«АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН ББК 53.53 УДК 616 А 59 Черешнев В. А., Родионов С. Ю., Черкасов В. А., Малютина Н. Н., Орлов О. А. Альфа-фетопротеин. Екатеринбург: УрО РАН, 2004. – 376 с. В монографии отражены современные данные о ...»

АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН

ББК 53.53

УДК 616

А 59

Черешнев В. А., Родионов С. Ю., Черкасов В. А., Малютина Н. Н., Орлов О. А.

Альфа-фетопротеин. Екатеринбург: УрО РАН, 2004. – 376 с.

В монографии отражены современные данные о строении, биологической активности, механизмах действия сывороточного белка крови альфа-фетопротеина (АФП).

АФП является тонким регулятором гомеостаза в физиологических условиях и при

развитии патологических процессов.

В книге представлены результаты экспериментальных и клинических исследований, посвященных изучению эффективности лекарственной формы АФП в терапии ряда аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваний. Освещены данные, характеризующие АФП как белок с выраженными иммуносупрессорными свойствами, реализующий свои эффекты на уровне комплексной регуляции процессов клеточной пролиферации, включения механизмов апоптоза, обеспечения клетки энергетическим и пластическим материалом и других механизмов.

Издание предназначено для широкого круга специалистов в области иммунологии, патофизиологии, терапии, хирургии, онкологии, реабилитологии, врачей других специальностей, студентов медицинских и биологических вузов, аспирантов, научных работников.

Ответственный редактор д. м. н., профессор, заслуженный деятель науки РФ Н. Н. Кеворков Рецензенты:

академик РАМН, д. м. н., профессор Р. М. Хаитов;

член-корреспондент РАМН, д. м. н., профессор А. В. Караулов Авторский коллектив выражает искреннюю благодарность сотрудникам ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ профессору И. Г. Сидоровичу и к. м. н. А. С. Ивановой за помощь в проведении исследований; сотрудникам Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН к. б. н. С. А. Замориной и к. м. н. Б. А. Бахметьеву за творческое участие как на этапе выполнения экспериментальной работы, так и в подготовке монографии к изданию.

Отдельная благодарность профессорам В. И. Масычевой и М. В. Черешневой за личный вклад в исследования и высказанные ценные критические замечания. Огромная благодарность всем специалистам, принявшим участие в работе.

Особая благодарность О. В. Коломейцу и М. П. Морозову за финансовую поддержку исследований и издания монографии.

22(04) – 104 © Авторский коллектив, 2004.

А ВП6(03) 1998 БО Черешнев В. А., Родионов С. Ю., ISBN 5-7691-1498-3 Черкасов В. А., Малютина Н. Н., Орлов О. А.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ И ФИЗИОЛОГИИ УрО РАН

ПЕРМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ МЗ РФ

ЗАО «ИНСТИТУТ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ»

В. А. ЧЕРЕШНЕВ, С. Ю. РОДИОНОВ, В. А. ЧЕРКАСОВ, Н. Н. МАЛЮТИНА, О. А. ОРЛОВ

АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН

ЕКАТЕРИНБУРГ,

ЧЕРЕШНЕВ

Валерий Александрович Доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, директор Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург), председатель УрО РАН.

Автор научного открытия, 21 изобретения, более 500 научных работ, опубликованных в российских и зарубежных научных изданиях, в том числе 16 монографий и учебника для вузов «Патофизиология».

Область научных интересов – изучение функций иммунной системы в норме и при патологических состояниях.

РОДИОНОВ

Сергей Юрьевич Доктор медицинских наук, руководитель лаборатории цитокинов и отделения клинической иммунологии Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург), директор по научной работе и производству ЗАО «Институт новых медицинских технологий» (Пермь).

Автор научного открытия, 2 запатентованных лекарственных препаратов, 16 изобретений, 89 научных работ, опубликованных в российских и зарубежных научных изданиях, в том числе монографии «Гомеостатика живых и технических систем» (М.: Наука, 1990).

Область научных интересов – разработка, производство и клиническое изучение новых иммунотропных и противоопухолевых препаратов.

4 АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН

ЧЕРКАСОВ

Владимир Аристархович Доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой госпитальной хирургии с курсом анестезиологии, реаниматологии и онкологии, ректор Пермской государственной медицинской академии МЗ РФ.

Автор 25 изобретений, более 300 научных работ, опубликованных в российских и зарубежных научных изданиях, в том числе 7 монографий.

Область научных интересов – разработка новых методов хирургического и консервативного лечения в практике хирургических болезней.

МАЛЮТИНА

Наталья Николаевна Доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой профессиональных болезней и терапии с курсом профпатологии ФУВ Пермской государственной медицинской академии МЗ РФ.

Автор 5 изобретений, более 250 научных работ, опубликованных в российских и зарубежных научных изданиях.

Область научных интересов – изучение иммунологических и гемоциркуляторных нарушений при заболеваниях внутренних органов.

Олег Алексеевич Доктор медицинских наук, главный врач Пермского областного онкологического диспансера, заведующий курсом онкологии кафедры госпитальной хирургии Пермской государственной медицинской академии МЗ РФ.

Автор 5 изобретений, более 120 научных работ, опубликованных в российских и зарубежных научных изданиях.

Область научных интересов – органосохраняющее лечение рака молочной железы, реконструктивно-пластические операции, иммунотерапия в комплексном и комбинированном лечении онкопролиферативных заболеваний.

www.profetal.ru

6 АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН

Н. В. Васильев был ученым-мыслителем, сочетавшим глубокие научные познания с незаурядной общей культурой и высокой нравственностью. Широта его эрудиции способна была вызвать удивление: в своих исследованиях он поднимался до высочайших философских обобщений, оставаясь в то же время понятным для людей, далеких от науки и философии.

Ему были свойственны те качества, какими должны обладать ученые, возглавляющие фундаментальные научные направления. Прежде всего это последовательность научного поиска и подчиненность его сквозной стержневой идее – как первое условие успеха и залог подлинного прорыва в новый горизонт знаний. Движение научного направления не ограничено жизнью одного поколения ученых, поэтому закономерно формирование и развитие научных школ. Н. В. Васильев обладал обостренной интуицией, способностью к «голографическому» мышлению, что, как дар Божий, отличает гениального ученого от просто талантливого. У Н. В. Васильева этот дар проявлялся способностью воссоздавать целостную картину изучаемого явления, основываясь на крупицах исходной информации.

Общее количество трудов, написанных Н. В. Васильевым, превысило 600, в их числе опубликована 41 монография – почти по числу лет, отданных научному творчеству. Еще четыре остались незавершенными. В его научной деятельности главной целью было развитие общефизиологического эволюционного направления в естествознании. Об этом свидетельствуют выдающиеся исследования Н. В. Васильева в области изучения иммунной системы, опубликованные в ряде монографий: «Роль нервной системы в процессах инфекции и иммунитета» (1963); «Очерки о роли кроветворной ткани в антителообразовании» (1975).

Опыт изучения эволюции иммунитета иллюстрирует множественность ее функций, и не всегда иммунные процессы выполняют защитную функцию в узком смысле слова.

Это позволило Н. В. Васильеву в 1982 году сформулировать положение о стратегиях функционирования иммунной системы. В его книге «Вопросы иммунологии опухолей» (1986) описано, что при канцерогенезе иммунодепрессия не является тотальной, а многие звенья системы иммунитета сохраняют в этих условиях достаточно большую степень свободы реагирования на антигены. Предполагается, что раковая клетка, являясь трансформированным элементом самого организма и обладая способностью к выработке эмбриональных антигенов, использует феномен антигенной мимикрии, т. е. маскируется под эмбрион, и система иммунитета функционирует в режиме, объективно выгодном не организму хозяина, а необластоме. Там же Николай Владимирович писал: «Раковую болезнь в принципе невозможно понять, оставаясь на позициях антропоцентризма. Нужно овладеть технологией переключения программы «охраны чужого в своем» на программу «отторжения чужого». А о том, что такое переключение, возможно, имеет место, свидетельствует тот факт, что по окончании физиологической беременности система иммунитета быстро переходит на обычный традиционный режим».

Многие идеи, высказанные Н. В. Васильевым, нашли практическое подтверждение в дальнейших исследованиях, результаты которых частично представлены в данной книге.

Человек продолжает жить, пока о нем помнят и живут его дела. Николай Владимирович писал: «Для человека главная память – это не мемориальный металлолом и не цветы возле могильной ограды, а продолжение начатой им работы». Будем считать его слова завещанием.

8 АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН

СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Cтруктура, синтез, биологическая роль альфа-фетопротеина в условиях физиологической нормы и при патологии, перспективы использования в клинической практике 1.1. История открытия альфа-фетопротеина

1.2. Локализация, структура и механизмы синтеза АФП

1.3. Соматический эмбриогенез как возможная основа злокачественного роста и противоречия иммунитета

1.4. Свойства АФП в условиях нормы и патологии

1.5. Идентификация, эктопический синтез АФП, диагностические аспекты в норме и патологии

1.6. Клинико-экспериментальные подходы к использованию фетальных протеинов (АФП: генная терапия, апоптоз, иммунологическая толерантность и специфическая иммунотерапия)

1.7. Клинико-патогенетические аспекты применения АФП в комплексном лечении внутренних болезней, хирургической и онкологической патологии

ГЛАВА 2. Технологические аспекты выделения, очистки и производства лекарственных форм АФП 2.1. Способы выделения и очистки АФП

2.2. Контроль препарата АФП

ГЛАВА 3. Экспериментальное изучение влияния АФП на физиологические показатели в норме и на моделях патологических реакций 3.1. Первичная токсикологическая характеристика препарата АФП

3.2. Оценка местного раздражающего действия

3.3. Изучение острой токсичности препарата АФП

3.4. Токсикологическое изучение препарата АФП при подкожном введении на обезьянах

3.5. Изучение токсичности лекарственной формы препарата АФП в хроническом эксперименте на кроликах

3.6. Влияние препарата АФП на физиологические показатели крыс

3.7. Оценка влияния компонентов препарата АФП на мышечную силу и выносливость мышей

3.8. Изучение аллергизирующего действия препарата АФП

3.9. Изучение мутагенности и потенциальной канцерогенности препарата АФП

3.10. Оценка способности препарата АФП индуцировать хромосомные аберрации в клетках костного мозга млекопитающих.................. 3.11. Оценка способности препарата АФП индуцировать ДНК-повреждающее действие в SOS-хромотесте

3.12. Исследование субстанции и лекарственной формы АФП на моделях патологических реакций

3.13. Исследование противоопухолевой активности препарата АФП в опытах in vitro

3.14. Исследование противоопухолевой активности препарата АФП in vivo

3.15. Исследование радиопротекторных свойств альфа-фетопротеина

ГЛАВА 4. Изучение эффективности препарата АФП в практике комплексного лечения внутренних болезней, хирургической и онкологической патологии 4.1. Применение препарата АФП в комплексном лечении хронических неспецифических заболеваний легких

4.2. Применение АФП в комплексной терапии заболеваний печени (хронические гепатиты и цирроз)

4.3. Применение АФП в комплексной терапии пациентов с тиреоидитом Хашимото

4.4. Применение препарата АФП в комплексном лечении неспецифического язвенного колита и гранулематозного энтерита (болезнь Крона)

4.5. Применение препарата АФП в комплексной терапии хронической ишемии сосудов нижних конечностей (ХИНК)

4.6. Применение препарата АФП у пациентов с ожоговой болезнью

4.7. Применение АФП в лечении онкологических заболеваний

Заключение

Приложение

Список литературы

ПРЕДИСЛОВИЕ

Потребность в специфически направленной регуляции защитных функций иммунной системы имеется в различных областях медицины. Однако наибольшую актуальность такой подход имеет в тех случаях, когда заболевания сопровождаются аллергическими реакциями и аутоиммунной агрессией. Актуальным является поиск биологически активных веществ и создание на их основе лекарственных препаратов, оказывающих свое воздействие как через стимуляцию, так и через подавление иммунных реакций организма. Во всем мире, и особенно в нашей стране, в последние годы появляются препараты, действие которых направлено на стимуляцию иммунной системы или замещение тех или иных ее мессенджеров и функциональных молекул. К первым относятся полиоксидоний, миелопид, ликопид, иммунофан и ряд других; ко вторым – ронколейкин и другие цитокины, препараты интерферонов и иммуноглобулинов. Номенклатура же препаратов, угнетающих функцию иммунной системы, практически не меняется, по крайней мере последние 10 лет. Это все те же глюкокортикоидные гормоны, их синтетические аналоги и циклоспорин А. При этом лечение больных, страдающих различными атопическими, иммунокомплексными и особенно аутоиммунными заболеваниями, невозможно без лекарственных средств, подавляющих избыточную реактивность иммунной системы.

