[ «Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов ...»
144. Liu, D. A polymerase chain reaction assay for improved determination of virulence of Dichelobacter nodosus, the specific caСШАtive pathogen for ovine footrot / D. Liu, J. Webber // Vet. Microbiol. – 1995. - Vol. 43 - P.
197-207.
145. Liu, D. Development of gene probes of Dichelobacter nodosus for differentiating strains causing virulent, intermediate or benign ovine footrot / D. Liu // British Vet. J. – 1994. - Vol. 150. – P. 451-462.
146. Liu, D. Improved laboratory diagnosis of ovine footrot: an update / D.
Liu, W.K. Yong // The Vet. J. - 1997. - Vol. 153. – P. 99-105.
147. Marsh, H. Foot-rot and other diseases of the feet of sheep / H. Marsh // JAVMA. - 1954. - Vol. 124. - № 9. - P. 1-4.
148. Martain, L. Le pietin estai de synthese / L. Martain, A.L. Banting, M.Y. Soyeux // Dossieures L'Elevage. - 1978. – Vol. 2. - № 5. – P. 55-67.
149. Mattick, J.S. Gene sequences and comparison of the fimbrial subunits representative of Bacteroides nodosus serotypes A to I: class I and class II strains / J.S. Mattick, B.J. Anderson, P.T. Cox // Molecular Microbiology. – 1991. - Vol. 5. - № 3. - P. 561-573.
150. Mayr, A. Grundlagen der Allgemeinen Medizinischen Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre. In: Mayr, A. (Hrsg.): Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre // 7. Aufl., Enke Verlag. Stuttgart, 2002. – P. 1 - 62.
151. Microbiological study of foot-rot in lambs: isolation, elastolytic activity and antimicrobial susceptibility / S. Piriz, J. Valle, R. De La Fuente et al. // Zentralbl. Veterinrmed. – 1992. - Vol. 39. - № 3. - P. 181-186.
152. Molecular analysis of Dichelobacter nodosus isolated from footrot in sheep in Malaysia / Z. Zakaria, S. Radu, A.R. Sheikhomar et al. // Vet.
Microb. – 1998. – Vol. 62. – P. 243-250.
153. Molecular characterization of a genomic region associated with virulence in Dichelobacter nodosus // M.E. Katz, R.A. Strugnell, J.I. Rood et al. // Infection and Immunity. – 1992. – Vol. 60. – P. 4586-4592.
154. Molecular detection and characterization of Dichelobacter nodosus in ovine footrot in India / S.A. Wani, I. Samanta, M.A. Bhat et al. // Molecular and Cellular Probes. – 2004. - Vol. 18. - P. 289–291.
155. Moore, L.J. The occurrence of treponemes in contagious ovine digital dermatitis and the characterisation of associated Dichelobacier nodosus / L.J. Moore, M.J. Woodward, R. Grogono -Thomas // Vet. Microbiol. - 2005.
– Vol. 111 –P. 199–209.
156. Mraz, O.J. Nomina und Synonyma der pathogenen und saprophytren Mikroben, isoliert aus den wirtschaftlich oder epidemiologisch bedeutenden Wirbeltieren und Lebensmitteln tierischer Herkunft / O.J. Mraz, J. Tesarcik, F. Varejka // VEB Gustav Fischer Verlag. – Iena, 1963.-488 p.
157. Mullis, K. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chaine reaction / K. Mullis, F.Falona // Meth. Enzymol. - 1991. Vol.155. - P. 335-350.
158. Маринов, Е.Някои биохимични изследования на кръвни серуме при овце, болни от копитен гнилец / Е. Маринов, Е.Арнаудова // Вет.сб.
- 1982. – t. 80. - № 8. – P. 15-20.
159. Масалски, Н.М. Експериментално предиэвмкване на копытен гнилец по овцете / Н.М. Масалски // Вет.мед.науки. - 1980. – т.17. - № 8. – P. 14-18.
160. Nieuwhof, G.J. Costs of the major endemic diseases of sheep in great Britain and the potentialbenefits of reduction in disease impacts / G.J.
Nieuwhof, S.C. Bishop // Animal Science. - 2005. - Vol. 81. – P. 57-67.
161. Nucleotide and deduced protein sequence of the extracellular, serine basic protease gene (bprB) from Dichelobacter nodosus strain 305:
comparison with the basic protease gene (bprV) from virulent strain 198 / G.G. Lilley, M.C. Riffkin, D.J. Stewart et al. // Biochemistry and Molecular Biology International – 1995. - Vol. 36. - P. 101-111.
