«Организация и проведение учебного процесса по подготовке специалистов в области биобезопасности и лабораторной диагностики возбудителей некоторых опасных инфекционных болезней (учебно-методическое пособие для ...»

Посев на среду Симонса и ацетатную среду Для посева на эти среды используют минимальную дозу, снимая рост микробов без прикосновения к поверхности среды или предварительно суспендируя петлю культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При положительном результате наблюдают рост на средах и появление синего окрашивания (при использовании бромтимолового индикатора), при отрицательном - отсутствие роста и изменения цвета среды.

2.7. Определение дезаминирования фенилаланина Среду с фенилаланином засевают массивной дозой штрихом и через сутки инкубации добавляют на поверхность выросшей культуры несколько капель 10% раствора хлорида железа. При дезаминировании фенилаланина наблюдают зеленое окрашивание разной интенсивности, при отрицательной реакции добавленная жидкость и среда имеют желтый цвет.

Определение подвижности бактерий в столбике полужидкого 0,3% агара Для определения подвижности бактерий делают посев уколом в столбик среды, не доходя до дна пробирки на 1/3. Подвижные бактерии вызывают помутнение вблизи укола, неподвижные - растут строго по уколу.

Определение индола по Эрлиху К бульонной культуре (двух- или трехсуточной) приливают 1-2 мл эфира. Пробирку встряхивают для извлечения индола, после чего дают эфиру отстояться. К эфирной вытяжке приливают 0,5 мл реактива Эрлиха.

При положительном результате эфир окрашивается в красный цвет.

Постановка реакции Фогеса-Проскауэра и с метиловым красным Для постановки этих реакций используют среду Кларка в объеме не менее 5 мл. Посев изучаемой культуры проводят обычной петлей. Инкубируют при С. Результаты первоначально учитывают через сутки.

Из среды с суточным ростом культуры переносят по 1 мл в 2 пробирки. В одну из них добавляют 1 каплю реактива метиловый красный и следят за изменением окраски - появление красного окрашивания указывает на положительный результат, при отрицательной реакции среда приобретает желтый цвет. Во вторую пробирку для постановки реакции Фогеса-Проскауэра добавляют 0,5 мл 6% спиртового раствора -нафтола и 0,2 мл 40% раствора КОН. Учет реакции проводят в течение первых 5-10 мин (лучше после встряхивания пробирки) или после 1-2 ч пребывания в термостате при 37 С. При положительной реакции отмечают вишневое окрашивание, при отрицательной - отсутствие окрашивания. В большинстве случаев четкие результаты в указанных реакциях получают через 2-3 сут инкубации.

Определение чувствительности культуры к диагностическими фагам методом «стерильного пятна»

Для постановки пробы с фагом используют 4-18-часовую бульонную культуру. Можно использовать взвесь суточной агаровой культуры в 0,85% растворе натрия хлорида (по оптическому стандарту мутности 10 ед.

ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

На поверхность питательного агара тонко оттянутой пастеровской пипеткой наносят капли испытуемой культуры, подсушивают. На одну из капель петлей наносят каплю диагностического фага (опыт), на другую каплю - каплю стерильного МПБ (контроль). После подсушивания чашку инкубируют при 37 С в течение 18-20 ч.

При положительном результате на месте нанесения фага появляется четко очерченный лизис (++++), полусливной лизис (+++), большее (++) или меньшее (+) число негативных колоний. При отрицательном результате - на месте нанесения фага и в контроле наблюдается сплошной рост культуры.

Определение индофенолоксидазы Реактивы: 1% водные растворы диметил-пара-фенилендиамина, тетраметил-пара-фенилендиамина (гидрохлорида), этилоксиэтил-пара-фенилендиамина сернокислого и парааминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) в сочетании с 1% спиртовым раствором a-нафтола или без него.

Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого стекла их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.

Постановка пробы:

а) на поверхность 18-часовой агаровой культуры, подозрительной колонии или полусливного роста на пластинчатом агаре наносят 1 каплю 1% водного раствора одного из указанных реактивов. Положительная реакция на индофенолоксидазу – ярко красная окраска культуры через 20-30 секунд.

б) для постановки пробы на оксидазу можно использовать специальные бумажки из набора СИБ или пропитать помещенную в чашку Петри полоску фильтровальной бумаги 2-3 каплями 1% водного раствора одного из реактивов. Культуру наносят на полоску смоченной реактивом бумаги платиновой петлей (но не хромникелевой), стеклянной или деревянной палочкой и распределяют в виде небольшого пятнышка. Через 10-30 секунд появляется пурпурно-красное окрашивание, свидетельствующее о положительной реакции.

Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на индофенолоксидазу дают вибрионы, аэромонады, псевдомонады, плезиомонады, а отрицательную – все энтеробактерии.

Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах.

Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах, пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными контролями соответственно с культурами вибрионов или псевдомонад и энтеробактерий, выращенными на используемом в лаборатории питательном агаре.

Проба тяжа (String test) На чашку Петри наносят каплю 0,5% водного раствора дезоксихолата натрия или 2,5% водного раствора моющего средства «Прогресс» и в ней суспендируют 18-часовую агаровую культуру исследуемого штамма.

При положительной реакции суспензия немедленно теряет мутность, становиться слизистой и вязкой – тянется за петлей, что характерно для вибрионов.

Проба позволяет дифференцировать вибрионы не только от энтеробактерий, но и от других родственных грамотрицательных микроорганизмов, которые не образуют «тяжа». Исключение составляют лишь некоторые штаммы аэромонас, которые в течение примерно 60 секунд образуют слабо тянущуюся нить.

Определение декарбоксилазной активности Определение декарбоксилазной активности проводят на специальных средах Мёллера, Фалькоу, Биргер-Крушинской, Ряпис и др. В пробирки с лизином, орнитином, аргинином и контролем (среда без аминокислоты) засевают по полной бактериологической петле 18-часовой агаровой культуры и заливают 0,5-1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37±0,5°С. Учет результатов производят ежедневно, при отрицательном результате – до 1-4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую сторону, а в дальнейшем при декарбоксилировании аминокислот накапливаются амины и происходит защелачивание среды.

Среда Мёллера фиолетового цвета, при кислой реакции желтеет, щелочной - изменяется до красно-фиолетового цвета. Среда Фалькоу имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции желтеет, при щелочной - синеет. Среда Биргер-Крушинской при положительной реакции изменяется в синий цвет, среда Ряпис и др. меняется от оранжевого до сиреневого.

Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.

Для посева используют культуру, выращенную в течение 12-20 ч на плотной или 3-4 часа в жидкой питательной средах. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при 37±0,5°С и учитывают через 6-18 ч.

Для определения диастатической активности могут быть использованы среда Гисса с крахмалом и среда Кодама. Культуру засевают в среду и также инкубируют при 37±0,5°С. Через 18 ч в пробирку со средой Кодама добавляют 2-3 капли раствора Люголя. При разложении крахмала среда не окрашивается.

Определение протеолитических свойств В столбик желатины уколом засевают 18-часовую культуру и инкубируют в течение 2-3 суток при температуре 37±0,5°С в течение 18 ч. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на мин. При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в контрольной пробирке) - затвердевает.

Определение образования индола Холерные вибрионы при выращивании в средах, содержащих триптофан (пептонная вода, мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера и др.), расщепляют его с образование индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек или реактива Эрлиха.

Определение уреазной активности на среде Кристенсена 18-20-часовую агаровую культуру засевают петлей на скошенную поверхность среды. Ферментацию мочевины определяют по изменению цвета среды от желтого к красно-фиолетовому в течение 1-2 суток.

Определение лецитиназной активности Бульонную или агаровую 18-часовую культуру в виде бляшки засевают на специально приготовленный агар, содержащий эмульсию куриного желтка. Посев инкубируют при 37±0,5°С. О лецитиназной активности судят по зоне преципитации и полного просветления вокруг засеянных участков среды (в мм).

Выявление способности к биолюминесценции Изучаемые штаммы засевают в 1% пептонную воду или на пластинки щелочного агара, инкубируют при температуре 37±0,5°С в течение 18 ч. Выросшие культуры просматривают в темной комнате. Свечение наблюдают после 5-10 мин адаптации в темноте.

3.6. Обеззараживание исследуемого материала при Использование ПЦР-анализа в практике лабораторной диагностики возбудителей I-II групп патогенности должно проводиться в строгом соответствии с СП 1.3.1285-03 и действующими нормативными документами.

Одно из основных противоэпидемических требований при постановке ПЦР – обеспечить надежную инактивацию исследуемого материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний. Однако применяемые в работе с возбудителями особо опасных инфекций табельные средства обеззараживания (растворы перекиси водорода, хлорамина, формалина и др.) не могут быть использованы в данном случае из-за их повреждающего действия на ДНК или ингибирования ПЦР.

В настоящее время разработаны способы обеззараживания исследуемого материала, зараженного или подозрительного на зараженность бактериями I-II групп патогенности, при проведении генодиагностических исследований методом ПЦР.

