«ВЫБОР ТАКТИКИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ МЫШЕЧНОНЕИНВАЗИВНЫМ РАКОМ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПРОМЕЖУТОЧНОГО РИСКА ...»

1

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ»

На правах рукописи

УРМАНЦЕВ МАРАТ ФАЯЗОВИЧ

ВЫБОР ТАКТИКИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ МЫШЕЧНОНЕИНВАЗИВНЫМ РАКОМ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

ПРОМЕЖУТОЧНОГО РИСКА

14.01.23 - урология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Павлов Саратов –

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Рак мочевого пузыря (общая характеристика, эпидемиология) 1.2. Патогенез и классификация форм рака мочевого пузыря 1.3. Биологические маркеры рака мочевого пузыря 1.4. Факторы риска развития рака мочевого пузыря 1.4.1. Экзогенные факторы риска 1.4.2. Генетические факторы риска 1.5. Прогноз и выбор тактики лечения при мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Объект исследования 2.2. Клинические методы обследования больных 2.3. Инструментальные методы исследования 2.4. Молекулярно-генетические методы исследования 2.5 Статистический анализ Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Молекулярно-генетические факторы развития рака мочевого пузыря Глава 4. ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА РЕЦИДИВА МЫШЕЧНО-

НЕИВАЗИВНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

4.1. Клинические факторы прогноза рецидива МНРМП 4.1.1. Анализ влияния гендерного факторов на риск развития рецидива в течение года 4.1.2. Анализ влияния возрастного фактора на риск развития рецидива МНРМП в течение года 4.1.3 Анализ влияния курения на риск развития рецидива МНРМП в течение года 4.1.4 Анализ влияния количества опухолевых очагов на риск развития рецидива МНРМП в течение года 4.1.5. Анализ влияния размеров первичной опухоли на риск развития рецидива МНРМП в течение года 4.1.6 Анализ влияния стадии заболевания на риск развития рецидива МНРМП в течение года 4.1.7. Анализ влияния степени дифференцировки опухоли на риск развития рецидива МНРМП в течение года 4.2. Генетические факторы прогноза рецидива МНРМП 4.2.1. Анализ полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков с риском развития рецидива МНРМП ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ 5.1 Алгоритм наблюдения и лечения пациентов с мышечно- неивазивным раком мочевого пузыря 5.2 Оценка результатов лечения пациентов с мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря промежуточного риска с использованием разработанного алгоритма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

95%CI – confidence interval (доверительный интервал) Ah – рецептор – арилгидрокарбоновый рецептор CYP – цитохром CYP1A1 – цитохром Р450 класса 1А GSTM1- ген глутатион-S-трансферазы класса мю (µ) GSTP1– ген глутатион-S-трансферазы класса пи (p) MDR – multi drug resistance N – объем выборки (число человек) OR – odds ratio (отношение шансов) SNP - single nucleotide polymorphism АФК – активированные формы кислорода ГП - генетические полиморфизмы ГСТ – глутатион-S-трансфераза п.н. - пар нуклеотидов ПАУ - полициклические ароматические углеводороды ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ПЦР - полимеразная цепная реакция РМП - рак мочевого пузыря МНРМП – мышечно-неинвазивный рак мочевого пузыря ФБК – ферменты биотрансформации ксенобиотиков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы В структуре злокачественных новообразований доля рака мочевого пузыря составляет почти 3,0%. Уровень заболеваемости в России в году составил 9,8 впервые выявленных случаев на 100 000 мужчин и 1, случая на 100 000 женщин, в 2010 году показатель составил 13,0 у мужчин и 1,8 случая на 100 000 у женщин. В России по данным 2010 года случаи заболевания раком мочевого пузыря в структуре онкопатологии составили 4,5% у мужчин (7 место) и около 1% у женщин. Уровень смертности мужчин также значительно выше [8; 23]. При этом смертность от рака мочевого пузыря в России превышает показатели смертности в мире на 19,8 %. В настоящее время только у 45 % больных рак диагностируется на ранней стадии. Ежегодно в мире раком мочевого пузыря заболевают 800 человек и 132400, то есть каждый третий, умирает от этого тяжелого заболевания [96].

Ежегодный рост заболеваемости и смертности больных раком мочевого пузыря стимулирует поиск методов диагностики, оптимальных подходов лечения и профилактики заболевания.

По данным различных авторов общая пятилетняя выживаемость больных раком мочевого пузыря не превышает 60% [34,111,182]. При этом общая пятилетняя выживаемость у пациентов, регулярно проходивших обследование после лечения составляет 64,0%, а у отказавшихся от дальнейшего наблюдения лиц– 27,0% [22].

Окончательно этиология и звенья патогенеза рака мочевого пузыря не установлены. Выявлены отдельные факторы риска, с большой вероятностью вызывающие возникновение рака. Вместе с тем своевременная диагностика и лечение опухолей мочевого пузыря остаются сложными и актуальными проблемами современной онкоурологии.

По данным зарубежных и отечественных исследователей, частота рецидивов мышечно-неинвазивного РМП после ТУР 60–90% [15,86].

Помимо высокой частоты рецидивов отмечается риск возможного прогрессирования заболевания в виде инвазивного роста опухоли (Т) или неблагоприятным прогностическим признаком развития РМП. Частота прогрессирования в период от 3 до 5 лет после различных видов лечения составляет для стадии Та 2–4%, для Т1 – 29–30%, а для CIS около 54% [209].

Для профилактики рецидива используется иммунотерапия БЦЖ и внутрипузырная химиотерапия (митомицин). В метаанализе состоящем из 11 клинических исследований, включающем 2749 пациентов показано, что терапевтическая эффективность интравезикальной инстилляции БЦЖ при рецидивах рака мочевого пузыря при среднем периоде наблюдения месяцев была выше. А в 6 исследований выявлено существенное превосходство БЦЖ терапии над ММС [38].

В 1996 г. H.W. Herr было предложено проведение повторной трансуретральной резекции опухоли для определения радикальности остаточной опухоли. В какие сроки и в каком объеме проводить до сих пор обсуждаются, но большинство рекомендуют проводить не раньше 2, но не позднее 6 недель. В эти сроки стенка МП восстанавливается после первой трансуретральной резекции мочевого пузыря [85]. Активно изучаются возможности повторной трансуретральной резекции мочевого пузыря – диагностические, потенциальные лечебные и прогностические, но результаты исследований недостаточно освещены. Однако данные различных авторов показывают, что повторная трансуретральная резекция мочевого пузыря может увеличить время выживаемости пациентов (безрецидивной и беспрогрессивной) [59, 76, 168], а также увеличить число рестадирований опухолей в сторону более агрессивных на 4–10 %.

гистологического исследования опухоли, таким образом данная операция позволяет оптимизировать прогноз [85]. Публикации отечественных авторов по данному вопросу содержат скудную информацию и в основном анализ результатов исследований зарубежных авторов.

С целю наблюдения за пациентами после трансуретральной резекции мочевого пузыря проводится динамическое наблюдение – контрольные цистоскопии и цитологическое исследование мочи.

Цитологическое исследование мочи имеет ряд недостатков. Обладет высокой чувствительностью при низкодифференцированных опухолях (G3) и опухолях высоких стадий (рТ1–Т4). Однако чувствительность при высокодифференцированных опухолях очень низкая. Кроме того, результаты исследования зависят от квалификации цитолога [152].

разработаны различные методы диагностики РМП, основанные на определении растворимых или клеточно-ассоциированных маркеров в моче. Несколько из таких маркеров стали применяться в клинической практике, однако на данный момент ни один из них не был признан стандартным диагностическим в урологической практике или внедрен в рекомендациях. [109].

Многочисленные данные убедительно доказывают существенную злокачественного процесса и развития опухоли. Однако закономерности функционирования генома раковой клетки еще далеки от понимания [206].

Европейским обществом по изучению и лечению рака (EORTC) для определения алгоритма лечения и наблюдения за пациентами мышечнонеинвазивным раком мочевого пузыря была разработана система оценки рисков развития рецидива и прогрессии [33]. Данная система оценки основана на клинико-морфологических параметрах опухоли. Тем не менее разделение, в основе которого лежат морфологические характеристики опухолей, не может полностью отражать клинический потенциал рака мочевого пузыря. Пациенты с высоким риском рецидива получают БЦЖ терапию как более эффективную, с низким риском- внутрипузырную химиотерапию. В случае ратификации промежуточного риска возможно применение обоих методов, однако учитывая побочные эффекты БЦЖ терапии назначение данного вида лечения показано при неблагоприятном прогнозе, в связи с этим большое внимание в последние годы уделяется поиску дополнительных факторов прогнозирования течения заболевания.

Определение таких факторов должно привести к созданию цельной прогностической системы, использование которой в клинической практике позволит разделить опухоли с различным клиническим течением и предположить прогрессирование, рецидивирование и метастазирование РМП с высокой вероятностью. В подобную систему могут быть включены иммуногистохимические, биохимические, транскриптомные и протеомные маркеры. На сегодняшний момент одним из наиболее перспективных направлений является определение молекулярно-генетических изменений в наследственном аппарате клетки и использование их в качестве клинических маркеров, определяющих характер и прогноз заболевания.

Необходимость определения прогностического значения молекулярногенетических маркеров послужила основанием для проведения данной работы.

Улучшение результатов лечения больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря промежуточного риска путем разработки алгоритма ведения пациентов с учетом выявленных молекулярногенетических маркеров прогноза рецидива заболевания.

1. Изучить клинические факторы прогноза риска рецидива у пациентов мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря.

2. Изучить ассоциацию вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP1A2, GSTP1, GSTM1, ARNT, AHR, AHRR) с риском развития мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря.

3. Изучить ассоциацию вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP1A2, GSTP1, GSTM1, ARNT, AHR, AHRR) с риском рецидива у пациентов мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря в течении года.

4. Разработать алгоритм тактики ведения пациентов мышечнонеинвазивным раком мочевого пузыря промежуточного риска с учетом изученных факторов риска рецидива и оценить результаты лечения пациентов с учетом использования разработанного алгоритма.

Впервые в клинических исследованиях получены данные об ассоциации полиморфных вариантов генов системы детоксикации (CYP1A1 (A2455G), CYP1A2 (С-163А), CYP1A2 (T-2467delT), ARNT (c.522G>C).

Впервые проведена оценка корреляция полиморфных вариантов генов (CYP1A1 (A2455G), CYP1A2 (С-163А), CYP1A2 (T-2467delT), ARNT (c.522G>C) с риском рецидива мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря.

Впервые разработан алгоритм ведения пациентов мышечнонеивазивным раком мочевого пузыря промежуточного риска после ТУР ОМП с учетом изученных молекулярно-генетические маркеров.

Теоретическая и практическая значимость В теоретическом плане получены новые данные об ассоциации полиморфных вариантов генов системы детоксикации: (CYP1A1 (A2455G), CYP1A2 (С-163А), CYP1A2 (T-2467delT);

транслокатора - ARNT (c.522G>C) с риском развития рака мочевого пузыря.

Получены новые данные об ассоциации полиморфных вариантов генов: (CYP1A1 (A2455G), CYP1A2 (С-163А), CYP1A2 (T-2467delT), ARNT (c.522G>C) рекомендовать их использование в качестве прогностических маркеров.

В практическом плане материалы работы позволили улучшить результаты лечения больных мышечно-неинвазивными формами рака мочевого пузыря. Разработаны и внедрены в клиническую практику алгоритм лечения пациентов с промежуточным риском рецидива мышечно-инвазивных форм рака мочевого пузыря. Обнаружение полиморфных вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, ассоциированных с развитием рецидива мышечно-неинвазивного РМП, рекомендовать методы диспансерного наблюдения и послеоперационной профилактики рецидива заболевания у данных групп больных.

