухоносных мешков обращают внимание на их состояние. В норме они заполнены воздухом, стенки эластичны, прозрачны; при патологии стенки мешков помутневшие, утолщенные, на их поверхности видны отложения фибрина.

Сердце. Приподнятую в область верхушки сердца сердечную сорочку рассекают ножницами. В норме в ней находится 2-3 капли прозрачной серозной жидкости. При патологии количество жидкости несколько увеличено, стенка сердечной сорочки утолщена, заметно отложение фибриновых масс. После осмотра сердечной сорочки определяют состояние эпикарда (исследуют на возможные наложения, кровоизлияния), миокарда и эндокарда.

Печень. При исследовании печени обращают внимание на цвет, размеры, состояние капсулы и паренхимы. Увеличение органа определяют по притуплению его краёв и по отпечаткам рёбер на поверхности печени. При осмотре желчного пузыря, находящегося на правой доле, определяют степень его наполненности желчью, консистенцию и цвет желчи.

Селезёнка. Она расположена в углу, образуемым железистым и мускульным желудком. в норме она округлой или овальной формы, краснобурого цвета. При исследовании обращают внимание на цвет и размер органа, на состояние капсул и паренхимы, наличие кровоизлияний, очажков некроза, новообразований.

Железистый желудок вскрывают ножницами продольно. При этом обращают внимание на состояние его стенок, слизистой и серозной оболочки.

Продолжают разрез по выпуклости мускульного желудка до места выхода двенадцатиперстной кишки. Для исследования слизистой оболочки мускульного желудка предварительно удаляют его роговую кутикулу. Кишечник у птиц представлен в основном тонкой кишкой, к толстому кишечнику относятся лишь две слепые кишки и небольшая прямая кишка.

При осмотре обследуют серозные покровы кишечника, брыжейку;

осматривают слепые кишки, обращая внимание на их толщину, консистенцию содержимого, отмечают возможные новообразования. При осмотре двенадцатиперстной кишки одновременно обращают внимание на состояние поджелудочной железы, расположенной в изгибе кишки. Вскрывают кишку, исследуют состояние её слизистой оболочки, определяют характер содержимого, осматривают на наличие гельминтов.

Яичник у птиц имеется только левый. Он расположен впереди левой почки и прилегает к надпочечнику. В яичниках могут быть новообразования, деформированные фолликулы, кровоизлияния.

Яйцевод. При вскрытии нередко отмечают различные деформации и дефекты: в его просвете иногда находят гельминтов, несформированное яйцо, а в стенке – воспалительные изменения, кровоизлияния.

Семенники у птиц парные, бобовидной формы, расположены симметрично по обе стороны от средней линии тела, вблизи переднего края почек. В семенниках возможны воспалительные изменения и другие дефекты.

Надпочечники расположены у переднего края почек и представляют собой орган желто-красного цвета, имеющий форму трёхсторонней пирамиды. При различных патологических состояниях могут быть изменены цвет, форма и величина надпочечников, иногда в них можно обнаружить кровоизлияния и участки некроза.

Почки расположены в углублениях пояснично-крестовой кости. У птиц почки состоят из трёх долей. Они тёмно-коричневого цвета. Часто отмечают набухание почек, изменение цвета, кровоизлияния, некротические очажки, отложения мочекислых солей, новообразования.

Фабрициева сумка представляет собой лимфоидный орган грушевидной формы, лежащей дорсально от клоаки. У кур наивысшее развитие сумки наблюдается к 4-5 месячному возрасту. К этому времени величина её становится 2,5х1,5см. С возрастом она уменьшается и у птиц в возрасте одного года она величиной с горошину. Затем она исчезает совсем. В фабрициевой сумке могут быть кровоизлияния, некрозы, в основном характерные для болезни Гамборо, а также другие изменения.

Щитовидные и паращитовидные железы. Щитовидные железы расположены в грудной полости по обе стороны трахеи (на 2 см выше её бифуркации). Они имеют вид треугольных или маленьких овальных тел красного цвета. Паращитовидные железы величиной несколько больше просяного зерна расположены каудально от щитовидных желез.

Зобные железы находятся справа и слева по ходу пищевода и трахеи. У молодняка птиц 6 пар таких желез, а у взрослых в связи атрофией их меньше. В норме эти железы представляют собой небольшие образования величиной с пшеничное зерно светло вишневого цвета. При патологии отмечают атрофию желез, не соответствую возрасту птицы, или, наоборот, их увеличение.

Ротовую полость, пищевод и зоб вскрывают одним разрезом с помощью ножниц, начиная с угла рта. При этом открываются для исследования ротовая полость и глотка. Продолжая разрез пищевода, вскрывают зоб. Во время вскрытия обращают внимание на наличие каких-либо отложений, кровоизлияний, узелков на слизистой оболочке. При исследовании зоба определяют состояние желез слизистой оболочки, степень наполнения органа («твердый» или «мягкий» зоб).

Гортань расположена сзади от основания языка и представляет собой щель, ограниченную щитовидным и черпаловидным хрящами. В ней могут быть скопления экссудата, наложения и кровоизлияния на слизистой оболочке.

Трахея разделяется на два бронха, которые уже в ткани легко разветвляются на мелкие бронхи. В трахеи могут быть воспалительные явления, кровоизлияния, фибринозно-гемморагические наложения, и также «пробки».

Легкие птиц располагаются в углублениях между ребер, вследствие чего дорсальная поверхность их неровная. При исследовании органа вскрывают и осматривают главный бронх, который проходит через всё легкое в каудовентральном направлении. В норме легкие розового цвета, воздушны. При патологии они уплотнены, тёмно-красного цвета.

Нервные сплетения и нервы. Обычно у птиц осматривают поясничное, крестцовое и плечевое сплетения и нервы – седалищный, бедренный, крыльцовый и лучевой. При этом могут быть выявлены увеличение нервных сплетений, утолщение нервных стволов, потеря поперечной исчерченности их.

Это особенно важно для диагностики и дифференциальной диагностики болезни Марека.

Головной мозг можно вскрывать двумя способами. В первом случае удаляют мускулатуру с костей черепа, а затем рассекают их костными или обычными ножницами. Разрез ведут по поперечной линии, проходящей по середине глазных орбит, а по бокам – в виде дуги, направленной выпуклостью к затылочному отверстию. Вскрытие полости черепа заканчивается продольным разрезом по средней линии черепной крышки. Образовавшиеся таким образом две симметричные костные пластинки поднимают вверх и откидывают назад и в стороны.

Во втором случае отделяют голову от туловища в области атлантозатылочного сочленения. Затем делают сагиттальный распил черепа частой пилой. После подрезания ножницами мягких тканей и роговых частей клюва извлекают обе половины головного мозга.

При исследовании головного мозга обращают внимание на наличие кровоизлияний на поверхности полушарий мозжечка, на выраженность в последнем рисунка «древа жизни». После извлечения и осмотра головного мозга приступают к вскрытию и исследованию носовой и придаточной полостей.

Подглазничные впадины вскрывают поперечным разрезом в области внутреннего глаз. Надавливая пальцем в области верхней половины клюва, определяют наличие или отсутствие выделений из носовой полости.

Спинной мозг. Обычно исследуют отдельные части спинного мозга :

шейную, грудную или пояснично-крестцовую. Спинномозговой канал вскрывают продольным распилом нескольких позвонков по средней линии их вентральной поверхности.

Кости и костный мозг исследуют на продольных распилах. Исследования проводят главным образом на бедренной и большой берцовой костях.

Патологоанатомическое вскрытие рыбы. Его осуществляют в лаборатории, на специальном столике, используя только свежую рыбу. Живую рыбу обязательно обездвиживают. Для этого при помощи препаровальной иглы, которую вводят сверху через черепную коробку, разрушают продолговатый отдел мозга, или ножницами делают затылочный разрез, в результате чего головной мозг отделяется от спинного.

Брюшную полость рыбы вскрывают при помощи трех разрезов. Сначала скальпелем прокалывают стенку брюшной полости несколько выше и впереди анального отверстия. В прокол вставляют тупой конец ножниц и делают первый разрез, который проходит вдоль брюшка параллельно его средней линии и кончается за основанием грудных плавников.