162. Nucleotide sequence of the gene encoding the two-subunit pilin of Bacteroides nodosus 265 / T.C. Elleman, P.A. Hoyne, N.M. McKern et al. // J. of Bacteriol. – 1986. - Vol. 167. - № 1. - P. 243-250.
163. Organization of the fimbrial gene region of Bacteroides nodosus: class I and class II strains / M. Hobbs, B.P. Dalrymple, P.T. Cox et all. // Molecular Microbiology. – 1991. - Vol. 5. - № 3. - P. 543-560.
164. Palmer, M.A. A gelatin test to detect activity and stability of proteases produced by Dichelobacter (Bacteroides) nodosus / M.A. Palmer // Vet.
Microbiol. - 1993. - Vol. 36. - № 1-2. - P. 113-122.
165. Parsonson, I.M. Ovine Interdigital Dermatitis / I. M. Parsonson, J.R.
Egerton, D.S. Roberts // J. Comp. Pathol. – 1967. - Vol. 77. -№ 3. - P. 309Petti, C.A. The role of 16S rRNA gene sequencing in identification of microorganisms misidentified by conventional methods / C.A. Petti, C.R.
Polage, P. Schreckenberger // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol. 44. - № 9. – P. 3469–3470.
167. Pilins from the B serogroup of Bacteroides nodosus: characterization, expression, and cross-protection / T.C. Elleman, D.J. Stewart, K.G. Finney et all. // Infection and immunity. – 1990. - Vol. 58. - № 6. - P.1545-1551.
168. Pilus ELISA and an anamnestic test for the diagnosis of virulent ovine footrot and its application in a disease control program in Nepal / О.P.
Dhungyel, R.J. Whittington, S.C. Ghimire et. al. // Vet. Microbiol. - 2001. – Vol. 79. – P. 31-45.
169. Pitman, D.R. The laboratory culture of Dichelobacter nodosus in a footrot eradication program / D.R. Pitman, M.A. Palmer, L.J. Depiazzi // Austr. Vet. J. - 1994. - Vol. 71. – P. 109-112.
170. Polymerase chain reaction amplification of the constant and variable regions of the Bacteroides nodosus fimbrial gene // G.H. John, J.O. Carlson, C.V. Kimberling et.al. // J. Of Clinical Microbiology. – 1990. – Vol. 28. - № 11. - P. 2456-2461.
171. Popoff, M.R. Causal agent of foot rot: description, pathogenicity, vaccination / M.R. Popoff // Revue-de-Medecine-Veterinaire. – 1991. – Vol.
142. - P. 453-462.
172. Protection of sheep against foot-rot with a recombinant DNA-based fimbrial vaccine / J.R. Egerton, R.T. Cox, B.J. Anderson et al. // Vet.
Microbiol. – 1987. – Vol. 14. - № 4. – P. 393-409.
173. Purification of the extracellular acidic proteases of Dichelobacter nodosus / A.A. Kortt, J.E. Burns, J.A. Vaughan et all. // Biochemistry and Molecular Biology International. - 1994. - Vol. 34. - P. 1157-1166.
174. Пейчев, Б. Ваксино профилактиката в комплексната борба с копитния гнилец по овцете / Б. Пейчев, Н. Найденова // Вет. Сбирка. – 1976. – т. 74. - № 4. – С. 13-14.
175. Resultati ispitanja prakticne primene vaccine protivu oboljenja uraca ovaca / R.V. Katitche, Z. Vukicevic, T. Petrov et al. // Vet.Glas. / 1973. – t.11. – P. 809-812.
176. Reuss, U. Neue verfahren zur bekampfung der Moderhinke beim schaf / U. Reuss // Kleineviehzuchter. – 1975. – t. 23. - № 25. – S. 888-890.
177. Roberts, D.S. Fluorescent-labelled antibody for the diagnosis of footrot / D. Roberts, P. Walker // Vet.Rec. - 1973. - Vol. 92. - № 3. – P. 70-71.
178. Saitou, N. The neigbou-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol.Biol.Evol.-1987. – Vol.4. –P.406Seifert, H.S. Qestions about gonococcal pilus phase- and antigenic variation / H.S. Seifert // Molecular microbiology. - 1996. - Vol. 212. – P.
433-440.
180. Serological classification and virulence determination of Dichelobacter nodosus isolated from Alberta and British Columbia sheep / M.E. Olson, S. Gard, D.W. Morck et al. // Can. J. Vet. Res. – 1998. - Vol.
62. - P. 33-37.
181. Severity and persistence of footrot in Merino sheep experimentally infected with a protease thermostable strain of Dichelobacter nodosus at five sites / L.J. Depiazzi, W.D. Roberts, С.D. Hawkins et al. // Aust.Vet.J. – 1998. – Vol. 76. - № 1. - P. 32-38.