Вероятность Риск развития МНРМП увеличивается при выявлении генотипа *1A*2C и аллеля *2С гена CYP1А1(A2455G), генотипов *1A*1D, *1D*1D и аллеля *1D гена CYP1A2(Т-2467delT) Факторами риска развития рецидива МНРМП в тесении года дифференцировки опухоли и наличие генотипа *1A*2C и аллеля *2C гена CYP1А1(A2455G), генотипа *1А*1А и аллеля *1А гена CYP1A2(С-163А), генотипа *1D*1D и аллеля *1D гена CYP1A2(Т-2467delT), аллеля С гена ARNT (c.522 G>С).

Применение внутрипузырной БЦЖ терапии у пациентов МНРМП промежуточного риска рецидива с наличием рисковых генотипов и аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков для профилактики рецидива.

Результаты диссертационного исследования доложены пятой Всероссийской научно – практической конференция с международным предстательной железы. Новые технологии в урологии», 14 – 16 апреля 2011 г. Белорецкий район, Республика Башкортостан, VI Конгрессе Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкоурологии», 26-27 апреля 2012 года, Нижний Новгород, XII съезде Российского общества урологов, 18-21сентября 2012, Москва, Шестой Всероссийской научно – практической конференции «Актуальные проблемы онкоурологии. Заболевания предстательной железы. Новые технологии в урологии», 11-13 апреля 2013 г. Белорецкий район, Республика Башкортостан, а так же на заседаниях кафедры урологии с курсом ИПО ГБОУ ВПО БГМУ, Республиканского отделения Российского общества урологов (2007–2013г.г., Уфа).

Материалы данного исследования внедрены в учебный процесс кафедр ГБОУ ВПО «БГМУ», методы, использованные в работе, вошли в клиническую практику Клиники БГМУ, РКБ им. Г.Г.Куватова МЗ РБ, МБУЗ БСМП г. Уфа, ГБУЗ КБ № 8 г. Уфы.

публикациях, в том числе 12 в рекомендованных ВАК для опубликования диссертационных исследований.

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками, таблицами и диаграммами. Список использованной литературы содержит 215 источников, из них отечественных и 192 зарубежных.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Рак мочевого пузыря (общая характеристика, эпидемиология) Ежегодно в мире регистрируют до 200 000 новых случаев РМП. В увеличивается с возрастом, большинство больных выявляется в возрасте от 70-90 лет [21, 188]. Ежегодно в России по данным всемирной организации здравоохранения регистрируется до 1600 новых случаев данного заболевания среди мужчин и 666 случаев среди женщин, что составляет соответственно 11,3 и 2,2 на тысячу населения [55,134].

Мышечно-неинвазивный формы РМП (Ta, T1, CIS) выявляются у 75-80% больных выявляется.

1.2. Патогенез и классификация форм РМП Наиболее распространена TNM-классификация рака мочевого пузыря, утвержденная в 2002 г. Международным противораковым союзом (UICC) [180].

Термин поверхностного роста вводит в заблуждение, подразумевая более доброкачественный процесс в связи с чем более верно название мышечно-неинвазивный. Мышечно-неинвазивные формы не прорастают собственную мышечную пластинку и представляют поражения, ограниченные слизистой оболочкой (Ta и CIS) и те, которые не проникают глубже основной мембраны в собственную пластинку (T1). CIS является плоским, высокодифференцированным, атравматичным раком мочевого пузыря с очень высокими показателями рецидива и прогрессии в течение лет, при отсутствии лечения [170]. Все поражения задействующие Новообразования заключенные органом (T2a и T2b) обладают лучшим прогнозом чем при прорастании стенки мочевого пузыря в околопузырную клетчатку (T3) [97].

Опухоли Та и Т1 могут быть удалены с помощью трансуретральной резекции (ТУР), поэтому с лечебной целью они объединены в одну группу - поверхностного рака мочевого пузыря. Также включены в эту группу плоские опухоли высокой степени злокачественности, ограниченные слизистым слоем, классифицируемые как карцинома in situ (CIS). Однако методы молекулярной биологии и клинический опыт показывают более высокий злокачественный и инвазивный потенциал CIS и Т1 опухолей.

Поэтому термины «опухоль без инвазии в мышечный слой» и «поверхностный определением. [33].

Гистологические подтипы Переходноклеточный- наиболее распространенный патологический подтип рака мочевого пузыря, наблюдается в более чем 90 % опухолей [65], менее общие подтипы включают плоскоклеточный рак, наблюдаемый приблизительно в 5 % рака мочевого пузыря и аденокарцинома, наблюдаемая приблизительно в 1 % раковых образований пузыря [100].

Плоскоклеточный рак составляет до 75 % рака мочевого пузыря в определенных регионах мира, в которых шистосомозная инфекция (также известная как Bilharziasis) является эндемичной [63] Классификация уротелиальной карциномы мочевого пузыря без инвазии в мышечный слой по гистологическому признаку В 1998 г. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Международным обществом по урологической патоморфологии (International Society of Urological Pathology) была предложена и в 2004 г.

опубликована новая классификация неинвазивных опухолей уротелия (классификация WHO/ISUP 1998 г.) [64, 167].

Основная ценность этой классификации заключае определении различных степеней анаплазии на основании определенных цитологических и гистологических критериев.

Классификация ВОЗ 2004 г. подразделяет плоские новообразования на уротелиальную гиперплазию реактивную уротелиальную атипию, атипию неизвестного злокачественного потенциала, дисплазию и CIS.

Среди неинвазивных папиллярных уротелиальных новообразований классификация ВОЗ 2004 г. выделяет PUNLMP, уротелиальный рак низкой и высокой степени злокачественности

PUNLMP

цитологических признаков злокачественности, но нормальные клетки уротелия объединяются в папиллярные структуры. Хотя эти опухоли доброкачественными и имеют тенденцию к рецидивированию Умеренная степень дифференцировки (G2), которая считалась противоречи классификации ВОЗ 1973 г., была удалена [46,144] (рис. Рис.1 Степень аплазии опухолей и классификация ВОЗ 1973 и 2004г.

Гистологический спектр переходноклеточного рака. Рисунок воспроизведен из публикации G. T. MacLennan Histologic graiding of noninvasive papillary urotelial Как показали исследования классификация ВОЗ 2004 г. имеет более высокую воспроизводи воспроизводимость, чем классификация 1973 г. [116].

прогностическую ценность прогностическое преимущество одной из них привели к противоречивым результатам [46,116,167]. Большинство клинических исследований по ТаТ1 опухолям, опубликованных до настоящего времени, выполнялись с использованием классификации ВОЗ 1973 г., поэтому последующие рекомендации основываются на данной классификации. До тех пор пока прогностическая ценность классификации 2004 г. не будет подтверждена большим количеством проспективных исследований, можно пользоваться обеими классификациями.

Мышечно-неинвазивный РМП является гетерогенной группой злокачественных новообразований, которая включает [122]:

интраэпителиальные новообразования с низкой степенью дифференцировки (CIS) папиллярные новообразования, ограниченные слизистой мочевого пузыря (Та) опухоли, прорастающие в подслизистый слой или собственную пластинку слизистой (Т1) Из всех поверхностных опухолей мочевого пузыря новообразования, находящиеся в стадии Та составляют 70% а в стадии Т1 -30% [203]. Общая пятилетняя выживаемость больных РМП составляет более 70% [15].

Типичный путь классифицирования больных с опухолями ТаТ1 – это разделение их на группы, основываясь на прогностических данных, полученных при многофакторном анализе. Используя подобный метод, предлагается провести разделение пациентов на группы риска: высокого, промежуточного и низкого [122]. При работе с ними обычно не проводится никакого различия между риском рецидива и риском прогрессирования.

Даже если прогностические факторы выявляют высокий риск рецидива опухоли, риск прогрессирования может оставаться низким, другие опухоли могут создавать высокий риск как рецидива, так и прогрессирования болезни. Европейская организация по исследованию и лечению рака (EORTC) разработала таблицы на основе баллов риска отдельно для краткосрочного и долгосрочного прогнозирования прогрессирования и рецидивирования у каждого конкретного больного [192]. Основой этих таблиц послужила база данных EORТC, включившая информацию по больным раком мочевого пузыря ТаТ1, которые были рандомизированы в 7 исследованиях EORTC, не включавших больных с CIS. Внутрипузырные введения препаратов получили пациентов, большинство химиотерапию. Им не проводили повторную ТУР и продолжительную БЦЖ-терапию. Система баллов основывается на шести наиболее значимых клинических и морфологических признаках:

• дифференцировка опухоли • число опухолей • Т-критерий • размер опухоли • частота предшествующего рецидива • наличие сопутствующей CIS Табл. 1 иллюстрирует весовой коэффициент каждого признака, по которым подсчитывается общее количество баллов, соответствующее риску рецидива и прогрессирования. Табл. 2 показывает общее количество стратифицированных баллов, как представлено в оригинальной статье [192], по четырем категориям, отражающим различную вероятность развития рецидива и прогрессирования в сроки от 1 до 5 лет. Рабочая группа ЕАУ предлагает использовать трехуровневую систему определения групп низкого, промежуточного и высокого риска развития рецидива и прогрессирования путем комбинирования двух из четырех категорий, четко ассоциированных с развитием рецидива и прогрессирования, как показано в крайнем правом столбце табл. 2.

Баллы по подсчету риска развития рецидива и прогрессирования Число опухолей Диаметр опухоли, см Число предшествующих рецидивов Стадия Сопутствующая CIS Степень дифференцировки (ВОЗ 1973 г.) Вероятность развития рецидива и прогрессирования в соответствии с общим числом Баллы для Вероятность Вероятность развития Группа риска рецидива рецидива на 1-м дива в течение 5 лет, % рецидива Патогенез Процесс опухолевой трансформации эпителия мочевого пузыря– многостадийный (рис. 2).

Рис.2. Патогенез РМП (Proctor I., Stoeber K., Williams G.H., 2010).

накапливаются необратимые изменения в структуре ДНК, которые приводят единичным или множественным мутациям, реализуюшимися в изменении фенотипа клетки.

трансформированную клетку воздействует промотор, стимулирующий пролиферацию. Усиление экспресии протоонкогенов и подавление экспрессии генов супрессоров опухолевого роста является главными генетическими механизмами, благодаря которому промоторы превращают нормальные клетки в опухолевые. Большинство протоонкогенов кодируют Протоонкогены участвуют в передачи сигнала и в регуляции митоза, через свои белковые продукты. При мутации протоонкогена происходит его активация, после чего он становится онкогеном и может вызвать развитие опухоли [193]. Белки, вовлеченные в сигнальные пути являются типичными представителями продуктов протоонкогенов — белоки RAS, WNT (signaling pathway), Myc (avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), TRK (семейство тирозинкиназных рецепторов),ERK, MAPK (mitogen activated protein kinases).

канцерогенеза - супрессоры опухолей. Эти гены контролируют синтез белков, обнаруживающих и восстанавливающих повреждения ДНК.