По данным отечественных и зарубежных исследователей, наибольший интерес в этом отношении вызывает фетальный белок альфа-фетопротеин, который является тонким регулятором гомеостаза в физиологических условиях и при развитии патологических процессов. Альфа-фетопротеин известен как белок, который вырабатывается гепатоцитами эмбриона и выполняет в том числе защитную функцию в системе «мать – плод» в раннем эмбриогенезе, предохраняя эмбрион от развития иммунологического конфликта. Синтез этого белка прекращается после рождения ребенка и возобновляется при возникновении гепатоцеллюлярного рака клетками, потерявшими способность к дифференцировке. В работах профессоров Ю. С. Татаринова и Г. И. Абелева показано диагностическое значение определения данного белка при гепатобластоме. Последний из авторов получил за эту работу Рокфеллеровскую премию.

В представленной книге в эксперименте и клинике впервые изучена эффективность лекарственной формы альфа-фетопротеина в терапии ряда аллергических и аутоиммунных заболеваний. Показана перспективность использования альфа-фетопротеина в лечении некоторых видов опухолевой патологии. Обсуждаются механизмы противоопухолевого действия препарата альфа-фетопротеина через возможность запуска механизмов апоптоза и блокирования феномена экранирования антигенных опухолевых детерминант.

Авторами впервые сделана попытка практического использования альфа-фетопротеина в качестве лекарственного средства. Предварительные положительные результаты лечения аллергических, аутоиммунных и некоторых опухолевых заболеваний заслуживают самого пристального внимания.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А/Г – альбумин-глобулиновый коэффициент АЛТ – аланинаминотрансфераза АОК – антителообразующая клетка АСТ – аспартатаминотрансфераза АФК – активные формы кислорода АФП – альфа-фетопротеин АФЦ – ацетилфтолилцеллюлоза БА – бронхиальная астма БАВ – биологически активные вещества БСА – бычий сывороточный альбумин БЦЖ – бацилла Кальметта – Гарена ВИДС – вторичные иммунодефицитные состояния ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВФС – временная фармакопейная статья ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа ГФ – государственная фармакопея ДАМ – дактиномицин Е-РОК – клетки, образующие «розетки» с эритроцитами барана (общее число Т-лимфоцитов) ЖЕЛ – жизненная емкость легких ИРИ – иммунорегуляторный индекс ИСЛК – индекс сдвига лейкоцитов крови ИФА – иммуноферментный анализ КВВ – конденсат выдыхаемого воздуха КЛ – кардиолипин КОЕ – колониеобразующая единица КонА – конканавалин А КРФ – креатинфосфатаза КРФ НК – кислоторастворимая фракция нуклеиновых кислот ЛДГ – лактатдегидрогеназа ЛИ – лимфоцитарный индекс ЛИИ – лейкоцитарный индекс интоксикации ЛП – липопротеиды ЛПНП – липопротеиды низкой плотности ЛПОНП – липопротеиды очень низкой плотности ЛПС – липополисахарид ЛТ – лейкотриены ЛФХ – лизофосфатидилхолин МВЛ – максимальная вентиляция легких МкАТ – моноклональные антитела МКЦ – микрокристаллическая целлюлоза МОС – мгновенная объемная скорость потока на уровне выдоха мРНК – матричная РНК М-РОК – клетки, образующие «розетки» с эритроцитами (число незрелых В1-лимфоцитов) МФ – макрофаги

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НСТ-сп – спонтанный вариант теста НСТ-ст – стимулированный зимозаном вариант теста НСТ-ст / НСТ-сп – индекс стимуляции фагоцитов НСТ-тест – тест с восстановлением нитросинего тетразолия фагоцитами НФ – нейтрофилы НЯК – неспецифический язвенный колит ОАК – общий анализ крови ОАТ – общая антитрипсиновая активность ОФВ1 – объем форсированного выдоха за 1 секунду ОФЛ – общие фосфолипиды ПАФ – полный адъювант Фрейнда ПГ – простагландины (ПГЕ2 – простагландин Е2 и т. д.) ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты ППСК – полипотентная стволовая клетка (stem cell) ПСВ – пиковая скорость выдоха ПЦР – полимеразная цепная реакция Ранние Е-РОК – активные Т-лимфоциты с повышенной аффинностью CD2-рецептора РБТЛ – реакция бластной трансформации лимфоцитов РГНТ – реакция гиперчувствительности немедленного типа РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов РЭА – раково-эмбриональный антиген СКК – стволовые клетки костного мозга СКЛ – смешанная культура лимфоцитов СОД – супероксиддисмутаза СОЭ – скорость оседания эритроцитов СРБ – С-реактивный белок СФМ – сфингомиелин СХ – свободный холестерин Т3 – трийодтиронин Т4 – тироксин ТГ – триглицериды Теоф. резистентные – Т-лимфоциты, которые после инкубации с теофиллином сохраняют экспрессию СD2-рецептора Теоф. чувствительные – Т-лимфоциты, которые после инкубации с теофиллином снижают экспрессию СD2-рецептора Термостабильные – незрелые, а также активированные Т-лимфоциты с пониженной скоростью синтеза и сбрасывания CD2-молекулы и высокой ее аффинностью ТПО – тиреопероксидаза ТСК – тиосемикарбазид ТСХ – тонкослойная хроматография ТТГ – тиреотропный гормон ФГА – фитогемагглютинин ФЖЕЛ – форсированная жизненная емкость легких ФР – физиологический раствор (0,9%-ный NaCl, рН = 7,4) ФС – фармакопейная статья ФСП – фармакопейная статья предприятия ФХ – фосфатидилхолин ФЭА – фосфатидилэтаноламин ХАТ – хронический аутоиммунный тиреоидит ХГЧ – хорионический гонадотропин человека ХИНК – хроническая ишемия сосудов нижних конечностей ХНЗЛ – хронические неспецифические заболевания легких цАМФ – циклический аденозин-монофосфат цГМФ – циклический гуанозин-монофосфат ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы ЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоциты ЧДД – частота дыхательных движений ЩФ – щелочная фосфатаза ЭБ – эритроциты барана Э-ФГА – эритрофитогемагглютинация CD – claster of determination CD3 – маркер зрелых Т-лимфоцитов CD4 – маркер Т-лимфоцитов, обладающих хелперной активностью CD8 – маркер Т-лимфоцитов, обладающих супрессорной активностью CD11 – -субъединица 2-интегринов CD16 – маркер натуральных киллеров CD19 – маркер В-лимфоцитов CD21 – маркер зрелых В-лимфоцитов CD22 – маркер зрелых В-лимфоцитов CD29 – 1-цепь интегринов, представленная на лейкоцитах CD72 – маркер В-лимфоцитов CD95 – маркер апоптоза EGF – эпидермальный фактор роста G-CSF – колониестимулирующий фактор гранулоцитов GM-CSF – колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов Hb – гемоглобин HLA-DR – общий маркер моноцитов, В-лимфоцитов и активированных Т-лимфоцитов IFN-,, – интерферон-альфа, бета, гамма IgA, E, G и т. д. – иммуноглобулины класса А, Е, G и т. д.

IGF – инсулиноподобный ростовой фактор IL-1, 2, 3 и т.д. – интерлейкин 1, 2, 3 и т. д.

M-CSF – колониестимулирующий фактор макрофагов МНС – главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex) NK – натуральные киллеры sIgA – секреторная форма IgA SOS-хромотест – тест на комплементарность повреждений ДНК TGF – трансформирующий фактор роста Th – CD4-позитивные клетки, обладающие хелперной активностью TNF- – фактор некроза опухолей альфа Тк – CD8-позитивные Т-лимфоциты, обладающие киллерной активностью Ts – CD8-позитивные Т-лимфоциты, обладающие супрессорной активностью

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Успехи молекулярной биологии, генетики, иммунологии, биохимии, биофизики и других наук приводят к тому, что арсенал клинических возможностей для лечения различных, ранее считавшихся «бесперспективными» заболеваний с каждым днем возрастает.

Вместе с тем наличие «информационной интервенции» в различных биологических и медицинских дисциплинах приводит к тому, что даже специалистам все труднее быть в курсе последних достижений современной науки. Например, ускорение процесса накопления новых фактов в иммунологии приводит к тому, что один иммунолог не всегда понимает другого, даже если они работают в смежных областях [250]. Подавляющее большинство фактов различные исследователи оценивают по-разному. Это закономерно для любой быстро развивающейся науки, где различия во мнениях специалистов – одна из движущих сил научно-технического прогресса, формирующегося по законам противоречий. Новое всегда находится в меньшинстве. Общепризнанное – это уже старое.

В последнее время многочисленные исследовательские коллективы иммунологов, молекулярных биологов, а также клиницистов оказались заинтересованы в поиске, создании и практическом использовании биологических соединений природного происхождения, обладающих свойствами регуляторов иммунитета и обменных процессов организма [233]. Это и предопределило широкий поиск биологически активных веществ, оказывающих свое воздействие как через стимуляцию, так и через подавление иммунных реакций.

В связи с этим возникла потребность в создании препаратов, осуществляющих специфически направленную регуляцию иммунитета. Особенно актуально это в случаях профилактики и лечения заболеваний, протекающих с проявлением аутоиммунных и аллергических заболеваний. При этих состояниях необходимо проводить комплекс мероприятий по снижению интенсивности иммунного ответа на определенную группу аутоантигенов, стараясь по возможности не подавлять кроветворение и противоинфекционный иммунитет [235]. Подобной иммунорегулирующей активностью обладает сывороточный белок альфа-фетопротеин (АФП) [2, 3].