Вторым полукруглым разрезом отсекают стенку брюшной полости, обнажая внутренние органы. С помощью третьего разреза вдоль головы отделяют стенку брюшной полости и убирают её в сторону. Разрезы делают осторожно, чтобы не повредить внутренние органы.

Патологоанатомический осмотр начинают с брюшной полости, обращая внимание на её содержимое, наличие жидкости (её количество, цвет, консистенцию) или газа, запаха, крупных полостных паразитов. Затем изучают внешний вид внутренних органов: наличие кровоизлияний, отёков, новообразований. После осмотра извлекают комплекс внутренних органов и осторожно отделяют их друг от друга. По внешним признакам: размеру, цвету, структуре, кровенаполнению и другим – определяют их состояние. Выделение и осмотр внутренних органов проводят в следующем порядке: 1) желчный пузырь, 2) печень, 3) селезенка, 4) желудочно-кишечный тракт, 5) половые железы, 6) плавательный пузырь, 7) почки, 8) мочевой пузырь, 9) сердце, 10) головной мозг, 11) мускулатура. Органы раскладывают по чашкам Петри и смачивают дистиллированной водой.

Желчный пузырь. Определяют степень его наполнения и размер, разрезают стенки пузыря и осматривают желчь, её цвет, прозрачность и консистенцию.

Печень. Устанавливают её форму, окраску, консистенцию, а также наличие кровоизлияний, светлых участков и цист.

Селезенка. Отмечают размеры, цвет, структуру, наличие кровоизлияний, рубцов, цист.

Плавательный пузырь. Определяют цвет, прозрачность, наличие кровоизлияний.

Сердце. Устанавливают наличие кровоизлияний на эпикарде и эндокарде, заполнение кровью и наличие сгустков, структурных изменений в сердечной мышце.

Головной мозг. Вскрывают черепную коробку с помощью 4 разрезов ножницами или скальпелем. Первый поперечный разрез проходит по заднему краю затылочной кости. Два продольных разреза идут с боковых сторон к соответствующей носовой ямке. Четвертым разрезом вырезанные кости убирают и осторожно удаляют ткань, покрывающую головной мозг. Сначала головной мозг осматривают, не вынимая из черепной коробки, а затем вынимают и, разрезая на доли, характеризуют состояние мозговых оболочек, вещества мозга, кровенаполнение сосудов.

Мускулатура. При осмотре скелетной мускулатуры обращают внимание на её цвет, консистенцию, наличие кровоизлияний, отёков, опухолей, цист, а также степень прикрепления к костям. Все отклонения, отмеченные при вскрытии, записывают в рабочую тетрадь, а затем отмечают в акте эпизоотологического обследования. Органы, имеющие патологические отклонения, дополнительно обследуют паразитологическими, бактериологическими, вирусологическими методами.

Вопросы для самопроверки:

1. Как проводят патоморфологическое исследование трупов крупных млекопитающих животных?

2. Как проводят патоморфологическое исследование трупов мелких млекопитающих животных?

3. Как проводят патоморфологическое исследование трупов птиц?

4. Как проводят патоморфологическое исследование трупов рыб?

научить слушателей проводить аллергическую диагностику Цель занятия:

Этот метод диагностики основан на повышенной чувствительности организма сенсибилизированного животного к специфическим аллергенам, полученным из соответствующих возбудителей. Аллергены вводят под кожу, внутрикожно или наносят на видимые слизистые оболочки. Аллергический метод в основном широко используется при диагностике хронически протекающих болезней (сап, туберкулёз, паратуберкулёз, бруцеллез).

Для внутрикожной инъекции аллергена используют шприцы с иглами, имеющие ограничительные плечики, пипетки (глазные), пипетмеры, автоматические инъекторы.

Глазная аллергическая проба. Пробу проводят только на здоровых глазах.

Нельзя ставить пробу в том случае, если у животного поражен хотя бы один глаз. Аллерген (например, маллеин) вводят под третье веко на конъюнктиву в объёме 0,1-0,2 см3 (3-4 капли) при помощи глазных пипеток или «Ripetmence».

Учёт результатов в реакции проводят в соответствии с инструкцией по применению используемого препарата. Положительная реакция характеризуется покраснением и набуханием конъюнктивы, выделением гнойного или слизистогнойного экссудата.

Внутрикожная аллергическая проба. Предварительно определяют место введения аллергена. У крупного рогатого скота аллерген чаще вводят в среднюю или нижнюю треть шеи. Предварительно в месте инъекции препарата выстригают шерсть в виде 2-х перпендикулярных друг другу полос шириной 1,5-2 см.

Аллерген (например, туберкулин, бруцеллизат и др.) вводят в центр места пересечения полос. Перед введением данного диагностикума кожу протирают спиртом. Доза введения аллергена, учет реакции и оценка выраженности воспалительной реакции указывается в соответствии с наставлениями. У мелкого рогатого скота аллерген внутрикожно вводят обычно в подхвостовую складку, предварительно очистив и также протирают 70%-ным спиртом. Учет реакции проводят путём общего осмотра животного, определения наличия местной температуры, характера отёка и изменения толщины кожной складки. Размеры отёка кожи вместе введения аллергена устанавливают штангенциркулем (или кутиметром).

Подкожная аллергическая проба. Обычно проводят её путём инъекции аллергена в объёме 0,5 см3 под кожу нижнего века (палпебральная проба) отступая на 1 см от его края со стороны наружного угла глаза. Место введения препарата выстригают и обрабатывают 70° спиртом. Для инъекции используют шприц ёмкостью 5,0 см3 и короткую тонкую иглу (№0416-0813).

Учёт реакции проводят согласно соответствующему наставлению. При положительной реакции на месте введения аллергена отмечается воспалительная реакция в виде плотной или тестоватой припухлости.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие существуют методы аллергической диагностики болезней животных?

2. Как осуществляют аллергическую диагностику болезней животных?

3. Какие препараты применяют при аллергической диагностике болезней животных?

Лабораторная диагностика включает проведение серологических, бактериологических, вирусологических, микологических и других исследований, осуществляющих в специальных условиях.

ознакомить слушателей с серологическими методами диагЦель занятия:

Серологическая диагностика заключается в выявлении зараженных животных с помощью реакций, основанных на обнаружении комплементарном строго специфическом взаимодействии антигена и антитела.

Серологические реакции позволяют относительно быстро обнаруживать антитела к антигенам (в т.ч. микробным) и антигены с помощью специфических гомологичных к ним антител.

Роль серологических исследований в постановке диагноза чрезвычайно велика. К настоящему времени известно много серологических реакций, с помощью которых возможно получить ценную информацию о заболевании животного, иммунном статусе организма.

Как явствует из определения основными компонентами серологических реакций являются антиген и антитело.

Серологические реакции феноменологически проявляются в виде агрегации, лизиса и действием использованной метки.

Агрегация может быть первичной и вторичной. Первичная агрегация происходит в результате взаимодействия антигена с антителом и при этом образуется комплекс (сюда относятся реакция агглютинации и реакция преципитации).

Для лучшего, более выраженного проявления агрегации комплекса антигенантитело компоненты реакции (антиген или антитело) адсорбируют на носителях (эритроцитах, латексе) или метят люминисцентами (флуорохромом).

Вторичная агрегация обуславливается действием дополнительного фактора на ещё не агрегированный комплекс антиген-антитело. Иммунный лизис, например, происходит под действием комплемента на сенсибилизированную клетку.

К таким реакциям можно отнести реакцию связывания комплемента (и её варианты), реакция конглютинации, реакция Кумбса, ИФА, реакция иммунофлуоресценции, радиоиммунный анализ.

Любую серологическую реакцию можно ставить в прямом и лимитированном варианте. В последнем случае вводится заведомо известный основной или дополнительный фактор (лимитирующий) и в конечном этапе определяется его наличие в свободном виде при помощи индикаторной системы. Например, в реакции связывания комплемента лимитирующим фактором является комплемент, а индикаторной системой является гемсистема (смесь взвеси эритроцитов барана и гемолизина). В РН лимитирующим фактором является количество антигена (или антитела) способной нейтрализовать определенной количество антителл (антигена). Оставшееся количество антигена или антител определяем прямой реакцией гемагглютинации.

По классификации Т.С. Сайдулдина (1992), приведенной в таблице 1, все серологические реакции делятся на 3 группы: с нативными компонентами, адсорбированными на твердых носителях и меченными компонентами каждая группа в сою очередь делится на реакции без дополнительных факторов и реакции с дополнительными факторами.