Согласно методическим указаниям (МУ 3.5.5.1034отобранные для ПЦР пробы (суспензии органов, кровь, биологические жидкости, смывы с поверхностей, фильтраты почвы, взвеси бактериальных культур) инактивируют следующими способами:

1. Материал, зараженный или подозрительный на зараженность неспорообразующими бактериями I-II групп патогенности.

В пробу вносят проверенный на бактерицидное действие мертиолат натрия до концентрации 1:10 000 и прогревают при 56°С в течение 30 минут. Затем мкл обработанного метриолатом натрия материала переносят в микроцентрифужные пробирки типа эппендорф, добавляют 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при 65°С 15 минут.

При исследовании на холеру используют метод прогревания образцов при 100°С в течение 30 минут.

2. Материал, подозрительный на зараженность спорообразующими микроорганизмами II - IV групп патогенности, в том числе Bacillus anthracis.

Исследуемый материал обеззараживают, применяя метод герминации (прорастания) спор с последующей обработкой пенициллином и прогреванием, а затем воздействием лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогреванием.

В пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера рН 7,2±1 засевают 0,1 мл исследуемого материала и инкубируют с аэрацией при 37°С в течение 2,5 часов. Добавляют пенициллин (1000 ед/мл) и инкубируют при 37°С 15 минут. После этого пробу прогревают на водяной бане мин при 100°С. Затем отбирают 100 мкл обработанной пробы в центрифужные пробирки типа эппендорф, добавляют 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при 65°С в течение 15 минут.

После инактивации проб любым из вышеописанных методов дальнейшее исследование проводят как с обеззараженным материалом.

4. ОСОБЕННОСТИ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОЙ

РАБОТЫ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ

ЖИВОТНЫМИ

4.1. Требования к размещению и оснащению помещений блока инфицированных животных В работе диагностических, научно-исследовательских и производственных лабораторий широко используют различных животных. Лабораторные животные служат для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования инфекционных процессов, изучения вирулентности и токсигенности штаммов микроорганизмов, постановки биологической пробы с целью выделения возбудителя и др. Кроме того, они являются донорами, у которых берут кровь для получения сыворотки, плазмы, эритроцитов.

Для экспериментальной работы используют беспородных (конвенциальных) белых мышей, белых крыс, хомяков, морских свинок и кроликов. Однако в настоящее время выведено много линий мышей и крыс, которые отличаются цветом и специфическими реакциями организма при проведении научных экспериментов.

Крупные животные (овцы, лошади, ослы, обезьяны) также являются объектами исследований. В частности, на овцах проверяют эффективность вакцин против бруцеллеза и сибирской язвы, на обезьянах – против чумы, туляремии и других инфекционных заболеваний. Лошадей, крупный рогатый скот используют в качестве продуцентов различных иммунобиологических препаратов. Отдельные вопросы эпизоотологии, эпидемиологии и профилактики природно-очаговых инфекций изучают на отловленных в природе грызунах.

Многие виды исследовательской работы предполагают контакты персонала с лабораторными животными, которые могут быть как естественно, так и экспериментально инфицированы возбудителями болезней, представляющими опасность для людей. В связи с этим необходимо создать сотрудникам лабораторий безопасные условия труда. Соответствующее внимание необходимо уделять и экспериментальным животным.

В настоящее время разработан целый ряд нормативно-технических документов по размещению и проектированию вивариев, разведению и содержанию лабораторных животных.

Действующие санитарно-эпидемиологические правила (СП 1.3.1285-03) регламентируют требования к проведению исследований на лабораторных, диких позвоночных животных и членистоногих, их содержанию, а также обеззараживанию и последующей утилизации трупов отработанных животных и материалов.

Все манипуляции по приему, первичной обработке и вскрытию поступивших на исследование грызунов, заражению, вскрытию, содержанию биопробных животных и членистоногих, а также научно-исследовательскую работу с использованием экспериментальных животных проводят в специальных помещениях для инфицированных животных. Эти помещения должны быть отдельным самостоятельным или изолированным от основной лаборатории блоком. Планировка и набор помещений блока для инфицированных животных варьируют в зависимости от ПБА, с которым проводятся исследования, вида размещаемых животных и характера выполняемых работ (например, аэрозольный метод заражения требует особых условий).

Заразный блок обязательно должен включать комнаты: для одевания СИЗ, снятия СИЗ, приема и первичной обработки материала, зоолого-паразитологической работы, заражения и вскрытия животных, содержания биопробных животных (одна или несколько комнат), обеззараживания материала (автоклавная), мытья и хранения тары для биопробных животных, ведения записей.