Следовательно даже если имеется мутация протоонкогена и онкоген сигнализирует к пролиферации супрессоры опухолей способны тормозить деление в контрольных точках. Генами-супрессорами являются: ген р53, гены BRCA2 и BRCA1 (breast cancer associated gene), ген Rb1(ген ответственный за развитие ретинобластомы). Также к генам-супрессорам гематологических опухолей, ген WT1 (tumor-suppressor gene), повреждения которого приводят к нефробластоме, ген VHL, мутации которого вызывают синдром фон Хиппеля-Линдау (развитие множественных гемангиом) и карциномы почки, CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) и CDKN2B (cyclin-dependent kinase inhibitor 2B) и другие[159]. При инактивации гена hMLH1 (gene mutator L homologue 1) увеличивается вероятность возникновения злокачественных образований желудка и толстого кишечника. Дефекты в этих генах приводят к пролиферации клеток, злокачественному перерождению тканей и прогрессии 1.3 Биологические маркеры рака мочевого пузыря На сегодняшний день существуют предположения, что рак мочевого пузыря является результатом 2 отдельных механизмов [104 (Рис. 3).

Рис.3. Важные генетические и эпигенетические дефекты, которые характеризуют расходящиеся пути канцерогенеза рак мочевого пузыря Эти опухоли представляют собой гетерогенные групп болезней, которые состоят из главных фенотипических разновидностей, низкодифференцированный папиллярный вариант и инвазивный вариант.

Они обладают радикально различными биологически прогнозом [210]. Низко Низкодифференцированные неинвазивные опухоли характеризуются мутациями в генах HRAS и рецепторе фактора роста фибробласта 3 (FGFR3), тогда как при высокодифференцированных инвазивных опухолях часто присутствуют дефекты в p53 и pRb путях супрессии опухоли. [210]. Инвазия опухоли и прогрессия при раке мочевого пузыря многофакторный процесс, возникающий вследствие микроэкологических изменени многие из которых указаны на рисунке 4.

[210]. Ген-супрессор опухоли p53 играет ключевую роль в регулировании прогрессии клеточного цикла и апоптоза при токсических состояниях. Изза частотой p53 изменений при высокодифференцированном раке мочевого пузыря исследователи смотрели на p53 выражение в комбинации с другими маркерами. В многоцентровом исследовании Shariat и др.

изучалась комбинация p53, pRB, p21, и p27 с целью оценки возможности использования этих маркеров в качестве улучшения прогноза исходов болезней у пациентов с прогрессирующим раком мочевого пузыря, которым произведена радикальная цистэктомия с регионарной лимфодиссекцией. [171]. Комбинация молекулярных маркеров улучшила точность прогноза рецидива заболевания и раковоспецифической смерти после цистэктомии, тогда как в случае рассмотрении маркеров по отдельности такой закономерности не наблюдалось. Агенты, восстанавливающие функции супрессии опухоли генов-супрессоров опухоли, такие как p53 или Rb могут быть потенциально терапевтический значимыми [118, 207] Pagliaro и др. применяли в качестве лечения группы больных раком мочевого пузыря аденовирусные частицы с дефектом репликации, который кодирует дикий тип p53 (Ad5CMV-p53);

внутрипузырные инстилляции хорошо переносятся и обнаруживались в намеченной ткани мочевого пузыря [142]. Таким образом, генотерапия может использоваться, вводя вирусный ответ в пределах опухоли, которая распространению вируса по всей опухолевой массе [158]. Кроме того, это предполагает, что антигены опухоли, возникшие в результате лизирования опухолевых клеток, могли бы вызвать системный антиопухолевый иммуный ответ [158] Для определения степени антиопухолевого ответа, который может быть достигнут при использовании этих методов необходимо длительное исследование в этой области. Один из наибольших интересов на сегодняшний день к раку мочевого пузыря заключается в поиске потенциальных генетических маркеров, которые могли помочь диагностировать рак мочевого пузыря ранее и снизить потребность в частых цистоскопиях. Среди наиболее распространенных генетических изменений при раке мочевого пузыря потеря гетерозиготности (LOH) на коротком и длинном плечах 9й хромосомы, которая найдена независимо от дифференцировки опухоли и стадии заболевания. LOH на других хромосомах обнаруживается чаще при опухолях с более высокой степени микросателитные маркеры могут обнаружить изменения в генетическом материале связанные с раком, включая микросателитную нестабильность и LOH [133]. Недавнее мультицентровое проспективное исследование, показало, что микросателитный анализ был сильным предсказателем прогноза рецидива, но чувствительность метода была не достаточно высока, чтобы внедрить её использование в обычной практике [196] В однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1%. У SNP есть потенциальное преимущество перед микросателитным анализом. Они могут быть обнаружены на экране больше чем в 300 генетических локусах сразу по сравнению с 13-20 локусами, что приводит к большей чувствительности обнаружения молекулярных изменений [87] Тест флюоресцентная гибридизация in situ (FISH)- очередной тест, основаный на диагностике генетических отклонений в клетках, содержащхся в моче (Таблица 3). Метаанализ мочевых маркеров наблюдения, показали, что у FISH были средняя чувствительность 79 % и средняя специфика 70 %.

[201] Главные неудобством FISH является нехватка стандартизации критерия для положительного теста, низкой чувствительности обнаружения низкодифференцированных опухолей, его дороговизна и потребности в специально обученном персонале для выполнения теста [56,109]. Объединенное тестирование с другим маркером может улучшить эффективность этого биомаркера. Park и др. оценил амплификацию гена, экспрессию mRNA и экспрессию белка гена Aurora киназа (AURKA), кодирующий ключевой регулятор митоза, который часто усиливается и/или обнаруживается сверхэкспрессия в опухолевых клетках [146]. FISH тест на амплификацию гена AURKA обладал специфичность 96.6 % и 87% чувствительностью в обнаружении рака мочевого пузыря при анализе центрифугированной мочи [146]. Протеомика привела к открытию маркеров, которые могут потенциально использоваться с целью диагностики рак мочевого пузыря. Анализ малых молекул методом масспектрометрии с активируемой поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI) является техникой, которая может идентифицировать и определить количество биомаркеров в моче, таких как CXCL1 и матрикса металопротеиназы (MMP) [176]. CXCL1 является хемокином CXC, который как известно экспрессируется при инвазивном раке мочевого пузыря. Kawanishi и др. оценивали образцы мочи здоровых людей и пациентов с поверхностным раком и инвазивным раком мочевого чувствительностью 70 % и специфичностью 81 % в качестве прогноза рака мочевого пузыря [101]. MMP-связанные комплексы, которые, как предполагает. Роем, и др, содержатся в большем количестве при злокачественных новообразованиях. Как MMP-2 так и MMP-9 димеры были обнаружены достоверно выше в образцах мочи у 41 пациента с раком мочевого пузыря по сравнению со здоровыми [161]. Произведён анализ мочевых тестов (Таблица 5). Эпигенетика - область, которая одновременно эволюционировала с геномикой и протеомикой и обращается к обратимым изменениям в функции гена, которые происходят без изменений в генетической последовательности [176]. Наиболее распространенные эпигенетические изменения, изученные в маркерах опухоли мочевого пузыря, касаются метилирования ДНК [176]. Lin и др. оценивали промоутер метилирования Е-кадерина, p16, p14, и RASSF1A у пациентов с раком мочевого пузыря и обнаружили, что RASSF1A был лучшим самостоятельным маркером, с чувствительностью 65 %, а также, что у комбинации RASSF1A, p14, и Е-кадерина чувствительность обнаружения рака мочевого пузыря составила 83 %. Гиперметилирование этих генов не был обнаружен ни в одном из 20 образцов мочи от здоровых людей контрольной группы. [107]. Эти маркеры потребуют ратификации в будущих исследованиях, однако, мочевые маркеры в настоящее время разрабатываются. Несмотря на то, что цистоскопия - "золотой стандарт" в диагностике рака мочевого пузыря, однако необходимо учитывать, что это инвазивный метод и относительно дорой [41].

Обзор существующих маркеров рака мочевого пузыря Цитологическое Уротелиальные Да Низкая чувствительность для исследование осадка клетки низкодифференцированных Fluorescence in situ Хромосомы Да Отсутствие стандартизации hybridization (FISH) 3,7,17 и 9p21 критериев положительного NMP- BLCA- BLCA- Aurora kinase (AURKA) CXCL Matrix metalloproteinase FGFR рекомендованные FDA, представлены в табл.4.

Доступные в настоящее время мочевые маркеров рака мочевого пузыря.

За последнее время опубликовано большое количество обзоров мочевых маркеров [2]. Основные достоинства и недостатки каждого из маркеров кратко представлены в таблице (табл. 5) Маркеры экспрессии генов uCyt+ пузыря (таблица 5). [133]. Он не требует подготовки и является самым надежным маркером для обнаружения CIS [109]. Специфичность данного Недостатками цитологии мочи являются ее низкая чувствительность при начальной стадии болезни, а также значимость на уровне экспертизы высокочувствительный и специфичный маркер рака мочевого пузыря может снизить заболеваемость. NMP-22 - ядерный митотический аппаратный белок, который вовлечен в правильное распределение хроматина к дочерним клеткам во время клеточной репликации [211]. В 2005 в рамках клинического исследования проводилось определение NMPвместо цистоскопии у пациентов с риском развития рака мочевого пузыря в качестве скрининга у 1000 пациентов, чувствительность и специфика теста NMP-22 составляли 55.7 % и 85.7 %, соответственно, разница между NMP-22 и цитологией мочи не обнаружена. Результаты NMP- мочекаменной болезни. [153]. BTA stat и тесты BTA-TRAK (Polymedco, Cortlandt Manor, NY) обнаруживают белок связанный с H-фактором комплимента в моче. BTA stat является иммунологическим обследованием, которое может быть выполнено в течении 5 минут, тогда как BTA-TRAK – стандартизированный энзимсвязанный иммуноферментный анализ [133].

BTA stat тест может быть ложно положительным во многих случаях, которые вызывают гематурию [130,137]. Специфичность BTA stat и тестов BTA-TRAK среди здоровых людей 90 %, но составляет приблизительно %-60 % у пациентов с различными доброкачественными заболеваниями мочеполовой системы [110].

Флюоресцентная имуноцитхимия использует флуорисцирующие моноклональные антитела с целью обнаружения опухолевые клетки.

Средняя чувствительность и специфичность составляют приблизительно 80 %. При этом чувствительность теста не коррелируется с объемом повреждения уротелия [110].

Недостатки флюоресцентной иммуноцитохимии – необходимость существенного опыта, регулярного контроля качества и времени для изучения исследуемого материала [110], BLCA-4 - транскрипционный фактор, который обнаруживается как в опухолевой, так и в нормальной тканях мочевого пузыря, однако BLCA-4 не обнаруживается в случает отсутствия новообразований мочевого пузыря [199]. Исследование с использованием BCLA-4 – имуноферментный анализ (ИФА) с моноклональными антителами [109]. В отличие от BLCA-4 BLCA- обнаруживается только в опухолевой ткани в мочевом пузыре и повышение уровня напрямую коррелируется с более высокой стадией заболевания [109] Антитела были предназначены для обнаружения BCLAв моче с помощью блоттинга и ИФА.[129] Оба BLCA-4 и BLCA- являются потенциально полезными маркерами рака мочевого пузыря, потому что они обнаруживают рак мочевого пузыря с высокой чувствительностью и специфичность. Необходимы крупные клинические исследования, проведенные в нескольких центрах для дальнейшей оценки этих маркеров [109], FGFR3 это гликопротеин, являющийся частью семейства рецептора тирозинкиназы [82,200]. При раке мочевого пузыря FGFR3 мутации происходят примерно в 50% случаях и эти мутации происходят в основном при немышечноинвазивных опухолях с низким риском рецидива и, как считается, связаны с благоприятным прогнозом [82,200, 202]. Фаза 2 клинического исследования TK1258 (Novartis, Базель, Швейцария), фармакологии ингибитора рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), рецептора фактор роста тромбоцитов (PDGFR) и рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR) показало подавление распространения роста ксенотрансплантата раковых клеток in vitro, что приводит к гиперэкспрессией FGFR3 [60, 154]. Таким образом, несколько маркеров показали перспективы в качестве неинвазивных биомаркеров рака мочевого пузыря, а некоторые могут осуществлять роль терапевтических мишеней. На сегодняшний день, однако, не применимо их использование в клинической практике в связи с отсутствием доказательств, свидетельствующих о том, что результаты базируются на практической основе. Кроме того, на данный момент, ни один из упомянутых маркеров не обладает высокой чувствительностью и специфичностью и таким образом не может заменить цистоскопию. При этом большинство маркеров не дают большую пользу в сочетании с цистоскопией и цитологией.