Наконец, каждую реакцию можно ставить в двух вариантах: в прямом и лимитированном.

Эта весьма удобная для пользования изучающими классификация серологических реакций.

Вопросы для самопроверки:

1. На чем основана серологическая диагностика инфекционных болезней животных?

2. Классификация серологических реакций.

Таблица 1 - Классификация серологических реакций 17.5.1.1 ПОСТАНОВКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ научить слушателей осуществлять серологические реакции Цель занятия:

Все серологические реакции проходят в определенных соотношениях составляющих их компонентов, что и определяет количественную характеристику того или иного диагностического теста и выражается в титрах.

Поэтому постановке главного опыта серологической реакции предшествует титрация используемых при этом компонентов. За титр принимают наименьшее количество то есть наибольшее разведение компонента реакции, достаточное для получения ожидаемого феномена. Титр выражается в разведении (например, 1:100) или в условных единицах (Г.Д. Ильгекбаева, 2008). При постановке прямых реакций без дополнительных факторов, куда относятся реакция агглютинации, реакция преципитации, реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации, реакция латескоагглютинации, коагглютинации, проводят титрацию одного из компонентов по известному другому, или содержанию активных начал (корпускул, сухому веществу).

Цель занятия:

В реакции агглютинации участвуют находящиеся в разводящей жидкости антитела и антиген. Антиген титруют на изготавливаемом его предприятии. В основе стандартизации данного компонента лежит обеспечение наличия в микробной взвеси определенного числа корпускул.

Так, например, антиген для пробирочной реакции агглютинации должен содержать 30 млрд микробных тел в фотоэлектроколориметрическим методом. Для этого необходимо иметь:

- бруцеллезный стандарт мутности выпускаемый Государственным контрольным институтом медицинских биологических препаратов им.Тарасевича;

- взвесь исследуемых бактерий;

- раствор, в котором суспензируется исследуемая культура бактерий;

- определение оптической концентрации бруцеллезных взвесей на аппарате ФЭК-56 ведется при светофильтре №4 «синий» с использованием кювет 0, см3;

- калибровочная кривая строится по бруцеллезному стандарту мутности;

- разведение оптического стандарта и исследуемых суспензий следует готовить в арифметической прогрессии.

Полученные данные наносятся на миллиметровую бумагу. Значения концентрации микробных клеток откладывается на оси Х, экстинции на – оси У.

Пример построения калибровочной кривой для количественного определения бруцелл показан в таблице 2.

Таблица 2 - Расчёт данных для построения калибровочной кривой В качестве контроля используется раствор, которым смывалась культура бруцелл и разводилась бактериальная взвесь.

Активность препарата определяется по 2 разведениям позитивной сыворотки.

Стандартную бруцеллезную сыворотку в РА разводят 0,5% фенолизированным физиологическим раствором 1:50. Из этого разведения делают следующие серийные разведения 1:100; 1:150; 1:200; 1:250; 1:300; 1:400;

1:500 примерно следующим образом:

1-20 см3 сыворотки разведенной 1/50+20 см3 физ. раствора = 1:100;

2-20 см3 сыворотки разведенной 1/50+40 см3 физ. раствора = 1:150;

3-10 см3 сыворотки разведенной 1/50+30 см3 физ. раствора = 1:200;

4-1 см3 сыворотки разведенной 1/50+40 см3 физ. раствора = 1:250;

5-7 см3 сыворотки разведенной 1/50+35 см3 физ. раствора = 1:300.

Указанные разведения сыворотки хранят во флаконах с притертыми пробками при температуре 2-4°С в течение одного месяца.

Антиген хорошо взбалтывают и готовят из него 5-6 разведений с таким расчетом, чтобы первое соответствовало примерно 3,5-4 млрд. микробных тел в 1 см3, а в дальнейшем на 0,3-0,4 млрд. меньше. Например, если к 1 см3 антигена требуется прибавить 7 см3 физиологического раствора, чтобы получить концентрацию 3,5-4 млрд. микробных тел в 1 см3, то дальнейшие разведения берут:

1+7,1; 1+8,1; 1+9,1; 1+10,1 и т.д.

Перед использованием в лабораториях для постановки РА антиген разводят в 10 раз 0,5% фенолизированным физиологическим раствором или 10% раствором поваренной соли (при исследовании сывороток крови овец, коз).

Каждое разведение антигена испытывают со всеми четырьмя разведениями стандартной сыворотки в РА при одинаковой дозировке ингредиентов, равной 0,5 см3. При этом после добавления антигена к сыворотке в каждой пробирке будет по 1,0 см3 смеси, соответствующей конечным разведениям сыворотки 1:200, 1:300,1:400,1:500. Одновременно антиген испытывают с 2-3-мя заведомо отрицательными сыворотками и 0,5% фенолизированным физиологическим раствором.

Пробирки встряхивают, выдерживают в термостате при температуре 37°С.

Учет реакции в РА проводят через 24 часа после выдерживания в термостате и 4 часа при комнатной температуре.

Реакцию оценивают в 4-х бальной системе в крестах:

четыре креста (#) – полное просветление жидкости, микробные тела антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100%ная агглютинация);

три креста (+++) – полное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);

два креста (++) – просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);

один крест (+) – едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо (25% агглютинации);

минус (-) – просветление жидкости и образование «зонтика» не наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших микробов антигена.

При учёте реакции антиген в разведении 1:10 с конечным разведением стандартной сыворотки 1:500 должен давать 50% агглютинации (++).

Пример приведен в таблице 3.

Таблица 3 - Схема постановки РА при титрации антигена антигена Конечные разведения сыворотки с антигеном 1:7 # +++ ++ Этот результат уточняют путем трехкратного повторения реакции с разведениями антигена 1+8, 1+8,5, 1+9, 1+9,5, 1+10. С отрицательными сыворотками и физиологическим раствором реакция должна быть отрицательной.

Если имеется стандартная позитивная сыворотка, то изготавливаемый антиген титруют на сыворотке, как показано в вышеприведенной таблице.

С помощью оттитрованного антигена определяют активность сыворотки и проводят её стандартизацию путём доведения до нужных титров аналогичной сывороткой (негативной – в случаях необходимости снижения или более позитивной при потребности увеличения активности).

Вопросы для самопроверки:

1. Какие компоненты необходимы для постановки реакции агглютинации?

2. Как стандартизируют антиген для реакции агглютинации?

3. Как титруют позитивную сыворотку для реакции агглютинации?

4. Как проводят реакцию агглютинации?

5. Как учитывают результаты реакции агглютинации?

Цель занятия:

В реакции преципитации при взаимодействии сыворотки и антигена изменяется дисперсность их коллоидов. Преципитирующее действие сыворотки в реакции возможно тогда, когда соответствующий антиген применяется в растворенном дисперсном состоянии. Для контроля активности преципитирующей сыворотки готовят стандартный антиген из вирулентной культуры. Например, для контроля преципитирующей сибиреязвенной сыворотки используют стандартный антиген, который готовят из вирулентной культуры сибирской язвы.

С этой целью бульонную культуру сибирской язвы засевают на агар заключенный в матрасные колбы. Посевы ставят в термостат при температуре 36С на сутки. Сплошной рост сибиреязвенных бацилл снимают специальным шпателем. Снятую бактериальную массу помещают в стерильную чашку Петри и автоклавируют при 120°С в течении 30 минут. Слегка побуревшую от стерилизации бактериальную массу высушивают в термостате в течение 3-5 дней до постоянного веса. Полученный порошок тщательно взвешивают с максимальной точностью (не менее 1 мг) и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:3000 – 13500, экстрагируют на холоду в течение 24 часов и фильтруют через асбестовый фильтр, причем первые его порции до получения совершенно прозрачного фильтрата удаляют. Антиген проверяют на активность с шестью сериями заведомо известной преципитирующей, сибиреязвенной сыворотками.

Такой антиген с позитивной сывороткой даёт чёткое кольцо преципитации в течение 20-40 секунд.

При постановке лимитированных реакций например с дополнительными факторами, куда относится РСК, РС и др. см классификацию, титрацию проводят всех входящих в неё компонентов, кроме исследуемого.