По своей структуре АФП является гликопротеином с молекулярной массой 69 кD, состоящим из одной полипептидной цепи, включающей около 600 аминокислот и содержащей примерно 4% углеводов. Он входит в состав генетического семейства альбуминоидов, расположенного у человека в 4-й хромосоме [2, 397, 505]. Молекула АФП содержит различные функциональные последовательности и сайты связывания [555]. Уникальной особенностью структуры АФП является наличие полипептидных мотивов, опосредующих адгезивные функции, что объединяет его с семейством протеинов экстрацеллюлярного матрикса – коллагеном, фибронектином, ламинином, витронектином, тромбоспондином и др., выполняющими ключевую роль в эмбриогенезе.

В то время как изучение структуры АФП, по-видимому, завершено [397], этого нельзя сказать об изучении биологических свойств АФП. По данным, приведенным в монографиях Н. Н. Кеворкова с соавторами [110], С. В. Ширшева [253], К. В. Шмагеля и В. А. Черешнева [257], АФП является тонким регулятором гомеостаза в физиологических условиях и при развитии патологических процессов. АФП связывает и переносит такие лиганды, как билирубин, жирные кислоты, стероиды, ретиноиды, флавоноиды, фитоэстрогены, красители, тяжелые металлы, диоксин, а также различные лекарственные препараты [104, 138, 197, 220, 554].

Эффекты АФП реализуются на уровне комплексной регуляции процессов клеточной пролиферации, включения механизмов апоптоза, обеспечения клетки энергетическим и пластическим материалом, индукции регуляторных сигналов через усиление экспрессии рецепторов и обеспечения синтеза простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов, взаимодействия со структурами экстрацеллюлярного матрикса, иммуномодулирующих эффектов [57, 58, 255–257, 352, 433, 497, 647]. АФП обладает исключительно высоким сродством к полиненасыщенным жирным кислотам и простагландинам [276, 335, 579, 702], вследствие чего участвует в регуляции синтеза ПГЕ2 [285].

Экспериментальные исследования свидетельствуют об иммуносупрессорной активности этого белка [2, 251, 255, 256, 333, 372, 554, 556, 563]. В частности, АФП подавляет синтез антител и созревание цитотоксических Т-лимфоцитов [601]; снижает пролиферативный ответ лимфоцитов на митоген [344]; повышает активность специфических Т-супрессоров [564, 688]; снижает активность натуральных киллеров [317]; угнетает фагоцитарную активность макрофагов [591] и уменьшает продукцию активированными моноцитами TNF- и IL-1 [714]. Обнаруженную способность АФП снижать реакции клеточно-опосредованного иммунного ответа in vitro уже успешно использовали для предотвращения развития аутоиммунных процессов у иммунодефицитной линии мышей New-Zeland [393]. Отмечается регулирующая роль альфа-фетопротеина в метаболизме стероидных гормонов; его способность блокировать связывание антител с ацетилхолиновым рецептором и клетками щитовидной железы, что препятствовало развитию экспериментального аутоиммунного тиреоидита и miastenia gravis [307, 537].

Приведенные данные характеризуют АФП как белок с выраженными иммуносупрессорными свойствами, которые целесообразно использовать для лечения аллергических и аутоиммунных заболеваний.

В постановлениях IV и V Всероссийских съездов онкологов было определено, что одним из перспективных научных направлений в онкологии является поиск веществ, обладающих апоптотическим действием в отношении опухолевой клетки.

Экспериментально показано, что АФП может связывать цитоплазматические белки, которые в норме доставляют ядерные факторы или транскрипционные кофакторы к поверхности органелл клеток. Этим подтверждается тесная связь АФП с клеточной пролиферацией и дифференцировкой [454]. Работая как транспортный белок, АФП способен направленно доставлять регуляторные сигналы в клетки, имеющие рецепторы к нему, усиливая информационный контроль за правильностью реализации генетической программы пролиферирующих клеток и в значительной мере влияя на уровень их функциональной активности [554].

Исследованиями Ю. Л. Волянского с соавторами (1994) [57]; E. Dudich et al. (1999, 2000) [352, 353]; Koide N. et al. (1999) [484] показано, что обработка опухолевых клеток человеческим АФП in vitro приводит к значительному торможению роста клеток с морфологическими изменениями, характерными для апоптоза. Более того, обнаружено, что предварительное введение АФП высокораковой линии мышей (карцинома молочных желез) в опытной группе более чем на 60% тормозит образование опухоли [44]. Это объясняется тем, что под влиянием АФП происходит снятие широко известного феномена иммунологического усиления (enhancing-effect) роста опухоли [196], а также активация механизмов апоптоза [104]. В то же время, являясь транспортным белком, АФП способен адресно доставлять к очагам опухолевого роста противоопухолевые химиопрепараты, искусственно с ним связанные [85, 122, 138].

Следует отметить, что АФП блокирует синтез эстрогенов [22, 101], что также позволяет использовать его в качестве средства профилактики и лечения мастопатий и злокаВВЕДЕНИЕ чественных опухолей молочных желез (гормонозависимые механизмы стимуляции пролиферативных реакций).

Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует об исключительной перспективности использования АФП для профилактики и лечения аллергических, аутоиммунных и опухолевых заболеваний. Актуальность изучения АФП на настоящем этапе развития знаний об этом белке сформулирована академиком Г. И. Абелевым: «Если исследования по изучению белковой структуры молекулы альфа-фетопротеина в целом завершены, то так или иначе в области функции АФП предстоит еще большая и не вполне предсказуемая работа. Проблема рецептора АФП представляется наиболее важной для понимания любых функций АФП, включая транспортную и иммуносупрессорную» [2].

В данной монографии приведены результаты масштабных исследований терапевтической эффективности нового препарата на основе человеческого АФП. Изначально препарат был разработан в рамках темы 82/1 ГКНТ РФ «Создание новых лекарственных средств методами химического и биологического синтеза» и разрешен к применению ГФК РФ (решение от 27.02.1997 г.) под названием «Альфетин» (приказ МЗ РФ № 129 от 15.09.1999 г.). Однако в дальнейшем, в связи с новыми положениями ВОЗ от 26.11.2001 г., касающимися вирусологической безопасности продуктов плазмы крови человека, был создан более технологически совершенный препарат АФП «Профеталь» (решение комитета МИБП МЗ РФ, протокол № 5 от 26.06.2003 г.). Исследования проведены с использованием обоих препаратов.

Структура, синтез, биологическая роль альфа-фетопротеина в условиях физиологической нормы и при патологии, перспективы использования в клинической практике

1.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА

АФП был открыт в 1944 году, на заре исследования белков, когда шведский биохимик Педерсен обнаружил в сыворотке крови телят массивную белковую фракцию, полностью отсутствующую в крови взрослых животных. Белок был назван фетуином (от лат. fetus – плод). Продолжая эти исследования, С. Бергстранд и В. Цар в 1956 и 1957 годах, сравнивая составы сыворотки крови человеческого плода и взрослых людей, нашли белковую фракцию, специфичную для эмбриональной сыворотки, и назвали ее -фетопротеином (т. е. белком плода). Предполагалось, что это человеческий аналог телячьего фетуина.

Впоследствии выяснилось, что это совершенно различные белки [2]. Поскольку АФП обнаруживался только у эмбриона, можно было думать, что он синтезируется в плаценте, которая после родов упраздняется вместе со специфическими белками, ею синтезируемыми [2, 3, 4].

В середине 50-х годов Грабар, Буртен и Зелинман из Института Пастера в Париже и группа ученых под руководством Г. И. Абелева из лаборатории Л. А. Зильбера в Москве активно разрабатывали методологические подходы сравнительного анализа нормальных и опухолевых тканей с использованием иммунохимических методов [269]. В результате этих исследований был обнаружен специфический антиген, присутствовавший в гепатоме и отсутствовавший в нормальной печени человека и взрослых мышей [270]. В ходе другого исследования этот антиген был обнаружен в мышином эмбрионе, где присутствовал не только в печени, но и во всех органах плода. Стало понятно, что данное вещество является основным компонентом эмбриональной сыворотки – эмбриональным сывороточным глобулином.

Было показано, что тканевые культуры мышиной гепатомы синтезируют и секретируют в среду этот белок, позже названный альфа-фетопротеином. АФП, продуцируемый плодом и мышиными гепатомами в тканевой культуре, был идентичен. Тогда же было обнаружено, что продукция АФП временно возобновляется после частичной гепатэктомии [269].

На этом основании было высказано предположение о том, что синтез данного белка связан с активной пролиферацией клеток печени любого генеза и вряд ли сможет быть использован в качестве специфического маркера злокачественных новообразований этого органа.

1.2. ЛОКАЛИЗАЦИЯ, СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМЫ СИНТЕЗА АФП

В начале 70-х годов было предложено несколько методов эффективной очистки АФП:

А. И. Гусевым с соавторами [78], а также S. Nishi в Японии [574], E. Alpert et al. в США [279], E. Ruoslahti et al. в Финляндии [620]. Это привело к быстрому прогрессу в изучении структуры АФП, его физико-химических свойств, состава и гетерогенности.

АФП – гликопротеин с молекулярной массой 69–70 kD, состоящий из одной полипептидной цепи, включающей 600 аминокислот и содержащей около 4% углеводов. По структуре и физико-химическим свойствам АФП близок к основному белку сыворотки крови взрослых особей – сывороточному альбумину; до 38% молекулы АФП идентично молекуле сывороточного альбумина [397].

АФП входит в состав генетического семейства альбуминоидов, расположенного у человека в 4-й хромосоме. Известны 4 продукта этого семейства: альбумин, АФП, витамин D-связывающий протеин и афамин (-альбумин). Общность их белковой структуры характеризуется наличием 3 доменов, образованных петлеобразными кластерами, стабилизированными дисульфидными связями через остатки цистеина [257].

Молекула АФП содержит различные функциональные последовательности и сайты связывания:

• актинсвязывающий сайт (II домен);

• апоптозиндуцирующие последовательности (I, III домены);

• билирубинсвязывающий сайт (II домен);

• эстрогенсвязывающий сайт (II домен);

• сегмент, подобный EGF (I домен);

• сайты, связывающие свободные жирные кислоты (I, II, III домены);

• пептид, ингибирующий рост (III домен);

• сегмент, подобный антигенам гистосовместимости II класса (III домен);

• инсулиноподобный сегмент (I домен);

• кинезиноподобные сегменты (I, II, III домены);

• ламининоподобные сегменты (II домен);

• сегмент, подобный казеину молока (II домен);

• плазминогенактивирующий сайт (III домен);

• сайт связывания с АФП-рецептором (III домен).

Уникальной особенностью структуры АФП является наличие полипептидных мотивов, опосредующих адгезивные функции. Это свойство объединяет АФП с семейством протеинов экстрацеллюлярного матрикса – коллагеном, фибронектином, ламинином, витронектином, тромбоспондином и др., выполняющими ключевую роль в эмбриогенезе [257].

АФП является физиологическим продуктом желточного мешка, печени и желудочно-кишечного тракта плода. С помощью моноклональных антител (МкАТ) на молекуле АФП идентифицируется от 3 до 8 различных эпитопов, причем только 2 из них являются видоспецифическими, остальные имеют перекрест с аналогами АФП одного или нескольких видов животных (мыши, крысы, телята, свиньи, собаки, кошки). АФП представляет собой гликозилированный белок, причем гликозидная часть имеет непостоянную структуру и состав. При определенных физиологических и патологических состояниях антигенная и гликозидная гетерогенность АФП начинает проявляться особенно ярко. Так, сывороточный АФП при хроническом гепатите содержит 4–6% фракции АФП с моносиаловым остатком, а АФП из крови больных гепатоцеллюлярной карциномой – до 30%.

