«Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов ...»

5) взятие патологического материала прижизненно. Использовали стерильные ватные тампоны (палочки). После отмывания копыта от грязи, стерильным ватным тампоном, смоченным PBS или 0,9% NaCl, несколько раз проводили по поражениям. Далее тампон помещали в микропробирку с соответствующим раствором (PBS или 0,9% NaCl). Пробы доставляли в лабораторию во льду в течение нескольких часов. В лаборатории микропробирки перемешивали на смесителе типа «вортекс» для отмывания бактерий с ваты, после чего ватные тампоны вынимали. Для исследования брали 200-500 мкл раствора.

2.1.2.3. Экстракция ДНК из диагностического материала Выделение ДНК из диагностического материала, полученного любым из вышеописанных способов, проводили различными методами:

1) использование три-реагента по методике производителя. Для ресуспендированного в PBS (0,9% NaCl или дистиллированной воде) добавляли 800 мкл триреагента, хорошо перемешивали на смесителе типа «вортекс» и оставляли на 5 мин при комнатной температуре.

перемешивали на смесителе типа «вортекс» и оставляли на 5-10 мин при комнатной температуре, центрифугировали 15 мин при 13200g при температуре 4°С. Отбирали верхнюю водную фазу. Добавляли 240 мкл 96%го этанола (из расчета 0,3 мл этанола на 1 мл триреагента, использованного в начале), аккуратно перемешивали на смесителе типа «вортекс», 2 - 3 мин держали при комнатной температуре, затем при -70°С 20 мин. Осаждали ДНК центрифугированием при 13200g при температуре 4°С 10 мин.

Тщательно удаляли всю жидкую фазу. Ресуспендировали ДНК-осадок в 1 мл 70%-го этанола, аккуратно перемешивали на смесителе типа «вортекс», центрифугировали 10 мин на 13200g при комнатной температуре.

Отбрасывали жидкую фазу и снова все повторяли. После 2-й промывки ДНК растворяли. Для этого после центрифугирования 15 мин при 13200g при температуре 4°С отобирали насосом этаноловую промывку, коротко высушивали около 3-5 мин и растворяли в 50 мкл 8mM NaOH, разбив осадок на смесителе типа «вортекс». Оставляли при комнатной температуре. Для проверки наличия нуклеиновых кислот 2 мкл полученного раствора смешивали с 2-мя мкл буфера для ПЦР, вносили в 1% агарозный гель и проводили электрофорез. При наличии нуклеиновых кислот получали свечение продукта;

2) фенол - хлороформный метод. Для исследования патологического материала использовали модифицированную нами методику Андерсена с сотр. (69). К 450 мкл исследуемой пробы, подготовленной одним из вышеописанных способов, добавляли 50 мкл 10Х ТЕ - буфера. К полученной смеси добавляли 50 мкл 10% SDS и 500 мкл фенол-хлороформной смеси (смешанной 1:1). Перемешивали на смесителе типа «вортекс» в течение секунд до получения гомогенной смеси. Далее центрифугировали 4 минуты при 13200g. Отбирали водную фазу (она сверху), одновременно измеряя ее объем. Добавляли, равный полученному, объем хлороформа. Перемешивали на смесителе типа «вортекс» и центрифугировали 4 минуты при 13200g.

Отбрали водную фазу сверху. К ней добавляли 0,1 её объема 3М ацетата натрия (рН 5,2) и 2,5 объема 96% этанола, перемешивали на смесителе типа «вортекс» и оставляли на 30 минут при -70°С (или на 1-2 часа при -20°С).

Опять перемешивали и центрифугировали 10 минут при 13200g. Супернатант отбрасывали, осадок промывали 50-100 мкл 70% этанола, перемешивали на центрифугировали 6-10 минут при 13200g, отбрасывали супернатант. Осадок хорошо подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл деионизованной воды. Выделенную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР;

3) выделение ДНК с помощью лизоцима и неорганического сорбента.

Выделение ДНК из исследуемого биологического материала проводилось с помощью Набора - I для выделения ДНК тест-системы для индикации и дифференциации M. bovis и M. tuberculosis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) («Ветбиохим», г. Москва) по методике производителя;

4) прямое внесение 5 мкл полужидкой среды в ПЦР–смесь и лизис бактериальных клеток прогреванием при 95°С в течение 10 минут.

Полимеразная цепная реакция на матрице ДНК проводилась в полипропиленовой микропробирке объемом 0,5 мл. Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала в конечным объёме 25 мкл: 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ трис-HCl (pH 9,0), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон Х-100. Для предохранения от испарения поверх реакционной смеси наслаивали 30 мкл минерального масла, после чего вносили в смесь 5 мкл раствора исследуемой ДНК.

Пробирки помещали в амплификатор и использовали температурновременной режим, одинаковый как для проведения ПЦР - амплификации фрагмента гена 16S рРНК, так и для фрагмента гена FimA (таблица 6).

Температурно - временные режимы, использованные для проведения ПЦР - амплификации фрагмента гена 16S рРНК и фрагмента гена FimA Температурно-временные режимы хранение Анализ фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в агарозном геле. В 1% гель вносили по 7 мкл продуктов ПЦР для детекции результатов амплификации или весь объем смеси для препаративного выделения из геля с целью секвенирования. Электрофорез проводили с использованием трис-ацетатного буфера (pH 8.5), содержащего бромистый этидий в концентрации 0,4 – 0,5 мкг/мл, при напряженности электрического поля 10 – 15 В/см в течение 30 - 40 минут. Гели просматривали с помощью трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм.

Детекция результатов электрофореграммы осуществлялась визуально по красновато-оранжевому свечению продукта амплификации.

2.1.2.6. Определение нуклеотидной последовательности Выделение ДНК из геля проводилось на наборе фирмы Fermentas «DNA Extraction Kit» Наработанные фрагменты вырезали из геля и выделяли с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Fermentas, Литва) по методике производителя.

Для секвенирования ДНК по двум цепям использовали те же праймеры, что и для проведения ПЦР.

Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР-продукта с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

2.1.2.7. Компьютерный анализ полученных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0.

Copyright © 1997-2004, Ibis Biosciences, США) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0. (44) Copyright © 1993-2006, DNASTAR, Inc., США).

Филогенетические дендрограммы были построены при помощи программы MegAlign из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006, DNASTAR, Inc., США). Данная программа позволяет провести выравнивание последовательностей методом ClustalW и строить дендрограммы методом «присоединения соседей» NJ (neighbor-joining method) (178).

2.2.1. Разработка метода ПЦР – амплификации фрагментов гена 16S рРНК для идентификации возбудителя копытной гнили овец D.nodosus Одной из задач данной работы была разработка ПЦР для видовой идентификации возбудителя копытной гнили овец на основе амплификации фрагмента гена 16S рРНК. Мировой опыт показывает, что именно этот ген наиболее подходит для выявления D.nodosus. Дело в том, что по сравнению с однокопийным и сильновариабельным геном fimA ген 16S рРНК достаточно консервативен и представлен в геноме тремя копиями, что позволяет значительно увеличить чувствительность и специфичность анализа. Это преимущество становиться важным, а зачастую даже критичным, при проведении детекции ДНК возбудителя прямо из патологического материала (минуя культуральные исследования) из-за относительно малого количества D.nodosus в зонах патологического процесса (140).

Исследования по разработке данной ПЦР для идентификации и возбудителя копытной гнили овец D.nodosus включали следующие этапы:

1. Подготовка диагностического материала путем наращивания бактериальной массы D.nodosus для проведения экспериментальной части работы;

2. Разработка метода выделения ДНК D.nodosus;

3. Подбор специфических праймеров;

4. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР;

5. Экспериментальная оценка специфичности и чувствительности ПЦР.

Разработку метода ПЦР – амплификации гена 16S рРНК осуществляли лиофилизированного состояния (сушки 2000 года) штамм реактивировали путем посева в полужидкую тиогликолевую среду. Первичные посевы редко проявляли характерный рост, чаще штрихи были малочисленные, расплывчатые, а накопление культуры – слабое. При световой микроскопии окрашенных по методу Грама бактерий среди характерных фиксировалось большое количество дефектных клеток – плохо прокрашенных, с рваной клеточной стенкой, вздутых, неровных. При дальнейших пересевах на ту же среду наблюдался характерный рост. Начиная со вторых суток выращивания в средней части пробирки появлялись вертикальные полоски-штрихи длиной 2 - 5 мм. Наиболее интенсивный рост в виде таких штрихов наблюдался на 3е сутки культивирования, в результате они вытягивались в достаточно длинные тяжи беловатого цвета, которые к 5 - 6-му дню начинали расходиться (Рис.1). Морфология и тинкториальные свойства также были характерными для культуры D.nodosus, выращенной на полужидкой питательной среде – чаще одиночные и прямые, грамотрицательные, стандартного размера, с хорошо заметными прокрашенными фуксином утолщениями по краям клетки (Рис.1).

Рис.1. Рост 4-х суточной культуры D.nodosus на тиогликолевой среде.

Рис.2. Микроскопия бактерий 4-х дневной культуры D.nodosus с тиогликолевой среды, окраска по Граму (х 1600).

Для изучения свойств культуры и получения клеток D.nodosus на плотной питательной среде проводили посев на кровяной тиогликолевый агар. Посевы помещали в анаэробные условия и выращивали в течение 3 – суток при 37°С. Наблюдался достаточно сильный для D.nodosus рост (Рис.3).

Культура при этом образовывала плоские или с чуть приподнятым центром округлые сероватые колонии диаметром 1 - 3 мм со складчатым краем (Рис.4). Данный вид колоний характерен для переходного (гладко – шероховатого) типа колоний. Однако, известно, что ранее штамм ПП 82/ был специально селекционирован для усиления вирулентных свойств, в связи с чем образовывал резкошероховатые плоские, волокнистые отросчатые колонии. Очевидно, что такое изменение является результатом многократных субкультиваций на полужидкой среде и потерей способности к пилеобразованию.

При окраске культур с плотной среды по Граму морфология и тинкториальные свойства бактерий D.nodosus были характерными, как и у бактерий с полужидкой среды.

Рис. 3. З - х дневная культура D.nodosus на кровяном агаре.

Рис. 4. Переходный тип колоний З-х дневной культуры D.nodosus на кровяном агаре (х 4).

Нами было решено остановиться на варианте праймеров, предложенных в 1993 году Ла Фонтейном с сотр. (140) (таблица 4). Ими были разработаны пара праймеров к вариабельным участкам гена 16S рРНК, специфичным для D.nodosus (Рис.5).

Рис.5. Схема ПЦР. Положения праймеров NOD F и NOD R на нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК D.nodosus для амплификации фрагмента длиной 783 н.п.

После выбора праймеров определялась теоретическая возможность их последовательностях. Для этого проводился поиск комплементарных праймерам нуклеотидных последовательностей в программе BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI, США) (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Важным этапом в работе явился выбор способа выделения ДНК D.nodosus, так как чистота и концентрация полученных нуклеиновых кислот влияет на успех дальнейших исследований. При этом нами было установлено, что способ отбора проб диагностического материала (смыв с плотной среды, лиофилизированный препарат в ампуле, полужидкая среда) при правильном исполнении особого значения не имел. Зато выделение ДНК лучше всего проходило модифицированным нами фенол - хлороформным способом с предварительным лизоцимным лизисом (в отличие от стандартного лизоцимного лизиса с осаждением ДНК неорганическим сорбентом или выделения с триреагентом).

В ходе оптимизации условий амплификации подбирались следующие параметры: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров, временные режимы проведения ПЦР. При проведении ПЦР температурновременные режимы, указанные в таблице 6, оказались оптимальными. Было обнаружено, что разработанные праймеры работают специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией MgCl2 (1,5 мМ).