Для постановки реакции преципитации применяют преципитирующую сибиреязвенную сыворотку, которая должна быть совершенно прозрачной. Реакцию ставят в пробирках Уленгута или в агаровом геле. В первом случае могут быть два варианта: наслаиванием и послаиванием.

Сыворотку разливают в объеме 0,25 – 0,3 см3, а затем на неё осторожно пипеткой по стенке пробирки в таком же объеме наслаивают антиген (экстракт).

Учет результатов проводят через 10-12 минут с момента соединения компонентов.

Реакцию считают положительной, если на границе соприкосновения иммунных пар в течении указанного времени появляется ясно выраженный серовато-беловатый диск-кольцо.

При отрицательном результате на резко выраженной границе между компонентами нет никаких следов преципитации. В остальных случаях (слабо выраженное кольцо, помутнение в виде облачка и т.п.) реакцию считают сомнительной.

В случае постановки реакции диффузной преципитации (например, при бешенстве) в чашки Петри или обезжиренные предметные стекла разливают расплавленный и охлажденный до 60°С агар.

Для постановки РП лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко». Он полностью растворяется и сразу же нужно фильтровать.

После застаивания агара в нем делают лунки при помощи тонкостенной металлической или стеклянной трубочки (или гильзы) с внутренним диаметром 4-5 мм., располагая их по трафарету. Лунки оплавляют этим же агаром, чтобы не было подтеков ингредиентов между агаром и дном лунки. В одну из лунок (например, центр) наносят исследуемый материал например, суспензию головного мозга животного, а вокруг неё в периферические лунки помещают преципитирующую сыворотку (или иммуноглобулин) в разных разведениях (1:2; 1:4; 1:8;

1:16). После того как ингредиенты реакции помещают в соответствующие луночки предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри) с влажной фильтровальной бумагой или ватой в термостат на 6 часов при температуре 37-38°С. Затем оставляют их при комнатной температуре еще на 10-18 часов.

В случае положительной реакции между ланками с исследуемым материалом и положительной сывороткой образуется линия преципитации (иногда за 2- минуты).

Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°С. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату (фильтровальная бумага).

Реакция преципитации в агаре – это чувствительный серологический тест, позволяющий быстро и с минимальной затратой реагентов проводить исследование.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие компоненты используют для постановки реакции преципитации?

2. Какие методы постановки реакции преципитации применяют?

3. Когда и как проводят учет результатов реакции преципитации?

17.5.1.1.3 РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ) Цель занятия:

Реакция иммунофлуоресценции основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 и др.) антигена, вступившего в реакцию со специфической антисывороткой, меченной Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженого патологического материала (как и для микроскопического исследования). От каждого кусочка готовят не менее 4 препаратов. Для контроля делают препараты из органов здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты из органов здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение четырех часов при температуре 2-4°С. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном на препараты наносят несколько капель конъюгата (флуоресцирующий иммунногаммаглобулин). Затем их помещают во влажную камеру (чашки Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20минут при температуре 25°С.

После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (рН 7,2-7,4) в течение часа, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и исследуют.

Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло. В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии патологическая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым светом. Антиген выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины.

В контрольном препарате желтовато-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечают. По интенсивности свечения результаты оценивают: # - яркая, сверкающая желто-зеленая люминесценция; +++ - отчетливо выраженная, достаточно яркая зелёная люминесценция; ++ - неяркая люминесценция зеленого цвета;

+ - слабая люминесценция, обнаруживаемая в крупных включениях, зеленого цвета; - отсутствие специфической люминесценции.

Метод флуоресцирующих антител высокочувствителен и позволяет получить ответ на исследование материала в день его поступления.

Вопросы для самопроверки:

1. На чем основана реакция иммунофлуоресценции?

2. Как осуществляется постановка реакции иммунофлуоресценции?

3. Когда и как проводится учет результатов реакции иммунофлуоресценции?

17.5.1.1.4 РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ (НЕПРЯМОЙ)

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ С АНТИГЕННЫМ ЭРИТРОЦИТАРНЫМ

ДИАГНОСТИКУМОМ

Цель занятия:

Сущность реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации заключается в том, что эритроциты после адсорбции на их поверхности антигенов или антител различной природы, приобретают новую серологическую специфичность, вследствие чего они могут агглютинироваться в присутствии специфических антител или антигенов.

титрации сенситин (антиген или антитело). С этой целью готовят последовательные разведения того или иного компонента и каждым отдельно взятым разведением сенсибилизируют подвергнутые Титром антигена (антител) считают предельное его разведение, которое обеспечивает агглютинацию эритроцитов положительной сывороткой (или, в противном случае, специфическим антигеном) в предельном разведении.

Для сенсибилизации эритроцитов используют вытитрованный антиген из расчета 4 антигенных единицы на 1 см3 3%-ной взвеси эритроцитов.

С этой целью берут антиген в двойном титре. Допустим, что при титрации получен титр антигена 1:100, для сенсибилизации эритроцитов берут разведение антигена 1:50, то есть в два раза больше и смешивают с эритроцитарной взвесью в соотношении 2:1, то есть два объема антигена и один объём взвеси эритроцитов. В этом случае получают 4 антигенные единицы.

При сенсибилизации эритроцитов, например, антиген и оба их компонента разводят буферно-физиологическим раствором с определенным значением рН.

Вначале готовят рабочий раствор антигена, то есть растворяют в необходимом объёме буферно-физиологического раствора двойную дозу его определенного титра.

Затем готовят в половинном к антигену объёме 3%-ную взвесь эритроцитов.

Приготовленный антиген и эритроциты смешивают, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню на 15-20 минут (в зависимости от объёма, чтобы смесь была прогрета).

Пример: допустим, что титр антигена 1:5, то есть к 1 см3 антигена прибавляем 4 см3 физраствора (рН=6,4). Если возьмём 30 см3 - 3% ной взвеси формалинизированных эритроцитов, обработанных танином, то из этого количества, см3 эритроцитарной взвеси оставляем для контроля (то есть без сенсибилизации) и 20 см3 для сенсибилизации. На этом количестве эритроцитов требуется 40,0см раствора антигена, где будет содержатся 8 см3 чистого антигена и 32 см3 забуференного физраствора, то есть 1:5.

Таким образом, при сенсибилизации эритроцитов смешивают 20 см3 3 %ной взвеси эритроцитов и 40 см3 раствора антигена.

По истечении времени сенсибилизации эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором с добавлением к нему (до 1%) нормальной кроличьей сыворотки (НКС).

Полученный таким образом эритроцитарный антигенный диагностикум проверяют на активность и специфичность с заведомо известными позитивными и негативными сыворотками.

Подготовка сывороток для исследования. Берут положительную и отрицательную сыворотки, разводят их физиологическим раствором 1:5 и инактивируют при 56°С в течение 30 минут.

Разведения испытуемых сывороток к реакции готовят на 1%-ном буфернофизиологическом растворе нормальной кроличьей сыворотки с рН=7,0.

Постановка реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА).

Для постановки реакции готовят физиологический раствор с добавлением к нему инактивированной нормальной кроличьей сыворотки (НКС), из расчёта см3 сыворотки на 250 см3 физиологического раствора, инактивируют НКС путем прогревания её в разведении 1:5 при 56ОС в течение 30 минут.

Реакцию ставят в лунках полистироловых пластин. С этой целью во все лунки наливают по 0,5 см3 раствор НКС и затем такой же объём инактивированной и разведенной 1:5 испытуемой сыворотки. Таким образом, первое разведение равно 1:10 и далее делаем последовательные разведения переливанием из одной лунки в другую по 0,5 см3. Из последней лунки 0,5 см3 выливаем. Следовательно, во второй лунке сыворотка будет разведена 1:20, в третьей – 1:40, в четвертой –1:80 и т.д.

Затем во все лунки вносят 0,05 см3 (одну каплю) эритроцитарного диагностикума.

Пластины тщательно, но осторожно, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2,5 – 3 часа.

К реакции ставят следующие контроли:

- с заведомо известными отрицательной и положительной сыворотками + сенсибилизированные эритроциты;

- все пробы сыворотки, участвующие в реакции в разведении 1:10 + танизированные, но несенсибилизированные эритроциты.