Не разрешается в одной комнате одевать СИЗ и снимать их после работы с ПБА. Через комнату для одевания защитной одежды входят в блок для инфицированных животных, а через комнату для снятия одежды выходят.

Комнату для одевания защитной одежды оборудуют зеркалом, шкафами с необходимым запасом СИЗ, столом для регистрации времени и характера предполагаемой работы, заполнения этикеток на экспериментальных животных и полкой, на которую помещают металлические контейнеры с необходимыми для работы материалами (например, питательные среды, взвеси бактериальных культур, фиксатор для мазков-отпечатков и др.).

В комнате для снятия и обеззараживания защитных костюмов размещают емкости с дезрастворами для обеззараживания рук, обработки наружных поверхностей сапог (калош), замачивания халатов, капюшонов (косынок), полотенец, нарукавников, фартуков, резиновых перчаток; емкость с раствором соды (моющего средства) для погружения ватно-марлевых масок (для последующего кипячения) и банку с 70 спиртом для погружения очков-консервов.

В этой комнате выделяют место (столик или полка) для контейнера, выносимого из заразного помещения.

Наружную поверхность контейнера тщательно обрабатывают дезинфектантом перед выносом из вскрывочной.

После снятия, в установленном порядке (перед зеркалом), защитного костюма руки обрабатывают спиртом и моют с мылом под водопроводным краном.

Помещение для приема и первичной обработки заразного материала должно иметь собственный вход и сообщаться со вскрывочной (можно через «передаточное» окно). Комнату оборудуют столами для регистрации и размещения поступающего на исследование материала и холодильником.

В комнате для зоолого-паразитологической работы проводят определение вида, величины, возраста грызунов, их очес, сбор эктопаразитов, разборку гнезд грызунов и подготовку паразитологического материала к исследованию.

Помещение для заражения и вскрытия животных должно быть достаточно просторным и смежным с комнатой для содержания биопробных (зараженных) животных. Целесообразно, чтобы оно сообщалось через шлюзы с автоклавной, где проводят обеззараживание материала. В комнате размещают столы для вскрытия и заражения животных, настольный или напольный бокс биологической защиты для проведения конъюнктивального и интранозального заражения, шкаф для инструментов, холодильник для хранения трупов животных, небольшой столик для ведения протоколов опытов, электроприборы для кипячения инструментов и шприцов, емкости различных объемов с дезинфицирующими средствами.

Столы для заражения (рис. 10) и вскрытия животных (рис.11) должны иметь невысокие бортики и полку под столешницей на расстоянии 15-20 см от пола. Поверхности стола и полки покрывают водонепроницаемым материалом (лучше антикоррозионным металлом). На полке под столом размещают емкости с дезинфектантом для дуршлага (для стекания жидкости с трупа животного), корнцанга, которым захватывают трупы животных, и эмалированную миску, над которой их переносят на вскрывочную доску.

Рабочее место для заражения Рабочее место для вскрытия мелких Большая кастрюля с 3% раствором моющего средства необходима для замачивания животных перед вскрытием с целью иммобилизации эктопаразитов, если они остались на животном после очеса и чтобы смочить волосяной покров животного.

Для обеззараживания лабораторной посуды используют бачки, ведра, кастрюли с дезинфицирующими средствами. Для трупов отработанных животных целесообразно иметь эмалированные ведра с ножной педалью для открывания крышки.

На стол для вскрытия животных ставят металлическую или эмалированную кювету с доской (50 см х см) из мягких пород дерева. Доска должна быть без сучков и трещин.

Металлическая или эмалированная кювета (большой таз) понадобится также для заражения лабораторных животных. Над кюветой операторы набирают в шприц инокулюм, заражают животных и сбрасывают в неё мелкие отходы (тампоны, бумажную обертку со стерильных тампонов, спички и др.). Для заражения белых крыс и мышей в корень хвоста лучше иметь мелкосетчатые металлические каркасы с отверстием для хвоста.

Для содержания биопробных животных предусмотрены одна или несколько (если необходимо одновременно размещать животных, инфицированных разными ПБА) так называемых биопробных комнат.

На стеллажах, которыми оборудованы эти помещения, размещают банки с зараженными животными.

При работе с белыми крысами и дикими грызунами стеклянные банки с животными помещают в металлические сетчатые или перфорированные баки с фиксированной крышкой. Зараженных кроликов содержат в закрытых металлических ящиках, поставленных в металлические кюветы.

В сибиреязвенных лабораториях устанавливают металлические стеллажи, чтобы можно было их обрабатывать прожиганием (например, паяльной лампой).