182. Short, J.A. An electron microscope study of Bacteroides nodosus:
ultrastructure of organisms from primary isolated and different colony types / J.A. Short, C.M. Thorley, P.D. Walker // J. Appl. Bacterial. – 1976. – Vol.
40. – P. 311-315.
183. Skerman, T.M. Bacteroides nodosus the caСШАtive agent of contagious foot-rot in sheep / T.M. Skerman // Actual data biol. pathol.
anaer. bact. – Bucharest. – 1977. - P. 327-333.
184. Skerman, T.M. Determination of some in vitro growth requirements of Bacteroides nodosus / T.M. Skerman // J. Gen. Microbiol. - 1975. - Vol. 87.
– P. 107-119.
185. Stewart, D J. The role of elastase in the differentiation of Bacteroides nodosus infections in sheep and cattle / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. – 1979.
- Vol. 27. – P. 99-105.
186. Stewart, D.J. An electron microscopic study of Fusiformis nodosus / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. – 1973. – Vol. 14. - № 1. – P.132-134.
lipopolysaccharide of Bacteroides nodosus / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. Vol. 23. – P. 319-325.
188. Stewart, D.J. Differences between strains of Bacteroides nodosus in their effects on the severity of foot-rot,bodyweight and wool growth in Merino sheep / D.J. Stewart, B.L. Clark, R.G. Jarrett // Aust. Vet. J. - 1984.
– Vol. 61. – P. 348-352.
189. Stewart, D.J. Footrot of Sheep. In: Egerton J.R., W.K. Yong, G.G.
Riffkin (Hrsg.): Footrot and Foot abscess of ruminants / D.J. Stewart // CRC press, Boca Raton. – Florida, 1989. - P.5-45.
190. Stewart, D.J. New approaches to footrot vaccination and diagnosis utilising the proteases of Bacteroides nodosus / D.J. Stewart // Advances in Veterinary Dermatology. - Bailliere Tindall, 1990. – P. 359-369.
191. Stewart, D.J. Observations on strains of Bacteroides nodosus of intermediate virulence to sheep / D.J. Stewart // Australian Veterinary Association. – Sydney, 1982. – P. 219-222.
192. Stewart, D.J. Ovine footrot: clinical diagnosis and bacteriology. In:
Corner L.A. and Bagust T.J. (eds): Australian Standard Diagnostic Techniques for Animal Diseases / D.J. Stewart, P.D. Claxton // CSIRO for the Standing Committee on Agriculture and Resource Management. - East Melbourne, Australia, 1993. – Р. 1-27.
193. Stewart, D.J. Review of Footrot diagnosis and the role of vaccination / Stewart D.J. // Sheep prod, and prev. med. - Sydney, 1983. – P. 487-490.
194. Stewart, D.J. The role of elastase in the differentiation of Bacteroides nodosus infections in sheep and cattle / D.J. Stewart // Res. Vet. Sci. – 1979.
– Vol. 27. – P. 99-105.
195. Stewart, D.J. The role of various antigenic fractions of Bacteroides nodosus in eliciting protection against foot-rot in vaccinated sheep / D.J.
Stewart // Res. Vet. Sci. – 1978. – Vol. 24. - № 1. – P.14-19.
196. Strom, M. S.Structure-function and biogenesis of the type IV pili / M.S. Strom, U.S. Lory // Annu. Rev. Microbiol. - 1993. - Vol. 47. - P. 565The effect of footrot on body weight and wool growth of sheep / D.J.
Marshall, R.I. Walker, B.R. Cullis et al. / Austr. Vet. J. - 1991. - Vol. 68. – № 2. - P. 45-49.
198. The fine structure of Fusiformis nodosus with special refence to the location of antigens associated with immunogenisity / P.D. Walker, J. Short, R.O. Thomson et all. // J. General. Microbiol. – 1973. – Vol. 77. – P. 351The patogenicity and cultural characteristics of virulent, intermediate and benign strains of B. nodosus causing ovine footrot / D.J. Stewart, J.E.
Peterson, J.А. Vaughan et al. // Austral.vet.j. - 1986. - Vol. 63. - P. 317-326.
200. The type IV fimbrial subunit gene (fimA) of Dichelobacter nodosus is essential for virulence, protease secretion, and natural competence / R.M.
Kennan, O.P. Dhungyel, R.J. Whittington et al. // J. of Bacteriol. – 2001. Vol. 183. - № 15. - P. 4451–4458.
201. The type IV fimbtial subunit gene {fimA) of Dihelobacter nodosus is essential for virulence, protease secretion, and natural competence / R.M.