Очевидно, особенности метаболизма разных по происхождению клеток обусловливают различное представление ими структурных эпитопов АФП. По присутствию фракций АФП с определенными антигенными или биохимическими характеристиками можно четко выделить ряд онкологических заболеваний [2, 3, 499].

K. Taketa et al. [675] из Университета Окаямы (Япония) в 1993 г. методом перекрестной эритрофитогемагглютинации (Э-ФГА) изучили качественный состав человеческого АФП, выделенного из крови пуповины. При анализе его углеводных структур методом перекрестного электрофореза с Э-ФГА, объединенного с продленным электрофорезом на геле агарозы или с электрофорезом сродства с конканавалином и лектином, было выявлено от 2 до 6 изоформ АФП.

G. J. Mizejewski в 2001 г. [555] в исследовании «Структура и функция альфа-фетопротеина: соотношение изоформ, эпитопов и конформационных вариантов» классифицирует АФП как структуру белкового суперсемейства, состоящего из белка АФП, витамина D и -альбумина. О молекулярных вариантах АФП много сообщалось в биомедицинской литературе. Предшествующие исследования идентифицировали изоэлекСТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ трические pH-изоформы и лектин-аггрегирующие варианты АФП, которые отличались по физико-химическим свойствам, но не по аминокислотному составу. Генетические варианты АФП, отличающиеся по длине мРНК, позже были экстенсивно описаны у грызунов при развитии плодных/перинатальных стадий онтогенеза, онкогенеза и регенерации органов.

С появлением МкАТ в 1980 г. были обнаружены и охарактеризованы множественные антигенные детерминанты в нативном АФП. Установлено, что белки, являющиеся производными АФП, ингибировали некоторые аутоиммунные реакции.

Как только аминокислотный состав молекулы АФП человека и грызунов стал известен, появилась возможность идентификации ферментативных фрагментов, что позволило начать синтез и исследования ее синтетических пептидных сегментов. Открытие и описание пространственной конфигурации самой молекулы АФП в 1981 г. и ее переходных форм позволило начать изучение физиологической функции белка в свете его потенциальной биологической роли.

В лаборатории иммунохимии Института онкогенеза ОНЦ РАМН под руководством Г. И. Абелева была изучена структура эпитопов человеческого АФП с использованием более чем 50 различных МкАТ, полученных из разных лабораторий мира. Иммуноаффинной электрохроматографией на мембранах из нитроцеллюлозы были проанализированы комплексы АФП с антителами, где установлены пять типов взаимодействий: 1) завершенная нейтрализация; 2) частичная нейтрализация; 3) однонаправленная нейтрализация;

4) увеличенное закрепление; 5) несостоятельность взаимодействия. Выявлены 23 различных эпитопа в молекуле АФП. На основе полученных результатов характеристика каждого эпитопа АФП была представлена восемью участками в виде блоков (узлов), местоположение которых рассматривалось относительно конформационного состояния молекулы АФП [726].

Y. Fujii et al. в 1993 г. [384] при помощи продленного электрофореза на геле агарозы проанализировали АФП, полученный из крови пуповины и от пациентов с гепатитом, циррозом, гепатоцеллюлярным раком, желудочно-кишечными опухолями и опухолью желточного мешка. Было зарегистрировано несколько вариантов изучаемого белка по структуре полисахаридных цепей.

При сравнительном изучении полисахаридных цепей человеческого АФП, выделенного из амниотической жидкости или пуповинной крови, и серологического АФП, N. Kawahara et al. [469] пришли к заключению об идентичности структур белка, полученного из разных источников. Исследованию структуры полисахаридных последовательностей АФП посвящена работа L. M. Wright et al. [723]. K. Taketa et al. [674] сообщают о том, что химическая реактогенность различных изоформ АФП зависит от количества остатков галактозы.

О различии изоформ человеческого АФП, выделенного из пуповинной крови и сыворотки больных различными неонкологическими заболеваниями печени, а также при гепатоцеллюлярном раке сообщают независимые исследователи [461, 550, 566, 645, 673]. Все изученные изоформы АФП отличались полисахаридными последовательностями [730].

При биохимическом сравнении бычьего сывороточного и человеческого АФП, выделенного из пуповинной крови, установлено, что молекулярная масса бычьего АФП составляет 81 kD, человеческого – 69 kD. Были обнаружены, по крайней мере, 7 изоформ бычьего и 3 изоформы человеческого АФП. Они имели 50–98%-ную гомологичность структуры [427].

Однако при изучении химической структуры сахарных цепей человеческого АФП, полученного от пациентов, страдающих гепатоцеллюлярным раком и раком желчного пузыря, полисахаридные последовательности в обоих случаях совпали, что может свидетельствовать о способности АФП образовывать одинаковые углеводные связи в случае одной органной локализации злокачественного процесса [282]. Углеводная структура гликопротеидов, в частности АФП, является, как полагают, тканеспецифичной. Однако в доступной литературе до последнего времени не было никаких отчетов относительно различий углеводных структур альфа-фетопротеина, произведенного гистологически идентичными опухолями в различных тканях. Электрофорез АФП гепатоидных аденокарцином и опухолей желточного мешка из различных органов выявил гетерогенность их полисахаридных цепочек [729]. Влияние полисахаридного лиганда на структурные свойства и конформационную стабильность человеческого АФП и его гомолог, человеческий сывороточный альбумин, было продемонстрировано В. Н. Юверским с соавторами [267]. Показано, что денатурация АФП, вызванная повышением температуры или гипертоническим раствором, необратима. Установлено, что это связано с отделением лиганда от молекулы АФП. Форма АФП без полисахаридной основы не имеет твердой третичной структуры, но показывает реальную вторичную структуру и высокую уплотненность. Это означает, что твердая третичная структура АФП косвенно управляется лигандами, в то время как их отделение приводит к образованию очень устойчивого («литого, подобного сфере») промежуточного звена. Напротив, процессы денатурации альбумина полностью реверсивны. Отделение лигандов от альбумина заканчивается только уменьшением в стабильности, но не переходом в устойчивое сферическое состояние. Аналогичные результаты были получены H. Ishikawa et al. [448, 449] и H. Mazume et al. в 1999 г. [539] при изучении механизма денатурации альбумина и АФП.

В норме АФП может обнаруживаться в сыворотке плода начиная с 4-й недели беременности. Его концентрация достигает пика между 12-й и 16-й неделями и затем постепенно снижается вплоть до рождения. В возрасте 1 года нормальный уровень АФП в сыворотке такой же, как у взрослых, т. е. менее 15 нг/мл [212]. У взрослых людей АФП был обнаружен при исследовании нормальной печеночной ткани методом иммуноблоттинга [641], а также в фолликулярной жидкости [458]. Так как АФП проникает через плаценту, он может обнаруживаться в довольно высокой концентрации в сыворотке крови матери, достигая максимума между 32-й и 36-й неделями беременности. Это служит важным показателем при мониторинге антенатального периода.

При изучении уровней и мест локализации АФП в крови и различных органах у плода человека 14–33-недельного срока развития и новорожденных установлено, что АФП присутствует во всех органах и тканях первых, а также в сыворотке крови новорожденных детей. С увеличением сроков беременности и у детей в раннем послеродовом периоде уровень АФП падает [383].

Исследование количественного содержания АФП в амниотической жидкости и в сыворотке крови у женщин с нормально протекающей 16–18-недельной беременностью выявило резкое снижение уровня амниотического АФП в зависимости от увеличения срока беременности, что свидетельствует об отсутствии диффузии этого белка через плодную оболочку в поздние сроки развития плода [437].

Регуляция синтеза АФП – наиболее интересное и многообещающее направление в исследовании онтогенеза и причин возобновления синтеза АФП в опухолях [2]. В этой связи были высказаны три гипотезы.

СТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

Первая – синтез АФП связан с определенной стадией клеточного цикла гепатоцита, например с поздней G1- или S-фазой. Таким образом, пролиферация нормальных или злокачественно перерожденных гепатоцитов должна сопровождаться синтезом АФП.

Вторая – АФП является эмбриоспецифическим антигеном гепатоцитов, и его синтез полностью или почти полностью подавляется в зрелых клетках. Регенерация печени ведет к временной, тогда как злокачественные новообразования – к постоянной «дедифференцировке» гепатоцитов до АФП-синтезирующей стадии [700, 701]. В связи с этим следует отметить, что регенерация печени у человека сопровождается гораздо более низкими уровнями АФП, чем у мышей, в то время как человеческие гепатоцеллюлярные карциномы носят более злокачественный характер и среди них АФП-положительные встречаются в 2–3 раза чаще, чем среди более доброкачественных опухолей печени у мышей. Это довольно редкий случай, при котором клиническая ситуация более благоприятна для исследователя, чем ситуация в экспериментальной модели.

Также была предложена гипотеза, что АФП продуцируется дифференцированными клетками, возникшими из эмбриональных клеток-предшественников и функционирующими лишь в эмбриогенезе. Стволовые клетки опухолей, согласно этой гипотезе, сохраняют, по крайней мере частично, способность дифференцироваться в эмбриоспецифические, где их последующие взаимодействия, очевидно, ответственны за подавление синтеза АФП во взрослой печени [399]. Из этой гипотезы следует, что полная диссоциация печени на единичные клетки должна привести к реэкспрессии синтеза АФП во всех гепатоцитах.

Действительно, первичные культуры гепатоцитов взрослых крыс обнаруживали четкую, хотя и слабовыраженную индукцию реэкспрессии АФП [509]. Гораздо более сильная индукция наблюдалась в культурах гепатоцитов мышей, полученных B. de Nechaud et al.

[348]. А. С. Глейберман [64] подтвердил и расширил эти данные. После перфузии печени раствором коллагеназы и эксплантации в культуру гепатоциты, начиная со второго дня, возобновляли активный синтез АФП: подавляющее большинство гепатоцитов обнаруживало АФП-положительное иммунопероксидазное окрашивание.

Рост клеточной популяции гепатоцитов в присутствии сульфата декстрана приводил к сильному и избирательному подавлению синтеза АФП [65]. Этот эффект был четко ассоциирован с возрастающей клеточной плотностью культур и формированием структур, подобных печеночным балкам.

A. S. Gleiberman et al. в 1989 г. [400, 401] при помощи ротации чашек Петри с суспензией клеток получили культуры с плотным монослоем клеток в центре и с редкими клетками по периферии. Исследователями был обнаружен «градиент» синтеза АФП: от АФП-положительных клеток на периферии до АФП-отрицательных в плотном слое клеток в центре чашек.

Стало очевидно, что клеточные контакты подавляли синтез АФП. За этот эффект могли отвечать различные факторы: формирование щелевых контактов между клетками, контакт мембранных рецепторов с внеклеточным матриксом или форма индивидуальных клеток. Оказалось, что все три компонента вовлечены в этот процесс. Так, установлена обратная связь между формированием щелевых контактов и синтезом АФП во время образования монослоя гепатоцитов. Та же закономерность проявлялась в одной и той же чашке – в плотной центральной части монослоя по сравнению с единичными клетками на периферии. Более того, когда клетки мышиной печени выращивались в трехмерном коллагеновом геле, они сохраняли характерную для них кубоидальную форму и нормальные размеры, формировали островковую и балочную структуры, объединенные щелевыми контактами. Кроме того, они образовывали типичные желчАЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН ные капилляры, экспрессирующие соответствующие маркерные антигены, и совсем не продуцировали АФП [401].