Комнату для обеззараживания отработанного материала оборудуют автоклавом (лучше проходным), нагревательными приборами (газовые или электрические плиты, стерилизаторы и др.), шкафами, рабочим столом. Проходной автоклав устанавливают таким образом, чтобы его загрузка осуществлялась со стороны вскрывочной. Для проведения обеззараживания при помощи дезсредств следует иметь емкости различных размеров, которые при необходимости можно также размещать в любом помещении заразного блока: в комнате для снятия СИЗ, в биопробной, вскрывочной и там, где проводят зоолого-паразитологическую работу.

Помещение для мытья и хранения чистых банок, кроме прямого назначения, можно использовать для содержания до опыта чистых лабораторных животных и подготовки их к исследованию (измерение температуры, взвешивание, удаление шерсти), непродолжительного хранения кормов и подстилочного материала. Это помещение оборудуют ванной, стеллажами и шкафами.

Поскольку целью биологического метода исследования является выделение патогена и его последующая идентификация, необходимо перед вскрытием животного подготовить специальные среды, определяемые видом возбудителя, предметные стекла для мазков-отпечатков органов, фиксатор, стерильные шприцы. Могут понадобиться пропитанные мертиолатом натрия (1:1000) фильтровальные бумажки для забора крови из сердца (для серологических исследований), стерильные деревянные палочки для посева органов при исследовании на бруцеллез и др.

Перед вскрытием оборудуют рабочее место. На вскрывочной доске размещают спиртовку на устойчивой подставке, два стакана с инструментами (хирургический пинцет, скальпель и ножницы в одном, анатомический пинцет и ножницы в другом), погруженными в 96 о спирт (1/3 объёма стакана), ступку или чашку Петри для приготовления суспензии органов, стеклянную воронку, штатив, на который можно положить предметные стекла. Понадобятся также пробирки с физиологическим раствором и стерильным песком для растирания в ступке органов вскрываемого животного, бактериологическая петля, пастеровские пипетки и простой карандаш. На столе с левой стороны кюветы расставляют питательные среды и стерильные чашки Петри, с правой – банку с нестерильными ватными тампонами и кристаллизатор с дезраствором для обработки рук (рис. 11).

Банки с биопробными животными, которых необходимо вскрыть, переносят из биопробной во вскрывочную комнату таким образом, чтобы не касаться внутренней поверхности горлышка. Выживших биопробных животных умерщвляют хлороформом (эфиром), которым смачивают ватный тампон и бросают в банку. Банку плотно накрывают крышкой или не пропускающим воздух материалом.

Все манипуляции с трупами животных проводят только инструментами, держа их за верхнюю часть.

Перед вскрытием животное захватывают корнцангом и погружают в 3% раствор моющего средства на 20-30 сек., после чего помещают на дуршлаг для освобождения от излишней жидкости и переносят на вскрывочную доску. После этого корнцанг погружают в дезинфектант. Перенос животного и корнцанга осуществляют только над дезраствором (рис. 12).

Подготовка животного к Фиксация, вскрытие и посев орвскрытию. ганов биопробного животного.

Животное помещают на вкрывочную доску и с помощью двух пинцетов растягивают за лапки, чтобы снять трупное окоченение. Хирургическим пинцетом, который держат в левой руке, захватывают левую верхнюю лапу животного и прикалывают ее в области пясти к доске. Такую же манипуляцию проделывают с правой задней лапкой, прикалывая ее к доске в области плюсны, и т.д. Приколышам придают наклонное положение, чтобы они не мешали в работе (рис.13).

После каждой манипуляции в ходе исследования экспериментатор должен обрабатывать руки дезраствором и насухо вытирать их полотенцем, чтобы исключить возможность падения инструментов с заразным материалом из мокрых рук.

Перед тем, как приступить к вскрытию, необходимо смочить в воде 3-4 ватных тампона, отжать и поместить их на вскрывочную доску. Одним тампоном обрабатывают шерсть животного и прикрывают отверстие мочеиспускательного канала, чтобы предотвратить возможное разбрызгивание содержимого мочевого пузыря во время вскрытия, другие тампоны используют для протирания инструментов перед обжиганием. Допустимо смачивать тампоны дезинфицирующим раствором, однако следует учитывать возможность снижения процента выделения возбудителя.

Вскрытие трупов следует проводить таким образом, чтобы исключить внесение микроорганизмов с поверхности в глубину тканей и перенос микробов из одного органа на другой. Поэтому следует тщательно обрабатывать инструменты после каждой манипуляции и обжигать – перед началом работы.