Herman, O.I. Dhungyel, R.J. Whittington et al. // Journal of Bacteriology. Vol. 183. - P. 4451-4455.
202. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories / P.C. Woo, S.K. Lau, J.L. Teng et al. // Clin. Microbiol. Infect.
– 2008. –Vol. 14. - № 10. – P. 908–934.
203. Thomas, J.H. Prioteolytic enzymes produced in liquid media by Fusiformis nodosus / J.H. Thomas // Austr. J. Agr. Res. – 1964. – Vol. 15. P. 417-426.
204. Thomas, J.H. The bacteriology and histopathology of foot-rot in sheep / J.H. Thomas // Austr. J. Agr. Res. – 1962. – Vol. 13. - № 4. – P. 725-739.
205. Thomas, J.H. The pathogenesis of footrot in sheep with reference to proteases of Fusiformis nodosus / J.H. Thomas // Austr. J. Agr. Res. – 1964.
– Vol. 15. - P. 1001-1016.
206. Thorley, C.M. A simplified method for the isolation of Bacteroides nodosus from ovine foot-rot and studies on it’s colony morphology and serology / C.M. Thorley // J. Appl. Bact. – 1976. – Vol. 40. – P. 301-309.
207. Thorley, C.M. Comparison of alum absorbed or non-alum absorbed oil emulsion vaccines, containing either pilate or non-pilate Bacteroides nodosus cells in inducing and maintaining resistance of sheep to experimental foot-rot / C.M. Thorley, J.R. Egerton // Res. Vet. Sci. – 1981. – Vol. 30. – № 1. – P. 32-37.
208. Thorley, C.M. Serotyping survey of 1296 strains of Bacteroides nodosus isolated from sheep and cattle in Great Britain and western Europe.
/ C.M. Thorley, S.E.J. Day // CSIRO Division of Animal Health and Australian Wool Corporation. – Glebe, NSW, 1986. – P. 135-142.
209. Toussaint, E.R. The specific contagious inflammation of the interdigital skin of cattle / E.R. Toussaint, J.L. Cornelisse // Vet. Med. Rev. P. 223.
210. Transfer of Kingella indologenes (Snell and Lapage 1976) to the genus Suttonella gen. nov. as Suttonella indologenes comb. nov.; transfer of Bacteroides nodosus (Beveridge 1941) to the genus Dichelobacter gen. nov.
as Dichelobacter nodosus comb. nov.; and assignment of the genera Cardiobacterium, Dichelobacter, and Suttonella to Cardiobacteriaceae fam.
nov. in the Gamma Division of Proteobacteria on the basis of 16s rRNA sequence comparisons / F.E. Dewhirst, B.J. Paster, S.L. Fontaine et al // Int.
J. Syst. Bacteriol. – 1990.- Vol. 40 - №. 4 - P. 426-433.
211. Transformation-mediated serogroup conversion of Dichelobacter nodosus / R.M. Kennan, O.P. Dhungyel, R.J. Whittington et al. // Vet.
Microbiol. – 2003. – Vol. 92. – P.169-178.
212. Treatment of foot rot in free-ranging mouflon (Ovis gmelini musimon) populations—does it make sense? / K. Volmer, W. Hecht, R.
Wei et al. // Eur. J. Wildl. Res. - 2008. - Vol. 54. – P. 657–665.
Understanding the molecular epidemiology of the footrot pathogen 213.
Dichelobacter nodosus to support control and eradication programs / P.
Buller, M. Ashley, D. Palmer et al. // J. of Clin. Microb. – 2010. - Vol. 48. Р. 877 – 882.
214. Wani, S.A. Current understanding of the aetiology and laboratory diagnosis of footrot / S.A. Wani, I. Samanta // The Veterinary Journal. Vol. 171. - P. 421–428.
215. Werff, C.D. van der. Bestrijding en therapie van rotkreupel bi j echapen in Friesland / C.D. van der Werff // Versl.Land.Onderz. - 1968. Vol. 704. – P. 90-100.
216. Whittington, R J. Epidemiological issues in the evaluation of footrot diagnostic tests / R.J. Whittington // Australian college of veterinary scientists. - Sydney, 1995.
217. Whittington, R.J. Antigens for serological diagnosis of virulent ovine footrot / R.J. Whittington, V.F. Saunders, E.K. Moses // Vet. Microbiol. Vol. 54. – P. 255-274.
218. Whittington, R.J. Application of ELISA to the serological diagnosis of virulent ovine footrot / R.J. Whittington, J.R. Egerton // Vet. Microbiol. Vol. 41. - № 1-2. – Р. 147-161.