Температура отжига праймеров, инициирующих амплификацию фрагмента гена 16S рРНК была протестирована с парой праймеров NOD F и NOD R в градиентной ПЦР с температурой отжига от 52°С до 63°С (Рис.6).

Режим амплификации был стандартный, кроме температурных значений отжига праймеров (таблица 6).

Результаты данной ПЦР показали одинаково надежную работу праймеров в градиенте температур от 52°С до 57°С, в градиенте температур от 60°С до 63°С отжига праймеров на матрицу ДНК не было. С учетом этих данных и расчетных температур отжига праймеров оптимальной была признана температура в 56°С.

Рис.6. Электрофореграмма результатов градиентной ПЦР с праймерами NOD F и NOD R для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. ДНК D.nodosus (треки 1 - 5) производственного штамма ПП 82/90. Треки: М – ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п.); температура отжига: 1 - 52°С; 2 – 55°С; 3 - 57°С; 4 - 60°С; 5 - 63°С.

Стоит отметить, что температура отжига праймеров в 50°С (режим амплификации см. таблицу 6), рекомендуемая авторами праймеров, практически всегда давала неспецифическую амплификацию в нескольких местах и нами не стала применяться (Рис.7).

Экспериментальная оценка специфичности теста проводилась нами на пробах, содержащих ДНК 10-ти видов бактерий – ассоциатов, как правило, участвующих в развитии патологического процесса при копытной гнили овец и находящихся на копытцах больного животного зачастую даже в больших использованные штаммы бактерий находились в ампулах и использовались культивирования. Одна проба содержала ДНК копытного рога здоровой овцы. Выделение ДНК из всех проб проводилось фенольно-хлороформным способом. Положительным контролем служила ДНК культуры D.nodosus, деионизованная вода использовалась как отрицательный контроль.

Рис.7. Электрофореграмма результатов ПЦР (в 1% агарозном геле) с праймерами NOD F и NOD R для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. ДНК D.nodosus (треки 1 - 2) производственного штамма ПП 82/90. Треки: 1 - отрицательный контроль (Н2О); 2 – ДНК D.nodosus с двумя неспецефическими ампликонами; М – ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п.).

Определение специфичности ПЦР при амплификации фрагмента

ПЦР ПЦР

Dichelobacter nodosus (патматериал) Staphylococcus aureus Clostridium perfringens Clostridium septicum Pseudomonas aeuroginosa Actinomyces pyogenes Streptococcus zooepidermicus Fusobacterium necrophorum Fusobacterium nucleatum Деионизованная вода Примечание: полож. – положительный результат;

Все использованные штаммы бактерий находились в ампулах и использовались для выделения ДНК прямо из лиофилизированного препарата без культивирования. Одна проба содержала ДНК копытного рога здоровой овцы. Выделение ДНК из всех проб проводилось фенольнохлороформным способом. Положительным контролем служила ДНК культуры D.nodosus, деионизованная вода использовалась как отрицательный контроль. Результаты ПЦР показали высокую специфичность праймеров (таблица 7).

Рис.8. Электрофореграмма (в 1% агарозном геле) результатов определения специфичности ПЦР для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. с использованием праймеров NOD F и NOD R. Треки: 1 – положительный контроль (ДНК D.nodosus производственного штамма ПП 82/90); 2 –ДНК D.nodosus в патматериале; 3 – ДНК здорового копытного рога; 4 - ДНК E.coli; 5 - ДНК S.aureus; 6 - ДНК B.subtilis; 7 - ДНК C.perfringens; 8 - ДНК C.septicum; 9 - ДНК P.aeuroginosa;

10 - ДНК А.pyogenes; 11 - ДНК S. zooepidermicus; 12 - ДНК F.necrophorum; - ДНК F. nucleatum; 14 – отрицательный контроль (H2О); М –ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п.).

чувствительности ПЦР для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus длиной 783 н.п. с использованием праймеров NOD F и NOD R.

Матрица – ДНК D.nodosus штамма ПП 82/90. Треки: 1-6) серийные разведения ДНК D.nodosus; 1) 29106 копий в пробе; 2) 29105 копий в пробе; 3) 29104 копий в пробе; 4) 29103 копий в пробе; 5) 29102 копий в пробе; 6) 2910 копий в пробе; М – ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п).

Определение чувствительности разработанной ПЦР проводилось путем титрования культуры D.nodosus, определения количества бактериальных клеток (геномных копий) в пробе, выделения ДНК из проб фенольно хлороформным методом и использования её в качестве матрицы для проведения ПЦР. По результатам этого исследования, изображенных на рисунке 9 можно заключить, что чувствительность ПЦР составляет бактерий в пробе (геномных копий).

2.2.2. Разработка метода ПЦР – амплификации вариабельного фрагмента гена fimA D.nodosus для типирования штаммов Определение серологической группы и серологического варианта бактериологическом исследовании возбудителя. Это связано с тем, что современные программы по ликвидации копытной гнили овец основаны на применении моноштаммовых вакцин, специфичных серологической группе эпизоотического штамма D.nodosus, что требует её точного определения.

Стандартным методом определения серологической группы является РА, которая основана на агглютинации фимбрий бактерии. Однако, кроме выделения культуры возбудителя для проведения этой серологической реакции необходим полный набор специфических антисывороток, которых нет в России. Выходом из этой ситуации является разработка генотипирования, основанного на ПЦР - амплификации гена fimA, кодирующего фимбриальные субъединицы. При определении нуклеотидных последовательностей fimA было обнаружено значительное различие между серологическими группами A, B, C, E, F, G, I, M (они объединены в I класс) и D, H (II класс). Это сведения должны учитываться при разработке праймеров.

Для каждой серологической группы должны быть созданы «консенсусные»

нуклеотидные последовательности, проведен сравнительный компьютерный анализ этих последовательностей между собой. После этого осуществлен поиск участков гена fimA, где последовательности внутри серологической группы были бы достаточно консервативны для создания специфических олигонуклеотидов и одновременно были отличны от последовательностей других серологических групп.

Исследования по разработке данной ПЦР для типирования возбудителя копытной гнили овец D.nodosus включали те же этапы, что и при амплификации гена 16S рРНК. Разработку метода ПЦР – амплификации гена fimA осуществляли также на производственном штамме ПП 82/90 D.nodosus.

Подготовка диагностического материала путем наращивания бактериальной массы и метод выделения были такими же, как в пункте 2.2.1.

Ранее исследователями было разработано несколько наборов праймеров (85, 123, 226, 170). Нами были проанализированы предложенные варианты и найдены удовлетворяющие нашим задачам олигонуклеотиды.

Для этого нами были проанализированы все имеющиеся на тот период в базе Genbank (NCBI, США) (www.ncbi.nlm.nih.gov) нуклеотидные последовательности этого гена в количестве 61 штамм D.nodosus. В компьютерной программе SeqMan из пакета программ Lasergene из них были созданы «консенсусные» последовательности, определены константные и вариабельные регионы гена fimA и наложены праймеры.

прямоугольником) прямого праймера FimA-F для амплификации вариабельного фрагмента гена FimA D.nodosus серогрупп A, B, C, E, F, G, I, M.

прямоугольником) обратного праймера FimA-R1 для амплификации вариабельного фрагмента гена FimA D.nodosus серогрупп B, C, E2, G, M.

прямоугольником) обратного праймера FimA-R2 для амплификации вариабельного фрагмента гена FimA D.nodosus серогрупп A, E1,F, I.

Рис. 13. Область гибридизации (обозначена черным прямоугольником) прямого праймера FimA-DH-F для амплификации вариабельного фрагмента гена FimA D.nodosus серогрупп Н и D.

Рис. 14. Область гибридизации (обозначена черным прямоугольником) обратного праймера FimA-DH-R для амплификации вариабельного фрагмента гена FimA D.nodosus серогрупп Н и D.

Наилучшим вариантом был признан набор из 5-ти праймеров, которые подразделяют штаммы на 3 группы - два прямых праймера связываются специфично по классам (I-му и II-му), а три обратных - специфичны для определенного набора серогрупп/серовариантов. Праймеры инициируют амплификацию двух третей С - концевого вариабельного фрагмента гена FimA (226) (таблица 5) (Рис.10 – 14).

Специфичность праймеров была проверена теоретически с помощью программы BLAST. Было установлено, что праймеры не отжигаются на микроорганизмов.

чувствительности ПЦР с праймерами FimA-DH-F и FimA-DH-R для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus длиной 440 н.п. на матрице ДНК D.nodosus штамма ПП 82/90. Треки: 1-6) серийные разведения ДНК D.nodosus; 1) 29106 копий в пробе; 2) 29105 копий в пробе; 3) 29104 копий в пробе; 4) 29103 копий в пробе; 5) 29102 копий в пробе; 6) 2910 копий в пробе; М – ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п).

По результатам оценки чувствительности ПЦР для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus было установлено, что чувствительность метода составляет 2900 геномных копии бактерии в пробе (Рис.15).

При разработке способа проведения ПЦР для получения надежной работы праймеров подбирались следующие параметры: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров, временные режимы проведения ПЦР. Было установлено, что разработанные праймеры работают специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией MgCl (1,5 мМ).

Также нами была оптимизирована температура отжига праймеров, инициирующих амплификацию фрагмента гена FimA. Для этого была протестирована пара праймеров FimA-DH-F и FimA-DH-R в градиентной ПЦР с температурой отжига от 56°С до 67°С. Режим амплификации см.

таблицу 6. После получения результатов оказалось, что оптимальной для отжига этих праймеров явилась температура в 56 - 62°С. В градиенте этих температур была хорошая наработка ампликонов и не наблюдались неспецифические амплификации (Рис. 16).

Рис.16. Электрофореграмма результатов (в 1% агарозном геле) градиентной ПЦР с праймерами FimA-DH-F и FimA-DH-R для амплификации фрагмента гена гена FimA D.nodosus производственного штамма ПП 82/90 длиной 440 н.п. Треки (температура отжига праймеров): - 56°С; 2 – 58°С; 4 - 62°С; 5 - 65°С; 6 - 67°С; М – ДНК-маркер (от 100 до н.п.).

Для генотипирования производственного штамма ПП 82/90 D.nodosus амплификацию вариабельного фрагмента гена FimA и предварительное его типирование. Режим амплификации см. таблицу 7. После проведения ПЦР и детекции её результатов амплифицированный ПЦР - фрагмент оказался отнесенным ко II классу и принадлежности к серогруппам D или H (Рис. 17).

Для дальнейшего точного определения группы и варианта после выделения из геля ДНК полученного амплифицированного фрагмента длиной около 440 н.п. было проведено секвенирование для определения его использовался пакет компьютерных программ Lasergene (DNASTAR, США) (Рис. 18).

Рис. 17. Электрофореграмма (в 1% агарозном геле) результатов амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus производственного штамма ПП 82/90 длиной около 440 н.п.. Треки: 1 – с праймерами FimA-F и FimA-R1; 2 - с праймерами FimA-F и FimA-R2; 3 - с праймерами FimA-DH-F и FimA-DH-R; 4 – отрицательный контроль (H2О); М – ДНК-маркер (от 100 до 1400 н.п.).