При вскрытии используют хирургический пинцет и ножницы, которыми одним движением рассекают кожу по средней линии брюшка от половых органов до нижней челюсти и делают разрезы в стороны к четырем лапкам. Осторожно отделяют кожные лоскуты скальпелем или сомкнутыми браншами ножниц (при вскрытии мелких грызунов), приподнимая кожу хирургическим пинцетом. При правильном вскрытии паховые и подмышечные лимфатические узлы остаются на кожных лоскутах, а подчелюстные и шейные – на мышцах шейной области. Использованные инструменты обрабатывают ватными тампонами, погружают в спирт и заменяют другим набором инструментов (рис.13).

После осмотра подкожной клетчатки и лимфатических узлов проводят посев кусочка измененного лимфатического узла (бубона) на среды методом отпечатков, захватив его анатомическим пинцетом. Затем делают отпечатки на двух предметных стеклах.

При необходимости посеять материал в пробирки со скошенным агаром используют бактериологическую петлю, которую накаляют, прижигают к ней исследуемый материал и сеют методом отпечатков. После посева остаток органа снимают с петли пинцетом и только после этого прожигают петлю. Оставшийся на кожном лоскуте лимфоузел вырезают и переносят в ступку (чашку Петри) для биопробы.

Далее приступают к вскрытию брюшной и грудной полостей. Обжигают инструменты, захватывают хирургическим пинцетом брюшную стенку в области лобка, надрезают её и, введя не глубоко в брюшную полость закругленный конец ножниц, делают два дугообразных разреза вправо и влево к нижним ребрам.

Затем надрезают нижние ребра, рассекают диафрагму по краю грудной клетки и продолжают разрезать с обеих сторон грудную клетку до верхних ребер. Образовавшийся лоскут из грудины и рёбер откидывают на мордочку животного. Инструменты очищают от следов крови с помощь тампонов и погружают в спирт.

После осмотра органов и оценки патологоанатомической картины приступают к посеву органов брюшной полости: печени, селезенки, парааортальных лимфатических узлов. С помощью анатомического пинцета и ножниц отсекают маленькие ( 5х5 мм) кусочки органов и, держа их пинцетом, сеют на чашки Петри и делают мазки-отпечатки. Часть материала (свежие кусочки) отбирают для приготовления суспензии органов. После каждой манипуляции инструменты тщательно очищают от следов крови, органов и погружают в спирт.

При исследовании животных на туляремию делают посев органов бактериологической петлей, на бруцеллез – стерильными деревянными палочками. В последнем случае кусочек органа помещают на конец палочки, осторожно вносят её в пробирку со скошенным агаром и растирают материал о внутреннюю стенку пробирки над поверхностью агара. Образовавшуюся массу тщательно втирают в поверхность среды. Использованную палочку погружают в дезраствор.

Кровь из сердца забирают пастеровской пипеткой, которую вводят в полость правого желудочка через предварительно «припеченное» накаленным скальпелем место. При этом сердце фиксируют анатомическим пинцетом.

У мелких грызунов отсекают верхушку сердца и, используя бактериологическую петлю, выступившие капли крови сеют на пластинчатый агар и в жидкие среды.

При необходимости забора крови для серологических исследований ею пропитывают фильтровальные бумажки с мертиолатом натрия. Пинцетом бумажки помещают в чашки Петри или в пробирки, если перед забором крови их свертывают в трубочку с помощью двух пинцетов.

Если животное загнившее, для посева берут костный мозг из трубчатой части бедренной кости. Кость предварительно освобождают от мышц, подкладывают под место предполагаемого разреза стерильный марлевый или ватный тампон и под прикрытием стеклянной воронки рассекают её. Придерживая пинцетом отрезок кости, бактериологической петлей или иглой забирают материал для посева.

У мелких грызунов исследуют головной мозг. На вскрывочную доску помещают слой ваты, смоченный дезраствором. Двумя пинцетами закрывают внутренние органы вскрытого животного кожными лоскутами и переворачивают труп спиной кверху на приготовленный ватный матрасик. Корень хвоста фиксируют приколышем. Отсепаровывают кожу головы за ушками, фиксируют её хирургическим пинцетом, введя острые концы в глазницы, и под прикрытием стеклянной воронки, которую держит помощник, рассекают кости черепа в области мозжечка. Не вынимая пинцет из глазниц, слегка приподнимают отсеченную часть черепа, чтобы обнажить мозг и бактериологической петлей берут материал на исследование.

В процессе посева, как уже упоминалось, делают мазки-отпечатки свежими кусочками органов на двух (или более) стеклах:

лимфатические узлы – четыре отпечатка легкие – два печень – один селезенка – три кровь – одна узкая полоса поперек стекла Мазки-отпечатки не должны быть толстыми.