219. Whittington, R.J. Grading the lesions of ovine footrot / R.J.
Whittington, P.J. Nicholls // Res. Vet. Sci. – 1995. - Vol. 58. - № 1. - P. 26Whittington, R.J. Humoral immune responses in ovine footrot / R.J.
Whittington // The University of Sydney. – Australia, 1994.
221. Williams, K. A simple and sensitive method for detecting bacterial elastase production / K. Williams, K.D. Phillips, A.T. Willis // Letters in Applied Microbiology. - 1988. - Vol. 7. – P. 173-176.
222. Winter, A.C. Lameness in sheep / A.C. Winter // Small Ruminant Research. - 2008. - Vol. 76. – P. 149-153.
223. Winter, A.C. Lameness in sheep 1. Diagnosis / A. Winter // In Practice. – 2004. - Vol. 26. – P. 58 - 63.
224. Younan, M. Update on footrot in south-west Germany / M. Younan, H. Both, W. Mller // Dtsch. tierrztl. Wochenschrift. – 1999. –Vol. 106. Р. 66-67.
225. Zhou H. Dichelobacter nodosus serotype M fimbrial subunit gene:
implications for serological classification / H. Zhou, J.G.H. Hickford // Vet.
Microb. – 2001. – Vol. 79. – P. 367-374.
226. Zhou, H. Extensive diversity in New Zealand Dichelobacter nodosus streins from infected sheep and goats / H. Zhou, J.G.H. Hickford // Vet.
Microb. – 2000. – Vol. 71. – P. 113-123.
227. Zhou, H. Novel fimbrial subunit genes of Dichelobacter nodosus:
recombination in vivo or in vitro? / H. Zhou, J.G.H. Hickford // Vet.
Microbiol. - 2000. - Vol. 76. - P. 163-174.
228. Zhou, H. Rapid and accurate typing of Dichelobacter nodosus using PCR amplification and reverse dot-blot hybridization / H. Zhou, J. Hickford, K. Armstrong // Vet. Microb. – 2001. – Vol. 80. – P. 149-162.
8. ПРИЛОЖЕНИЯ ПРИЛОЖЕНИЕ А.
Методические рекомендации разработали:
Алексеева С.В., ассистент кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней (ФГОУ ВПО МГАВМиБ); Забережный А.Д., доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией прикладной вирусологии и биотехнологии (ГУ НИИВ им.Д.И.Ивановского); Панасюк С.Д., доктор ветеринарных наук (НПФ «Ветконт-М»); Сидорчук А.А., доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой эпизоотологии и инфекционных болезней (ФГОУ ВПО МГАВМиБ).
Рассмотрены и одобрены научно – методическим советом ФГОУ ВПО МГАВМиБ 25 марта 20011 г. (Протокол № 2).
Рекомендации предназначены для использования в научноисследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению D.nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также ветеринарных лабораториях.
1.1. Копытная гниль - инфекционная, хроническая болезнь овец, проявляющаяся хромотой с периодами обострения и характеризующаяся поражением кожи межкопытной щели, отслоением и гнилостным распадом копытного рога подошвы, а также боковых стенок копытец одной или нескольких конечностей.
К заболеванию восприимчивы взрослые овцы всех пород и ягнята старше 3 - 4 месяцев (после отъема).
1.2. Возбудитель болезни - Dichelobacter nodosus (ранее назывался Bacteroides nodosus) представляет собой крупную прямую или слегка изогнутую по оси грамотрицательную палочку с утолщениями на одном или обоих концах по виду напоминающую гантели. Микроорганизм является строгим анаэробом, неподвижен, не образует спор и капсул. В мазках из патологического материала палочки возбудителя располагаются одиночно грамотрицательными палочками, расположенными радиально. Это явление названо «феномен Бевериджа» и является специфическим признаком при постановке бактериоскопического диагноза.
1.3. Источником инфекции являются овцы, больные копытной гнилью.
инфицированные навоз, подстилку, траву и предметы ухода.
Основным предрасполагающим фактором заражения и развития копытной гнили является повышенная влажность окружающей среды при высокой скученности животных и плюсовой температуре.
Болезнь особенно быстро распространяется среди овец при их выпасе на низменных, заболоченных пастбищах или содержании в кошарах и выгульных дворах с сырой, занавоженной подстилкой.
1.4. Диагноз на копытную гниль устанавливают комплексно, на основании эпизоотологических данных, клинических признаков и результатов лабораторных исследований (световая и люминесцентная микроскопия мазков – отпечатков пораженных тканей и биологическая проба на овцах) в соответствии с действующими Методическими указаниями по лабораторной диагностике копытной гнили овец (1985).