1.4 Факторы риска развития рака мочевого пузыря 1.4.1 Экзогенные факторы риска РМП у мужчин встречается в несколько раза чаще, чем у женщин.

Высокая заболеваемость РМП мужчин, объясняется экологическими и диетическими факторами, врожденными анатомическими особенностями и гормональными факторами [36]. Канцерогенность табачного дыма, профессиональные вредности (работа с ароматическими аминами) - два основных экологических фактора риска развития РМП. Курение табака — доказанный фактор риска развития рака мочевого пузыря, в 50—65% случаев у мужчин и 20—30% —у женщин является его причиной. В 1955 г.

Впервые Holsti и соавторы выявили повышение риска опухолей мочевого пузыря у мышей в результате воздействие табачных смол на слизистые верхних дыхательных путей [64]. Причинная связь выявлена между экспозицией табака и раком в исследованиях, в которых случайность была устранена с достаточной достоверностью [45].

У рака мочевого пузыря есть много известных факторов риска, хотя много случаев возникают без очевидного связи с канцерогенными веществами [74]. Курение сигарет - самый значимый фактор риска развития рака мочевого пузыря, риск населения (population attributable risk) связанный с курением составляет 46% [29]. Кроме того, относительный риск (OR) смерти от рака мочевого пузыря среди мужчин- курильщиков 3.3, а для бывших курильщиков 2; OR для женщин 2.2 и 1.9 соответственно [29]. Хотя конкретные канцерогенные вещества в сигаретном дыме, ответственном за высокий риск рака мочевого пузыря, неизвестны, предполагается что ароматические амины являются провоцирующим фактором [204]. Четырехлетний отказ от курения уменьшает риск рака мочевого пузыря на 40 %, что свидетельствует о важной роли прекращения курения у пациентов [36]. Многие химикаты являются канцерогенными веществами для рака мочевого пузыря, включая анилиновые краски, которые часто присутствуют в цветных тканях и циклофосфамиде [204].

Работа с длительной экспозицией с ароматическими аминами, которые включают бетанафтиламин, 4-аминобифенил, бензидиновые и другие потенциальные канцерогенные встречаются в красильной и кожаные отрасли промышленности и других группах рабочих такие как автомобилестроители, водители грузовика, слесари, в бумажном и резинотехническом производстве, рабочие литейного завода, специалисты по химической чистке, зубные техники, парикмахеры, и морские инженеры [57]. Обычно рак мочевого пузыря не проявляется до 30 - 50 лет стажа с профессиональной вредностью [74]. Также с повышенным риском рака мочевого пузыря связывают и другие химические агенты.

Значительно более высокий уровень рака мочевого пузыря был обнаружен в северо-восточном Тайване с эндемический высоким уровнем мышьяка в воде [51]. Также высокий риск рака мочевого пузыря был найден у людей, принимающих внутрь китайскую травяную добавку для снижения массы тела, в которой — из-за производственной ошибки — трава Stephania tetrandra была случайно заменена Aristolochia fangchi, которая является канцерогенном [135]. Увеличенное потребление жидкости может снижать риск рака мочевого пузыря у мужчинах, что было предложено как диетическая модификация для пациентов с раком мочевого пузыря, увеличивая диурез, уменьшается время контакта канцерогенных веществ с уротелием, снижая тем самым их относительную концентрацию. [Ошибка!

Источник ссылки не найден., периодом 10 лет продемонстрировало, что потребление жидкости обратно пропорционально риску развития рака мочевого пузыря; риск рака мочевого пузыря у мужчины с самым большим потреблением жидкости (больше чем 2531 мл/день) приблизительно вдвое больше чем у мужчин с исследования, однако, были не в состоянии продемонстрировать достоверную корреляцию между потреблением жидкости и риском развития рака мочевого пузыря [71]. Инфекция мочевыделительной системы, хроническое раздражение от катетеров или камней мочевого пузыря, нефункционирующий мочевой пузырь связаны с повышенным риском развития плоскоклеточного рака мочевого пузыря [128]. Инфекция мочевого пузыря микроорганизмом Schistosoma haematobium повышает риск развития рака мочевого пузыря, особенно плоскоклеточного рака, и являются эндемическими в Египте; воспаление вызванное выделениями этого паразита играют в онкогенезе [74]. Имеются данные о связи лучевой терапии органов малого таза, например у мужчин с раком простаты, с последующим повышенным риском рака мочевого пузыря [166].

К предполагаемым канцерогенным компонентам табачного дыма относятся: ариламины (4-аминобифенил), полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), гетероциклические амины, N-нитрозосоставляющие и различные эпоксиды. Длительности и интенсивность курения (число заболеваемостью РМП[45]. Отмечается, что у лиц, начавших курить и у тех, подвергавшихся пассивному курению в молодом возрасте риск рака мочевого пузыря выше. [36]. Непосредственное снижение риска развития рака мочевого пузыря наблюдалась у тех, кто прекратил курить. Это снижение составило около 40% за первые 4 года прекращения курения и достигло 60% после 25 лет отказа от курения табака [45]. Стимулирование отказа от курения приведет к снижению заболеваемости раком мочевого пузыря как у мужчин, так и у женщин. Профессиональная экспозиция является вторым важным фактором риска рака мочевого пузыря. Случаи, связанные с профессиональной деятельностью, в ряде исследований составляют 20—25% от всех случаев возникновения рака мочевого пузыря.

производные бензола и ариламины (2-нафтиламин, 4-АВР, 4,4`метиленэдиателин и о-толуидин). Профессии, в которых встречается экспозиция к данным канцерогенам, включают промышленность с использованием красителей, резины, текстиля, красок, кожи и химикатов [147].

использование данных веществ оказывает минимальное влияние на объединенном анализе 11 исследований методом случай — контроль по изучению рака мочевого пузыря, проведенных в европейских странах между 1976 и 1996 гг., сообщено о тенденции в снижении заболеваемости раком мочевого пузыря, связанной с профессиональными вредностями [103]. Пример профессиональной вредности — экспозиция ароматических аминов, которые являются канцерогенами для уротелия и которые могут Предполагается, что лиц у которых ацетелирование проходит медленно риск развития рака мочевого пухыря выше,чем у быстрых ацетиляторов.

ассоциировано с высоким риском рака мочевого пузыря. NAT1 и NAT2 — гены N-ацетилтрансферазы вовлечены в процесс инактивации [69].

Ряд исследований наводил на мысль о возникновении риска рака мочевого пузыря вследствие воздействия фенацетина, также упоминается, что данное явление дозозависимое, однако эти данные противоречивы в отношении его производного — ацетоминофена. В 1987 г Международным агентством по изучению рака (МАИР) фенацетин был включен в список веществ с доказанной канцерогенной активностью у человека. [49].

Сообщалось, что риск развития вторичных злокачественных опухолей мочевого пузыря после проведения дистанционной лучевой терапии при гинекологических злокачественных опухолях увеличивается от 2 до 4 раз [52]. Заболеваемость раком мочевого пузыря была статистически значимо ниже у больных раком предстательной железы, после радикальной простатэктомии в сравнении с пациентами, подвергнутыми дистанционной лучевой терапии [40].

Некоторые пищевые факторы связаны с развитием рака мочевого пузыря, но данные различных исследований противоречивы. В настоящее время недостаточно доказательств о причинной взаимосвязи между раком мочевого пузыря и пищевыми факторами. Метаанализ 38 статей представил данные в поддержку гипотезы о взаимосвязи диеты и рака мочевого пузыря, так как прием овощей и фруктов снижает риск развития последнего [187].

Существует прямая связь инвазивного рака мочевого пузыря, особенно плоскоклеточного рака с наличием хронической инфекции мочевыводящих путей. Доказано, что шистосомоз мочевого пузыря является причиной рака мочевого пузыря, при этом риск развития увеличивается в раза. Шистосомоз является второй наиболее распространенной паразитарной инфекцией после малярии. В странах Африки, Азии, Южной Америки и Карибского бассейна около 600 млн человек заражены шистосомозом [24]. Также доказана связь применения циклофосфамида при лечении лимфопролиферативных и других неонкологических заболеваний с последующим развитием инвазивного рака мочевого пузыря. При этом латентный периодом может составлять от 6 до 13 лет. Именно акролеин, являющийся метаболитом циклофосфамида, ответствен за увеличение заболеваемости раком мочевого пузыря [99].

При ретроспективном анализе больных, подвергнутых цистэктомии, продемонстрировано, что у женщин чаще диагностируется первичный инвазивный рак мочевого пузыря, чем у мужчин (85% против 51%).

Предполагается, что у женщин на момент диагностирования рака возраст старше, что оказывает прямой эффект на их продолжительность жизни. К тому же у женщин с гематурией, вероятно, постановка диагноза занимает больше времени, так как проводится дифференциальная диагностика с более распространенными заболеваниями, чем рак мочевого пузыря [47].

1.4.2. Генетические факторы риска РМП Генетическая предрасположенность является важным фактором риска развития РМП. В формировании опухоли мочевого пузыря установлено прямое или косвенное участие множества генетических и эпигенетических изменений. Однако рассмотрение меженного взаимодействия в развитии РМП и его клинических форм не проводилось [151].

кодирующие белки, участвующие в канцерогенезе могут предрасполагать к изменению их функциональной активности. [5]. Полиморфизмы, являясь в основном нейтральными, меньше подвержены естественному отбору, поэтому их частота в популяции весьма значительна. Однако, генетические полиморфизмы не всегда проявляются как нейтральные мутации.

Существенно чаще полиморфизмы повергают к появлению белковых субстратов с несколько измененными свойствами (физико-химическими) и тем самым изменяют их активность (функциональную). Многоими исследованиями показано, что в зависимости от географических условий, этнической принадлежности различные варианты генов могут предрасполагать, либо, наоборот, препятствовать проявлению различных заболеваний. Гены, ассоциированные с повышенным риском развития заболевания, получили название генов предрасположенности [1, 3; 17].

Полиморфные варианты генов системы биотрансформации ксенобиотиков являются наиболее годящимися генетическими маркерами для изучения многофакторных, в том числе и онкологических заболеваний.

В отличие от других классов генов, экспрессия варианты генов системы биотрансформации ксенобиотиков непосредственно регулируется влиянием факторов окружающей среды химической природы [4,14,131.].

Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков Гены ФБК являются модификаторами главных генов онкогенеза.

Механизм токсического действия химических веществ в основе своей содержит их способность нарушать биохимические процессы: биосинтез белка, тканевое дыхание, окислительное фосфорилирование, перекисное окисление липидов,метаболизм ксенобиотиков [12,13].

Известно, что биотрансформация ксенобиотиков происходит в несколько этапов. При этом участвуют многие ферменты детоксикации.

Главным образом система метаболизма ксенобиотиков содержит следующие процессы: активация (этап 1), детоксикация (этап 2) и выведение (рис. 4) [80].

Рис. 4. Основные фазы биотрансформации ксенобиотиков (Баранов В.С., 2004).