При вскрытии животного в протоколе отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов в паху, подмышечных впадинах. Учитывают их величину, форму и цвет. При осмотре органов грудной полости обращают внимание на наличие экссудата в полости плевры, гиперемию или ишемию (малокровие) легких. Регистрируют состояние органов брюшной полости, отмечая наличие очагов поражения (абсцессов).

После окончания вскрытия, осторожно извлекают приколыши, придерживая лапки животного пинцетом. Подносят к столу, как можно ближе, кастрюлю (бачок) с дезраствором для сбора отработанных трупов и, захватив двумя хирургическими пинцетами кожные лоскуты животного, опускают его в емкость.

Туда же сбрасывают использованные тампоны. Тщательно обрабатывают вскрывочную доску смоченными в дезрастворе тампонами. Переносят в фиксатор предметные стекла с мазками-отпечатками. При всех манипуляциях используют пинцет. Чашки Петри, пробирки с посевами, штатив перед тем, как поместить в бикс для транспортировки, протирают смоченными в дезрастворе салфетками или ватными тампонами.

Для заражения биопробных животных используют суспензию органов вскрытого животного. Вначале органы под прикрытием воронки измельчают ножницами, если их собирали в чашку Петри, или растирают с помощью пестика и стерильного песка, если использовали ступку. В образовавшуюся массу постепенно добавляют физиологический раствор 1:4 – 1:5 и эмульгируют. Суспензию для заражения набирают в шприц через стерильный ватный тампон. Для посева суспензии на пластинчатый агар используют бактериологическую петлю. Можно прикоснуться к агару пестиком, которым растирали органы, а затем отпечаток рассеять петлей.

4.3. Заражение лабораторных животных Использование определенного вида лабораторных животных и метода заражения определяется целью и задачами исследования. Разработаны следующие способы введения исследуемого материала биологическим моделям: накожный, внутрикожный, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, в переднюю камеру глаза, интратрахеальный, интраназальный, внутрикишечный, субокципитальный.

Некоторые методы заражения требуют предварительной подготовки животного. Так, при накожном и внутрикожном способах инокуляции материала удаляют волосяной покров в области брюшка или спины животного. Внутрикишечное и субокципитальное введение патогена проводят под наркозом.

Учитывая высокую степень риска инфицирования персонала лаборатории при интраназальном и интратрахеальном способах заражения, все манипуляции с животными проводят в боксах биологической безопасности. Особые требования по размещению, планировке, оборудованию, техническому обслуживанию и режиму работы предъявляют к аэрозольным лабораториям, проводящим ингаляционное заражение животных возбудителями I – II групп патогенности.

Наиболее часто в практических лабораториях используют беспородных белых мышей, морских свинок, хомячков и кроликов, применяя подкожный, накожный, внутрибрюшинный методы введения инфицированного материала, а также заражение в корень хвоста или вену.

В исследование берут только здоровых животных определенных массы тела и возраста.

Перед заражением животных рассаживают в банки или металлические ящики (кролики), на которые прикрепляют заранее заполненные этикетки. В этикетке указывают вид и вес животного, номер (по журналу регистрации биопроб), вид и количество (объем, доза) вводимого материала, метод инокуляции, дату заражения и фамилию экспериментатора.

Для обеспечения безопасных условий при заражении животных необходимо строго соблюдать специально разработанные методические приемы. Особые требования предъявляют к подбору шприцев.

Работа по заражению животных проводится в паре.

Помощник распробковывает пробирку с исследуемым материалом и наклоняет ее таким образом, чтобы врач мог набрать необходимое количество. Чтобы исключить случайное выливание содержимого пробирки, желательно пользоваться пробиркой с углублением в верхней части стенки. Для того чтобы избежать попадания в шприц пузырьков воздуха, следует полностью погрузить иглу в жидкость срезом книзу и медленно продвигать поршень.

При необходимости удалить пузырек воздуха из шприца следует с помощью пинцета насадить на иглу стерильный ватный тампон упакованный в бумажный конверт, перевести шприц в вертикальное положение иглой вверх и осторожно его выдавить. После этого пинцетом снимают с иглы тампон, погружают его в дезинфектант, а пинцет – в стакан со спиртом. Более безопасный способ набора инфицированного материала из чашки Петри или ступки.

При заражении материалом, содержащим сравнительно крупные частицы (суспензии органов исследуемых животных и человека, членистоногих, пищевых продуктов и др.), его набирают в шприц через стерильные марлевые или ватные тампоны.

После того как материал набран в шприц, категорически запрещается прикасаться рукой к игле или месту соединения ее с цилиндром.