Лабораторную диагностику копытной гнили затрудняют отсутствие возможности проведения бактериологического исследования из-за биологических особенностей возбудителя, отсутствие лабораторных моделей для постановки биопробы и отсутствие компонентов для постановки РНИФ.
В настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является более объективным методом диагностики копытной гнили овец по сравнению с микроскопией мазков - отпечатков. Вид возбудителя - D.nodosus - можно идентифицировать с помощью амплификациии фрагмента гена 16S рРНК.
Ген рибосомальной РНК (рРНК) — один из наиболее консервативных (наименее вариабельных) генов. Поэтому анализ сходств и различий в последовательности рРНК различных бактерий позволяет судить об их систематическом положении. Ген 16S рРНК содержит около 1600 п.н.
Значительную часть гена занимают консервативные области, имеющие практически одинаковый нуклеотидный состав у различных микроорганизмов, но также имеются видоспецифичные вариабельные участки, определив нуклеотидный состав которых, можно идентифицировать микроорганизмы. Мировой опыт показывает, что именно этот достаточно консервативный ген наиболее подходит для выявления D.nodosus. Из-за наличия трех копий в геноме возбудителя его амплификация позволяет значительно увеличить чувствительность анализа по сравнению с генами, представленными одной копией. Это преимущество становится важным, а зачастую даже критичным, при проведении детекции возбудителя прямо из патологического материала (минуя культуральные исследования) из-за относительно малого количества D.nodosus в зонах патологического процесса.
амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus, содержащего 783 пары нуклеотидов с целью выявления и идентификации возбудителя копытной гнили овец.
Амплификация фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus в реакции ПЦР (полимеразная цепная реакция) позволяет достоверно определить вид возбудителя копытной гнили овец не только в культуре, но и прямо в патологическом материале без проведения бактериологического исследования.
Методика предназначена для использования в научноисследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению D.nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, ветеринарных лабораториях.
Оборудование (могут использоваться аналоги других фирм):
- амплификатор «Терцик» (ДНК-Технология, Россия);
-вакуумный насос (ОМ-1, Россия);
- комплект оборудования для молекулярно-биологических исследований (автоматические пипетки со сменными наконечниками, смеситель типа вортекс, микроцентрифуга, термостат, пробирки);
- комплект приборов для проведения электрофореза (источник питания и камера для электрофореза, трансиллюминатор);
- холодильник, поддерживающий температуру - 20° С;
Реактивы и ферменты:
- натрия хлорид (NaCl) (Химмед, Россия);
- магния хлорид раствор 25 мМ (MgCl2) (Promega, США);
- легкоплавкая агароза (Sigma, США);
- хлороформ (Химмед, Россия);
- этиловый спирт – ректификат (Реахим, Химмед, Россия);
- уксусная кислота;
- натрий ацетат, безводный (Sigma, США);
- масло минеральное (ESSO);
- ЭДТА (Ethylenediaminotetraacetic acid) (Applichem, Германия);
- 10 % SDS (Sodium dodecylsulfate) (Applichem, Германия);
- бромистый этидий (Serva, Германия);
- фенол насыщенный Tris-HCl pH-8,0 (Helicon, Россия);
- лизоцим (Biosolve, Голландия);
- Taq-полимераза (MBI Fermentas, Литва).
Растворы и буферные смеси:
- дезоксинуклеозидтрифосфаты (смесь четырёх дезоксинуклеозидтрифосфатов по 10 mM каждого, Хеликон, Россия);
- олигонуклеотиды (водный раствор с концентрацией 10 пмоль/мкл) (Синтол, Россия);
- маркер молекулярной массы от 100 до 1400 п.н. (GeneRulertm 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas, Литва).
- PBS (фосфатный буфер, рН 7,4)(Химмед, Россия);
- трис-HCl (pH 3,5 – 5,0) (Химмед, Россия);
- тритон Х-100 (Helicon, Россия);
- ТЕ (Tris – EDTA) буфер (10х) (pH 8,0) (Интерлабсервис, Россия);
- раствор с краской для нанесения образца на гель (Fermentas, Литва);
-ТАЕ (трис-ацетатный) буфер (50х) (pH 8,5) (Fermentas, Литва).
5.1. Подготовка проб патологического материала Патологическим материалом являются пораженные копытца от вынужденно убитых животных. Копытце отмыть от грязи и поместить в стерильную посуду или полиэтиленовый пакет и с соблюдением мер, предотвращающих распространение инфекции, доставить в термосе со льдом в лабораторию не позднее 24 ч после его отбора. Материал можно однократно замораживать. Отбор материала необходимо проводить от неподвергавшихся лечению или обработкам животных.