Учет реакции осуществляют по следующей схеме:

# - эритроциты покрывают все дно лунки тонким равномерным слоем;

+++ - эритроциты покрывают почти все дно лунки, зонтик - несколько меньше диаметром, чем при 4 крестах реакции;

++ - агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки;

+ - вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютинации;

- - (минус) - реакция отрицательная, на дне лунки эритроциты оседают в виде пуговки или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.

Вопросы для самопроверки:

1. В чем заключается сущность РНГА?

2. Какие компоненты участвуют в РНГА?

3. Какие контроли предусмотрены при постановке РНГА?

4. Когда и как проводят учет результатов РНГА?

17.5.1.1.5 РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РГА) Цель занятия:

которых происходит адсорбция их эритроцитами. В результате чего наступает агглютинация (склеивание) эритроцитов, образуется характерный осадок на дне пробирки. Эритроциты животных отдельных видов могут адсорбировать один дли несколько различных вирусов, в зависимости от антигенной структуры последнего. Разные вирусы могут адсорбироваться эритроцитами животного одного вида, и один вирус способен вызывать агглютинацию эритроцитов животных разных видов. Например, вирус чумы свиней гемагтлютинирует эритроциты свиней, кроликов; вирус гепатита утят адсорбируется и склеивает (агглютинирует) эритроциты уток, кур. РГА используют для установления вируса в исследуемом материале.

Для РГА необходимо иметь вируссодержащий материал, взвесь отмытых эритроцитов кур, физиологический раствор. Вируссодержащий материал представляет собой тонкую взвесь растертой в ступке с физиологическим раствором ткани павшей птицы или зараженного куриного эмбриона. Обычно исходное разведение тканевой суспензии (или эмбриональной жидкости) берут 1:5 - 1:10.

Подготовка взвеси эритроцитов. Кровь берут из подкрыльцовой вены здоровых кур. Кожную поверхность предварительно дезинфицируют (протирают ватным тампоном, смоченным в спирте), стерильной кровопускательной иглой или лезвием безопасной бритвы прокалывают или надрезают подкрыльцовую вену. Кровь собирают в стерильную колбочку на 25 см3 или в пробирку широкого диаметра, где находятся маленькие стеклянные (или фарфоровые) шарики.

(Чтобы предотвратить свертывание крови, вместо шариков можно пользоваться лимонно- или щавелевокислым натром). При поступлении первых порций крови колбочку (или пробирку) нужно сразу слегка встряхнуть, фибрин осядет на шариках, в результате получается дефибринированная кровь, которая легко отсасывается пипеткой. После взятия крови место травмы у курицы (или петуха) зажимают тампоном для остановки кровотечения.

Дефибринированную кровь центрифугируют, сыворотку отсасывают пастеровской пипеткой, осадок эритроцитов суспендируют физиологическим раствором и вновь центрифугируют. Такие отмывание эритроцитов повторяют несколько раз до получения полной прозрачности жидкости над осадком эритроцитов. Затем отсасывают физиологический раствор, градуированной пипеткой насасывают осажденные эритроциты и в чистой колбочке готовят 1%-ную взвесь (1 см3 эритроцитов + 99 см3 физиологического раствора химически чистой поваренной соли).

Постановка реакции. В штатив вставляют 10-15 пробирок. Вместо пробирок лучше пользоваться специальной доской из плексигласа с углублениями емкостью 2 см3. В первую и вторую пробирки (или лунки доски) наливают по 1 см вируссодержащего материала. Во все пробирки, начиная со второй, разливают по 1 см3 физиологического раствора. Затем из второй пробирки пипеткой отсасывают 1 см3 жидкости и переносят ее в третью, из третьей берут 1 см3 в четвертую и т.д.

Таким образом, последовательно получают кратное разведение вируса (1:2; 1:4; 1:8 и т. д.). Из последней пробирки 1 см3 выливают в сливную чашку.

После приготовления разведений вируса во все пробирки вносят по 1 мл готовой 1%-ной взвеси отмытых эритроцитов кур. Объем жидкости в каждой пробирке (или лунке) - 2 см3. Пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Учет результата реакции проводят в зависимости от свойств вируса через 1,5 - 2,5 часа и больше.

При наличии вируса в исследуемом материале агглютинированные эритроциты осядут на дно пробирки в виде диска с неровными бахромчатыми зубчатыми краями. Чем выше концентрация вируса, тем характернее выражена реакция. По мере уменьшения концентрации вируса в пробирках (большая степень разведения) четкость реакции выражена слабее. В отрицательных случаях эритроциты оседают небольшим кружочком с ровными краями. Осадок легко разбивается в однородную тонкую суспензию.

Реакцией гемагглютинации и обнаруживают вирусы чумы птиц, оспы голубей, инфекционного гепатита утят, чумы собак, инфекционного энцефаломиелита лошадей, гриппа поросят, гриппа человека.

Вопросы для самопроверки:

1. Сущность РГА при диагностике вирусных заболеваний.

2. Что обнаруживают реакцией гемагглютинации?

3. Какие компоненты необходимы при постановке РГА?

4. Постановка РГА.

17.5.1.1.6 РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ (НЕПРЯМОЙ)

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) С АНТИТЕЛЬНЫМ

ЭРИТРОЦИТАРНЫМ ДИАГНОСТИКУМОМ

В качестве антигена для исследования в РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом используют суспензию из органов больных прогревают при 100°С в течение 10-20 минут. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Полученную надосадочную жидкость подвергают вторичному центрифугированию при 5000-6000 об/мин в течение 30 минут.

Надосадочную жидкость сливают, осадок разводят физиологическим раствором 1:3 и используют в качестве антигена для РНГА.

Постановка РНГА. В луночки полистироловой пластинки вносят калиброванной пипеткой 0,05 см3 разведенной на физиологическом растворе один из стабилизаторов (нормальная лошадиная сыворотка 1:500, твин-80 1:5000, глицерин 1:500). В первые ряды луночек вносят по 0,05 см3 исследуемого материала и делают последующие двукратные разведения. В раститрованный, таким образом, исследуемый материал добавляют 0,05см3 эритроцитарного антительного диагностикума и оставляют на 2-часа при комнатной температуре, после чего проводят учет реакции по следующей схеме:

# - эритроциты покрывают все дно лунки тонким равномерным слоем;

+++ - эритроциты покрывают почти все дно лунки, зонтик - несколько меньше диаметром, чем при 4 крестах реакции;

++ - агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки;

+ - вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютинации;

– - (минус) – реакция отрицательная, на дне лунки эритроциты оседают в виде пуговки или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.

Вопросы для самопроверки:

1. Что обнаруживают антительным эритроцитарным диагностикумом?

2. Какие компоненты используют для постановки реакции гемагглютинации при обнаружении антигена?

3. Когда и как проводят учет результатов реакции?

17.5.1.1.7 РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ПАССИВНОЙ

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТПГА)

Цель занятия:

При постановке реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) (для выявления специфических гемагглютининов) специфическое подавление (торможение) гемагглютинации осуществляется добавлением к испытуемой сыворотке специфического антигена в дозе 2-5 минимальных нейтрализующих единиц в объеме 0,2 см3. Смесь оставляют на 30 минут при температуре 37°С или 60 минут при комнатной температуре. После этого в каждую луночку добавляют по 0,05 см3 (одну каплю) антигенного эритроцитарного диагностикума.

Эритроциты перемешивают встряхиванием пластинки и оставляют на неподвижной поверхности. Через 2-3 часа учитывают результаты реакции. При наличии в испытуемой сыворотке специфических гемагглютининов в РТПГА они нейтрализуются добавленным антигеном и гемагтлютинация будет отмечаться в меньшем количестве луночек, чем при РПГА.

- антиген (в рабочей дозе) + позитивная сыворотка (заведомо известная) + (после 30 минутного выдерживания) антигенный эритроцитарный диагностикум (специфическая активность взятых для реакции ингредиентов).

Вопросы для самопроверки:

1. В чем заключается сущность РТПГА?

2. Какие компоненты необходимы для постановки РТПГА?

3. Какие контроли необходимы при постановке РТПГА?

4. Как проводится учет результатов РТПГА?

17.5.1.1.8 РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ АНТИТЕЛ (РНат) Цель занятия:

При постановке реакции нейтрализации антител (РНат) (при исследовании материала на наличие антигена) испытуемый материал (фильтрат взвеси тканей или другого объекта) титруют в объеме 0,2 см3. Затем во все луночки добавляют по 0,2 см3 специфической агглютинирующей сыворотки, содержащей две минимальные сывороточные (гемагглютинирующие) единицы.