Следующий шаг в анализе регуляции АФП был направлен уже на биологию клетки, где прежде всего необходимо было установить, какие события ведут ко включению или выключению гена АФП. Один из главных механизмов регуляции тканеспецифических генов, в числе которых находится и ген АФП, основан на межклеточных взаимодействиях.

В лаборатории Г. И. Абелева при изучении затухания синтеза АФП в первые недели после рождения мышей обнаружено, что оно сопровождает строительство печеночных балок – характерных гистологических структур печени взрослых особей. Разрушение балок при отравлении печени (например, четыреххлористым углеродом) вело к реэкспрессии синтеза АФП в клетках именно тех участков печени, где балка была разрушена. Отсюда ясно следовало, что угасание синтеза АФП в зрелых гепатоцитах обратимо и контролируется клеточными взаимодействиями в печеночной балке (рис. 1.2.3).

Если главное в контроле работы гена АФП – межклеточные или клеточно-матриксные взаимодействия, то диссоциация взрослой печени на отдельные гепатоциты должна привести к возобновлению работы этого гена, что и происходит в действительности. Перфузия печени раствором протеолитического фермента, разрушающего межклеточный белковый матрикс, и помещение гепатоцитов в питательную среду вне организма привели к возобновлению синтеза АФП почти во всех клетках (рис. 1.2.2а). А заключение их в простой по составу, но обязательно трехмерный внеклеточный матрикс или совместное культивирование с клетками, строящими такой матрикс вокруг клеток печени, восстанавливало клеточные структуры, типичные для взрослой печени, в которых к тому же полностью подавлялся синтез АФП (рис. 1.2.2б). Таким образом, клеточно-матриксные отношения вели к подавлению активности гена АФП, которое происходило наряду с восстановлением формы клеток и специфических межклеточных контактов между соседними клетками печени.

Ген АФП, нормально выраженный в плодной печени, трансгенно отключен во взрослой ткани, однако может быть активизирован вирусом герпеса [528]. При изучении поврежденной (GalN) печени крысы установлено, что восстановление гепатоцитов и непаренхиматозных эпителиоцитов происходит в результате экспрессии мРНК АФП в интервале 2–5 суток, когда интенсивно происходит пролиферация регенерирующих (эмбрионализированных) гепатоцитов, сопровождающаяся активным синтезом АФП. После дифференцировки гепатоцитов синтез АФП прекращается. Эти результаты указывают, что после GalN-повреждения печень отвечает активацией клеток-предшественников, которые распространяются и затем дифференцируются в зрелые гепатоциты [345]. Эти исследования сходны с результатами изучения регенерации печени крыс при А-витаминной недостаточности, когда после резекции участка печени регистрируется резкое повышение уровня мРНК АФП [439].

N. L. Lazarevich [505] в своей работе «Молекулярные механизмы экспрессии гена альфа-фетопротеина» подробно рассматривает ситуации синтеза АФП в постнатальном развитии организма, которые возникают при опухолевом процессе в печени и герминомных тератобластомах, в меньшей степени после химических и механических повреждений печени, сопровождаемых регенерацией (в частности, при остром вирусном гепатите). На различных моделях показано, что экспрессия регулируется главным образом на уровне транскрипции гена АФП. Известно, что в регулирующей области этого гена имеется тканеспецифический промотор, три независимых энхансера, ядерный фактор гепатоцита (HNFs) и специфический супрессор, которые определяют функциональный статус гена АФП. Однако механизмы, отвечающие за изменение уровня синтеза АФП в ходе онтогеСТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ неза и онкогенеза, остаются не вполне определенными. Исследованиями отдела лекарств медицинской школы Университета Нагасаки установлено, что обработка клеток гепатомы человека in vitro бутиратом натрия ведет к переключению гена-продуцента альбумина на синтез АФП, причем переход на синтез АФП тормозит образование РНК в клетках гепатомы [697].

Таким образом, регуляция синтеза АФП осуществляется на генетическом уровне. Регуляторный район гена АФП занимает протяженный участок в 7 тысяч пар нуклеотидов (7 кВ), и его структура отражает специфику регуляции гена, то есть его экспрессию только в определенных тканях. Тканеспецифическая экспрессия гена АФП определяется наличием трех энхансеров – коротких участков ДНК, расположенных в отдалении от промотора, участка гена, с которого начинается его транскрипция (рис. 1.2.1). Взаимодействие энхансеров со специфическими ядерными факторами (трансфакторами) в сотни раз увеличивает интенсивность транскрипции и тем самым определяет тканевую специфичность экспрессии этого гена. Установлено, что экспрессия гена АФП регулируется на тканевом уровне и может быть ограничена производными энтодермальных клеток (контактное ингибирование). Исследование на собранных матрицах ДНК in vitro показало, что составляющие хроматина определяют экспрессию/репрессию гепатоцитами гена АФП.

Реэкспрессия гена АФП в клетках печени осуществляется при участии ядерного фактора 3 [339]. Известно также, что репрессия гена АФП в печени после рождения осуществляется при участии так называемого регулятора альфа-фетопротеина 1 (Afr1) [603]. Специфические для экспрессии АФП трансфакторы имеются только в печени и желточном мешке – в органах, где АФП синтезируется. Эффективное выключение гена АФП определяется другим участком ДНК – сайленсером, расположенным в начальном районе промотора. Взаимодействие соответствующего негативного трансфактора с сайленсером ведет к полному и немедленному прекращению транскрипции гена АФП.

Благодаря проведенным исследованиям структура гена АФП у крыс, мышей и человека, а также регуляторные районы этих генов известны. В эмбриогенезе и канцерогенезе не происходит каких-либо реорганизаций этого гена, а регуляция его экспрессии имеет место на транскрипционном уровне. На фланкирующем участке выше гена АФП обнаружены три регуляторных сайта. Два из них ведут себя как типичные энхансеры, и для их работы требуется присутствие ядерных тканеспецифических факторов. Третий, находящийся в районе промотора, нуждается в репрессоре – специфическом факторе, который выключает транскрипцию гена АФП в зрелом гепатоците. Интересно, что в этом районе также присутствуют последовательности, чувствительные к ингибирующему действию глюкокортикоидного рецептора. Исследованиями отдела биохимии и генетики Техасского медицинского университета установлено, что в условиях in vitro и in vivo в клетках плодной печени мышей дексаметазон тормозит синтез мРНК АФП-пула [610, 611]. В то же время обработка клеток HepG2 гидрокортизоном in vitro приводила к увеличенной экспрессии рецепторов глюкокортикоида и повышала продукцию АФП [524].

Достаточно изучен механизм экспрессии/депрессии гена АФП в ДНК клеток плодной печени крыс in vitro [299, 598, 638]. В частности, показано, что дискретная активация регуляторного домена происходит при непосредственном участии глюкокортикоидных гормонов, что лишний раз подчеркивает взаимосвязь метаболизма АФП и стероидов [412].

Рис. 1.2.1. Схема регуляторного района гена АФП и расположения соседних генов:

СА, АФП, aАлб – гены сывороточного альбумина, АФП и -альбумина; EI–EIII – энхансеры I, II, III; S – район сайленсера; Р – район промотора. Цифры – расстояние от начала гена АФП в тысячах пар оснований; 5', 3' – начало и конец соответствующих генов.

Рис. 1.2.2. Реэкспрессия АФП в зрелых гепатоцитах и ее подавление в органоспецифических островках:

а – культура зрелых гепатоцитов мыши вне организма. Коричневая окраска: АФП, выявленный иммуноэнзиматическим методом; б – органотипический островок гепатоцитов в смешанной культуре с клетками, образующими матрикс. Окраска как в (а), АФП отсутствует (препарат Е. И. Кудрявцевой) Рис. 1.2.3. Два состояния зрелого гепатоцита *АФП(+/–) – экспрессия/подавление гена АФП

СТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

При изучении образцов нормальной печеночной ткани и биоптатов гепатоцеллюлярной карциномы учеными из отдела патологии Нью-Йоркского медицинского университета установлено участие белка р53 в синтезе АФП гепатоцитами и клетками гепатоцеллюлярной карциномы. Белок р53 является репрессором синтеза АФП [355, 508, 584, 607].

Ядерные белки, связанные с энхансерами и сайленсерами, изучаются весьма интенсивно, и уже идентифицирован один такой белок. Предполагается, что для этой цели могли бы быть полезны варианты гепатомы Morris 7777 [265]. Это клональные варианты, селекционированные in vitro, различающиеся лишь способностью продуцировать АФП. Синтез других белков, специфичных для печени, в них не меняется. Более того, различия между клонами объясняются изменениями в регуляции, но не в структуре АФП-гена. И наконец, эти различия связаны с эпигенетическими механизмами, а не с мутацией. Таким образом, использование клонов в трансфекционном тесте и в качестве источника для идентификации регуляторных белков является, по-видимому, многообещающим.

Наибольшую трудность в этой области составляет разработка системы in vitro для оценки стадиеспецифического фактора, участвующего в регуляции АФП-гена. Культура гепатоцитов с контролируемой продукцией АФП, связанной с межклеточными взаимодействиями, представляется наиболее простой и вполне адекватной моделью для изучения онтогенетической регуляции гена АФП in vitro. Описанная система позволяет идентифицировать трансфакторы в сочетании с регуляторными элементами АФП-гена, а также факторы, определяющие специфическую картину хроматиновой структуры в этом районе.

Введение в гепатоцит гена АФП (трансгенные животные), содержащего соответствующие энхансеры, но лишенного сайленсера, приводит к неугасающей тканеспецифической работе гена как в период эмбрионального развития, так и во взрослом организме. Отсюда ясно, что в печени специфические для экспрессии гена АФП трансфакторы присутствуют с самого возникновения этого органа и сохраняются в зрелых, полностью дифференцированных клетках. В то же время негативный фактор появляется только на более поздних стадиях развития, обычно после рождения.

Положительные трансфакторы гепатоцита, активирующие энхансеры, образуют семейство, многие члены которого идентифицированы и в большей или меньшей степени изучены. Негативные же трансфакторы изучены значительно меньше, неясны ни их природа, ни механизм действия.

«Энхансерно-сайленсерная» регуляция гена, по-видимому, универсальный механизм тканеспецифической экспрессии генов, т. е. избирательной активации набора генов, характерного для той или иной ткани. Известно, что в основе этого механизма лежат другие, не менее загадочные процессы, такие как определение синтеза тканеспецифического набора трансфакторов и доступность тканеспецифических энхансеров и промоторов, плотно упакованных в хромосоме, соответствующим трансфакторам. Ясно, что при закладке определенной ткани гены, определяющие ее физиологию, обнажаются, становятся доступными трансфакторам и ферменту, синтезирующему мРНК по матрице ДНК [2].