CGCTCGTTCACAAGTTAGCCGCGTTATGTCAGAAACTGGACAAATGCGCACTGCCATCGAAACTTGCCTTTTAGATGGTA

AAGAAGCCGGTGAATGCTTCATTGGTTGGACCACAAGTAACTTATTAGCTGCAGCTGGTGGTAGCACTACTAACAACGCA

ACAGCTGCAGCTCCTGGTCAAGGAGGTTTGAATATTACCTACGCACTTGAATCCACTGCTGAAAATAAGATTGAAGCTAC

ATTTGGTCAGAATGCTGCCGCTACACTTCATGGTAAAAAATTAACATGGACACGCAGCCCAGAAGCTACTTGGTCTTGCT

CAACAGACGTTGATGAAAAATTCAAGCCAACTGGCTGTAAAAAATAGAGACTAATAGTCTTTTGCTTACAGGCG

Рис. 18. Нуклеотидная последовательность (394 н.п.) вариабельного фрагмента гена fimA, амплифицированного с помощью пары праймеров FimA-DH-F и FimA-DH-R, производственного штамма ПП 82/ D.nodosus. Генотип Н1 (класс II).

Ранее штамм ПП 82/90 был отнесен к сероварианту В2 в РА и к сероварианту В4 в ИФА (3, 33, 35). Нами были получены другие результаты.

При проведении сравнительного анализа полученной нуклеотидной последовательности с помощью программы BLAST с имеющимися в базе последовательностями гена FimA D.nodosus было установлено, что штамм ПП 82/90 имеет наибольшее сходство со штаммом М13765 (с разницей в нуклеотидных замен), а также двумя генетически идентичными штаммами AF316611 и AF146890 (с разницей в 8 замен), принадлежащих сероварианту Н1. Следовательно, российский производственный штамм ПП 82/90 имеет наибольшее родство с австралийским и новозеландскими штаммами. При этом штамм AF316611, также как и ПП 82/90, является вакцинным производственным штаммом (компания Schering-Plough Animal Health).

2.2.3. Реактивирование, изучение жизнеспособности, сохранности морфологических, тинкториальных и культуральных свойств, а также молекулярно – генетическое исследование 27 штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко Коллекция ВИЭВ содержит 28 штаммов (в работу были взяты штаммов, т.к. штамм ПП82/90 был нами уже исследован). Это единственная коллекция штаммов D.nodosus в России (таблица 1). Все культуры находились в запаянных под вакуумом ампулах и были лиофилизированы в 1988 - 91 гг. Реактивацию начали с наиболее поздней сушки – 1991 года, в случае неудачи проводили посевы 1990 года сушки. Следует отметить, что проведение реактивации настолько старых лиофилизированных культур D.nodosus в России проводилось впервые, данных по жизнеспособности таких штаммов не было ни в отечественной, ни в зарубежной литературе.

Имеются лишь данные по жизнеспособности D.nodosus в лиофильном виде в течение 4-5 лет (35).

Из первичных посевов удавалось взять в дальнейшую работу около 30 % культур. Эти культуры росли в виде комочков ваты, часто с точечными вкраплениями различной величины и количества в разных частях пробирки.

При микроскопии таких культур в основном наблюдалось сохранение морфологических и тинкториальных свойств возбудителя, но часть клеток всё же были деформированными, плохо прокрашенными, изъеденными, овальными. Накопление культуры в пробирках было слабое, что подтверждалось малым количеством делящихся бактериальных клеток в мазках. Повторные пассажи таких культур значительно усиливали рост возбудителя, а также улучшали морфологические и тинкториальные свойства. После вторичных пассажей также проводили оценку роста и микроскопию культур. Интересно, что на начальных этапах реактивации нами не наблюдался характерный для D.nodosus рост в виде ярко выраженных штрихов или «комет». При подтверждении хорошего роста и наличии характерного возбудителя, культуры пересевали на тиогликолевый кровяной агар и помещали в анаэростат с условиями вакуума при температуре 37°С на 4-6 дней. Данный этап был необходим для определения культуральных свойств на плотной среде, усиления вирулентных свойств, а также наращивания биомассы возбудителя для дальнейшего проведения молекулярно-генетических исследований. Оценка роста проводилась визуально и микроскопией мазков, окрашенных по методу Грама. На КА рост культур чаще всего был в виде слегка беловатых росинчатых колоний, довольно слабый, некоторые штаммы не удалось вырастить именно на этом этапе. Были штаммы, дававшие шероховатый тип колоний (Р-86, Войтик, Каз-9). После микроскопии характерных колоний и подтверждения наличия грамотрицательных палочек с утолщениями на концах, проводились пересевы на полужидкую среду, а оставшиеся на чашке колонии использовались для смыва возбудителя и выделения его ДНК. Рост культур D.nodosus после пересева с КА на полужидкую тиогликолевую среду уже на 2-й день был очень сильным в виде характерных штрихов по всему столбику среды (Рис. 19).

Если штамм давал хороший рост на плотной среде, выделение ДНК D.nodosus осуществлялось с помощью триреагента. При отсутствии роста на плотной среде и наличии роста на полужидкой среде, ДНК получали прямым внесением 5 мкл этой среды в ПЦР–смесь, а в случае неудачи осуществляли выделение фенольно-хлороформным способом.

Рис.19. Двухдневная культура D.nodosus на полужидкой тиогликолевой среде (после пересева отдельных колоний с плотной тиогликолевой среды).

Молекулярно - генетическая экспертиза штаммов D.nodosus из коллекции ВИЭВ нами была проведена впервые в России. Мы использовали методы, успешно отработанные на производственном штамме ПП 82/90 и описанные в разделах 2.2.1., 2.2.2.

Идентификацию вида возбудителя проводили с помощью пары праймеров NOD F и NOD R для амплификации участка гена 16S рРНК. Все жизнеспособные штаммы в этом исследовании при помощи разработанной ПЦР были идентифицированы как D.nodosus (таблица 8).

Далее было необходимо провести генотипирование возбудителей.

Методика амплификации вариабельного фрагмента гена fimA с проведением дальнейшего секвенирования полученных ДНК-фрагментов и сравнения их нуклеотидных последовательностей с референтными последовательностями Genbank NCBI в программе BLAST описана в разделе 2.2.2.

Результаты амплификации методом ПЦР фрагментов генов № Название Идентифика Серогруппа Генотипирование по Примечание: полож. – положительный результат.

Рис. 20. Элайнмент полученных нами нуклеотидных последовательностей фрагмента гена fimA 8 – ми штаммов D.nodosus (класс I).

Рис. 21. Элайнмент полученных нами нуклеотидных последовательностей фрагмента гена fimA 9 – ми штаммов (включая производственный штамм ПП 82/90) D.nodosus (класс II).

Сводная таблица результатов изучения штаммов D.nodosus, использовавшихся в исследовании Примечание: «+» – положительный результат; «-» – результат отсутствует.

Для амплификации применялись все пять праймеров: FimA-F; FimA-R1;

амплифицированных фрагментов ДНК мы получили 17 нуклеотидных последовательностей вариабельных участков гена fimA (Рис. 20, 21) и осуществили генотипирование 17 штаммов D.nodosus из коллекции ВИЭВ.

Штамм Киржач типировать не удалось (таблицы 8 и 9).

По результатам молекулярно-генетической экспертизы удалось идентифицировать все 17 штаммов (100%), взятых в анализ, генотипировать штаммов (94,1%), в том числе те, которые не были серотипированы ранее.

Один штамм, серотипированный ранее по серогруппе, не был генотипирован нами вообще (5,9%). Было установлено, что 8 штаммов принадлежит к генотипу Н (47%), 7 – В (41,2%) и 2 штамма серогруппы Е (11,8%). При этом только один штамм полностью совпадает по серогруппе и сероварианту с генотипом (Л-83). У 3-х штаммов (Б-7, КЯ-82, КЧ-82) наблюдалось частичное совпадение, только по серогруппе. У 6-ти штаммов типирование в РА не проводилось и наши данные по типированию были впервые полученными. У 7-ми штаммов не совпадают ни серогруппа, ни соответственно, серовариант с установленным генотипом. Штамм Киржач генотипировать пока не удалось (таблицы 8 и 9).

2.2.4. Разработка способов подготовки проб патологического материала для выявления ДНК D.nodosus методом ПЦР патологического материала. В случае копытной гнили овец местом поражения являются исключительно копытца животного. Причем, локализация поражений зависит от стадии поражений. В 1-2-ю стадии возбудитель затрагивает кожу межкопытцевой щели и начинает проникать под аксиальную часть копытного рога, а в 3-4-ю стадии проникает под роговой чехол также с абаксиальной стенки копытец и пяточной стороны.

В любом случае перед взятием проб копытце тщательно отмывали от грязи с использованием водопроводной воды и щетки. Для каждого животного использовали новую пару стерильных перчаток, щетку и инструмент с целью предотвращения перекрестной контаминации.

Прижизненное взятие патологического материала проводили с помощью ватных тампонов или отрезанием кусочков копытного рога на границе зон разделения здорового и больного рога. Полученный материал помещали в стерильный 0,9% раствор NaCl и во льду доставляли в лабораторию. В лаборатории клетки с ватных палочек отмывали, тщательно перемешивая на смесителе типа «вортекс», вынимали тампон и коротко центрифугируют раствор в течение 15 с для осаждения крупных частиц. В работу брали надосадок. С кусочками патологического материала поступали иначе. В асептических условиях в стерильной ступке, отдельной для каждой пробы, кусочки копытного рога растирали в 0,9% растворе NaCl до получения непрозрачной суспензии. Чем лучше была выполнена эта работа, тем большую концентрацию бактериальных клеток нам удавалось получить для анализа. В работу брали жидкую часть этой суспензии, крупные частицы оставляли в ступке. В полученные таким образом пробы мы добавляли лизоцим в количестве 4 мг/мл и инкубировали при 4°С 2 часа для лизиса бактериальных клеток. Далее выделение ДНК проводили фенольнохлороформным способом. Как правило, большинство пораженных копытной гнилью отар располагаются на достаточном удалении от лабораторий молекулярной диагностики, доставка патологического материала затруднена.

Нами был разработан способ доставки патологического материала на достаточно далекие расстояния (исследованный нами материал привозили в Москву из Ставропольского края). После вынужденного убоя больной копытной гнилью овцы отрезали копытце животного, помещали в стерильный полиэтиленовый пакет и ставили в лед. В таком виде копытце должно быть доставлено в лабораторию в течение 24 часов. Если время доставки 1-2 дня, копыто необходимо заморозить и везти в замороженном состоянии во льду. Нам удавалось транспортировать материал 1,5 суток, он прибывал практически не размороженным, но требовал безотлагательной обработки вышеописанным способом, т.е. получением суспензии копытного рога. Данный способ оказался наиболее удобным, т.к. позволял не только длительно транспортировать материал, но и в большем количестве брать пробы из-за возможности разрезать копытце пополам и получить лучший доступ к патологическому материалу. Также стоит отметить, что замороженный патологический материал нельзя размораживать больше одного раза.

патологического материала вышеописанными способами с помощью ПЦРамплификации фрагмента гена 16S рРНК длиной 783 н.п., инициированной праймерами NOD F и NOD R, показаны в таблицах 10-12. Пораженные копытной гнилью копытца овец брались от вынужденно убитых животных.

Так же были пробы на ватных палочках и соскобы патологического использовалось копытце овцы из благополучного хозяйства. Классическим методом постановки диагноза служило подтверждение клинического заболевания результатами микроскопии с нахождением феномена «Бевериджа».

Результаты ПЦР с пробами патологического материала копытец Примечание: положит. – положительный результат.

Результаты ПЦР с пробами патологического материала в виде Примечание: положит. – положительный результат;

Результаты ПЦР с пробами патологического материала в виде смывов с пораженных копытец на ватных палочках Примечание: положит. – положительный результат;

патологического материала, представленных в таблицах 10 – 12, определялась в сопоставлении с классическим методом. Применялись следующие формулы:

где: ИО – количество истинно - отрицательных результатов;

ЛП - количество ложно - положительных результатов.

где: ИП – количество истинно - положительных результатов;

ЛО - количество ложно - отрицательных результатов.