Смесь оставляют при 37°С на 30 минут. Затем в каждую луночку добавляют по одной капле антигенного диагностикума. Пластинки встряхивают и оставляют на неподвижном месте в течение 2-3 часов.

По истечении указанного времени проводят читку реакции по схеме, обратной той, которая принята для РПГА.

Определение минимальной сывороточной (гемагглютинирущей) единицы.

С этой целью использую специфическую позитивную сыворотку, которую раститровывают до предельного разведения в реакции непрямой гемагглютинации.

В 10 лунок полистироловой пластинки наливают по 0,4 см 3 разводящей жидкости (нормальная кроличья сыворотка 1:100). В первую лунку приливают 0,4 см3 агглютинирующей сыворотки, предварительно разведенной 1:50 (в отдельной пробирке), получая, таким образом, 0,8 см3 в разведении 1:100. Путем дальнейшего переноса по 0,4 см3 в следующие луночки получают разведения сыворотки до 1:51200. В последние две луночки гемагглютинирующую сыворотку не добавляют (контроль эритроцитов с НКС и негативной сывороткой того же вида животных, что и позитивная). Затем во все лунки добавляют по одной капле (0,05 см3) антигенного диагностикума. Пластинки встряхивают и через 2- часа производят учет результатов реакции. Последняя в ряду луночка, где зарегистрирована полноценная гемагглютинация, является показателем максимального разведения сыворотки, содержащей минимальное количество гемагтлютинирующих единиц.

При постановке РНат берут сыворотку в удвоенном количестве (две гемагглютинирующих единицы).

Определение минимальной нейтрализующей дозы антигена. Для этого используют специфический антиген.

В 10 лунок полистироловой пластинки разливают по 0,2 см3 разводящей жидкости (1 %-ный раствор НКС). Затем в первую лунку добавляют 0,2 см3 предварительно разведенного (1:50) антигена. После чего из первой лунки переносят 0,2 см3 во вторую лунку, где разведение антигена составляет 1:20 и т.д. в 10-ой лунке разведение антигена будет равно 1:51200 (можно подсчитать, в случае использования корпускулярного антигена и знания исходного количества корпускул, количество микробных клеток в исследуемой взвеси.

Затем в каждую луночку добавляют две гемагглютинирующие единицы позитивной сыворотки (1 капля) смесь оставляют на 30 минут при комнатной температуре. После этого в каждую пробирку вносят 0,05 см3 антигенного эритроцитарного диагностикума. Эритроциты перемешивают встряхиванием пластинки и оставляют на 2-3 часа при комнатной температуре. Добавленная специфичная сыворотка нейтрализует имеющийся в лунках антиген и реакции гемагглютинации не будет, а проявится лучше в тех лунках, где осталась свободная сыворотка.

Можно определить минимальную нейтрализующую дозу антигена также посредством постановки РПГА с антительным эритроцитарным диагностикумом. Для этого раствор антигена также как и в первом случае, раститровывают (в объеме 0,4 см3). Затем во все лунки добавляют по одной капле антительного эритроцитарного диагностикума.

Учет результатов реакции производят через 2-3 часа. Последнее разведение, в котором еще отмечается четкая гемагглютинация, учитывается как одна нейтрализующая доза антигена.

Вопросы для самопроверки:

1. Сущность РНат.

2. Компоненты, используемые при постановке РНат?

3. Что является лимитирующим фактором в РНат?

4. Когда и как учитывают результаты РНат?

17.5.1.1.9 РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ (ЗАДЕРЖКИ)

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА, РЗГА)

Цель занятия:

Сущность РТГА заключается в том, что действие вируса тормозится (или подавляется) специфической сывороткой, в результате чего гемагглютинация не наступает.

Для постановки РТГА необходимо иметь вируссодержащий материал в разведении, соответствующем 4-кратной концентрации его титра, установленного реакцией гемагглютинации (титром называют наименьшее количество вируса, которое проявляет положительную реакцию). Например, таким наименьшим количеством оказалось разведение 1:128; следовательно, 4-кратная концентрация составит разведение 1:32. Наряду с вирусом необходимо иметь специфическую гипериммунную сыворотку, 1%-ную взвесь отмытых эритроцитов, физиологический раствор.

Для получения специфической антисыворотки гипериммунизируют какимнибудь определенным вирусом (например, вирусом чумы птиц) лабораторных животных (кроликов, морских свинок, петухов), то есть в их организм многократно вводят вирус через определенные сроки. Периодически от этих животных берут кровь и проверяют активность сыворотки, содержащей антитела, специфические в отношении вируса, служившего антигеном в процессе гипериммунизацнн. Активность сыворотки определяется ее титром.

Постановка реакции. В штатив помещают не менее десяти пробирок. В первые две пробирки (или луночки доски из плексигласа) наливают по 0,5 см3 сыворотки. Во все пробирки (кроме первой) вносят по 0,5 см3 физиологического раствора. Начинал со второй пробирки жидкости перемешивают и по 0,5 см3 переносят в последующие пробирки, то есть делают последовательные разведения сыворотки (из последней пробирки 0,5 мл выливают в сливную чашку с дезинфицирующим раствором). Затем во все пробирки добавляют вируссодержащий материал. По 0, см3. Пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 - 40 минут (или помещают в термостат на 10 - 15 минут) для взаимодействия вируса с антителами сыворотки. После этого во все пробирки вносят по 1 мл взвеси эритроцитов, пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 - 3 часа (в зависимости от вида вируса продолжительности выдержки и последующего учёта реакции может колебаться).

Положительным результатом реакции считают отсутствие гемагглютинации в пробирках с большей концентрацией сыворотки (меньшая степень ее разведения).

Вопросы для самопроверки:

1. Сущность РТГА.

2. Компоненты РТГА.

3. Постановка и учёт результатов РТГА.

Цель занятия:

Реакция нейтрализации основана на специфическом взаимодействии сывороток и вируса. Её применяют с диагностической целью и для типизации вируса.

В пробирки помещают вирус (для учебных занятий можно взять вирус болезни восприимчивым к данному вирусу. Контрольные животные получают вируссодержащий материал без сыворотки. Если в исследуемом материале содержится вирус, контрольные животные погибают. Животные, привитые смесью вирус + сыворотка, должны остаться живыми, так как специфическая сыворотка нейтрализует патогенное действие вируса. Используя известную сыворотку по ее нейтрализующему действию, устанавливают видовую (типовую) принадлежность вируса (например, специфическая антиящурная А сыворотка нейтрализовала действие вируса; отсюда вывод – в исследуемом материале от больной коровы был вирус данного типа).

Вместо биологической пробы на животных в реакции нейтрализации можно применять также куриные эмбрионы или культуры ткани. Эмбрионы, инфицированные смесью вирус + сыворотка, должны остаться живыми и развиваться, а контрольные (зараженные вирусом без сыворотки) погибнуть. В культуре ткани, инфицированной вирусом, отмечается цитопатогенный эффект; в культуре ткани, в которую вводили смесь вируса с иммунной специфической сывороткой, цитопатогенный эффект отсутствует - культура ткани развивается нормально.

Реакцией нейтрализации диагностируют и типизируют вирусы ящура, чумы птиц, бешенства и др.

Вопросы для самопроверки:

1. Сущность реакции нейтрализации.

2. Компоненты РН.

3. Где и когда используют РН.

научить слушателей осуществлять постановку иммуноферЦель занятия:

Из числа прямых реакций с дополнительными факторами наиболее употребительной в ветеринарной практике является иммуноферментный метод.

Этот диагностический тест основан на том, что при присоединении молекул антител и фермента они сохраняют свои функциональные активности, то есть антитела связывают антиген, а фермент расщепляет субстрат.

Схематично иммуноферментный метод можно представить следующим образом (рис.3).

Сначала лунки покрывают антигеном, после чего добавляют антитела, которые специфично с ним связываются. Избыток антител отмывают и добавляют антиген по отношению к используемым антителам (сыворотка крови кроликов иммунизированных исследуемой сывороткой), сшитый с ферментом.