После доставки в лабораторию копытце необходимо еще раз тщательно отмыть от грязи с использованием воды (водопроводной) и щетки. Далее копытце разрезать по аксиальной линии и отобрать кусочки тканей на границе здоровых и пораженных участков. Кусочки патологического материала поместить в фарфоровую ступку, сильно измельчить, залить PBS или 0,9% NaCl в соотношении 1:1-3 и как можно тщательнее растереть до получения насыщенной суспензии. Суспензию забрать, стараясь захватить только жидкую часть без крупных частиц материала. Пробы поместить в микропробирки и добавить лизоцим в количестве 4 мг/мл, держать при 4°С часа (не менее) для лизиса бактериальных клеток. По окончании времени экспозиции пробы кратковременно (15-20 секунд) центрифугировать при 12000-13200g для осаждения частичек патологического материала.
5.2. Подготовка проб из культуры возбудителя В случае изучения штаммов возбудителя копытной гнили овец диагностическим материалом служат полужидкая тиогликолевая среда с бактериальной массой или смывы культуры клеток с плотной тиогликолевой среды, лиофильно высушенные штаммы в ампулах.
Для получения бактериальных клеток с плотной питательной среды с кровяного тиогликолевого агара колонии культуры D.nodosus смыть 2-мя мл 0,9% NaCl (или PBS) и поместить в микропробирки, центрифугировать минут при 13200g, отобрать надосадок, осадок ресуспендировать в 450 мкл 0,9% NaCl (или PBS) (при необходимости, шаги по отмыванию бактерий можно повторять).
Для взятия проб культуры из полужидкой питательной среды с её поверхности удалить слой вазелинового масла и пастеровской пипеткой набрать материал в количестве около 1 мл. Его поместить в микропробирки и для осаждения агара кратковременно (15-20 секунд) центрифугировать при 12000-13200g, после чего на дне должен образоваться студенистый осадок размером с небольшую горошину, не затрагивая его набрать 450 мкл надосадка и перенести в свежие микропробирки для дальнейшего выделения ДНК. В случае слабого накопления бактериальной массы D.nodosus в культуральной пробирке, после взятия пробы и проведения вышеописанного шага по удалению агара можно сконцентрировать возбудителя путем осаждения центрифугированием и отмыванием клеток от среды. Однако для выполнения этой задачи необходимо брать большее количество первичных проб, так чтобы в результате получать из них одну. Для этого, после выполнения шага по осаждению агара, пробы еще раз центрифугировать минут при 13200g для осаждения клеток, далее добавить 2-3 мл 0,9% NaCl центрифугировать 10 минут при 13200g (при необходимости, шаги по отмыванию бактерий повторить до получения достаточно чистого клеточного осадка). Полученный осадок ресуспендировать в PBS или 0,9% NaCl в таком количестве, чтобы после слива проб из нескольких микропробирок в одну получить конечный объем 450 мкл и провести выделение ДНК фенольно-хлороформным способом.
Диагностическим материалом могут служить лиофильно высушенные штаммы бактерий, запаянные в ампулы или флаконы. Для этого в асептично вскрытую ампулу внести 450 мкл PBS или 0,9% NaCl, растворить образец и перенести в микропробирку для продолжения выделения ДНК фенольнохлороформным способом.
5.3. Выделение ДНК фенол - хлороформным методом К 450 мкл надосадка добавить 50 мкл 10Х ТЕ - буфера. К полученной смеси добавить 50 мкл 10% SDS и 500 мкл фенол-хлороформной смеси (смешанной 1:1). Перемешать на смесителе типа «вортекс» в течение секунд до получения гомогенной смеси. Далее центрифугировать 4 минуты при 13200g. Отбирать водную фазу (она сверху), одновременно измеряя ее объем. Добавить, равный полученному, объем хлороформа. Перемешать на смесителе типа «вортекс» и центрифугировать 4 минуты при 13200g.
Отобрать водную фазу сверху. К ней добавить 0,1 её объема 3М ацетата натрия (рН 5,2) и 2,5 объема 96% этанола, перемешать на смесителе типа «вортекс» и оставить на 30 минут при -70°С (или на 1-2 часа при -20°С).
Опять перемешать и центрифугировать 10 минут при 13200g. Супернатант отбросить, осадок промыть 50-100 мкл 70% этанола, перемешать на центрифугировать 6-10 минут при 13200g, отбросить супернатант. Осадок хорошо подсушить на воздухе и растворить в 50 мкл деионизованной воды.
Выделенную ДНК использовать в качестве матрицы в ПЦР.