Для таблицы 10: чувствительность = (10 / 10+0)100 = 100%;

Для таблицы 11: чувствительность = (3 / 3+2)100 = 60%;

Для таблицы 12: чувствительность = (1 / 1+4)100 = 20%;

По результатам проведенных подсчетов оказалось, что наибольшую диагностическую значимость имеет ПЦР, проведенное на выделенном из проб патологического материала в виде пораженных копытец вынужденно предложенным нами новым способом.

2.2.5. Проведение филогенетического анализа 15-ти штаммов D. nodosus Для изучения эволюционной истории, установления родственных связей нами были исследованы фрагменты гена fimA 15-ти штаммов D.nodosus. Нами была предложена новая OTU (оперативная таксономическая единица) для D.nodosus в виде вариабельного фрагмента гена fimA, отграниченного в начале прямыми праймерами, а в конце стоп – кодоном, позволяющая точно распределять генотипы возбудителя в пределах образующихся кластеров.

При построении филогенетической дендрограммы для обработки результатов мы пользовались программой MegAlign из пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR, США). Данная программа позволяет провести выравнивание последовательностей методом ClustalW и строить дендрограммы методом присоединения соседей - NJ (neighbor-joining method).

полученные нами нуклеотидные последовательности относятся всего к 3-м из 10-ти возможных генотипов возбудителя, для соблюдения точной кластерной топологии дендрограммы, а также определения эволюционных связей с изолятами из других стран, в анализ были добавлены еще референтные нуклеотидные последовательности из базы данных Genbank (NCBI, США). Все добавленные последовательности были обрезаны соответственно выбранной OTU (Рис. 22).

Топология дендрограммы, полученной после филогенетического анализа, представлена в виде прямоугольного масштабированного дерева, для определения эволюционных дистанций между двумя OTU которого, необходимо измерять сумму длин всех соединяющих их горизонтальных ветвей (20) (Рис. 23).

Анализируя полученную дендрограмму можно подтвердить кластовую структуру популяции возбудителя копытной гнили, основанную на проявлении вирулентных свойств с помощью фимбрий. Обнаруживается значительная эволюционная дистанция между кластерами под номерами 1- и кластерами 9,10, что показывает разделение всех серогрупп D.nodosus на два больших класса - I и II.

Рис. 22. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства на основе анализа нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена FimA (длиной около 400 н.п.) 15-ти депонированных в РФ штаммов (обозначены названия и серовариант) и 23-х референтных штаммов D.nodosus из Genbank NCBI (обозначены номера доступа в базе данных). Цифры в узлах дендрограммы обозначают кластеры (серогруппу и генотип): 1 - B, 2 - A, 3 – I, 4 – E, 5 – F, 6 –M, 7 – C, 8 – G, 9 –H, 10 - D.

дивергенция Рис. 23. Генетические дистанции между штаммами, представленными на рисунке 22.

В свою очередь, наименьшие эволюционные дистанции наблюдаются внутри кластеров, между штаммами одной серогруппы, и тем более сероварианта. Так, можно заключить, что нуклеотидные последовательности штаммов Яг, Знамя труда, Р -86 и КЯ-82 абсолютно идентичны друг другу и находятся в кластере серогруппы В. Абсолютная идентичность наблюдается между штаммами ПП 89/90 и К – 8 в кластере серогруппы H. Точные числовые значения эволюционных дистанций между сиквенсами любых двух пар штаммов можно посмотреть по специальной таблице, рассчитываемой программой MegAlign в момент построения дендрограммы (Рис.23).

На дендрограмме можно определить эпизоотически значимые, сильновирулентные группы D.nodosus, наблюдающиеся в эпизоотических очагах копытной гнили, где возбудитель подвергается значительному давлению иммунной системы организма животных и уходит от этого воздействия путем изменений в геноме. К таким генетически гетерогенным группам можно отнести кластеры B, H и в некоторой степени – Е. И действительно, литературные данные и результаты наших исследований подтверждают преобладание возбудителей данных серогрупп в мире, все они выделены из эпизоопических очагов болезни. Есть на дендрограмме и кластеры скорее эндемических штаммов, чем вызывающих активные эпизоотические очаги. Кластеры A, I, D, G, C являются генетически устойчивыми и менее эпизоотически значимыми. Особый случай представляет кластеры серогрупп М и F. Внутри группы эволюционная дистанция между штаммоми серогруппы М - AF 146889 и AF 038920, гораздо больше, чем между AF 146889 и штаммами соседнего кластера серогруппы F.

Действительно, штамм AF 038920 был выделен в эндемических районах Непала и является авирулентным, хотя наличие фимбрий на его поверхности доказано (109, 225). Вероятно, речь идет о потере агглютинирующих эпитопов на фимбриях. Вопрос об особенностях серогруппы М является до сих пор открытым.

С точки зрения построения эпизоотических гипотез на основе имеющихся данных по месту выделения штаммов можно судить об эпизоотологических связях между странами, неблагополучными по копытной гнили.

Копытная гниль – высококонтагиозная инфекционная болезнь мелкого рогатого скота с поражением копытец, вызванная Dichelobacter nodosus (D.nodosus). Клиническое проявление этой болезни зависит от условий содержания и кормления, а также от факторов внешней среды и состава складывающейся ассоциации вторичных микроорганизмов (27). Несмотря на огромное количество потраченных усилий и средств, заболевание и сегодня остается серьезной проблемой для большинства овцеводческих стран мира, оно продолжает наносить огромный экономический ущерб, складывающийся в основном из снижения шерстной, мясной продуктивности и недополучения приплода. С каждым годом с увеличением торговли овцами в глобальном масштабе возрастает опасность заноса возбудителя в благополучные местности или расширения серогруппового разнообразия эпизоотических штаммов в уже неблагополучных регионах.

По этим причинам ветеринарные врачи и ученые овцеводческих стран активно разрабатывают программы по контролю и ликвидации копытной гнили, в основе которых лежит эпизоотологический мониторинг болезни, выполняемый на основе современных диагностических средств (117, 214).

Классический бактериологический метод постановки диагноза на копытную гниль остается чрезвычайно сложным для выполнения. Причин этому несколько и они кроются в следующем:

1) Возбудитель без условий анаэробиоза может сохранять жизнеспособность в патологическом материале очень непродолжительное время, до нескольких часов, как правило, до лаборатории его доставить не удаётся;

2) Количество бактериальных клеток D.nodosus в зонах поражений очень мало по сравнению с другими ассоциатами, локализацию возбудителя без наличия навыков сложно определить;

3) Медленный характер роста D.nodosus в первичных посевах позволяет другим видам ассоциативных анаэробных или факультативно анаэробных бактерий заглушать его колонии, посевы слишком «грязные», приходиться проводить большое количество дробных посевов;

4) Колонии D.nodosus настолько малы, что зачастую остаются незамеченными;

5) Нет специальных селективных сред для D.nodosus;

6) Нет лабораторных моделей для постановки биопробы, только естественно восприимчивые животные.

В результате диагностика копытной гнили в нашей стране в большинстве случаев основана на постановке клинического диагноза, подкрепленного результатами микроскопии и нахождением «феномена Бевериджа». В России много лет назад была разработана РНИФ, которая качественно улучшала процесс постановки диагноза, но на сегодняшний день данная реакция недоступна (25). Однако к началу 90-х годов исследования были приостановлены.

В то же время за рубежом проблемы диагностики копытной гнили овец стали решаться еще в 1993 году, когда Ла Фонтейн и сотр. разработали олигонуклеотиды для иммуноблоттинга по гену 16S рРНК, которые как оказалось, гораздо лучше работают в ПЦР и могут амплифицировать ген прямо из патологического материала минуя бактериологическое выделение возбудителя (140). Нами было принято решение изучить возможности видовой диагностики бактерий по этому гену применительно к D.nodosus.

Оказалось, что ген 16S рРНК один из самых консервативных в геноме бактерий и существуют два подхода к его амплификации с целью определения вида. Первый, это применение праймеров к консервативным для всех бактерий участков гена с дальнейшим секвенированием и анализом в BLAST (26) или специализированной базе генов 16S рРНК (http://www.arbsilva.de), второй - применение праймеров к вариабельным участкам, характерным только для D.nodosus (140). Второй вариант подходит для рутинной лабораторной диагностики и для разработки ПЦР мы протестировали несколько олигонуклеотидов, предложенных авторами.

Чувствительность метода по их данным составила менее 10 клеток D.nodosus.

Несомненный интерес представляло сообщение авторов, что праймеры успешно работают для детекции D.nodosus прямо из патологического материала (в этом случае время анализа по сравнению со стандартным культуральным сокращается с 3-4-х недель до 24 часов) (140).

Далее было необходимо разработать условия ПЦР и испытать работу праймеров сначала на культуре, а затем на патологическом материале.

Разработку метода проводили на культуре производственного штамма ПП 82/90, как наиболее изученного, хорошо растущего и лиофилизированного в 2000 – х годах D.nodosus. Для работы этот штамм был нами реактивирован из лиофильного состояния, морфологически, тинкториально, культурально охарактеризован, наращена биомасса бактерии на плотной и полужидкой средах и только после этого взят в исследование.

В зарубежной литературе предлагалось довольно много вариантов лизиса бактерии и последующего выделения ДНК D.nodosus. Основной метод, предлагаемый учеными (разработанный в 1984 году Андерсеном и сотр.), был отвергнут нами из-за чрезмерной длительности и сложности, хотя в дальнейшем в нашей модификации успешно применен для работы с патологическим материалом (69). Смыв культуры с плотной среды проводили PBS или 0.9% физиологическим раствором, что позволяло сохранить клетки без разрушения. Важно отметить, что для лучшего отмывания следует пользоваться шпателем, так как клетки очень плотно сидят на субстрате и их приходится практически соскребать. Дальше мы концентрировали клетки центрифугированием в течение 10 – 15 мин при 13200g, промывали PBS или 0.9% физиологическим раствором и опять центрифугировали, таким образом, избавляясь от примеси агара и кровяных частиц. Следует иметь в виду, что полностью агар редко удается отмыть, поэтому для сохранения бактериальной массы лучше этот шаг повторять максимум 2-3 раза. Отмывание клеток из полужидкой среды проводили таким же способом, но в данном случае лучше брать больший объем среды (т.к. будут сильные потери клеточной массы) и делать отмываний больше, так как количество агара в осадке будет значительное. Оба метода хороши, концентрированного материала.

Также нами были опробованы способы получения ДНК из лиофильно высушенных штаммов и прямым внесением 5 мкл культуры в тиогликолевой среде в ПЦР-смесь. Это очень быстрые способы, первый не требует посевов, а второй – выделения ДНК. Но у них есть недостатки. Так, материал из ампул содержит мало бактерий и много постороннего белка, хотя при правильном проведении фенольно-хлороформного выделения ДНК получается достаточно концентрированная и чистая для проведения ПЦР. Чего нельзя отметить для способа, рекомендованного Дангуелом (85), но признанного нами как не очень надежного, так как при прямом внесении культуры в ПЦР реакция проходила примерно в половине случаев. Вероятно, это может быть из-за слишком малого количества клеток в пробе из среды или наличия каких-либо ингибиторов ПЦР в ней.

После получения ДНК из культуры возбудителя необходимо было разработать методику ПЦР - амплификации фрагментов генов 16S рРНК и fimA. Прежде всего, была проверена специфичность выбранных праймеров теоретически с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), и практически - анализом ряда штаммов других близкородственных бактерий и ассоциатов, участвующих в развитии копытной гнили. Все праймеры в обоих исследованиях показали последовательности, в том числе на ДНК копытного рога.