Если связавшиеся антитела перекрестно реагируют и с антигеном, то связанный с ферментом антиген, то есть сыворотка иммунизированных кроликов будет также сорбироваться на твердой фазе. Количественно это будет определяться увеличением поглощения в результате проведения катализируемой ферментом реакции.

1 Сенсибилизация но- 2 Внесение испытуе- 3 Отмывка носителя сителя антигеном мой антителосодержащей жидкости нов, меченых пероксидазой Рисунок 3 – Схема проведения иммуноферментного анализа Постановке реакции предшествует титрование дополнительно фактора – антиглобулина, меченного пероксидазой.

Рабочее разведение антиглобулина определяют в ИФА методом перекрестного титрования.

Лунки полистироловой планшеты, адсорбированные специфическим антигеном, тщательно промывают.

Готовят двукратное линейное разведение специфической позитивной сыворотки от 1:100 до 1:102400 и негативную сыворотку 1:100 в объеме 1,0 см3.

Каждое разведение позитивной сыворотки разливают по 0,1 см 3 в короткие восьмигнездные ряды лунок в которых адсорбирован специфический гомологичный сыворотке антиген: в первый ряд из разведения 1:100, во второй - 1:200 и т.д., а в 12-й ряд вносят негативную сыворотку в разведении 1:100 (контроль).

Планшету закрывают крышкой и помещают в термостат при 37-38°С на один час.

Далее по истечении указанного времени, лунки планшеток тщательно отмывают.

Затем сухой антиглобулин к этой видовой сыворотке, меченный пероксидазой, растворяют в 5 см3 фосфатно-солевого буфера (ФСБ) и разводят до рабочего разведения перед использованием.

Из основного разведения (1:10) антиглобулина, меченного пероксидазой, готовят разведения от 1:10 до 1:12800 и каждое из них разливают по 0,1 см3 в 12гнездные длинные ряды лунок, содержащих различные разведения позитивной бруцеллезной сыворотки и негативную сыворотку 1:100. Планшету закрывают крышкой и выдерживают в термостате (37-38 °С) в течение часа. После чего лунки отмывают, как указано выше.

Во все лунки планшеты вносят по 0,1 см3 раствора ортофенилендиамина (ОФД) и выдерживают в термостате (37-38°С) в течение 15-30 минут.

Реакцию между ферментом и раствором ОФД останавливают путем добавления в каждую лунку по 0,05 см3 2Н раствора серной кислоты.

За титр антиглобулина, меченного ферментом, принимают его наибольшее разведение, дающее желтое окрашивание не менее чем в два креста с антигеном и специфической позитивной сывороткой, при отсутствии окрашивания в лунке с негативной сывороткой.

Постановка начинается с адсорбирования антигена на лунках планшеты.

Специфический антиген разводят 1:100 в натрий карбонатном буфере, и вносят во все лунки по 0,1 см3. Такие планшету оставляют на ночь при 4°С в холодильнике. Планшеты с адсорбированным антигеном пригодны в течение месяца при условии хранения их в холодильнике (4°С) упакованными в целлофан.

Затем лунки планшеты отмывают.

Испытуемые сыворотки крови разводят 1:100 и 1:200 фосфатно-солевым буфером и вливают в лунки, где адсорбирован антиген. Для этого в первой лунке готовят разведение 1:100, внося 0,002 см3 испытуемой сыворотки, и 0,198 см разводящей жидкости, а во вторую лунку – 0,1 см3 только разводящей жидкости.

После этого из первой лунки во вторую переносят 0,1 см3, из которой после смешивания 0,1 см3 удаляют. Планшету закрывают крышкой и помещают в термостат (37-38°С) на час.

После чего лунки планшеты отмывают, как указано выше.

Готовят рабочее разведение антиглобулина меченного пероксидазой, из основного разведения (смотри выше) по 0,1 см3 во все лунки. Планшету закрывают крышкой и выдерживают в термостате (37-38°С) в течение часа.

Процедуру прекращают отмывкой лунок, как указано выше.

Во все лунки вносят по 0,1 см3 раствора ортофенилендиамина и выдерживают при температуре 37-38°С 15-30 мин.

Иммуноферментную реакцию останавливают серной кислотой, как указано выше.

Учет и оценка реакции:

Реакцию учитывают визуально сразу после внесения в лунки 2 Н серной кислоты по цвету жидкости в опытных и контрольных лунках. Постановку считают правильной и учет результатов производят в случае, если в контрольных лунках с позитивной сывороткой произошло оранжево-коричневое окрашивание, а с негативной сывороткой окрашивание отсутствует или раствор имеет слабожелтый оттенок.

Оценка реакции:

++++ - оранжево-коричневое окрашивание;

+++ - желто-коричневое окрашивание;

++ - желтое окрашивание;

+ - слабо желтое окрашивание.

Диагностическая оценка результатов реакции. За титр принимается наибольшее разведение испытуемой сыворотки, обусловливающее окрашивание не менее чем в два креста. Титр 1:200 оценивается как положительный результат, а 1:100 - как сомнительный.

Контроль главного опыта. Одновременно с основным ставят следующие контроли:

с позитивной сывороткой крови, начиная с разведения 1:100 до предельного титра;

с негативной сывороткой в разведениях 1:100 и 1:200.

Вопросы для самопроверки:

1. На чем основан ИФА?

2. Что является лимитирующим фактором в ИФА?

3. Последовательность постановки ИФА.

4. Как осуществляется учет результатов реакции?

17.5.1.1.12 РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Цель занятия:

Наиболее употребительной в ветеринарной практике из лимитированных вариантов серологических реакций с дополнительными факторами является реакция связывания комплемента.

Длительное изучение специфического лизиса бактерий и животных клеток (бактериолизины, цитолизины, гемолизины) привело к открытию Борде (ученик И. И.

Мечникова) и Жангу (1901) особой иммунобиологической пробы названной ими реакцией связывания комплемента (РСК). В крови инфицированных организмов при ряде заболеваний (сап, бруцеллёз, перипневмония, трипаносомозов и др.), а также у животных, иммунизированных бактерийными и прочими белковыми антигенами, обнаруживаются особые антитела, выявляющие свою функцию в связи с комплементом (комплементсвязывающие антитела).

бактерийный антиген; 2) соответствующую антигену иммунносыворотку (антитело) и 3) комплемент (свежая сыворотка последний остается в пробирке свободным. Все три компонента вместе составляют бактериолитическую систему. Видимых изменений в пробирке где происходит РСК в бактериолитической системе, не отмечают ни в случае связывания, ни в случае отклонения комплемента; таким образом, отсутствует кокой либо критерий для решения вопроса, произошло ли связывание или отклонение комплемента в бактериолитической системе. Борде и Жангу вышли из создавшегося положения простым и оригинальным методом. В дополнение к составным частям бактериолитической системы они ввели в качестве индикатора гемолитическую систему: эритроциты барана (антиген) и специфический гемолизин против последних (сыворотка кролика, иммунизированного против эритроцитов барана).

Если в бактериолитической системе комплемент связался, гемолиза сенсибилизированных гемолизином эритроцитов не произойдет. Таким образом, отсутствие гемолизина эритроцитов указывает, что бактерийный антиген специфически соответствует иммунтелу, содержащемуся в сыворотке испытуемого животного. Отсюда можно сделать практический вывод, а именно; в испытуемой сыворотке имеются специфические иммунтела против данного микроорганизма.

Если в первой системе не произошло связывания комплемента, то наступает гемолиз эритроцитов, так как оставшийся свободным комплемент проявляет своё действие в гемолитической системе. Наступление гемолиза служит показателем наличия свободного комплемента в бактериолитической системе, что возможно лишь при отсутствии в испытуемой сыворотке иммунтел. Отсюда ясен и вывод: в испытуемой сыворотке специфических иммунтел против данного микроорганизма не имеется.

Возможен, однако, и третий исход: неполный гемолиз эритроцитов, когда в испытуемой иммунсыворотке оказывается незначительное количество антител.

В данном случае неадсорбированная комплексом «бактерийный антиген антитело» часть комплемента остается свободной, но её недостаточно для полного гемолиза взвеси эритроцитов.