цитохромов семейства P450 (монооксигеназы), эстеразами амилазами, микросомальной эпоксидгидролазой алкогольдегидрогеназами [18]. Биологически активны ксенобиотики, обладающими свойством липофильности, к которым относится токсичные метаболизируются цитохромами семейства Р450 [61].

эндоплазматическом ретикулуме жизненно важных органов (печень, почки, легкие, мозг кожа). С помощью этих систем происходит биотрансформация огромного числа гидрофобных соединений ксенобиотиков в электрофильные метаболиты.

В случае воздействия промежуточных продуктов с ключевыми внутриклеточными макромолекулами возникают токсичны тератогенные, мутагенные и канцерогенны эффекты.

Цитохром Р450 участвует в синтезе и метаболизме многих важных классов физиологических соединений. К ним относят жирные и желчные нейротрансмиттеры. Однако основной функцией этого класса ферментов является детоксикация широкого спектра ксенобиотиков [16]. Имеются данные, что вместо детоксикации монооксигенирование ксенобиотиков (ароматические амины, ПАУ, толуол, анилин, азобензолы) с дальнейшим их превращением в высокотоксичные метаболиты. Последние, в свою очередь, способствуют изменению активности редокс-чувствительных внутриклеточных регуляторных белков и факторов транскрипции, непосредственно связанных с нуклеиновыми кислотами, и таким образом проявляют генотоксичность. Также было обнаружено, что цитохром Р обладает способностью к катализу оксидазных реакций, в результате которых образуются активные формы кислорода [19].

Основная функция 2 стадии метаболизма ксенобиотиков состоит в нейтрализации и детоксикации токсичных продуктов (гидрофобных), образовавшихся в результате детоксикации (фазы 1). Функционирование всех ферментов фазы 2 сводится к метаболизму веществ, обладающих функциональной группой. В этой фазе принимают участие глутатион-Sтрансферазы, ацетилтрансферазы, метилтрансферазы, глюкуронилтрансферазы, сульфотрансферазы и другие. Эти ферменты в основном локализуются в гиалоплазме, часть - раположена в мембранах митохондрий и эндоплазматического ретикулума.

осуществляется через почки, легкие и кишечник. Гены, которые кодируют полиморфных вариантов и мутаций генов лекарственной устойчивости, а также определение их влияния на экспрессию является потенциально значимым.

В результате скоординированных действии первых двух фаз многие тысячи ксенобиотиков модифицируются в гидрофильные метаболиты [18].

Доказано, что этапы обезвреживания ксенобиотиков активируемые. Фазы чрезвычайно скоординированы, любые изменения, будь то качественные обезвреживания. Что приводит к непредсказуемым, а иногда и вредным последствиям для организма [4].

значительные отличия в метаболизме экзогенных соединений, а также рассматриваться в качестве фактора предрасположенности к заболеваниям [4].

биотрансформации ксенобиотиков также могут определять не только предрасположенность к онкологическим заболеваниям, в частности к раку мочевого пузыря, но и предопределять клинические формы заболевания [9; 77].

уникальной способности лежит множественность цитохромов Р450.

каталитической активностью, но разнообразными субстратными характеристиками.

конститутивные и индуцибельные. При этом необходимо отметить, что это подразделение не зависит от структуры и хромосомной локализации.

Конститутивные изофoрмы Р450 независимо от условий роста постоянно продуцируются клеткой. Экспрессия активируемых ферментов контролируется химическими соединениями. Одно из важнейших свойств этих ферментов, приобретенное в процессе эволюции- специфическая индукция отдельных форм Р450. Временами ферменты своего метаболизма, в том числе цитохромы Р-450, активируются экзогенными веществами. Это необходимо знать при приеме лекарственных средств, побочным действием которых является индукция ферментов собственного метаболизма. В ответ на попадания в клетку чужеродных соединений формируется адаптивный ответ, важнейшей составляющей которого является феномен индукции цитохрoмов Р450. Происходит усиление функции детоксикации организма, что способствует вывведению ксенобиотика.

НАДФН используется цитохром Р450 в качестве кофактора монooксигенирования [19].

НАДФН+Н+ +О2 +R НАДФ+ +Н2О+RO; где R - субстрат Доказано участие ферментов системы цитoхрома Р450 в метаболизме ряда канцерогенных веществ, а именно: ПАУ, ариламинов, гетероциклических аминов, нитрозоаминов, стероидов, афлатоксинов и т.д.

и являются наиболее изученными [177]. Канцерогенный эффект этих веществ является результатом взаимодействия двух разнонаправленных процессов: метаболический- ведущий к активации или детоксикации канцерогенных веществ и процесс накопления организмом поврежденной ДНК.

Рис. 5. Роль цитохрома Р450 в процессах химического канцерогенеза (Куценко По данным литературы существует 36 семейств генов Р450. У млекопитающих представлено 12 генами. Суперсемeйство цитохрома Р (CYP) у человека описано 57 функциональноактивными генами и Необходимо отметить что ферменты первых 3 семейств CYP1, CYP2, CYP3 участвуют в преобразовании экзогенных соединений тогда как основной функцией остальных является участие эндобиотиков [91], хотя естественно данная специализация относительная [19].

В настоящее время семейство CYP1 представлено 3 генами CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 [91 Цитохромы Р450 1А1 осуществляют биоaктивацию следующих проканцерогенов и прooксидантов. Р450 1А1 – бензпирена и других ПАУ, которые обнаруживаются в табачном дыме. Цитохром Р 1А Канцерогенные полициклические ароматические углеводороды являются типичными индукторами CYP1А1. Позже был обнаружен еще более сильный индуктор, 2,3,7,8- тетрахлордибензодиоксин (ТХДД), способный из-за высокого сродства к арилгидрокарбоновому рецептору индуцировать ароматических углеводородов [177].

Ген CYP1A1 расположен на участке q22-q24 15й хромосомы.

Экспрессия его осуществляется главным образом печени, в лёгких [183], желудочно-кишечном тракте, головном мозге, макрофагах и лимфоцитах [19]. В настоящее время существуют описания четырех полиморфизмов данного гена, причём полиморфизм в 7 интроне, встречается только у Африканцев [70]. Трaнзиция аденина на гуанин гена CYP1A1 в 7 экзоне в положении 2455 приводит к смене изолейцина на валин в аминокислотной последовательности каталитического центра энзима. Такое изменение приводит к продукции фермента с активностью в 2 раза выше исходной [150]. По-видимому, увеличение ферментативной активности CYP1A может повергать к накоплению активных токсических веществ в клетке, наиболее опасными их которых являются активные кислородные молекулы (АКМ). Каталитическая активность фермента до сих пор дискуссионна, так как по данным других авторов полученных в результате эксперимента полиморфизм в этой области не изменяет активность фермента in vitro. Возможно он связан с другими функциональными полиморфизмами, например в регуляторной области [160].

предыдущим полиморфный вариант Т3801С, аналогично который приводит к повышению активности фермента [179]. По литературным данным сцепленные аллели полиморфных локусов A2455G и Т3801С гена CYP1A1 связаны с повышенным риском рака предстательной железы [26], развития рака легкого [92,160], рака мочевого пузыря [164], рака молочной железы [27], рака прямой кишки [178].

После взаимодействия загрезняющий веществ окружающей среды и химических веществ с Ah- рецептором происходит транслокация в ядро и формированием димера, который далее взаимодействует с ксенобиотикотвечающим элементом [30].

В отличие от гена CYP1А1 ген CYP1А2 метаболизирует многие химические соединения без индукции, так как является конститутивным.

Фермент CYP1А2 активен в отношении гетероциклических аминов, пищевых мутагенов, афлатоксина В1, ПАУ, ариламиноа и нитрозоаминоа.

Существуют доказательства участия энзима в метаболизме эндогенных соединений таких как стероиды. Цитохром P450 1A2 играет главную роль в метаболизме лекарственных препаратов (парацетамол, теoфилин, клозaпин, кофеин, фенацетин и т.д.) и нейрoтoксинов [164].

Метаболическая активация ариламинов осуществляется в два этапа.

Сначала с помощью CYP1A2 происходит N-гидроксилирование, после Также необхолимо отметить, что цитохром Р450 1A2 участвует в метаболизме 17-эстрадиола, чем определяет воздействие на организм эстрагенов.

Считается, что цитохром CYP1A2 является главным энзимом, участвующем в 1 фазе метаболизма ксенобиотиков. Выявлено, что CYP1A2 составляет примерно 15% всех цитохромов печени, где он также.

Активность CYP1A2 in vivо показывает существенные индивидуальные различия в связи с индукции экспрессии употреблением ряда продуктов и внешнесредовым воздействием. Сигаретный дым и ПАУ индуцируют CYP1А2. Такая индукция приводит к значительному увеличению количества белка и уровня мРНК.

Ген CYP1A2 содержит 7 экзонов на коротком плече 15 хромосомы в положении 15q22 и обладает более 40 однонуклеотидных полиморфизмов.

Близость последовательности аминокислот ферментов CYP1A2 и CYP1A составляет 71%, такое же сходство определяется и в субстратной специфичности.

В процессе исследования изначально описывалось 4 полиморфизма гена CYP1A2: A(G-3860A), B(T-2467delT), C(T-739G), и D(A-163C), которые получили наименование CYP1A2*1B, 1D, 1E, и 1F. Однако позже показано, что функционально значимыми являются только CYP1A2*1D и CYP1A2*1F. [163]. Выявлено, что полиморфизм гена CYP1A2 (-163А/С CYP1A2*1F) приводит к увеличению его индуцибельности, что изменяет каталитическую активность фермента [163]. Функциональная значимость продемонстрировал, что аллель гена CYP1A2*1F достоверно чаще встречался среди европейских курильщиков [164].

Арилгидрокарбоновый рецептор Известно, что транскрипционная активность генов CYP1A1 и обусловлена взаимодействием загрязняющими веществами CYP1A окружающей среды, химическихсоединений с арилгидрокарбоновым рецептором (AhR) с последующей транслокацией в ядро и формированием гидрокарбонового рецептора (ARNT), который далее взаимодействует с XRE-элементом (xenobiotic-responsive element) в промоторном регионе гена [22]. Кроме того, активированный лигандом арил гидрокарбоновый гидрокарбонового рецептора (AHRR). AHRR ингибирует сигнальный путь AhR, конкурируя с рецептором за димеризацию с ARNT и XREпоследовательностью без последующей транскрипционной активации.

Кроме того в литературе имеются данные о том, что отдельные полиморфные варианты этих генов способны модифицировать индивидуальную чувствительность к канцерогенам [148].

ксенобиотиков это глутатион-S-трансферазы (ГСТ). Основной функцией глутатинрансфераз является протекция клеток от продуктов перекисного окисления липидов и ксенобиотиков путем их восстановления. Глутатионформирует связи между сульфатной группировкой S-трансфераза глутатиона и субстратом, таким образом способствует конъюгации электрофильный центр. Некоторые ГСТ действенно осуществляют глутатион-зависимое восстановление гидрофобных гидроперекисей с большим объемом молекулы: ДНК, фосфолипидов, гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот, мононуклеотидов. Эти энзимы реализуют некоторые некаталитические функции, связанные с отделением канцерогенов, моделированием путей передачи внутриклеточного сигнала и внутриклеточным транспортом широкого спектра гидрофобных лигандов [175]. Очень важно, что глутатионтрансферазы являются важным компонентом антиоксидантной защиты. Они способны утилизировать продукты свободнорадикальных повреждений [68].

Глутатион-S-трансферазы принято подразделять на 2 подсемейства.