Подбор праймеров к гену FimA явился сложной задачей. Первая треть гена консервативна и схожа с аналогичными фимбриальными генами других бактерий, например E.coli, P.aeruginosa, N.gonorrhoeae, M.bovis, как правило, для диагностических целей праймерами эту часть не захватывают (101). Зато начало второй трети гена, тоже консервативное, очень удобно для отжига праймера и охвата всех серогрупп, входящих в I - й класс (A, B, C, E, I, F, G, M), для II-го класса (D, H) с целью увеличения специфичности необходим свой праймер на эту последовательность. Далее варианты подбора обратных праймеров резко сокращаются из-за чрезвычайной вариабельности оставшейся части гена, даже внутри серогрупп. Поэтому одним из вариантов является разработка праймеров к консервативным участкам консенсусных последовательностей по каждой серогруппе в отдельности, что очень неудобно из - за слишком большого количества серогрупп (10 штук) и, соответственно, необходимости постановки сразу 10 ПЦР на один проверяемый изолят. Для определения сероварианта в BLAST все равно возникает необходимость секвенирования полученного ампликона. Хотя данный метод на сегодня активно разрабатывается группой австралийских ученых для «мультиплексной» ПЦР (85). Также существуют разработки на основе 5-ти обратных праймеров (226), но наименьшим возможным количеством для I - го класса является набор из 2-х обратных праймеров и 1го – для класса II. То есть, для исследования одного штамма необходимо праймеров – два прямых и три обратных, полученный ампликон подлежит дальнейшему секвенированию для сравнения в BLAST и определения серогруппы и сероварианта. Данные праймеры были проверены нами на специфичность теоретически с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), и практически – на других пилеобразующих бактериях (E.coli, P.aeruginosa). Все праймеры были специфичны.

амплификации. При этом подбирались следующие параметры: концентрация специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией MgCl (1,5 мМ). Кроме FimA-F и FimA-R2, а также NOD-F и NOD, все остальные пары праймеров были проверены в градиентных ПЦР для оптимизации температур отжига. Хотя праймеры имеют значительный разброс в расчетных температурах отжига между собой, все они показали довольно широкий диапазон рабочих температур без неспецифических амплификаций.

После анализа результатов нами было принято решение рекомендовать работу на 56°С при одинаковых условиях ПЦР для всех пар праймеров с целью обеспечения возможности постановки реакции одновременно с праймерами на 16S рРНК и fimA и получения более быстрых результатов.

После проведения разработанного ПЦР нами была получена целевая полоса амплификации величиной около 440 п.н. и по результатам сравнения секвенирования ампликона) в BLAST определена серогруппа и серовариант производственного штамма ПП 82/90 – H1. Результат отличался от заявленных ранее В2, определенной в РА и В4 –в ИФА (3, 33, 35). В связи с этим можно заключить, что результаты серологического исследования, сыворотками, которые довольно долго хранились, было низкое качество приготовленных антигенов или их недостаточная концентрация, да и на саму реакцию влияет слишком много факторов (например, самоагглютинация).

По результатам амплификации и секвенирования участка гена FimA производственного штамма ПП 82/90 впервые в Российской Федерации была получена нуклеотидная последовательность участка гена FimA серогруппы Н серварианта H1.

На основании полученных результатов амплификации участков генов 16S рРНК и fimA с целью идентификации и генотипирования D.nodosus филогенетического анализа были признаны нами пригодными для дальнейшего исследования других штаммов D.nodosus и разработке методик работы с патологическим материалом.

Дальнейшие исследования проводили на штаммах D.nodosus из коллекции ВИЭВ им.Я.И. Коваленко. Коллекция состояла из 28 штаммов возбудителя, выделенных сотрудниками лаборатории болезней овец в конце 70-х начале 80-х гг прошлого века в различных регионах СССР, 3 штамма из них были получены из Англии. В эксперимент были взяты 27 штаммов, так как производственный штамм ПП82/90 нами уже был исследован. На первом этапе предстояло реактивировать штаммы из лиофильного состояния, что само по себе в случае D.nodosus является сложной задачей, а данных по оживлению коллекции 20-ти летней давности мы вообще не имели. Зато сообщалось, что штаммы D.nodosus жизнеспособны в лиофильном виде только в течение нескольких лет (35). Для посевов использовали тиогликолевую среду, как хорошо зарекомендовавшую себя для выращивания D.nodosus. Методики выращивания также были стандартными, разработанными отечественными или зарубежными исследователями. Для подтверждения реактивирования посевы постоянно проверяли визуально и микроскопией на соответствие выросших штаммов морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам D.nodosus, характерным для роста на данной среде. Как и ожидалось, в первичных посевах наблюдался сильный полиморфизм бактерий и низкое накопление бактериальной массы, почти не было делящихся клеток, визуальной оценке вида колоний сильно мешало помутнение среды в нижней части пробирки из-за наличия обезжиренного молока, которое использовалось при лиофильной сушке.

Повторные пересевы, как правило, позволяли реанимировать штамм, восстанавливалась морфология клеток, появлялись активно делящиеся клетки и, соответственно, усиливалось накопление в среде. Третий пассаж значимого изменения роста не вызывал и у хорошо растущих культур его можно не проводить. Третий пассаж мы стали применять только для плохо растущих культур, хотя в большинстве случаев он не помогал усилить рост штамма. На кровяном агаре росли только хорошо ожившие штаммы, этим объясняется отсутствие среди вновь лиофилизированных нами и отданных на хранение в музей некоторых штаммов, которые были нами успешно молекулярно-генетически охарактеризованы (таблица 9). В их случае для проведения ПЦР мы брали культуру прямо в тиогликолевой среде. Причем, метод отмывания бактерий из этой среды, хотя и многостадиен, достаточно прост в исполнении, но рекомендоваться в случае совсем слабого бактериального накопления не может из-за больших потерь клеток. Тогда мы использовали метод прямого внесения этой среды в ПЦР-смесь с прогреванием для разрушения бактерий, но стабильных результатов в данном случае не получили из-за возможного наличия каких-либо веществ, мешающих прохождению реакции или действительно настолько малому количеству возбудителя, что он не попадал в смесь. Если из двух ампул 91-го года сушки не удавалось получить культуру, мы брали предыдущую сушку 90-го года, максимум дважды. При отсутствии роста штамм признавали нежизнеспособным и работать с ним прекращали. Таким образом, всего было реактивировано и лиофильно высушено для дальнейшего хранения штаммов из коллекции (лиофилизированный препарат 17-го штамма – КЯ- был забракован после контроля).

По результатам молекулярно-генетической экспертизы удалось подтвердить вид возбудителя (D.nodosus) и генотип (с получением нуклеотидных последовательностей) у 17 штаммов из коллекции. Штамм Киржач показал хороший рост на полужидкой и плотной тиогликолевой средах, был идентифицирован как D.nodosus, но не был генотипирован.

Вероятно, это связано с сильной вырожденностью нуклеотидной последовательности в местах отжига праймеров и нуждается в более подробных исследованиях генома с подбором новых олигонуклеотидов. Зато штамм ЯГ был и идентифицирован и генотипирован, но не был релиофилизирован, так как давал рост только на полужидкой среде и не рос на тиогликолевом агаре, что не позволило его пересушить для дальнейшего хранения (таблица 9).

патологического материала. Как уже отмечалось выше, патологический материал из копытец слишком загрязнен и имеет малое количество D.nodosus. Кроме этого, на наш взгляд проблемой для получения бактерий является их сильное внедрение в пораженные ткани рога и трудности извлечения оттуда. Обычные способы выделения не давали результатов.

Оказалось, необходима предварительная обработка патологического материала. Важным шагом явилось хорошее суспендирование кусочков копытного рога в ступке. Далее необходимо продолжить разрушение связей с кератином и начать лизис клеток D.nodosus добавлением сухого лизоцима в количестве 4 мг/мл и оставить не менее чем на 2 часа при температуре 4°С.

Этот шаг является критическим для получения ДНК. Метод значительно модифицирован нами в сторону упрощения по сравнению с предложенным Андерсеном (69). Он предлагал воздействие лизоцима на кусочки копытного рога в течение суток и далее дополнительно воздействовать Протеиназой К часа. При взятии проб из прибывшего к нам в лабораторию копытца, предложенный нами метод работал в 100 % случаев. С прибывшими в PBS пробами кусочков копытного рога и ватных палочек от здорового животного все обстояло не так гладко. Как правило, выделить ДНК не удавалось.

Причинами могли служить не совсем точное взятие проб, более грязное, чем от отрезанной конечности, более поверхностное и, соответственно, с меньшим количеством возбудителя и большим количеством ингибиторов ПЦР. Кроме того, вероятно возбудитель и его нуклеиновые кислоты, хуже сохранялись в растворе помещенные в микропробирки при столь длительной транспортировке (во льду одни сутки). Ватные палочки явились самым ненадежным вариантом взятия проб, хотя многими исследователями советовались для применения (125, 226), на наш взгляд эти пробы почти не содержат возбудителя и сильно загрязнены гнойным содержимым поражений. Лучшим вариантом выделения ДНК из патологического материала явился стандартный фенольно-хлороформный метод. Для выделения с использованием лизоцима и неорганического сорбента или с триреагентом пробы имели слишком много примесей и осуществлять выделение ДНК было технически неудобно. Так, следует констатировать, что при выделении ДНК D.nodosus фенольно-хлороформным методом из патологического материала и использовании её в качестве матрицы, разработанная ПЦР проявила 100% чувствительность и 100% специфичность по сравнению с классическим методом в случае использования проб в виде целых копытец. Эти данные позволяют рекомендовать разработанный способ пробоподготовки для метода ПЦР – амплификации видоспецифичного фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus для диагностики копытной гнили овец.

освещается скудно и если проводится, то только по полному гену fimA (225).

Однако прочтение таких фенотипически значимых генов, как fimA, необходимо для изучения молекулярной эпизоотологии возбудителя болезни.

Нами филогенетическому анализу были подвергнуты 15 штаммов (14 из коллекции ВИЭВ и производственный штамм ПП 82/90. Предложенная нами OTU, с началом, являющимся концом консервативной первой трети гена fimA и отграниченном прямым праймером, с концом, совпадающим с концом этого гена ранее учеными в мире не предлагалась. Положительным моментом разработанной нами OTU является возможность применения тех же праймеров, что и для генотипирования с целями диагностики, отпадает необходимость в олигонуклеотидах для амплификации целого гена, что упрощает подход к выполнению методики молекулярными эпизоотологами.

Полученные нами данные филогенетической дендрограммы позволяют не только уточнить результаты генотипирования штаммов, полученные с помощью программы BLAST, но и выполнить задачу краткосрочного и локального эпизоотологического исследования, которая заключается в определении идентичности, генетического родства и взаимосвязей изолятов в конкретной неблагополучной местности (12, 40). Это ключ для проведения противоэпизоотических мероприятий и дальнейшего мониторинга за циркулирующими типами возбудителя копытной гнили овец. И, что также очень важно, накопление локальных данных является фундаментом для осуществления глобальной задачи молекулярной эпизоотологии, заключающейся в определении связей штаммов, циркулирующих на данной территории, со штаммами, распространенными на других территориях или в другие годы. Частично нами эта задача была выполнена путем включения в анализ референтных последовательностей изолятов из базы данных Genbank, однако глубокого анализа осуществить пока не получается из-за отсутствия сведений о времени и местности их выделения, а также из-за совсем малого времени наблюдения за молекулярными характеристиками штаммов, в том числе и российских. Поэтому наши данные лягут в основу осуществления задачи долгосрочного и глобального эпизоотологического анализа, итогом которого должно стать выяснение закономерностей распространения, эпизоотоологического надзора и прогноза, учитывающих эти закономерности (40).