При изучении смешанной культуры клеток печени обнаружено, что гепатоциты крыс с эпителиальными клетками печени негепатоцитарного происхождения сохраняют свое дифференцированное состояние и функции. В это время гепатоциты активно продуцировали АФП и в них отсутствовал антиген желчных капилляров. В дальнейшем, однако, гепатоциты собирались в островки, становились кубоидальными, формировали желчные протоки и «устанавливали» щелевые контакты. Следует подчеркнуть, что островки гепатоцитов были всегда окружены внеклеточным матриксом и как бы погружались в него. В таких островках синтез АФП полностью подавлялся. Таким образом, здесь наблюдалась та же ситуация: гепатоциты, объединенные в структуры, подобные балкам печени, прекращают продукцию АФП [400].

Другое важное наблюдение сделано T. Kitagawa [480] и T. Onoe [594]. Они установили, что существует четкая корреляция между продукцией АФП в острой фазе канцерогенеза у крыс и пролиферацией так называемых овальных клеток, которая «вспыхивает» в печени на ранней стадии действия канцерогена. Овальные клетки считаются предшественниками гепатоцитов. S. Sell [644] показал с помощью иммунофлуоресценции наличие АФП в овальных клетках. Таким образом, установлено, что синтез АФП в «предраковой» печени имеет место в определенных «переходных» клетках и что АФП может рассматриваться как стадиеспецифический антиген в процессе созревания гепатоцита. С тех пор внесено сравнительно мало нового в понимание природы этих клеток. Остаются неясными как их происхождение, так и жизненный цикл. Вполне возможно, что они возникают из клеток канальцев Геринга и трансформируются в незрелые гепатоциты.

Весьма многообещающим является обнаружение аналогичных овальных клеток в регенерирующей печени мышей. Эти клетки несходны с гепатоцитами, холангиоцитами и клетками протоков Геринга. Они синтезируют сывороточный альбумин, но у них отсутствуют мембранные маркеры, характерные для зрелых гепатоцитов. Они неидентичны гепатоцитам фетальной печени, но активно продуцируют АФП. Их происхождение в регенерирующей печени мышей, а также дальнейшая трансформация в зрелые клетки не изучены, так как нет возможности наблюдать за этими процессами в нормальной печени.

Неизвестно также, является ли синтез АФП в этих клетках конститутивным или индуцибельным. В будущем очень важно будет установить, имеются ли злокачественные аналоги овальных клеток в опухолях печени.

G. I. Abelev и T. L. Eraiser [271] в аналитическом обзоре обсуждают вопросы клеточной основы синтеза АФП при нормальном развитии, при регенерации печени, гепатокарциногенезе и в опухолях. Высказано предположение, что продукция АФП зародышевыми клетками и опухолями печени является следствием их происхождения от единых типов клеток в нормальных условиях. Наличие продукции АФП опухолью зародышевого желточного мешка объясняется тем, что висцеральная энтодерма является первым местом клеточного синтеза АФП в эмбрионе. Следующее место продукции АФП – эмбриональный гепатобласт, а, как известно, гепатобластомы – максимальные производители АФП среди различных видов раковых опухолей. Причина возобновления синтеза АФП в гепатоцеллюлярных раках еще недостаточно понятна. Эта проблема обсуждена авторами в свете возможной роли овальных клеток в гепатоцеллюлярном раке, в происхождении и понятии двух состояний зрелого гепатоцита, связанных и не связанных с продукцией АФП. Ключевая роль в обзоре отводится внеклеточной матрице, участвующей в контроле состояния гепатоцита и экспрессии гена АФП. В частности, в эксперименте установлено влияние фибронектина на процесс дифференцировки гепатобласта в зрелый гепатоцит с депрессией гена АФП и экспрессией гена альбумина [418].

Роль овальных клеток печени в реализации процессов пролиферации и экспрессии синтеза АФП обсуждается в экспериментальных исследованиях S. Matsusaka et al. [536];

T. Sakamoto et al. [626]; C. J. Vessey et al. [707]; B. I. Yoo et al. [736]. Однако следует подчеркнуть, что овальные клетки не являются единственными клетками, ответственными

СТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

за синтез АФП в печени. Более того, при регенерации печени они составляют меньшинство АФП-продуцирующих клеток.

Главным источником АФП в регенерирующей печени мышей, по-видимому, являются зрелые гепатоциты. Этот неожиданный результат был получен в иммуногисто- и иммуноцитохимических исследованиях. Тщательное изучение особенностей АФП-синтезирующих гепатоцитов показало, что они являются типичными зрелыми клетками печени, которые начинают синтезировать АФП еще до вступления клетки в S-фазу. Весьма интересным оказалось наблюдение, что пролиферация клеток печени не является обязательным условием индукции синтеза АФП в этих клетках, вместе с тем пролиферирующие гепатоциты могли не продуцировать АФП (рис. 1.2.3). Эти исследования показали, что практически каждый зрелый гепатоцит способен возобновлять экспрессию АФП при наличии достаточных стимулов, например в случае, если регенерация печени индуцирована смешанным воздействием: гепатэктомией и отравлением четыреххлористым углеродом [2].

Если рассмотреть вопрос синтеза АФП как часть общей проблемы биологии раковой клетки, то на первый план выступает основной принцип, который заключается в том, что опухоли сохраняют направление и уровень дифференцировки той клетки, из которой они возникли. Опухоли в большей или меньшей мере тканеспецифичны – эта их особенность не стирается сотнями и тысячами генераций, проходимых ими in vivo или in vitro.

Это обнаруживается зачастую в самых неожиданных формах: применение некоторых универсальных индукторов дифференцировки выявляет в самых безликих клеточных линиях, прошедших тысячи генераций, отлично сохранившуюся способность выходить в дифференцировку – например, у одной такой линии – в сторону образования непосредственных предшественников эритроцитов, у другой – дифференцировку в МФ, а у перевиваемой опухоли яичка (эмбрионального рака) – способность дифференцироваться в 14 различных тканей, так же как у полипотентных эмбриональных клеток [2]. Такая возможность следует и из опытов B. Mintz и K. Illmensee (1975), где в экспериментах клетки злокачественной тератокарциномы, полученные от мышиных эмбрионов, при пересадке им другого генотипа (оба генотипа фенотипически отличались по окрасу шерсти) теряли злокачественные свойства и превращались в нормальные клетки: после рождения у этих мышей появлялась мозаичная черно-белая окраска, опухоли не развивались [549]. Так было доказано, что в организме эмбриона можно дифференцировать опухолевую клетку в нормальную.

В эмбриональных опухолях яичка или яичников АФП – наиболее характерный маркер, встречающийся в крови в подавляющем большинстве (> 80%) случаев. Эти опухоли, как уже говорилось выше, сохраняют способность дифференцироваться в полноценные тканевые структуры, в том числе и в клетки желточного мешка, синтезирующие АФП при нормальном развитии. Таким образом, синтез АФП в этих опухолях имеет вполне логичное объяснение, четко подтвержденное экспериментально. В случае опухолей печени, развивающихся в самые первые годы жизни у детей, ситуация еще более простая, чем при эмбриональных опухолях. Детские опухоли (гепатобластомы) развиваются из клеток эмбриональной печени, являющихся самыми мощными продуцентами АФП в нормальном эмбрионе.

Высокодифференцированные гепатомы – очень плохие продуценты АФП как по частоте его выявления, так и по уровню синтеза этого белка. И это закономерно, так как зрелые гепатоциты АФП не образуют вовсе. Наиболее характерен АФП при умереннодифференцированных опухолях печени, обычно встречающихся у человека. Эти опухоли состоят из клеток, напоминающих клетки взрослой печени, не вырабатывающие в нормальных условиях АФП. Почему же они синтезируют его в опухоли? Второй труднообъяснимый факт – громадный разброс в уровнях АФП у отдельных больных, достигающий 100-тысячекратных различий, и это при одном и том же уровне дифференцировки опухолей. При этом всегда имеются клетки, продуцирующие и не продуцирующие АФП в одной и той же опухоли, возникшей из одной клетки-предшественницы. Образование АФП в опухолях печени «взрослого» типа не имеет пока точно установленной причины, но мы склонны объяснить этот факт исходя из данных по обратимости подавления синтеза АФП в зрелых гепатоцитах.

В опухолях, как известно, нарушаются межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия. Клетки как бы изолируются от печеночной балки, что ведет к снижению уровня их дифференцировки, включая и возобновление синтеза АФП. Таким образом, можно предположить, что в основе реэкспрессии гена АФП в гепатомах «взрослого» типа лежит сдвиг равновесия в системе. Причинами его могут быть утрата опухолевой клеткой рецепторов к внеклеточному матриксу, дефектный матрикс и рост опухоли в условиях клеточного стресса, снижающего или полностью подавляющего синтез АФП. Каждая из этих возможных причин имеет экспериментальные обоснования или, вернее, аргументы в пользу ее реального существования. Так, трехмерный матрикс, организующий гепатоциты в культуре, не влияет на поведение клеток гепатомы. Очевидно, что либо они лишены рецепторов к матриксу, либо дефектна цепь, ведущая от рецептора к реагирующим внутриклеточным системам. Нарушение образования матрикса клетками, контактирующими с гепатоцитами, можно воспроизвести в культуре гепатоцитов и получить высокий синтез АФП.

И наконец, клеточный стресс. Известно, что при клеточном стрессе, вызванном тепловым шоком, действием тяжелых металлов, снижением рН-среды, гипоксией или недостатком глюкозы, клетки отвечают снижением или прекращением синтеза «нормальных белков» и индукцией белков клеточного стресса. Один из таких белков оказался антагонистом по отношению к синтезу АФП в гепатоме. Синтез обоих белков в одной клетке не встречался ни в естественных, ни в экспериментальных условиях. Пока неясно, насколько общим является этот феномен, но ясно, что он может находиться среди тех факторов, которые влияют на уровень продукции АФП гепатомами.

Таким образом, при рассмотрении различных ситуаций, связанных с возобновлением синтеза АФП опухолями, можно утверждать, что во всех случаях и даже в частных особенностях такого возобновления проявляется один и тот же принцип: опухоли сохраняют и проявляют черты дифференцировки и дифференцировочные потенции, свойственные их нормальным предшественникам. И эта особенность – одна из проблем их природы, еще до конца не понятых.

Итак, клетки опухоли не утрачивают полностью способности к дифференцировке в те клетки (и не только), из которых они произошли. Почему это происходит – далеко не простой и не вполне ясный вопрос. Очевидно, что такое сохранение необходимо для поддержания свойств, характерных для опухоли. Тогда вполне естественно, что тканеспецифические гены, к которым относится и ген АФП, в опухоли продолжают находиться в активном состоянии. Этот вопрос будет детально рассмотрен с общебиологических позиций в следующем разделе.

СТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

КАК ВОЗМОЖНАЯ ОСНОВА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО РОСТА

И ПРОТИВОРЕЧИЯ ИММУНИТЕТА

Существующие концепции злокачественного роста, при всем их многообразии (физико-химическая, вирусно-генетическая, дисонтогенетическая, полиэтиологическая [99]), объясняют, как правило, лишь отдельные стороны проблемы онкогенеза, не охватывая всех ее многочисленных граней. В частности, отсутствуют пока ответы на три ключевых вопроса, от решения которых зависит, возможно, дальнейшее развитие проблемы, а именно: 1) функции, пути активации и программы функционирования онкогенов;

2) причина отмены контактного ингибирования; 3) роль нарушений иммунологического надзора в патогенезе злокачественного роста. Все они тесно связаны друг с другом, а второй и третий, скорее всего, представляют собой две плоскости одного явления.