Реакция связывания комплемента отличается не только высокой специфичностью, но и исключительно большой чуствительностью. В качестве антигена можно использовать, кроме бактерийных экстрактов, любые белковые вещества. В ветеринарной практике РСК приобрела большое значение в диагностике сапа, перипневмонии крупного рогатого скота, бруцеллеза и случной болезни лошадей. Она применяется также при диагностике некробациллеза, мыта, туберкулеза, паратуберкулеза, эпизоотического лимфангита, лептоспироза, риккетсиозов и некоторых вирусных инфекций (инфекционный энцефаломиелит лошадей, определение типов ящурного вируса и др.).

В медицине РСК используют для диагностики сифилиса (реакция Вассермана), риккетсиозов и других заболеваний.

Методика постановки реакции связывания комплемента. При постановки РСК применяют пять компонентов. Все они разводятся физиологическим раствором (0,85%). Каждый компонент вводится в строго вытитрованной для данного опыта дозе.

1. Бактерийный антиген 2. Испытуемая сыворотка крови исследуемого животного 3. Комплемент – свежая сыворотка крови морской свинки.

Перечисленные компоненты, каждый в объёме 0,2 мл соответствующего титра (т.е. разведения в физиологическом растворе), ставят в пробирке (после их смешивания встряхиванием) в водяную баню при 37ОС на 20 минут для связывания комплемента (собственно реактивная фаза). По окончании этого срока в пробирку добавляют компоненты 4 и 5.

4. Гемолизин – гемолитическая сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана.

5. Эритроциты барана – 2,5-3%-ная взвесь.

За этим следует вторичное помещение пробирок в водяную баню на минут (индикаторная фаза).

Таким образом, методика РСК предусматривает разобщение во времени реактивной и индикаторной фаз реакции: индикатор – гемолитическая система – вводится в опыт по окончании первой фазы течения реакции.

Решающее значение в методике РСК имеет точная титрация каждого компонента, т.е. выяснение в опыте наиболее оптимального его разведения в физиологическом растворе, обеспечивающего специфический результат реакции.

Наиболее изменчивым компонентом является комплемент, в отношении которого безусловно необходима титрация в день опыта и тщательное наблюдение за его активностью на всех этапах реакции. Проверка титра отдельных компонентов обеспечивается обязательной постановкой ряда специальных контрольных исследований в порядке проведения опыта РСК.

Точная титрация компонентов и четкое выполнение режима реакции (надлежащая температура, правильно изготовленный физиологический раствор, чистота посуды) – обязательные условия её постановки.

Для разведения определенного компонента используют специально выведенные формулы (их две).

Из сыворотки или вообще какого-либо другого составляющего реакции готовят основные разведения.

I – разведение 1:10, т.е. 1 часть компонента с 9 частями физиологического раствора;

II – разведение 1:100, т.е. 1 часть первого разведения и 9 частей физиологического раствора.

Из этих основных разведений производятся все остальные по формуле:

А – заданное разведение В – основное разведение 1 – это объём (обычно 1,0см3) основного разведения Основное разведение в большей своей части содержит физиологический раствор в связи с этим этот объём вычитается, т.е. он также идет на разведение.

Поэтому на такое количество по объёму нужно брать меньше разводящей жидкости.

Пример: из разведения 1:10 сделать разведение 1:100, т.е. нужно взять часть разведения 1:10 и добавить 9 частей физиологического раствора.

Из разведения 1:100 сделать разведение 1:2500, т.е. надо взять 1 часть разведения 1:100 и 24 части физиологического раствора. Всего получится 25, см3.

Но такое большое количество разведение требуется редко. Чаще всего для титрации нужно 2,0-5,0 см3 и если производить разведение, таким образом, то много довольно дорогих компонентов будут теряться напрасно. Чтобы этого не было, разведения готовят сразу в нужных количествах. Это можно делать двумя способами.

1-й способ. Количество основною разведения и физиологического раствора уменьшается в одинаковое число раз, например в 10 раз (в прежнем примере это будет 0,1+2,4=2,5 (см3). Этим способом можно получить приблизительные количества.

2-й способ. По нижеприведенной формуле получаем точно заданное количество искомого разведения.

X - заданное количество искомою разведения:

A - заданное разведение.

B - основное разведение, из которого готовят заданное.

Пример. Требуется приготовить 2 см3 разведения 1:1000 из разведения 1:100.

то есть 0,2 см есть объем разведения 1:100. Это количество надо вычесть из 2,0 см3 2,0 – 0,2=1,8 см3 Это количество физиологического раствора, которое нужно добавить к 0.2 см3 основною разведения, чтобы получить 2,0 см заданною разведения.

На практике часто последующее разведение готовят из предыдущего.

Пример. Приготовить разведения 1:500; 1:1000; 1:1500; 1:2000 и т.д. С этой целью берется 2.0 см3 разведения 1:100 и добавляется 8,0 см3 физиологического раствора. Это разведение 1:500. Из приготовленного разведения 1:500 берется см3 и добавляем 1 см3 физиологического раствора. Получим разведение 1:1000.

Далее из разведения 1:500 берем 1 см3 +2 см3 разводящей жидкости получим 1:1500. Также из разведения 1:500 берем 0,5 см3+1,5 см3 физиологического раствора получим 1:2000. Если названные компоненты возьмем в соотношении 0, см3 +2 см3. то разведение будет 1:2500. Разведение 1:1500 1+1= 1:3000 и т.д.

Можно, конечно, разведения произвести иначе, но все-таки нужно стремиться к тому, чтобы как можно больше получить разведений из какого-либо одного. В этом случае они будут более точными.

Комплемент разводится несколько иначе. Для более точной дозировки его лучше разводить 1:20, так как меньшая активность позволяет более точно определять нужное его количество.

Иногда бывает необходимо к имеющемуся основному разведению комплемента прибавить физиологический раствор, чтобы получить разведение с меньшим количеством чистою комплемента. Это нужно бывает делать при недостатке комплемента, когда готовят его для главного опыта. В этом случае поступают так:

1) определяют количество чистого комплемента в остатке основного разведения;

2) остаток чистого комплемента делят на количество чистого комплемента в 1,0 см3 приготовляемого разведения;

3) на полученное частное отделения умножаем количество физиологического раствора в 1,0 см3 приготовляемого разведения;

4) из этого числа вычитается количество физиологического раствора в оставшемся основном разведении;

5) полученное число будет обозначать количество (объем) физиологического раствора, которое нужно будет добавить к основному разведению, чтобы получить искомое разведение.

1. При постановке реакции осталось 5 см3 основною разведения комплемента (1:20). Требуется приготовить разведение с содержанием комплемента (чистой сыворотки морской свинки) 0,03 см3 в 1 см3. В 5 см3 основного разведения чистого комплемента 0,25 см3 и 4,75 см3 физиологического раствора.

2. В 0.25 см3 комплемента содержится 8,3 искомых доз по 0,03 см3. 0,25:

0,03=8,3 доз.

3. До объема 1 см3 в каждой искомой дозе не хватает 0,97 см3 (1- 0,03=0, см3). В 8,3 дозах (по 0,03 см3) должно содержаться 0,97 х 8,3=8,05 см3 физиологического раствора. Вычитаем из 8,05 - 4,75 (это количество физиологического раствора в 5 см3 оставшегося основного разведения комплемента) = 3,3 см3. В см3 основного разведения комплемента плюс 3,3 см3 физиологического раствора равно 8,3 см3 разведения с содержанием 0,03 см3 комплемента в 1 см3.

Схема титрования комплемента в гемолитической представлена в таблице 3. При этом комплемент титруют в разведении 1:10 или 1:20 в дозах от 0,02 до 0,2см3 с интервалом в дозах по 0,02 см3. После внесения комплемента в каждую пробирку добавляют недостающее до 0,2 см3 количество физиологического раствора и остальные компоненты по схеме как указано в таблице 4. Титром комплемента в гемолитической системе считают наименьшее количество его, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 минут в водяной бане при 37С.

Таблица 4 - Схема титрования комплемента в гемолитической системе Комплемент в разведении 1: Физиологический Гемолизин в удвоенном титре 2,5%-ная взвесь рана Физиологический раствор зультат В приведенном примере, титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08 см3.

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической системе на позитивной (бруцеллезной), негативной сыворотке крови того же вида животных, которых исследуют и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Допускается в качестве лимитирующего фактора брать гемолитическую смесь и проводить её титрование по схеме как указано ниже при описании постановки РДСК (см. ниже модификация реакции связывания комплемента).