типирования имеющихся у нас штаммов показал очень низкую их корреляцию, вероятной причиной является несовершенство простых серологических методов в сравнении с молекулярно-генетическими, так как генотипирование предполагает более детальную характеристику амплифицированных участков генома и оценку с помощью различных методик, а на РА действует много внешних факторов, что не способствует точности этой реакции.

Таким образом, на основе нашего молекулярно-генетического анализа удалость подтвердить, что результаты генотипирования характеризуются серологическими методами классификации микроорганизмов и эволюционных и эпизоотологических связей различных изолятов возбудителя копытной гнили овец (40).

1. Разработана методика ПЦР на основе амплификации фрагмента гена 16S рРНК, которая позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью проводить видовую диагностику культуры возбудителя копытной гнили овец - Dichelobacter nodosus.

2. Разработана методика на основе ПЦР – амплификации, последующего секвенирования и сравнительного компьютерного анализа вариабельного фрагмента гена fimA, для типирования штаммов на 10 групп и 19 вариантов Dichelobacter nodosus без использования серологических методов.

3. Показана возможность реактивации штаммов Dichelobacter nodosus после 20-летнего хранения в лиофилизированном виде с сохранением культурально - морфологических свойств и определения их вида и генотипа с помощью молекулярно – генетических методов.

4. Разработан способ подготовки проб патологического материала, для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.

5. Проведен филогенетический анализ на основе нового предложенного фрагмента гена fimA Dichelobacter nodosus, который показал корреляцию между серогруппами и генотипами возбудителя.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

практического использования методика ПЦР, позволяющая с высокой идентификацию возбудителя - D.nodosus без проведения культуральных исследований.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Для использования способа в научно - исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению D.nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР», утвержденные Научно методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г.

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абдурагимов, Х.А. Экономический ущерб от копытной болезни / Х.А.

Абдурагимов // Ветеринария. - 1968. - № 6. – С. 33-34.

2. Артюшина, И.А. Гомология ДНК у разных штаммов Bacteroides nodosus / И.А. Артюшина, Ю.Д. Караваев, С.К. Артюшин // Тр. ВИЭВ.

– М., 1987. - Т. 64. - С. 95-97.

3. Артюшина, И.А. Применение иммуноферментного метода для дифференциации штаммов возбудителя копытной гнили овец / И.А.

Артюшина, Ю.Д. Караваев, И.Н. Семенова // Бюлл. ВИЭВ. – 1988. – Т.

65. – С. 66-68.

4. Артюшина, И.А. Создание банка генов Bacteroides nodosus / И.А.

Артюшина, С.К. Артюшин, С.Д Панасюк // Тр. ВИЭВ. – М., 1988. - Т.

64. - С. 21-23.

5. Архангельский, И.И. Копытная гниль овец / И.И. Архангельский, А.А.

Сидорчук, Ю.Д. Караваев. – М.: Агропромиздат. - 1986. – 95 с.

6. Бектемиров, М.А. Диагностика копытной гнили овец / М.А.

Бектемиров // Ветеринария. – 1979. - № 1. – С. 46 -48.

7. Бектемиров, М.А. Копытная гниль овец / М.А. Бектемиров // Ветеринария. – 1983. - № 2. – С. 40-42.

8. Бектемиров, М.А. Разработка методов диагностики копытной гнили овец, выделение и изучение биологии возбудителя: автореф. дис. … канд. вет. наук: 16.00.03 / М.А. Бектемиров. – М., ВИЭВ. - 1978. – 19 с.

9. Бектемиров, М.А. Серологические методы диагностики копытной гнили овец / М.А. Бектемиров // Сб. Профилактические и лечебные мероприятия в условиях отгонного животноводства. – Махачкала, 1981. – Т. 12. – С. 119-122.

10. Биологические свойства возбудителя копытной гнили овец / И.И.

Архангельский, Ю.Д. Караваев, А.В. Ляушкин и др. // Тр. ВИЭВ. – 1979. – Т. 49. – С. 76-80.

11. Волкова, А.А. Некробактериоз овец / А.А. Волкова, Р.С. Галлиев, В.И.

Овчаренко. – Фрунзе, 1965. – 184 с.

12. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей / А.Е. Платонов, Г.А. Шипулин, Е.Н. Тютюнник и др. // Пособие для врачей. ЦНИИЭ. – М.,2001. -37 с.

13. Гришаев, Н.Е. Некоторые свойства протеаз F. nodosus / Н.Е. Гришаев // Доклады ВАСХНИЛ. – 1972. - № 7. – С. 40-42.

14. Гришаев, Н.Е. Об этиологии копытной гнили овец / Н.Е. Гришаев // Доклады ВАСХНИЛ. – 1969. - № 11. – С. 31-34.

15. Егошин, И.С. Итоги изучения патоморфологических изменений при копытной гнили у овец / И.С. Егошин, Д. Раимбеков // Патоморф.

патогенез диагн. бол. с-х жив-х. – М., 1980. – C. 143-146.

16. Жолмагамбетов, С.М. Эпизоотология и клинические признаки копытной гнили овец / С.М. Жолмагамбетов // Сб. трудов MBA. – М., 1979. – Т. 108. - С.91-93.

17. Жолмагамбетов, С.М. Эпизоотология и клинические признаки копытной гнили овец / С.М. Жолмагамбетов, С. Нуйкин // Новые методы диагн., лечения и проф. не инфекцион. и инфекц заб-ний с-х жив-х. – М., 1979. – С.91-93.

18. Инструкция о мероприятиях по борьбе с копытной гнилью овец: утв.

гл. упр. ветеринарии Минсельхоза СССР 30.12.85. – М., 1986. – 5 с.

19. Кузнецов, Г.С. Лечение и ликвидация копытной гнили у овец / Г.С Кузнецов // Ветеринария. - 1961. - № 10. – С. 44-48.

20. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ / В.В. Лукашов // Уч. пособие. - М.:БИНОМ. - 2009. – 256 с.

21. Люминесцентный метод диагностики копытной гнили овец / И.И.

Архангельский, А.В. Ляушкин, Ю.Д. Караваев и др. // Ветеринария. – 1976. - № 6. – С. 51-53.

22. Ляушкин, А.В. Копытная гниль овец / А.В. Ляушкин // Болезни овец и коз. - М.: Колос. - 1973. - С. 108-114.

23. Мельникова, К.В. К изучению патогенеза копытной гнили овец / К.В.

Мельникова, С.Н. Кулаченко, А.Т. Добродомов // Болезни овец и меры борьбы с ними. – Чита, 1980. – С. 72-73.

24. Мельникова, К.В. Терапевтическое действие различных форм медного купороса на копытную гниль зимой / К.В. Мельникова // Болезни овец и меры борьбы с ними. – Чита, 1980. – С. 72-73.

25. Методические указания по лабораторной диагностике копытной гнили овец: утв.гл.упр. ветеринарии Минсельхоза СССР 25.12.85. – М., 1986.

26. Определение микробной флоры пигментных желчных камней на основе анализа гена 16S рибосомальной РНК / А.К. Ларин, П.Л.

Щербаков, Л.А. Харитонова и др. // РЖГГК. – 2009. - № 5. – С. 49-54.

27. Панасюк, С.Д. Значение ассоциаций микроорганизмов в этиологии и профилактике инфекционных болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота (некробактериоз, копытная гниль): дис. … докт.вет.наук: 16.00.03 / Сергей Дмитриевич Панасюк. - – М.: ВГНКИ.

- 2007. – 430 с.

28. Раимбеков, Д. Опыты по лечению копытной овец / Д. Раимбеков, И.С.

Егошин // Инфекционные болезни овец. – Фрунзе, 1976. – C. 197-201.

29. Раимбеков, Д.Р. Копытная гниль овец и меры борьбы с ней / Д.Р.

Раимбеков. - Фрунзе, 1979. - 12 с.

30. Саттаров, А.С. Эпизоотология копытной гнили овец на башкирском южном Урале и опыт оздоровления благополучных хозяйств от этой инфекции / А.С. Саттаров, У.М. Акчурин // Инф. бол. овец. – Фрунзе, 1976. – С.195-197.

31. Семенова, И.Н. Реакция агглютинации при копытной гнили овец / И.Н.

Семенова // Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов. – М., 1981. – С. 138-139.

32. Семенова, И.Н. Реакция непрямой гемагглютинации для диагностики копытной гнили овец / И.Н. Семенова // Бюл. ВИЭВ. – 1985. – Вып. 59.

- С. 26-29.

33. Семенова, И.Н. Серологическая типизация штаммов возбудителя копытной гнили овец / И.Н. Семенова, А.А.Сидорчук, Ю.Д. Караваев // Бюл. ВИЭВ. – 1988. – Вып. 65. - С. 38.

34. Сидоров, М.А. Некоторые вопросы эпизоотологии заболеваний конечностей овец / М.А. Сидоров, А.В. Ляушкин // Бюлл. ВИЭВ. – 1973. – Вып. 16. – С. 20-23.

35. Сидорчук, А.А. Копытная гниль овец: иммунитет, специфическая профилактика и терапия: дис. … докт. вет. наук: 16.00.03 / Александр Андреевич Сидорчук. – М.: ВИЭВ. - 1991. – 396 с.

36. Сукеев, Ш.С. Вопросы дифференциальной диагностики и взаимосвязи некробактериоза, контагиозной эктимы и копытной гнили / Ш.С.

Сукеев, Л.Т. Майгулакова, М. Абышев // Сб. Болезни овец и меры борьбы с ними. – Чита, 1980. – С. 112-114.

37. Сукеев, Ш.С. К вопросу дифференциальной диагностики копытной гнили овец / Ш.С. Сукеев, И.С. Егошин // Проф. и меры борьбы с бол.

овец. – Махачкала,1973. – C. 48-49.

38. Сукеев, Ш.С. К эпизоотологии копытной гнили мелкого и крупного рогатого скота / Ш.С. Сукеев // Сб. Болезни овец и меры борьбы с ними. – Чита, 1980. – С. 110-112.

39. Сукеев, Ш.С. О копытной гнили в Киргизии / Ш.С. Сукеев, И.С.

Егошин, Д. Раимбеков // Ветеринария. – 1974. - № 3. – С. 50-59.

40. Черкасский, Б.Л. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней / Под. ред. В.И.Покровского. - М.: Медицина. - 1993. - Т.1 – 464с.

41. A multiple site-specific DNA-inversion model for the control of Omp phase and antigenic variation in Dichelobacter nodosus / E.К. Moses, R.T.

Good, M. Sinistaj et.al. // Mol. Microbiol. - 1995. – Vol. 17. - № 1. – P. 183A retrospective study of clinical and laboratory characteristics of ovine footrot / D. Liu, C. Roycroft, J. Samuel et.al. // Vet. Microbiol. – 1994. Vol. 42. – № 4. - P. 373-381.

43. A single amino-acid change between the antigenically different extracellular serine proteases V2 and B2 from Dichelobacter nodosus / M.C. Riffkin, L.

Wang, A.A. Kortt et all. // Gene. – 1995. - Vol. 167. - P. 279-283.

44. A survey of the control and financial impact of footrot in the New Zealand Merino industry / J.G.H. Hickford, S. Davies, H. Zhou et al. // Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production. – 2005. - Vol. 65. – P.

117–122.

45. Abbott, K.A. Current approaches to the management of ovine footrot / K.A.

Abbott, C.J. Lewis // The Veterinary Journal. – 2005. - Vol. 169 - P. 28–41.

46. Activities and partial purification of extracellular proteases of Bacteroides nodosus from virulent and benign foot-rot / A.A. Kortt, I.J. O’Donell, D.J.

Stewart et al. // Austral. J. Biol. Sci. – 1982. – Vol. 35. - P. 481-489.