В числе свойств необластомы, обусловливающих ее высокую приспособляемость, следует, прежде всего, назвать интенсивную митотическую активность клеток и их способность ускользать из-под иммунологического контроля даже в случае наличия у опухолевой ткани резкого антигенного контраста (аллогенные перевивные системы).

С учетом общего положения, согласно которому патологические явления представляют собой гипертрофированные проявления физиологических процессов, перспективен поиск физиологических аналогов, напоминающих по тем или иным параметрам злокачественный рост. Таких феноменов известно два. Это регенерация и эмбриогенез, на сходство которых с онкогенезом обращалось внимание неоднократно, начиная со времен Вирхова и Конгейма. Регенерация, в свою очередь, тесно связана с воспалением, взаимосвязь же хронического воспалительного процесса с канцерогенезом клиницистам известна давно. Формируется, таким образом, четырехкомпонентная система, составные части которой явно взаимосвязаны, хотя дешифровка этих связей является делом будущего. Ниже излагаются соображения, свидетельствующие о наличии общих черт у эмбриогенеза, канцерогенеза и репаративной регенерации, и предпринимается попытка обоснования подходов к пониманию механизмов развития злокачественного роста как общебиологического явления.

В основе каждой болезни, как правило, лежит повреждение структуры [15, 16]. Термин «структура» используется здесь расширенно, объединяя устройство живой материи от молекулярного до организменного уровней. Принятое в литературе деление повреждений на обратимые и необратимые, специфические и неспецифические хотя и не лишено условности, однако достаточно четко отражает ситуацию, поэтому проявление повреждения на любом уровне прямо или косвенно связано с особенностями повреждающего этиологического фактора [37, 51].

Вне зависимости от того, каким фактором вызвано повреждение и на каком уровне оно реализуется, всегда и везде оно связано исходно с нарушением макромолекулярных структур, входящих в состав клетки, межклеточного вещества. Это относится к белкам, нуклеиновым кислотам и, вероятно, к высокомолекулярным полисахаридам. В первую очередь речь идет о нарушении упорядоченности пептидной структуры белка, дестабилизации и раскручивании пептидных цепей, изменении их пространственной конфигурации [15, 35], а также о деградации ядерной ДНК. Последнее наиболее характерно для воздействия мутагенных факторов, таких как канцерогенные вещества, ионизирующая радиация, онковирусы. Важная роль в указанных явлениях принадлежит активации и синтезу новых нуклеаз [60].

Повреждения любых субклеточных структур немедленно вызывают реактивные изменения состояния клетки, направленные на замещение и восстановление дефекта. Определяющим звеном этих процессов является усиление анаболизма ДНК, РНК и протеинов, представляющее собой биохимическую основу запуска процессов регенерации [15, 35, 59]. Указанные явления входят как органическая составная часть в понятие реактивности, так как последняя включает в себя не только способность организма воспринимать то или иное раздражение, но и готовность отвечать на него комплексной реакцией. Такая трактовка реактивности, смещая акцент на защитно-приспособительную ее суть, позволяет утверждать, что характер и итог компенсаторно-защитных реакций организма зависит в конечном счете от исходного состояния биосистемы [66]. Реактивность биосистемы оказывается органически сомкнутой с понятием резистентности, находящейся в большинстве случаев в обратном соотношении со степенью сложности организации индивидуума и его положением в эволюционном ряду. Стратегия адаптации низших организмов ориентирована преимущественно на приспособление к жизни во вредной среде, а не на борьбу с создавшимися условиями [66]. Напротив, у высших организмов в процессе эволюции формируется система приспособлений для защиты от изменений условий внешней среды. Становление этой системы тесно связано с эволюцией реактивности организма [15, 16], а следовательно, и с эволюцией регенерации [168].

Регенерация представляет собой, в широком смысле слова, восстановление структурных элементов и отражает принцип ауторегуляции жизненных процессов [79]. Она всегда локальна, т. е. связана с местом повреждения [225], и включает в себя восстановление структуры и функций на всех уровнях организации биосистемы. Преобладание той или иной формы регенерации (например, клеточной или внутриклеточной) в различных органах и тканях определяется их структурно-функциональной специализацией. В конечном счете способностью к регенерации обладают все органы и ткани.

Филогенез регенерации происходит поэтапно, и каждому этапу присущи свои специфические черты. Общий регенерационный потенциал организма, судя по всему, в филогенезе уменьшается [15, 35, 77, 223, 225], хотя в литературе высказано и противоположное мнение [105, 136]. То же, и в еще более отчетливой форме, имеет место и в онтогенезе [223, 224, 229].

Регенерация представляет собой частный случай процесса развития. Это обстоятельство сближает ее с эмбриогенезом. Наиболее отчетливо это сходство прослеживается на относительно ранних этапах эволюции – до уровня земноводных включительно, у которых в ходе регенерации утраченных структур наблюдается закладка новых органов и их дифференцировка [80, 81]. Полноценный регенерационный процесс непременно подразумевает наличие двух фаз: пролиферации и дифференцировки. Если период фазы пролиферации характеризуется размножением клеток-предшественников, то сущность фазы дифференцировки состоит в их структурно-функциональной специализации. Следовательно, регенерация есть ответ на повреждение, состоящий в полном либо частичном восстановлении утраченных структур и функций, представляющий собой механизм вторичного развития, входящего в общий адаптационный синдром [105].

Сходство процессов эмбрионального развития и регенерации очевидно. При эмбриональном развитии и при регенерации образуются одни и те же органы [177]. Это имеет место, например, у губок, кишечнополостных, планарий, а также амфибий (регенерация конечности и хвоста).

СТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

Сложнее обстоит дело с сопоставлением регенерации, эмбрионального и постнатального развития паренхиматозных органов у высших организмов, однако и здесь отчетливо прослеживаются параллели, хотя в этом случае регенерация повторяет не столько эмбриональное, сколько постнатальное развитие [204]. Таким образом, хотя знака равенства между эмбриогенезом и регенерацией ставить нельзя (главное отличие регенерации от эмбриогенеза состоит в повторном протекании процессов), явления эти имеют много общего, в особенности если принять во внимание такой биологический феномен, как соматический эмбриогенез. Последний отличается от обычной регенерации тем, что в этом случае имеет место образование целого организма из его фрагмента, сопровождающееся нередко существенной перестройкой организации с закладкой новых осей симметрии и полярности, в то время как регенерация представляет собой восстановление, протекающее с сохранением прежней организации. Регенерация и соматический эмбриогенез – явления близкие, но не идентичные [136, 204, 225]. Обстоятельство это исключительно важно, как мы увидим, для понимания проблемы онкогенеза. Характерно, что в онтогенезе способность к соматическому эмбриогенезу и регенерации меняется прямо противоположным образом: если первая возрастает, то вторая, как уже говорилось, резко уменьшается. Так, у D. Tigrina Girard, размножающейся бесполым путем, при вырезании фрагмента тела происходит не регенерация, а соматический эмбриогенез, который выражен тем лучше, чем старше животное. У Dendraenoculum Lacteum, напротив, наблюдается не соматический эмбриогенез, а регенерация, и с возрастом она падает [249].

И эмбриогенез, и регенерация представляют собой сложноорганизованные, строго регулируемые процессы. Регуляция их осуществляется, во-первых, генетическими механизмами, на основе принципа репрессии/дерепрессии; во-вторых, системами межклеточных, межтканевых и межорганных корреляций, осуществляемых путем обмена биохимическими и, возможно, биофизическими сигналами; в-третьих, путем нейроэндокринной и иммунной регуляции [13, 15, 35, 168]. Ни о какой автономии эмбриогенеза и регенерации не может, следовательно, быть и речи. В полной мере это относится и к соматическому эмбриогенезу, протекающему в физиологических условиях.

Итак, регенерация и эмбриогенез имеют общие корни. Соматический эмбриогенез представляет собой промежуточное звено, сближающее оба эти явления. Основой их служат сменяющие друг друга процессы пролиферации и дифференцировки, контролируемые рядом механизмов слежения. Нарушение этого контроля не только изменяет естественный ход регенерации и морфогенеза, но и способно вывести клетку в режим «пролиферативного взрыва». Следствием этого может быть ускорение соматического мутагенеза и в конечном счете развитие злокачественной опухоли.

Мнение о том, что злокачественный рост представляет собой патологический вариант эмбриогенеза, высказывалось неоднократно [705, 724]. Исторически оно восходит к теории «зародышевых зачатков» Конгейма. В 70-е годы был создан большой задел в этом направлении. Концепция активно развивалась в работах Б. П. Токина [225], Л. Б. Меклера [148], А. С. Шевелева [250], В. Б. Винницкого [51]. Л. Б. Меклер в 1977 г. прямо пишет о том, что «злокачественная опухоль представляет собой патологический, диссеминированный, встроенный в ткани плод, возникший в результате слияния ядер соматических клеток на основе партеногенеза» [148]. Представляется необходимым рассмотреть вопрос о наличии сходства и различия между процессами регенерации и эмбриогенеза с одной стороны и онкогенезом – с другой.

Сходство регенерации, эмбриогенеза и онкогенеза состоит прежде всего в том, что в основе трех названных состояний лежит интенсивный пролиферативный процесс. Итог же пролиферации оказывается совершенно различным: в первых двух случаях имеет место отмена ее дифференцировкой, при онкогенезе – неограниченное ее продолжение. Все три процесса имеют, таким образом, единый исток, но прямо противоположный финал.

И для онкогенеза, и для регенерации свойственна дедифференцировка (эмбрионализация) клеток. Будучи документирована увеличением ядра и ядрышка, образованием свободных рибосом, уменьшением числа митохондрий [123], она является непременной предпосылкой регенерации, обеспечивая выход клеток из-под коррелятивного «замка»

[136]. Например, регенерация немертин, в ходе которой клетки утрачивают свою характерную структуру и преобразуются в клетки, сходные с эмбриональными [148]. Ряд морфологических и функциональных особенностей сближает анаплазированные, опухолевые и эмбриональные клетки. Им присущ атипизм ультраструктур (увеличение количества рибосом, изменение формы, величины и расположения митохондрий, увеличение количества лизосом, появление многочисленных и тесных контактов ядра, митохондрий и эндоплазматической сети). Морфологические признаки, присущие опухолевой клетке (атипичные митозы, гиперхромия ядер и т. д.), наблюдаются также при регенерации тканей, воспалении, что затрудняет дифференциальный диагноз [7, 15]. В отличие от дедифференцировки при злокачественном росте, дедифференцировка при регенерации обратима.

Сближает с эмбриональной тканью злокачественную опухоль и ряд биохимических особенностей. В опухолевой ткани, как и в эмбриональной, гликолитические процессы преобладают над окислительными, что приводит к накоплению молочной кислоты [7, 15, 250]. Изоэнзимный спектр ряда ферментов (пируваткиназы, лактатдегидрогеназы, глутаминазы, ДНК-полимеразы и др.) опухолевых и эмбриональных клеток сходен [291, 313, 374]. В злокачественных опухолях синтезируются эмбриональные белки, появляющиеся также при беременности и на фоне регенерации [6, 13, 375, 404]; здесь же синтезируется и ряд других биологически активных веществ, вырабатываемых в тканях эмбриона [456].