КОНТРОЛИ: Положительным контролем выделения служит лиофильно высушенная культура D.nodosus, штамм ПП 82/90 (НПФ «Ветконт-М»).
Выделение ДНК проводить по п. 5.2, последний абзац. Выделенную ДНК ( мкл) использовать для проведения ПЦР.
В качестве отрицательного контроля использовать деионизованную воду.
На всех этапах анализа в первую очередь проводить манипуляции с отрицательным контролем, затем с исследуемыми образцами и в последнюю очередь с положительным контролем.
Полимеразная цепная реакция проводится в полипропиленовой микропробирке объемом 1,5 мл. Реакционная смесь для проведения ПЦР в конечным объёме 25 мкл содержит: 5 мкл раствора исследуемой ДНК, 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ трис-HCl (pH 9,0), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон Х-100. Для предохранения от испарения поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл минерального масла. Пробирки помещают в амплификатор.
Для амплификации используют следующий температурно-временной режим: 950С-2 минуты, 560С-25 секунд, 720С-1 минута (1 цикл); 940С- секунд, 560С-25 секунд, 720С-50 секунд (35 циклов).
Праймеры (S.L. Fontaine, J.R. Egerton, J.I. Rood, 1993):
5.5.1. Приготовление буфера для электрофореза Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мл 50хТАЕ буфера добавить 980 мл дистиллированной воды.
Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи:
навеску 4,04 г основного триса растворить в 200 мл дистиллированной воды, добавить 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА (рН 8,0) и довести объём буфера до 1000 мл дистиллированной водой.
В термостойкой посуде приготовить необходимый объем 1% суспензии микроволновой печи до полного растворения агарозы. Расплавленную агарозу охладить до 45оС, постоянно перемешивая, добавить 3,5 - 4 мкл бромистого этидия на 100 мл раствора, залить в специальную форму с гребёнкой и дать затвердеть. Форму с образовавшимся агарозным гелем перенести в аппарат для горизонтального электрофореза, погрузить в буфер и осторожно извлечь гребёнку.
К 7 мкл амплификата добавить 3 мкл буфера для нанесения образца, перемешать пипетированием и полученные пробы внести в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки.
Электрофорез проводить при напряжении 8 вольт/см длины геля.
Краситель (например, метиловый оранжевый) должен пройти не менее половины геля. Направление движения образцов в геле от “-” к “+“!
«Трансиллюминатор». Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся красноватых полос.
Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полосы положительного контроля. Размер положительной пробы длиной около 800 н.п. (точно - н.п.). Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольных пробах (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта) (Рис. 1).
В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос.
Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново.
Рис. 1. Пример электрофореграммы в 1% агарозном геле результатов амплификации фрагмента гена 16S рРНК длиной 783 н.п. с использованием праймеров NOD F и NOD R. D.nodosus производственного штамма ПП 82/90.
Треки: 1 – положительный контроль (ДНК D.nodosus производственного штамма ПП 82/90); 2 – положительный результат пробы (ДНК D.nodosus в патматериале); 3 – отрицательный результат пробы (биологический материал здорового копытного рога); 4 – отрицательный контроль (H2О); М –ДНКмаркер.
6. Аннотация экспериментальных данных С помощью данной методики выявлена ДНК Dichelobacter nodosus в пробах патологического материала от вынужденно убитых овец (пораженные копытца) стационарно неблагополучной по копытной гнили отары Ставропольского края. Подтвержден вид возбудителя у 17 депонированных в ВИЭВе штаммов Dichelobacter nodosus, выделенных в 1970-80-е гг. на территории бывшего СССР (Семенова И.М., Бектемиров А.М., Сидорчук А.А.) и 1-го производственного штамма ПП 82/90 (НПФ «Ветконт-М»).
Работу с химическими компонентами и биологическим материалом следует проводить с соблюдением правил техники безопасности.
Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать резиновые перчатки.
Ультрафиолет вызывает ожоги слизистой оболочки глаз. При просмотре гелей пользоваться защитным экраном или очками.
Острые отравления фенолом происходят главным образом при попадании его на кожу. Работать с ним необходимо под вытяжкой и с использованием резиновых перчаток. Недопустимо нагревать емкости с фенолом и располагать рядом с открытым пламенем.
Вдыхание хлороформа подавляет действие центральной нервной системы, вызывает интоксикацию. Работать с ним необходимо в резиновых перчатках под вытяжкой.
Разработанная методика ПЦР позволяет выявлять и идентифицировать возбудителя копытной гнили овец в тканях пораженных копытец вынужденно убитых животных, в культурах с плотной питательной среды, с полужидкой питательной среды и из лиофильно высушенных штаммов.
«