47. Aetiology of ovine footrot in the Portuguese region of Alto Alentejo / R.

Jimenez, S. iriz, P. Martin-Palomino et al. // J. Vet. Med. B. – 2003. – Vol.

50. – P. 118-120.

48. Amino acid sequence of extracellular acidic protease V5 of Dichelobacter nodosus. the caСШАtive organism of ovine footrot / A.A. Kortt, M.C.

Riffkin, A. Focareta et all. // Biochemistry and Molecular Biology International. – 1993. - Vol. 29. - P. 989-998.

49. Antigenic stability of fimbriae of Bacteroides nodosus / L.J. Moor, A.T.

Crowe, M. Norman et all. // Austr. Vet. J. - 1990. - Vol. 67. - P. 219-223.

50. Bacteriological study of footrot in pigs: a preliminary note / S. Piriz, M. A.

Hurtado, J. Valle et al. // Vet. Rec. – 1996. - Vol. 139. - P. 17-19.

51. Barber, D.M.L. Foot rot in sheep / D.M.L. Barber // Vet. Rec. – 1979. – Vol.

104. – P. 194-195.

52. Benito, M. Etiologie et pathogenie du pietin chez les ovins et les bovine / M.

Benito // Rev.med.veter. - 1974. – Vol. 125. - № 5. – P. 611-620.

53. Bergey’s Manual of systematic bacteriology – 9th Edd., - 1986. – Vol. 2.

54. Beweridge, W.I.B. Disease caused by non-sporing anaerobes:ovine footrot necrobacillosis / W.I.B. Beweridge // Bull. OIE. – 1967. – Vol. 67. – P.

1597–1601.

55. Beweridge, W.I.B. Foot-rot in sheep: a transmissible disease due to infection with Fusiformis nodosus / W.I.B. Beweridge // Bull. Counc. Sci. Industr.

Res. – 1941. – Vol. 140,№ 1. – P.32-38.

56. Billington, S.J. Virulence regions and virulence factors of ovine footrot pathogen Dichelobacter nodosus / S.J. Billington, J.L. Johnston, J.I. Rood // Fems. Microb.letters. – 1996. – Vol. 145. – P. 147-156.

57. Broad, T.E. Partial purification and propertiens of extracellular proteolytic activy of Bacteroides nodosus / T.E. Broad, T.M. Skerman // N.Z.J. Agric.

Res. – 1976. – Vol. 19. - № 3. – P. 317-322.

58. Бинев, К. Рентгенова картинана усложненията при копитният гнилец поовцете / К. Бинев, Ж. Филипов // Вет.сб. - 1980. – вып. 78. - № 7. – С.

18—19.

59. Cagatay, I.T. Characterization of footrot bacteria Dichelobacter nodosus using PCR amplification and DNA sequence analysis / I.T. Cagatay, J.G.H.

Hickford // Turk. J. Vet. Anim. Sci. – 2006. – Vol. 30. – P. 53-59.

60. Cagatay, I.T. Update on ovine footrot in New Zealand: isolation, identification, and characterization of Dichelobacter nodosus strains / I.T.

Cagatay, J.G.H. Hickford // Vet. Microbiol. – 2005. - Vol. 111 - P. 171–180.

61. Characterisation of virulent and benign strains of Bacteroides nodosus / L.J.

Depiazzi, R.B. Richards, J. Henderson et al. // Vet. Microbiol. – 1991. – Vol. 26. - № 2. – P. 151-160.

62. Characterization of a basic serine proteinase (pI 9.5) secreted by virulent strains of Dichelobacter nodosus and identification of a distinct, but closely related, proteinase secreted by benign strains / A.A. Kortt, J.B. Caldwell, R.

Edwards et al. // Biochemical Journal. – 1994. - Vol. 299. – P. 521-525.

63. Chetwin, D.H. The recognition and prevalence of Bacteroides nodosus serotype M in Australia and New Zealand / D.H. Chetwin, L.C. Whitehead, U.S.E. Thorley // Austr.Vet. J. – 1991. - Vol. 68. - № 4 - P. 154-155.

64. Claxton, P.D. Classification of Bacteroides nodosus by agglutination tests / P.D. Claxton, L.A. Ribeiro, J.R. Egerton // Austr. Vet. J. – 1983. – Vol. 60. P. 331-334.

65. Claxton, P.D. Footrot in goats and characterization of caprine isolates of Bacteroides nodosus: Footrot in Ruminants / P.D. Claxton, К.С. O'Grady // CSIRO. – Australia, 1986. – P. 119 -123.

66. Claxton, P.D. Serogrouping of Bacteroides nodosus isolates: Footrot in ruminants / P.D. Claxton // CSIRO. – Australia, 1986. – P. 131 – 134.

67. Clinical and laboratory diagnosis of benign, intermediate and virulent strains of Bacteroides nodosus: Footrot of ruminants / D.J. Stewart, J.E. Peterson, J.A. Vaughan et al. // CSIRO. - Australia, 1986. – P. 81-91.

68. Clinical footscald and footrot in a New Zealand Romney flock: phenotypic and genetic parameters / T.М. Skerman, D.L. Jolmson, D.W. Kane et al. // Aust. J. Agric. Res. – 1988. - Vol. 39. – P. 907 – 916.

69. Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding the structural subunit of Bacteroides nodosus fimbriae / B.J. Anderson, M.M.

Bills, J.R. Egerton et al. // J. of Bacteriol. – 1984. – Vol. 160. - № 2. – P.

748-754.

70. Cloning and Sequencing of a Moraxella bovis Pilin Gene / C.F. Marrs, G.

Schoolnik, J.M. Koomey et al. // J.of Bact. - 1988. – Vol. 163. - № 1. – P.

132-139.

71. Cloning, sequencing and expression of the gene (aprV5) encoding extracellular serine acidic protease V5 from Dichelobacter nododus / M.C.

Riffkin, A. Focareta, R. Edwards et al. // Gene. – 1993. - Vol. 137. - P. 259Comparison of gene probe and conventional methods for the differentiation of ovine footrot isolates of Dichelobacter nodosus / J.I. Rood, P.M.

Howarth, V. Haring et al. // Vet. Microbiol. – 1996. - Vol. 52 - P. 127-141.

73. Complete nucleotide sequence of the 27-kilobase virulence related locus (vrl) of Dichelobacter nodosus: evidence for extrachromosomal origin / S.J.

Billington, A.S. Huggins, P.A. Johanesen et al. // Infection and Immunity. – 1999. – Vol. 67. – P. 1277-1286.

74. Contagious fot rot. / W.P. Deweese, Т. Clay, D.G. Ely et at. / Sheep breeder.

- 1982. – Vol. 102. - № 9.-P. 134, 136, 138.

75. Control of footrot in small ruminants in Nepal. ACIAR Projects AS2/1991/017 and AS2/1996/021. - ACIAR, Canberra, 2001. - Режим доступа: http: //www.aciar.gov.au/node/12737.

76. Cooper, B.S. Differences in morphology of Bacteroides nodosus attributable to the culture media / B.S. Cooper // New Zealand Vet. J. – 1977. – Vol. 25.

- № 1-2. - P. 16-20.

77. Cooper, B.S. Differences in morphology of Bacteroides nodosus attributable to the culture media / B.S. Cooper // New Zealand Vet. J. – 1977. – Vol. 25.

- № 1-2. - P. 16-20.

78. Cygan, Z. Niektore zagadnienia zwiazane z immunoprofilaktyka w zanokcicy owiec / Z. Cygan, J. Barcz, D. Deptula // Medicina Wet. – 1978. – t. 34. - № 4. – S. 196-199.

79. Day, S.E.J. Serotyping of Bacteroides nodosus: proposal for 9 further serotypes (J-R) and a study of the antigenic complexity of B. nodosus pili:

Footrot in ruminants / S.E.J. Day, C.M. Thorley, J.E. Beesley // CSIRO. – Australia, 1986. – P. 147-159.

80. Dean, H.M. The pathology of contagious footrot in sheep/ H.M. Deane, R.

Jensen // Am. j. vet.res. - 1955. – Vol. 59. - № 16. - 203-208.

81. Delineation of the virulence-related locus (vrl) of Dichelobacter nodosus / V. Haring, S.J. Billington, C.L. Wright et al. // Microbiology. – 1995. - Vol.

141. - P. 2031-2089.

82. Depazzi, L. Footbathing, footrot ecology and dominance in mixed Dichelobacter nodosus infections / L. Depazzi // Proceedings of the National Workshop on Footrot. - Perth, 2003 – P. 59-63.

83. Depazzi, L.J. A degrading proteinase test to distinguish benign and virulent ovine isolates of Bacteroides nodosus / L.J. Depiazzi, R.B. Richards // Austral Vet. J. – 1979. – Vol. 55. - № 1. – P. 25-28.

84. Detection of Dichelobacter nodosus in wild ungulates ( Capra ibex ibex and Ovis aries musimon) and domestic sheep suffering from foot rot using a two-step polymerase chain reaction / L. Belloy, M. Giacometti, P. Boujon et al. // Journal of Wildlife Diseases. – 2007. - Vol. 47. - № 1. - P. 82–88.

85. Dhungyel, O.P. Serogroup specific single and multiplex PCR with preenrichment culture and immuno-magnetic bead capture for identifying strains of D.nodosus in sheep with footrot prior to vaccination / О.P.

Dhungyel, R.J. Whittington, J.R. Egerton // Molecular and Cellular Probes. Vol. 16. – P. 285-296.

86. Diagnosis of footrot in goats: application of ELISA tests for response to antigens of Dichelobacter nodosus / S.C. Ghimire, R.J. Whittington, O.P.

Dhungyel et al. // Vet. Microbiol. – 2002. – Vol. 87. – P. 237-251.

87. Differentiation of Bacteroides nodosus biotypes and colony variants in relation to their virulence and immunoprotective properties in sheep / T.M.

Skerman, S.K. Erasmuson, D. Every et all. // Infection and immunity – 1981. – Vol. 13. - № 4. – P. 788-795.

88. Egerton, J.R. Benign foot-rot. A specific interdigital dermatitis of sheep associated with infection by less proteolytic strains of Fusiformis nodosus / J.R. Egerton, I.M. Parsonson // Aust. Vet. J. – 1969. – Vol. 45. – P. 345-349.

89. Egerton, J.R. Breeding sheep for resistance to footrot / J.R. Egerton, H.W.

Raadsma // CAB International. – Oxon, 1991. – P.347 – 370.

90. Egerton, J.R. Characteristics of Bacteroides nodosus isolated from cattle / J.R. Egerton, E.A. Laing // Vet. Microbiol. - 1978. - Vol. 3. - P. 269-279.

91. Egerton, J.R. Comparison of oil adjuvant and alum precipitated Bacteroides nodosus vaccines in treatment of foot-rot / J.R. Egerton, J.J. Thomson, G.C.

Merritt // Veter. Rec. – 1979. – Vol. 104. - № 5. – P. 98-100.

92. Egerton, J.R. Control and eradication of footrot at the farm level - the role of veterinarians / J.R. Egerton // New Zealand Veterinary Association. - New Zealand, 1989. - P. 215-218.

93. Egerton, J.R. Control and eradication of ovine footrot. Footrot in ruminants / J.R. Egerton // CSIRO. – Australia, 1986. – P. 35-41.

94. Egerton, J.R. Foot-rot in vaccinated and unvaccinated sheep / J.R. Egerton, I.R. Morgan, D.H. Burrell // Vet. Rec. - 1972. - Vol. 91. – P. 447-453.