Наконец, сходство опухолевой и эмбриональной ткани состоит в их иммунологической неотторгаемости. Механизмы, обеспечивающие эти эффекты, имеют много общего [13, 250, 705]. Есть основания полагать, что они имеют отношение к обеспечению контроля за процессом регенерации [13, 15]. В пользу неформального сходства канцерогенеза и эмбриогенеза свидетельствует также эктопическая продукция некоторыми злокачественными опухолями гормонов беременности [6, 646] и наличие у эмбриональных антигенов иммунодепрессивных свойств [583, 606].

Для более наглядного отображения самых общих черт в сходстве эмбриогенеза, онкогенеза, репаративной регенерации приведена таблица 1.3.1.

СТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

Взаимосвязь этапов эмбриогенеза, канцерогенеза и репаративной регенерации Оплодотворение. Появле- Действие канцерогенного Действие повреждающего ние зародышевой клетки, фактора. Трансформация фактора. Размножение неотличающейся от материн- клеток, их размножение, по- зрелых клеток, появление ского организма по составу явление опухолевых транс- эмбриональных антигеI трансплантационных и эм- плантационных и эмбрио- нов. Нарушение генного бриональных антигенов. нальных антигенов. Нару- гомеостаза взрослого оргаНарушение генного гоме- шение генного гомеостаза низма Образование «критичес- Образование «критичес- Образование «критической» массы зародышевых кой» массы опухолевых кой» массы регенерируюклеток. Развитие иммуно- клеток. Развитие имму- щих клеток. Развитие имлогической толерантности нологической толерантно- мунологической толерантк зародышевым клеткам, сти к злокачественным ности к регенерирующим которая обусловливается клеткам, которая обусло- клеткам, которая обусловблокирующими фактора- вливается появлением фи- ливается появлением фими сыворотки крови, тро- бриноидного слоя на этих бриноидного слоя на этих II фобласта и плода, экспрес- клетках, блокирующими клетках, блокирующими сией эндогенных вирусов факторами сыворотки кро- факторами незрелых клетипа С, гормонально-ме- ви, блокирующими факто- ток, экспрессией эндогентаболическими сдвигами рами опухоли, экспрессией ных вирусов типа С, антиэндогенных вирусов типа телами к клеткам частично Роды. Изгнание плода и Прогрессирующее разви- Восстановление целостноплаценты из организма тие опухоли. Гибель орга- сти ткани, дифференциматери. Сенсибилизация низма ровка клеток, исчезновение гормонально-метаболическими сдвигами, способствующими сенсибилизации; деблокирующими факторами сыворотки крови Из всего сказанного можно сделать вывод о том, что физиологическими прототипами злокачественного роста являются эмбриогенез и репаративная регенерация, располагающие потенциально всеми механизмами, необходимыми для выхода в необластомогенез.

В основе опухолевого развития лежит хроническое раздражение и повреждение клетки различными средовыми факторами. Детали этого процесса не выяснены, однако в качестве одного из возможных вариантов может быть предложена представленная ниже гипотетическая схема.

В результате хронически наносимого повреждения наступает истощение регенеративной способности клетки, а иногда и полное ее угнетение. В районе повреждения начиАЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН нают действовать специфические и неспецифические механизмы стимуляции регенерации. В частности, появляются вещества, стимулирующие клеточное деление. Их количество значительно увеличивается по отношению к веществам, ингибирующим клеточное деление. В том числе речь может идти о цАМФ и цГМФ. В случае невосстановления размножения, а именно так бывает при глубоком угнетении у клетки способности к регенерации, положительное изменение «индекса регенерации» достигает определенного пикового значения, что и ведет в конечном счете к переходу протоонкогена в онкоген. Последний включает репрессированную до этого в геноме программу соматического эмбриогенеза. Дальнейший ход событий определяется далеко идущим сходством эмбриональной и опухолевой ткани, общностью метаболизма и антигенного состава.

В частности, экспрессия эмбриональных антигенов обеспечивает, по-видимому, опухолевой клетке возможность «ускользать» из-под иммунного надзора по законам «антигенной мимикрии». Одновременно происходит переключение системы иммунитета с программы «отторжения чужого» на программу «охраны чужого в своем», состоящее в частичном ингибировании киллинга с одновременным сохранением и даже активацией трофической функции системы иммунитета.

Выше уже шла речь о снижении репаративной способности и, наоборот, о повышении способности к соматическому эмбриогенезу по мере увеличения возраста животных.

В результате повышения роли соматического эмбриогенеза по отношению к регенерации, наступающей к середине жизни организма, создаются условия, способствующие возникновению злокачественных новообразований. Согласно этой концепции опухоль рассматривается как популяция клеток, образующихся из онкогерминативной клетки путем соматического эмбриогенеза [169]. При этом «озлокачествление» клетки сопровождается ее эмбрионализацией с экспрессией фетальных белков.

Известно, что возникновение в организме клона малигнизированных клеток неизменно сопровождается включением гомеостатических механизмов защитно-регуляторного характера [76, 160, 213]. Однако особенность злокачественного опухолевого процесса состоит в том, что, однажды начавшись, он продолжает свое неудержимое развитие бесконтрольно, автономно. Этим отличается рост опухоли от развития тканей при регенерации, воспалении, гипертрофии, когда созревание и дифференцировка клеток координируются с состоянием и функцией окружающих тканей и всего организма [74, 108, 146, 176, 209]. Причины этого явления кроются как в свойствах самой злокачественной клетки, так и в парадоксальных особенностях взаимодействия опухоли с иммунной системой организма.

Многочисленными исследованиями показано, что по антигенному профилю опухолевые клетки значительно отличаются от клеток нормальной ткани [44, 73, 76, 100].

Однако весь накопленный до настоящего времени экспериментальный материал свидетельствует о том, что специфические антигены опухолевых клеток не представляют собой какого-либо нового класса маркеров, а появляются вследствие дедифференцировки опухоли и возврата ее к эмбриональному фенотипу [52, 266, 482]. Гипотеза о «фетализме» опухолевых клеток была высказана Конгеймом свыше 100 лет назад. Более того, было показано, что сходные механизмы индукции клеточной пролиферации обусловливают антигенное сходство гликопротеинов опухолевых и бактериальных клеток [24, 97].

Следует подчеркнуть, что, несмотря на огромный фактический материал о генетических нарушениях, ассоциированных с неоплазиями [551], проблема возникающего

СТРУКТУРА, СИНТЕЗ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

вследствие этого антигенного своеобразия опухолевой клетки и антигенной характеристики опухолей еще очень далека от своего решения. Но уже сейчас можно утверждать, что использование антигенного сходства опухолевых и эмбриональных тканей может оказаться весьма плодотворным для поиска путей иммунологического воздействия на злокачественные клетки.

Взаимодействие опухоли с иммунной системой сопровождается реакцией с обеих сторон. Это показали многочисленные динамические исследования иммунного статуса онкологических больных [134, 144]. Отмечена зависимость состояния некоторых показателей клеточного звена иммунитета от распространенности процесса [58, 227]. Иммунный статус больных зависит как от типа опухоли, стадии процесса, так и от индивидуальных особенностей организма [45, 72, 134]. Однако применяемые в клиниках методы иммунологического анализа позволяют зафиксировать лишь общие изменения в иммунном статусе, что мало характеризует специфический процесс, а скорее зависит от типа лечения. Такое состояние дел не удовлетворяет и заставляет вести разработку чувствительных тестов для оценки реактивности организма на антигены, в том числе и онкофетальные, растущей в нем опухоли [45, 72]. Эта задача приобретает особое значение в свете результатов многочисленных исследований последних десятилетий, показавших, что развивающаяся в организме опухоль обладает целым спектром возможностей активного воздействия на все звенья иммунитета [133].

Основными клетками, способными осуществлять неспецифическую защиту, являются макрофаги и натуральные киллеры. Они способны быстро уничтожать клетки, несущие признаки чужеродности, причем этот процесс не зависит от антигенов MHC и не требует предварительной иммунизации. В различных экспериментальных системах показана барьерная роль этих клеток на начальных этапах злокачественного процесса. Рассмотрение проблемы противоопухолевой защиты в эволюционном аспекте подтверждает, что фагоцитирующие клетки способны противостоять опухолевому росту у наиболее древних в филогенетическом аспекте форм живого, не имеющих иммунных лимфоцитов [106].

При введении агентов, стимулирующих МФ и NK: БЦЖ, мурамилпептида, INF и т. д.

– значительно удлиняется латентный период возникновения экспериментальных опухолей [36]. Введение животным антимакрофагальной сыворотки усиливает рост и метастазирование опухолей [604]. У мышей с врожденной аплазией тимуса (nude) спонтанные опухоли развиваются не чаще, чем у нормальных мышей [145].

Арсенал противоопухолевых реакций NK разнообразен. Они узнают на поверхности опухолевой клетки определенные гликопротеиды, связываются с ними и образуют литический комплекс, посредством которого в клетку-мишень вводятся протеазы и другие цитотоксические факторы [258, 463]. Этот процесс активируется интерфероном, IL-2 и другими цитокинами [683]. МФ способны фагоцитировать опухолевые клетки, оказывать антителозависимое и антителонезависимое цитотоксическое действие, продуцировать активные формы кислорода и фактор некроза опухолей (TNF-) [36, 273, 382].

Однако при длительном контакте (более 48 ч) с клетками опухоли роль МФ может меняться [36]. Известно, что опухолевые клетки выделяют широкий спектр биологически активных веществ, изменяющих иммунологическую реактивность организма [160]. Под действием факторов опухолевых клеток МФ теряют цитотоксические и иммуностимулирующие свойства и превращаются в сателлитные клетки, роль которых сводится к продукции ростовых факторов для опухоли [213]; синтезу ПГЕ2, подавляющего противоопуАЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИН холевые иммунные реакции лимфоцитов [161]; синтезу протеаз (трипсина, эластазы, коллагеназы и др.), которые разрушают матрикс опухоли и слущивают с поверхности опухолевых клеток фибронектин. Это приводит к нарушению контактного торможения роста клеток и усилению метастазирования [146].

Таким образом, на основании анализа литературных данных можно сделать вывод о двойственной роли факторов неспецифической резистентности – от активной противоопухолевой защиты на ранних стадиях формирования злокачественного заболевания до прометастатических и иммуносупрессирующих функций в очаге прогрессирующей опухоли.

Роль гуморального и клеточного звеньев иммунитета в развитии онкопатологии различается. Изучение гуморального противоопухолевого иммунитета показало, что наличие в сыворотке крови больного антител к опухолеассоциированным антигенам далеко не всегда приводит к стимуляции механизмов антителозависимого лизиса опухолевых клеток. При определенных условиях антитела могут способствовать росту опухоли, связывая и экранируя ее антигенные детерминанты [636].

Доказано, что главную роль в элиминации из организма малигнизированных клеток играют клеточно-опосредованные реакции [76]. При этом специфический цитолиз злокачественных клеток осуществляют цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), несущие на своей поверхности рецепторы к опухолевому антигену [160]. В организме больного эти клетки присутствуют практически при всех онкозаболеваниях, о чем свидетельствует положительная реакция ГЗТ на опухолеассоциированные антигены и онкофетальные белки [44, 147, 704].