Выделяют цитозольные - 8 классов ГСТ, основываясь на биохимических характеристиках: альфа(), мю(µ), пи(), сигма(), тета(), зета(), омега(), каппа (). Второе подсемейство - микросомальные трансферазы [175].

Учитывая выявленную клиническими исследованиями роль ГСТ в таких патологиях как ревматоидный артрит [68], системная красная волчанка, рак мочевого пузыря, рак лёгкого, эмфиземы [50] особого внимания заслуживают глутатион-S-трансферазы М1, Т1, Р1.

Ген глутатион-S-трансферазы класса мю(µ), GSTM1 локализован на длиином плече 13 хромосомы. Он показан 5 генными локусами GSTМ1, GSTМ2, GSTМ3, GSTM4 и GSTM5 [149]. Ген GSTM1 в значительной степени экспрессируется в печени и в легких. Выявлено, что локус GSTМ имеет три формы. 2 аллеля GSTM1*А и GSTM1*В, отличаются парой нуклеотидов в 7 экзоне и не функциональный нулевой аллель [4].

Предположительно возникновение нулевого аллеля гена GSTM1 в результате неравного кроссинговера [149]. Фермент, кодируемый этим геном метаболизирует детоксикацию алкилированных и ПАУ.

Установлено достоверное превышение частоты обнаружения гомозигот по эндометриозе, ретровирусной а также герпетической инфекции [4]. В 2006г исследовательская группа по руководством Ye Z. провели метаанализ 130 исследований пациентов с раком лёгкого. Было выявлено, что при нулевом генотипе гена GSTM1 риск развития заболевания состалял 1,18-1,22. В 2006г Gonlugur U с соавт. обнаружили связь этого генотипа с низкой выживаемостью больных раком легкого [212]. В 2009 г Mo Z. et al. был проведён метанализа выборки больных раком предстательной железы (N= 4564) и здоровых (N=5464). Было выявлено достоверное увеличение риска развития рака предстательной железы у носителей нулевого генотипа гена GSTM1(отношение шансов составило 1,33) [125]. Нулевой генотип гена GSTM1 ассоциирован с повышенной чувствительностью к веществам, с которыми рабочие контактирую на производстве [5].

Глутатион-S-трансфераза класса (GSTP1) участвует в детоксикации пестицидов, эпоксидпроизводных ПАУ а также показано её участие в процессах канцерогенеза [19, 80]. Подсемейство генов GSTP представлено одним членом - ген GSTP1. Данный ген располагается на коротком плече 11 хромосомы (11q13). Доказана его экспрессия главным образом в легких, сердце и в плаценте [175].

Ген GSTP1 составляя 83% всех легочных ГСТ [208]. Описание полиморфизма гена GSTP1 произошло в 1990 г. [37]. В 6 экзоне гена сопровождающаяся изменением аминокислотной последовательности фермента Ala114Val. Последствия влияния последней мутации на активность фермента неизвестны. Транзиция A на G в 313 положении в экзоне гена приводит к замене Ile105Val. Это приводит к изменению той части последовательности ДНК, которая кодируюует связывание фермента с определенными химическими веществами, что приводит к изменению активности фермента [155]. Изучено 4 аллеля этого гена: GSTP1*А, GSTP1*В, GSTP1*С и GSTP1*D [208].

Многочисленными исследованиями выявлено, что фермент GSTP обязательно присутствует в опухолевых тканях. Таким образом считается, что этот энзим вносит вклад в развитие злокачественных новообразований [94]. Ген GSTP1 экспрессируется в высокой степени в эпителий легкого, мочевого пузыря и желудочно-кишечного тракта. На эти ткани внешняя среда оказывает наибольшее влияние. В связи с этим при низкой активности GSTP1 эти ткани являются областью риска развития токсического процесса [132]. Исследование проведенное на популяции европейцев также обнаружило экспрессию гена GSTP1 в указанных тканях [39].

В развитии онкопатологии имеет значение баланс активности различных ГСТ. Это прежде всего обусловлено их полиморфностью и к перекрывающейся субстратной специфичности [14]. В случае сниженной активность одних ГСТ, связанной с нулевыми генотипами, риск онкопатологии может быть сниже за счетактивации других.

Функционально дефектные энзимы второй фазы (глутатион-S-трансферазы 1 и µ1) вызывают накопление множества активированных канцерогенов, таким образом они участвуют в процессе канцерогенеза. Образовавшиеся ДНК-аддукты, неподвергающиеся репарации, вызывают повреждения в ДНК [215]. Доказано, что при повреждении клеток эпоксидами диола бензпирена появляется мутация в гене р53 [93]. Данная мутация снижает белковую функцию и таким образом гена р53 утрачивает способность останавливать клеточный цикл для свершения репарационных процессов [6,11,123].

1.5 Прогноз и выбор тактики лечения мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря.

Трансуретральная резекция опухоли мочевого пузыря (ТУРОМП) является диагностической, прогностической и часто терапевтической.

[6,121] После первоначальной ТУРОМП у 33 - 53% пациентов сохраняются остаточные опухоли [76]. Наличие остаточной опухоли увеличивается риск раннего рецидива и прогрессии. [85, 121]. Кроме того, опухоль может быть недостадирована при первоначальной резекции.

Вероятность того, что опухоль, первоначально расцененная как поверхностная, могла быть недостадирована и, следовательно, прорастала в мышечный слой, составляет 10% [95].

Чтобы оптимизировать стадирование заболевания, повторная ТУР ОМП часто выполняется спустя 2 - 6 недель после начальной резекции у пациентов с высокодифференцированной опухолью Ta больших размеров, не полностью резецированной опухолью или любой опухолью T1, особенно без мышечной инвазии.[121, 33]. При повторной ТУРОМП, не зависимо от локализации процесса от 34 % до 76 % пациентов будет иметь остаточную болезнь.[59,85]. Согласно Divrik и др., безрецидивный 3-х летний период на 30 % чаще наблюдался у пациентов подвергшиеся повторному ТУРОМП с последующей инстилляцией Митомицина С (MMC) по сравнению с теми, которые подверглись начальному ТУР ОМП с инстилляцией ММС. [85]. Критики повторной резекции утверждают, что это требует повторного анестезиологического пособия, которое увеличивает риск осложнений, является дорогостоящим, и, в случае адекватной резекцией и интравезикальной химиотерапией и/или иммунотерапией, является ненужной [197, 121] Однако в связи с необходимостью оценки инвазии заболевания принято производить повторную ТУРОМП.

Цель лечения мышечно-неивазивного рака мочевого пузыря в предотвращении рецидива и возможной прогрессии в мышечноинвазивную форму с целью снижения онкоспецифической смертности. В попытке уменьшить риск рецидива используется преоперационная интравезикальная терапия ТУРОМП. Метаанализ 7 рандомизированных клинических исследований, включающих 1476 пациентов, исследовал снижет ли однократная интравезикальная химиотерапия, произведенная непосредственно после трансуретральной резекции (ТУР) риск рецидива у пациентов с Ta и раком мочевого пузыря T1[190]. При среднем сроке наблюдения 3.4 лет, у пациентов, получивших одну инстилляцию после ТУР (эпирубицин, MMC, тиотера, или пирарубицин) наблюдался рецидив в 37 % по сравнению с 48 % пациентов с одним только ТУРОМП (P=0.001). Однако у пациентов с полифокальным характером роста опухоли рецидив наблюдался в 65%, демонстрируя, что только одна постоперационная интравезикальная химиотерапия является не достаточной терапией [190]. Обновления 2007 года клинического руководства лечения немышечно инвазивного рака мочевого пузыря американской ассоциации уролог (AUA) поддерживает использование единственной послеоперационной инстилляции химиотерапевтического агента в ранний послеоперационный период с целью снижения риска рецидива у пациентов после несложной ТУРОМП [78]. Адъюватная интравезикальная терапия в других случаях может быть использована с целью снижения риска рецидива. Согласно руководству по лечению рака мочевого пузыря Национальной всеобщей онкологической сети (NCCN) ТУРОМП с последующей интравезикальной химиотерапией или иммунотерапией, рекомендуется пациентам с низкодифференцированным Ta и высокодиференнцирванным Ta и T1; интравезикальная терапия с Бациллой Calmette-Guerin (БЦЖ) рекомендуется после резекции Cis.[ 126].

Обновление клинического руководства AUA от 2007 года поддерживает курс интравезикальной химиотерапии или БЦЖ для лечения агрессивного немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря у пациентов с высоким риском рецидива, но низким риском прогрессии. [78, 173].

скорректированную выживаемость по сравнению с больными, которым проводился только индукционный курс без длительной поддерживающей терапии [38]. Низкий уровень прогрессирования болезни (20% в течение лет) главным образом наблюдается у больных с небольшими опухолями (менее 3 см) и без сопутствующей CIS, при этом приблизительно у 90% пациентов мочевой пузырь интактен при наблюдении в течение 10 лет [169].

Прогрессирование опухоли в Т2 развивается в 6—25% при Та и 27— 48% при Т1 любой степени дифференцировки. Недостадирование опухолей ТаТ1 выявлено в большой серии обширных цистэктомий, выполненных в связи с наличием рецидивных опухолей у 35—62% [81.].

От 24 до 49% опухолей Т2 диагностируется первоначально как опухоль без инвазии в мышечный слой [43].

Выбор цистэктомии в качестве первичного лечения основывается на мультифокальности роста опухоли, размерах опухолевого узла, наличии CIS мочеиспускательного канала [139]. Хотя процент больных с первичными опухолями ТаТ1 при показаниях к выполнению цистэктомии не выживаемость достигает приблизительно 80% и, таким образом, не отличается от выживаемости больных после ТУР и длительной БЦЖтерапии [113]. В случаях рецидива опухоли Та, Т1 в большинстве своем наблюдается ассоциация с CIS, недостадирование во время цистэктомии отмечается в 34%, но 10-летняя выживаемость незначительно различается между пациентами с рТ1 и рТ2 опухолями [67]. Рецидив, резвившийся несмотря на проводимую БЦЖ-терапию, обозначается как персистенция опухоли на 9-м месяце и ассоциировано с 30% риском развития инвазивных опухолей и смерти от метастатической болезни [119]. Solsona и соавт. показали, что у 80% больных с персистирующим заболеванием на 3-м месяце отмечается прогрессирование болезни до инвазивной стадии [181].

Таким образом, цистэктомию следует выполнять у соответствующих больных по крайней мере на 9-м месяце [42]. Применение химиотерапии второй линии у этих больных не оправдано, в связи с низкой эффективностью [185].

Интравезикальное введение БЦЖ вакцины увеличивает время до возникновения рецидива после ТУР ОМП. Произведен метаанализ клинических исследований включающий 4767 пациентов, в котором интравезикальная инстиляция БЦЖ вакцины после ТУР ОМП значительно уменьшала риск рецидива опухоли у пациентах с МНРМП [79].

Метаанализ 24 исследований с данными о прогрессии включающий пациента при среднем сроке наблюдения 2.5 года, заключался в изучениии вляния внутрипузырной инстиляции БЦЖ риск на прогрессию [191].

Внутрипузырная инстиляция БЦЖ после того, как произведена ТУР ОМП уменьшала риск прогрессии при папиллярных опухолях на 32 % и при CIS на 35 % [191]. Предположено, что БЦЖ в состоянии снизить риск смерти болезнеспецифичных смертельных случаев было слишком мало для достоверной оценки [191]. Оптимальная доза, график инстилляции и штамм БЦЖ до сих пор остаются неясными, но улучшение результатов лечения рак может быть достигнута с помощью поддерживающей терапии [191, 198]. Использование БЦЖ связано со многими побочными эффектами, несколько из которых могут быть серьезными, такими как сепсис. Следовательно для внутрипузырной инстилляции в качестве терапии РМП использовались агенты с меньшей токсичностью.