95. Egerton, J.R. Management of footrot. In: Proceedings of the Seminar on Foofrot Eradication Programme in sheep and Goats in Nepal / J.R. Egerton, О.P. DhungyeL, S.C. Ghimire // Lumle-Agricultural-Centre. – 1994. - Vol.

94. - P. 13-17.

96. Egerton, J.R. Serology of foot-rot: antibodies against Fusiformis nodosus in normal, affected, vaccinated and passively immunized sheep / J.R. Egerton, G.C. Merritt // Aust. Vet. J. – 1973. – Vol. 49. – P. 139-145.

97. Egerton, J.R. Significance of Fusiformis nodosus serotypes in resistence of vaccinated sheep to experimental ovine foot-rot / J.R. Egerton // Aust. Vet.

J. – 1974. – Vol. 50. - № 2. – P. 59-62.

98. Egerton, J.R. Surface and somatic antigens of Fusiformis nodosus / J.R.

Egerton // J.Comp.Pathol. – 1973. - Vol. 83. – P. 151-159.

99. Egerton, J.R. The aetiology and pathogenesis of ovine foot-rot /1/ A histological study of the bacterial invasion / J.R. Egerton, D.S. Roberts, I.M.

Parsonson // J. Comp. Path – 1969. – Vol. 79. – P. 207-219.

100. Electron microscopic study of Bacteroides nodosus pilli and associated structures / J.L. Gradin, A.E. Sonn, D.E. Bearwood et al. // American Journal of Veterinary Research. - 1991. - Vol. 52. – P. 206–211.

101. Elleman, T.C. Pilins of Bacteroides nodosus: molecular basis of serotypic variation and relationships to other bacterial pilins / T.C. Elleman // Microbiological Reviews. – 1988. - Vol. 52. - № 2. - P. 233-247.

102. Eradication and control of virulent footrot in Western Australia:

Department of Agriculture Government of Western Australia: a farmer's http://www.agric.wa.gov.au/objtwr/imported_assets/content/aap/sl/hea/farm ers_footrot_guide_2008.pdf.

103. Every, D. Proteinase isoenzyme patterns of Bacteroides nodosus:

distinction between ovine virulent, ovine benign isolates and bovine isolates / D. Every // J.gen.microb. - 1982. - Vol.128. - P. 809-812.

104. Every, D. Purification of pili from Bacteroides nodosus and an examination of their chemical, physical and serological properties / D. Every // J. of General. Microbiol. – 1979. – Vol. 115. - № 2. – P. 309-316.

105. Firth, N. A protein family assosiated with filament biogenesis in bacteria / N. Firth, R.A. Skurray // Molecular Microbiology. - 1995. - Vol.

17. - P. 1218-1219.

106. Genetic-associated resistance to foot rot in selected Targhee sheep / M.S. Bulgin, S.D. Lincoln, С.F. Parker et al. // JAVMA. - 1988. - Vol. 192. P. 512-515.

107. Genome sequence and identification of candidate vaccine antigens from the animal pathogen Dichelobacter nodosus / G.S.A. Myers, D. Parker, K. Al-Hasani et. al. // Nature Biotechnology. – 2007. –Vol. 25. – № 5. – P.

569-575.

108. Genomics, genetics and pathogenesis of dichelobacter nodosus / J.I.

Rood, R.M. Kennan, D. Parker et al. // Department of Agriculture. – Perth, 2004. – P.26-27.

109. Ghimire, S.C. Identification and characterisation of serogroup M among Nepalese isolates of Dichelobacter nodosus, the transmitting agent of footrot in small ruminants / S.C. Ghimire, J.R. Egerton, O.P. Dhungyel // Vet. Microbiol. – 1998. – Vol. 62 – P. 217-233.

110. Ghimire, S.C. PCR-RFLP of outer membrane proteins gene of Dichelobacter nodosus: a new tool in the epidemiology of footro / S.C.

Ghimire, J.R. Egerton // Epidemiol. Infect. – 1999. – Vol. 122. - № 3. – P.

521-528.

111. Ghimire, S.С. Characterization of Dichelobacter nodosus isolated from footrot in sheep and goats in Nepal / S.С. Ghimire, J.R. Egerton, O.P.

Dhungyel // Small Ruminant Res. – 1996. – Vol. 23. - P. 59 - 67.

112. Gordon, L.M. Temporal relationships and characterisation of extracellular proteases from benign and virulent strains of Bacteroides nodosus as detected in zymogram gels / L.M. Gordon, W.K. Yong, C.A.

Woodward // Res. Vet. Sci. - 1985. – Vol. 39. - № 2. – P. 165-172.

113. Gradin, J. L. Selective medium for isolation of bacteroides nodosus / J.L. Gradin, J.A. Schmitz // J.Clin.Microbiol. – 1977. - Vol. 6. - №. 3. - P.

298-302.

114. Gradin, J.L. Serogrouping of Bacteroides nodosus isolates from sources in the United States / J.L. Gradin, A.E. Sonn, L. Petrovska // Am. J.

Vet. Res. - 1993. – Vol. 54. – P. 1069-1073.

115. Graham, B. Routine laboratory testing for footrot in Australia / B.

Graham // Proceedings of the National Workshop on Footrot. - Perth, 2003 – P. 71-72.

116. Graham, N.P.H. Pathogenesis of ovine foot-rot: the role of some environmental factors / N.P.H. Graham, J.R. Egerton // Aust.Vet.J. – 1968. – Vol. 44. - P. 235-240.

117. Green, L.E. Assessment of current knowledge of footrot in sheep with particular reference to Dichelobacter nodosus and implications for elimination or control strategies for sheep in Great Britain / L.E. Green, T.R.N. George // The Veterinary Journal. – 2007. – Vol. 175. - № 2. – P.173-180.

118. Green, R.S. A method to differentiate between virulent and benign isolates of Bacteroides nodosus based on the thermal stability of their extracellular proteinases // N.Z.Vet.J. – 1985. - Vol. 33. - P. 11-13.

119. Green, R.S. Characterisation of certain proteinase isoenzymes produced by benign and virulent strains of Bacteroides nodosus / R.S Green // J. Gen. Microbiol. - 1985. - Vol. 131. – P. 2871-2876.

120. Hart Isolation and characterisation of a novel spirochaete from severe virulent ovine foot rot / I. Demirkan, S.D. Carter, С. Winstanley et al. // J.

Med. Microbiol.. – 2001. – Vol. 50. – P. 1061 - 1068.

121. Hindmarsh, F. Serogroups of Bacteroides nodosus isolated from ovine footrot in Britain / F. Hindmarsh, J. Fraser // Vet Rec. - 1985. – Vol. 116. – P. 187-188.

122. Hine, P.M. Ovine footrot: histopathology of a synergic disease, in Models of Anaerobic Infections / P.M. Hine, M.J. Hill // Ed. Martinus Nijhoff. - The Hague, 1984. – 5 p.

123. Identification and grouping of Dichelobacter nodosus, using PCR and sequence analysis // G.H. John, R. Smith, K.J. Abraham et.al. // Molecular and Cellular Probes. – 1999. – Vol. 13. - P. 61–65.

124. Identification of three gene regions associated with virulence in Dichelobacter [Bacteroides] nodosus, the causative agent of ovine footrot / M.E. Katz, P.M. Howarth, W.K. Yong et al. // Journal of General Microbiology. – 1991. – Vol. 137. – P. 2117-2124.

125. Improved diagnosis of virulent ovine footrot using the intA gene / B.F. Cheetham, L.R. Tanjung, M. Sutherland et al. // Vet. Microbiol. 2006. Vol. 116 - P. 166–174.

126. Irevors, J. Gene transfer among bacteria in soil and aquatic environments: a review / J. Irevors, Т. Batkay, W Boutquin // Canadian Journal of Microbiology. - 1987. - Vol. 33. – P. 191-198.

127. Isolation and characterisation of Bacteroides nodosus from foot lesions of cattle in Western Australia / R.B. Richards, L.J. Depiazzi, J.R.

Edwards et al. // Austr. Vet. J. - 1980. - Vol. 56. – P. 517-521.

128. Isolation and characterization of Bacteroides nodosus fimbriae:

structural subunit and basal protein antigens / J.S. Mattik, B.J. Anderson, M.R. Mott et al. // J. Bact. – 1984. – Vol. 160. - № 2. – P. 740-747.

129. Isolation and identification of anaerobic bacteria from ovine foot rot in Spain / S. Piriz, R. Cuenca, J. Valle et al // Research in Veterinary Science. – 1990. – Vol. 9. – P. 245-247.

130. Isolation of spirochaetes from an incident of severe virulent ovine footrot / R. Naylor, P. Martin, J. Jones et al. // Vet. Rec. – 1998. - Vol. 143. P. 690-691.

131. Jessen, P. Baquiloprim/sulfadimidine in calves and young cattle. Oral treatment of enzootic pneumonia and infectious pododermatitis / P. Jessen, O. Kristiansen, F.O. Madsen // Dansk-Veterinaertidsskrift. – 1993. - Vol. 76.

- P. 796-798.

132. Johnson, J.L. Ribosomal ribonucleic acid homology among species of the genus Bacteroides / J.L. Johnson, B. Harich // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1986. - Vol. 36. - №. 1. - P. 71-79.

133. Kati, R. Resultati naih ispitavania etiopatogeneze epizootskog oboljenja papaka / R. Kati // Vet. Glasnik. – 1976. – t. 30. - № 6. – P. 507Katitch, R.V. Les problemes de l'etiologie et de imunolo-prrophylaxie dans le pietin du mouton / R.V. Katitch // Comp.immun.microb.inf.dis. t.2. - 22-59.

135. Katitch, R.V. Role des microbes anaerobies dan» la patogenic du pietin du mouton / R.V. Katitch // Rec.med.vet. - 1971. – t. 147. - № 2. – P.

179-186.

136. Kerry, J.B. Vaccination against foot-rot / J.B. Kerry // Irish. Vet. J. – 1971. - № 12. – P. 229-230.

137. Kingsley, D.F. Distribution of serogroups of Bacteroides nodosus with particular reference to New Zealand and the United Kingdom : Footrot in Ruminants / F.H. Hindmarsh, D.M. Liardet, D.H. Chetwin // CSIRO. – NSW, 1986. – P. 143-146.

138. Kortt, A.A. Detection of the еxtracellular proteases of Bacteroides nodosus in polyacrylamide gels: a rapid method of distinguishing virulent and benign ovine isolates / A.A. Kortt, J.E. Burns, D.O. Stewart // Res.vet.sci. – 1983. – Vol. 35. - P. 481-489.

139. Kmper, H. Moderhinke als Tierschutzproblem / H. Kmper, H.

Stumpf // Tagung Schaf- und Ziegenkrankheiten, Gieen. - 2000. - Vol. 7. – 140. La Fontaine, S. Detection of Dichelobacter nodosus using speciesspecific oligonucleotides as PCR primes / S.L. Fontaine, J.R. Egerton, J.I.

Rood // Vet. Microb. – 1993. – Vol. 35. – P. 101-117.

141. La Fontaine, S. Evidence that Bacteroides nodosus belongs in subgroup gamma of the class Proteobacteria, not in the genus Bacteroides:

partial sequence analysis of a B. nodosus 16S rRNA gene / S.L. Fontaine, J.I. Rood // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1990. – Vol. 40. – №. 2. - P. 101-117.

142. Lai, M.M. RNA recombination in animal and plant viruses / M.M. Lai // Microbiology Reviews. - 1992. - Vol. 56. – P. 61-79.

143. Lilley, G.G. Amino acid and DNA sequences of an extracellular basic protease of Dichelobacter nodosus show that it is a member of the subtilisin family of proteases / G.G. Lilley, D.J. Stewart, A.A. Kortt // Eur. J.

Biochem. – 1992. - Vol. 210. - P. 13-21.