Метаанализ 11 клинических исследований включающий 2749 пациентов сравнил терапевтическую эффективность и токсичность внутрипузырная инстилляция БЦЖ в сравнении с MMC при рецидиве РМП стадии Ta и T [31]. Со средним сроком наблюдения 26 месяцев, при этом у 38.6 % пациентов в группе БЦЖ и 46.4 % пациентов в группе MMC был выявлен рецидив МНРМП (P=005). В подгруппе с использованием БЦЖ вакцины все 6 исследований показали существенное превосходство над MMC (P =0.001) [31].

Результаты этого метаанализа предположили, что БЦЖ превосходит MMC в предотвращении рецидива опухоли [38]. Цистит является наиболее распространенной местной побочной реакцией, как в BCG так и MMC группах. Цистит, связанный с БЦЖ выявляется чаще [38]. В общем симптомы местной и системной токсичности были управляемыми и были более частыми в группе БЦЖ, за исключением аллергии и кожных реакций, которые были более распространены в группе MMC. [38]. Для дальнейшего изучения роли БЦЖ и MMC в лечении мышечнонеинвазивного рака мочевого пузыря проведен мета-анализ терапевтического эффективностями на прогрессирование Та и Т1 рака мочевого пузыря [38] При медиане наблюдения - 26 месяцев, рецидив опухоли наблюдался у 7.7 % пациентов в группе БЦЖ и 9.4 % пациентов в группе MMC, однако данные статистический не достоверны. В подгруппе из 5 клинических[ исследований с применением БЦЖ достоверно чаще показатель рецидива был ниже чем с MMC. [38]. В отдельном метаанализе включающем 6 исследований (1527 пациентов) Shelly и др. подтвердили, что рецидив встречался реже в группе пациентов с внутрипузырной инстилляцией БЦЖ чем с MMC, только у пациентах с высоким риском развития рецидива не было найдено различий в развитии болезни или выживании, хотя авторы упоминают, что причиной могло послужить ограниченность данных или потребность в более длительном наблюдении [174]. Необходимо отметить, что процент пациентов, испытывающих местную и системную токсичность составил были 30 % и 12 % для группы MMC и 44 % и 19 % для группы БЦЖ соответственно [174]. Недавний метаанализ 9 рандомизированных исследований включавший пациентов, сравнивавших эффективность БЦЖ и MMC у пациентов с агрессивным МНРМП показал, что в целом, никакой разницы во времени до первого рецидива нет, однако, обнаружено 32%-ое снижение риска рецидива при использовании БЦЖ по сравнению с MMC [112]. В показателях прогрессии, общей, раковоспецифической выживаемости достоверный различий между группами найдено не было найдено. [112].

Внутрипузырная инстилляция БЦЖ и химиопрепаратов также использовались для лечения пациентов с изолированным CIS. [190] эффективность БЦЖ и химиотерапии в лечении пациентов с CIS [190]. В девяти рандомизированных исследований включавших 700 пациентов с CIS проведена оценка эффективности БЦЖ, MMC, эпирубицина, доксирубицина[190]. При среднем сроке наблюдении 3.6 лет у 47 % пациентов, получающих БЦЖ, не было никаких доказательств наличия болезни против 26 % при внутрипузырной инстилляция химиопрепарата (P=0,001).

значительно уменьшало риск краткосрочного и долгосрочного отказа от использования по сравнению с внутрипузырная инстилляция химиотерапией и таким образом в данном метаанализе рассматривается в качестве предпочтительного агента для внутрипузырной инстилляции при CIS. [190]. Попытки увеличить эффективность БЦЖ заключались в использовании объединенных иммунологических внутрипузырный методов лечения. В многоцентровом исследовании фазы 2(1007 пациентов) применялась комбинация БЦЖ и интерферона (IFN). У 59 % пациентов не получавших БЦЖ и 45 % пациентов, у которых был предшествующий отказ от БЦЖ, рецидив болезни не был обнаружен при среднем продолжении 24 месяца. [98] Комбинированное использование БЦЖ и IFN- вариант лечения, но в настоящее время его нет в руководствах NCCN.

сравнивающее БЦЖ с IFN и монотерапию БЦЖ для демонстрации превосходств комбинации. [98]. Хотя БЦЖ - эффективное лечение, но приблизительно у 20-40% пациентов выявляется рецидив после БЦЖ [209]. Однако приблизительно у 35 % пациентов после 2 курса БЦЖ отмечался длительный безрецидивный период. [136].

Оптимальная доставка препарата при внутрипузырной инстилляции может улучшить результаты лечения. Ухудшающими факторами при инстиляции MMC являются растворение препарата выделяющейся мочой во время экспозиции и его неустойчивости в кислой среде мочи [31]. В фазе рандомизированного клинического исследования, включавшего пациентов Au и др. сравнивали эффективность применения ММС в группах пациентов: исследуемая - воздержалась от питья жидкостей в течение 8 часов и принимала 3 дозы бикарбоната натрия перед внутрипузырным введением 40 мг MMC, контрольная группа состояла из 111 пациентов, получивших 20 мг MMC без любых фармакокинетических манипуляций. [31]. В исследуемой группе средняя длительность безрецидивного периода была достоверно более длительная (29.1 месяцев против 11.8 месяцев; P=0.001), а частота 5-летнего безрецивного периоды составила 41% против 24,6% в контрольной группе (P=0.005). Были выдвинуты предложения внести корректировки в стандарт применения многоцентровом рандомизированном клиническом исследовании, производилась сравнение использования местной микроволновая гипертермия в сочетании с MMC в сравнении с монотерапией MMC. У пациентов при минимальном сроке наблюдения 24 месяца частота рецидива составила 58 % в группе ММС и 17 % в группе с использованием микроволновой гипертермии [53]. Подобный протокол использования в качестве лечения при мышечно-неивазиновм РМП высокого риска рецидива, продемонстрировал 63% частоту безрецидивного течения при сроке наблюдения 35 месяцев. [73]. С целью улучшения доставки препарата через биологические мембраны и тем самым увеличения накопления его в тканях предлагалось использование электрофореза при исследовании, пациенты с CIS были рандомизированы на группы: первая получала электрофорез при внутрипузырной инстилляции ММС, вторая – пассивная инстилляция ММС, третья получала БЦЖ [53]. После 6 месяцев было выявлено статистически достоверное превосходство электрофореза ММС (58 %) над пассивным введением MMC (31 %), и максимально приблизилось к БЦЖ (64 %). [58] Доцетаксел был исследован в качестве агента для внутрипузырной инстилляции в клиническом исследовании 1 фазы. Доцетаксел вводили в дозе 5мг 6 раз. Восемнадцать пациентов закончили испытание с отсутствием рецидива, у 56 % пациентов не было выявлено доказательств заболенваия при последующей цистоскопии и биопсии. [117]. Доцетаксел показал хорошие результаты и требуют дальнейшего исследования фазы 2.

Руководства лечения мышевно-неивазивного РМП Американской Урологической Ассоциации (AUA), заявляют, что цистэктомия или последующая внутрипузырная терапия должна рассматриваться для CIS или высокодифференцированного рака T1, который сохраняется или рецидивирует после инициальной внутрипузырной инстилляция. [78].

Руководства Европейской Ассоциации Урологии (EAU) повторяют эту точку зрения, упоминая цистэктомию как предпочтительное лечение пациентов с CIS [139]. Наличие опухоли при цистоскопии спустя месяцев после первой ТУР ОМП, сохраняющейся после 2 курсов БЦЖ терапии - верный признак рассмотреть радикальную цистэктомию в качестве последующего лечения[136]. Решение о отсрочке цистэктомии до прогрессии до мышечно-инвазивной формы рака мочевого пузыря связано с более высоким показателем раковоспецифической смертности чем смертности от цистэктомии, выполненной при мышечно-неивазивной форме [84]. Huguet и др., наблюдали 62 пациентов у которых наблюдались частые рецидивы после БЦЖ терапии. Все эти пациенты впоследствии подверглись радикальному цистэктомии. [90].

При патологическом стадировании у 27% пациентов выявлена pT стадия – что свидетельствует о недостадированиию. У пациентов с прогрессией заболевания 5-летная раковоспецифическая выживаемость составила 38 % против 90 % без прогрессии болезни (P= 0.006) [90].

В заключении, хотя нет предполагаемого рандомизированного клинического исследования, сравнивающего раннее выполнение цистэктомии с второй линией внутрипузырной терапии для высокого риска рецидивирования, радикальная цистэктомия - привилегированный вариант лечения для пациентов с наличием рецидивов после внутрипузырной инстилляции БЦЖ. Тем не менее, внутрипузырная терапия, продолжает иметь существенную роль в лечении пациентов, которым не возможно выполнить радикальное хирургическое лечение в связи с тяжелой сопутствующей патологией и отказавшимся от оперативного лечения [136,139].

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Объект исследования неродственных человек, проживающих на территории Республики Башкортостан.

Группа пациентов НМРМП состояла из 128 человек находившихся на стационарном лечении в Клинике БГМУ, РКОД и РКБ г. Уфы (РБ) в период с 2001 по 2012 гг. в возрасте от 40 до 83 лет. Средний возраст составил 61.07±11.14 лет. Срок наблюдения за пациентами составил от до 5 лет после ТУР. Пациенты с рецидивом заболевания в течение первого года наблюдения вошли в основную группу МНРМП (N=71), без рецидива - в группу сравнения МНРМП (N=57). Необходимо отметить что всем этим иммунотерапии, так как в то время в России не было рекомендовано соответствующее лечение. С 2005 года все пациенты промежуточного и высокого риска рецидива получили соответствующее внутрипузырное представлено в таблице 6.

Распределение больных МНРМП по полу и возрасту (n=128) Кроме того, с целью выявления генетических факторов риска развития РМП мы обследовали 141 здоровых добровольца, без признаков онкологических заболеваний.

исследование. Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови.

2.2. Клинические методы обследования больных.

Диагностика складывается из анализа клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования.

1. Общеклинические обследовани (жалобы, анамнез заболевания, локальный и общий статус).

биохимических исследований крови, цитологическое исследование мочи).

Исследование образцов мочи или промывных вод из мочевого Интерпретация цитологического исследования зависит от морфолога.

Качественной оценке могут препятствовать небольшое количество клеток, инфекция мочевыводящих путей, конкременты или внутрипузырные инстилляции. Однако в опытных руках чувствительность метода составляет около 90%. Цитологическое исследование выполнялось на свежем образце мочи при адекватной фиксации.

2.3. Инструментальные методы исследования высокоинформативным методом диагностики и послеоперационного мониторинга, который облегчает диагностику и длительное динамическое наблюдение пациентов.

При УЗИ отмечались такие характеристики как изменения стенки мочевого пузыря (толщины, эхогенности, внутренней структуры и контуров стенки), изменения в окружающих тканях (инфильтрация, отек) и осложнения течения.

Цистоскопия выполнялась всем пациентам с диагнозом РМП. Чаще цистоскопия совмещалась с одномоментной ТУР.

Ультразвуковое исследование выполняли на аппарате B-K Medical 2102 Hawk (Дания) с конвексным датчиком, частотой 3,5-5,0 Гц.

2.4. Молекулярно-генетические методы исследования Выделение ДНК складовались из нескольких этапов:

Подписание информированного согласия пациентом для забора крови.

Забор крови заполнение анкеты пациентом и транспортировка в генетическую лабораторию.

Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови.

Проведение ПЦР синтеза ДНК и рестрикционного анализа.

Проведение электрофореза и визуализация результатов Анализ и сопоставление полученных результатов генетических исследований с клиническими факторами После забора крови в пробирки с консервантом (4:1) материалл помещался в холодильник, где хранился при температуре +4С не более недель. Когда набиралось 10 образцов мы проодили стандартную переферической крови. Следующим этапом производили очистку материалла от белков экстракцией забуференным фенолом, така как фенол активно денатурирует белки, смесь фенол-хлороформа полностью ингибирует РНК-зную активность. Затем мы проводили экстракцию хлороформом остатков фенола из препарата ДНК. Осаждение ДНК мы проводили при помощи охлажденного 96% этилового спирта. С целью очистки от солей, полученную ДНК мы двухкратно промывали 70% этиловым спиртом, а после эвакуации этилового спирта подсушенный осадок ДНК растворяли в деионизированной воде. Полученный материалл ДНК помещали в морозильную камеру, где хранили при температуре С.

Проведение ПЦР синтеза ДНК и рестрикционного анализа Изучение локусов генов P450: CYP1А1 (A2455G), CYP1A2 (С-163А, T-2464delT)); арил-гидрокарбонового рецептора AНR (c.1661G>A), его репрессора AHRR (c.565C>G), транслокатора ARNT (c.522G>C); глутатион S-трансферазы: GSTM1 (протяженная делеция), GSTP1 (A313G мы осуществляли на автоматическом термоциклере методом ПЦР синтеза ДНК применяя специфические олигонуклеотидные праймеры Амплификация состояла из предварительной денатурации и циклов амплификации.

Анализ генов GSTM1 мы выполняли по методике Баранова 1997 г.

Метод ПДРФ мы использовали для исследования локусов генов, CYP1A1, ARNT, GSTP1, CYP1A2, AHR, AHRR.

Следующим этапом мы проводили рестрикцию при помощи специфических эндонуклеаз Затем мы проводили электрофорез в полиакриламидном неденатурированном геле и визуализацию результатов в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

На завершающем этапе мы проводили анализ локусов изучаемых генов с целью выявления генотипов повышенного и пониженного риска развития МНРМП («маркеры предрасположенности и устойчивости»). Для выявления рисковых генотипов, ассоциированных с риском проводили сравнение внутри общей выборки больных в группах с рецидивом и без рецидива МНРМП 2.5. Статистический анализ Математическая обработка результатов исследования проводилась с применением статистических программ: Statistica v.10.0, BIOSTAT (Primer of Biostatistics edition 7, Microsoft Access.

Полученные данные мы обрабатывали используя биометрические методы анализа. В своей работе мы вычисляли среднее значение (М), среднее квадратичное отклонение (), средняя ошибка среднего значения (m).

Частоты аллелей определяли по формуле:

xi=Pi/N, где Pi – число i–тых аллелей, N – объем выборки Ошибка вычислялась по формуле:

Для определения ( ) использовали программу BIOSYS-2.

Показатели гетерозиготности рассчитывали по формуле:

данной выборке; Nij - число особей генотипа АiAj в данной выборке объема Теоретическую гетерозиготность определяли как ожидаемую по Харди-Вайнбергу долю гетерозигот:

где m - число аллелей, pi - частоты аллелей.

Коэффициент отклонения фактической гетерозиготности от теоретически ожидаемой рассчитывали по формуле:

где: h – ожидаемый, а g – наблюдаемый уровень гетерозиготности.

Для сравнения распределения частот аллелей в различных группах, использовали критерий с поправкой Йетса на непрерывность (при числе единиц наблюдения менее 10).

В случае попарного сравнения выборок по частоте одного признака, т.е. когда k=2 и m=2, использовали точный критерий Фишера 2=[N1N2(p1-p2)]/[Npср(1-pср)];

здесь pср=(p1N1+p2N2)/N - средневзвешенная частота фенотипа.

Уровень значимости определяется по 2 критерию с одной степенью свободы.

Ассоциацию генотипов и аллелей c развитием заболевания выявляли, сравнивая выборки больных и здоровых индивидов по частоте одного признака с использованием критерия. Статистически значимыми считали различия при р < 0.05. Для исключения ошибки первого типа вводили поправку на множественность сравнений: значение P умножали на количество попарных сравнений и получали новое значение рcor.

вычисляли как соотношение шансов (OR -odds ratio): OR = (a х d)/(b х c), где а - частота аллеля (генотипа) в выборке больных, b - частота аллеля (генотипа) в контрольной выборке, с - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в выборке больных, d - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контрольной выборке. Доверительный интервал для относительного риска рассчитывали по следующей формуле:

В случае, когда один из показателей был равен 0, показатель OR вычислялся по формуле: [(2a+1)*(2d+1)]/[(2b+1)*(2c+1)] [Schlesselman, 1982].

Значение OR=1 показывало отсутствие ассоциации, значение OR> рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с признаком («фактор риска»), ORA гена AHR; с.522 G>С гена ARNT; с.565 С>G гена AHRR приведены в таблице 22.

Анализ полиморфного локуса c.1661G>A гена AHR показал сходство распределения частот генотипов (х2=3.28, р=0.19) и аллелей (х2=2.44, р=0.12) между основной и группой сравнения.

Анализ полиморфного маркера c.565C>G гена AHRR также не выявил каких-либо ассоциаций с риском развития МНРМП (х2=3.61, р=0.16 для генотипов и х2=2.18, р=0.14 для аллелей).

Изучение распределения частот аллелей (х2=5.28, р=0.02), но не генотипов (х2=5.32, р=0.07) полиморфного локуса c.522G>C гена ARNT показало статистически достоверные различия между группами больных МНРМП. Так, было показано, что аллель С (OR=2.19, 95%CI(1.11-4.34) Частота генотипов и аллелей генов AHR, ARNT и AHRR у больных МНРМП является фактором риска развития рецидива МНРМП, а аллель G (OR=0.46, 95%CI (0.23-0.90) заболевания. Частота генотипа GG увеличена в группе сравнения (64.5%) по сравнению с основной группой (40.4%) (х2=4.40, р=0.04; OR=0.37, 95%CI (0.15-0.94) Следовательно, данный генотип также является фактором устойчивости к развитию рецидива МНРМП (см.табл. 22. и рис 15).

GG GC CC G C

Рис. 15. Частота генотипов и аллелей гена ARNT(c.522 G>С) у больных МНРМП Анализ ассоциации делеционного полиморфизма гена GSTM1 с риском развития рецидива МНРМП в течение года Распределение частот генотипов гена GSTM1 у больных МНРМП основной группы и группы сравнения значимых различий между группами не выявил (2=0.14, р=0.71) (табл. 23).

Анализ ассоциации полиморфного локуса A313G гена GSTP1 с риском развития рецидива МНРМП в течение года Анализ распределения частот полиморфного локуса A313G гена GSTP1 у больных МНРМП в основной группе и группе сравнения достоверных различий между группами не выявило (2=0.74, р=0.69) (табл.

24.

Частота генотипов и аллелей гена GSTP1(A313G) у больных МНРМП

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ

5.1 Алгоритм наблюдения и лечения пациентов с мышечнонеивазивным раком мочевого пузыря В связи с риском развития рецидива пациенты с МНРМП нуждаются в диспансерном наблюдении. Частота проведения цистоскопий зависит от индивидуальной степени риска развития рецидива заболевания. Используя таблицы прогноза риска рецидива, рекомендованные EAU, и генетические маркеры мы можем с большей вероятностью предсказать риск развития рецидива у каждого конкретного пациента и соответственно адаптировать схему наблюдения.

выполнить через 3 месяца после ТУР. К сожалению, в настоящее время рекомендации о возможности безопасного уменьшения количества цистоскопий в последующем периоде наблюдения основываются только на ретроспективном опыте. У больных с низким риском развития рецидива, при отрицательном результате первой цистоскопии, EAU рекомендует выполнить третью цистоскопию на 9 месяц наблюдения и в дальнейшем 1 раз в год на протяжении 5 лет. Пациентам с высоким риском рецидива при отрицательном результате первой контрольной цистоскопии, последующие следует выполнять каждые 3 месяца в течение 2 лет, каждые 4 месяца на 3-м году, в последующем каждые 6месяцев до 5-го года наблюдения и в дальнейшем 1 раз в год. У больных с промежуточным риском рецидива EAU рекомендует применять схему наблюдения, адаптированную в соответствии с клиническим опытом врача и оценкой течения заболевания.

Мы предлагаем, при наличии выше изученных генетических маркеров риска развития рецидива заболевания, смещать пациента в группу более высокого риска и, следовательно, применять схему более активного наблюдения.

рецидивирования с молекулярно-генетическими изменениями. В результате проведенного исследования было выявлено, что генотип *1A*2C (OR=2.69, 95% CI 1.13-6.49) и аллель *2C (OR=2.42, 95% CI 1.12полиморфного локуса гена генотип *1А*1А(OR=3.23, 95% CI 1.09-9.98) и аллель *1А(OR=1.87, 95% CI 1.07полиморфного локуса С-163А гена CYP1A2, генотип *1D*1D (OR=5.60, 95% CI 1.09-38.6) и аллель *1D (OR=2.37, 95% CI 1.30-4.35) полиморфного локуса Т-2467delT гена CYP1A2, аллель С (OR=2.19, 95% CI 1.11-4.34) полиморфного варианта c.522 G>С гена ARNT предрасполагают к риску развитию рецидива в течении года после ТУР ОМП у больных МНРМП.

Таким образом, можно утверждать, что данные полиморфные варианты генов являются неблагоприятными маркерами течения МНРМП. На основе вышеизложенного мы разработали алгоритм ведения пациентов с МНРМП промежуточного риска, в котором предлагаем при выявлении у пациента генотипа высокого риска рецидива заболевания внутрипузырную терапия проводить с использованием БЦЖ, а так же наблюдать за пациентом как за пациентом группы высокого риска рецидива заболевания (рисунок 16).

Поверхностный рак мочевого пузыря цистоскопия через 3 мес, дальнейшем протяжении Рисунок 16. Алгоритм ведения пациентов с мышечно-неинвазивными формами РМП 5.2 Оценка результатов лечения пациентов с мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря промежуточного риска с использованием разработанного алгоритма.

промежуточного риска получавших внутрипузырную терапию с учетом разработанного алгоритма, состоящая из 28 пациентов (10 с наличием рисковых генов, 18 без рисковых генов) (основная) и ретроспективная группа пациентов получавших лечение без использования алгоритма (10 с наличием рисковых генов, 18 без рисковых генов) (контрольная).

Частота выявления рецидива в группа больных с применением разработанного алгоритма в течении первого года наблюдения составила 25%, тогда как в группе получавших лечение без учета алгоритма этот показатель составил 28,6%, в течении 2 лет рецидив был выявлен у 31,1% разработанного алгоритма и 35,7% в контрольной группе. После 3 лет наблюдения рецидив мышечно-неивазивного рака мочевого пузыря промежуточного риска был выявлен у 42,9% пациентов в группе больных не получавших согласно алгоритму после трансуретральной резекции мочевого пузыря и лишь у 31,1% пациентов в основной группе больных с получивших лечение согласно разработанному алгоритму был выявлен рецидив (табл. 25).

2 года 3 года Результаты представлены на диаграмме 1.

Диаграмма 1. Частота развития рецидива в основной и контрольных группах у пациентов с наличием маркеров предрасположенности к раннему появлению рецидива.

Также необходимо отметить что, в дополнении к снижению показателей частоты рецидива было отмечено уменьшение угла тренда алгоритму.