При необходимости освободить руки работающего после набора инокулята, шприц можно положить в чашку Петри, предварительно наколов на иглу стерильный ватный или марлевый тампон. При этом шприц должен лежать устойчиво и не касаться иглой и канюлей бортика чашки.

Все манипуляции, связанные с набором инфицированного материала из пробирки и заражением животных, проводят над кюветой (тазом) с дезинфицирующим раствором.

Шприц с инокулятом держат строго горизонтально между большим, средним и безымянным пальцами правой руки. Указательный палец, оставаясь свободным, не должен касаться (до момента заражения) поршня (рис.14).

Рис. 14. Исходное положение шприца при заражении лабораторных животных Использованные шприцы обеззараживают кипячением или дезинфицирующим раствором. Чтобы исключить опасность разбрызгивания заразного материала при разборке шприца, следует придерживаться определенных правил. Остаток неиспользованного после заражения материала медленно выпускают в дезинфектант, погрузив иглу шприца в раствор. Затем, держа шприц иглой вниз, над емкостью (стерилизатор, кастрюля) с водой или дезраствором, осторожно пинцетом снимают иглу и опускают ее в жидкость. Наклоняют шприц канюлей вверх и пинцетом медленно вытягивают поршень и также погружают его в жидкость.

После этого вводят одну браншу пинцета внутрь цилиндра и осторожно затапливают его.

Шприцы одноразового применения не разбирают, как указано выше набирают дезраствор, на иглу пинцетом надевают защитный колпачок, погружают до уровня канюли вдезраствор и заполняют его раствором из шприца, затем пинцетом погружают в емкость с дезраствором.

Если использовались шприцы с насадкой, вынимают только поршень, остальные детали разбирают после обеззараживания. Пинцет помещают в стакан со спиртом или дезинфицируют вместе со шприцами.

При подкожном методе заражения исследуемый материал (0,1-0,2 мл, максимально 0,5 мл – белой мышке, хомячку; 0,5-1,0 мл – морской свинке) вводят экспериментальной модели в область бедра. Помощник фиксирует животное (белая мышь, хомячок, морская свинка) руками или корнцангом (крыса) и подносит к экспериментатору в растянутом виде брюшком кверху. Если инокулюм вводят в правую лапку белой мыши или хомячка необходимо захватить правой рукой ушки и складку кожи в области затылка, а левой – хвост и задние лапки животного и наоборот (рис.15).

Подкожный (внутримышечный) Внутрибрюшинный метод зараметод заражения белой мыши. жения морской свинки.

При заражении крыс помощник фиксирует корнцангом кожу в области затылка животного, хвост и заднюю лапку прижимает рукой к корнцангу, а свободную заднюю лапку, в которую предполагается вводить материал, держит другой рукой.

Морских свинок берут рукой так, чтобы одна передняя лапка располагалась между большим и указательным, другая – между указательным и средним пальцами помощника. Фиксированные лапки отводят кзади.

Задние лапки фиксируют между большим, указательным и средним пальцами другой руки помощника.

В момент заражения руки помощника должны располагаться в одной плоскости с животным, чтобы исключить возможные аварийные ситуации.

Заражающий над кюветой с дезинфектантом в правой руке держит шприц с исследуемым материалом, левой рукой с помощью анатомического пинцета спиртовым ватным тампоном протирает место инокуляции материала, оставляет тампон на руке помощника, этим же пинцетом слегка приподнимает кожу животного вверх и вводит иглу срезом кверху строго под кожу. Затем экспериментатор переносит пинцет на муфту иглы, чтобы зафиксировать ее на шприце, и медленно надавливает на поршень указательным пальцем. После введения материала необходимо сразу убрать указательный палец с поршня, пинцет - с канюли шприца и под прикрытием спиртового тампона вывести иглу изпод кожи. Используемый тампон опускают в дезраствор.

Заражающий набирает при помощи порошня в шприц дезинфицирующий раствор и погружает его в емкость с дезраствором. Помощник помещает животное в банку, которая должна стоять вблизи работающих. Не касаясь горлышка банки, животное головой вниз опускают в нее на глубину не более 5 – 6 см и освобождают сначала голову, а затем задние лапки.

Внутрибрюшинный метод заражения применяют с целью ускорения биологического исследования материала. В этом случае для биопробы можно брать только так называемый «чистый» материал (например, кровь).

Техника внутрибрюшинного метода заражения отличается от подкожного способом подачи животного. В момент непосредственного введения исследуемого материала лабораторное животное должно располагаться вертикально головой вниз. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что уменьшает возможность его повреждения в момент инъекции.

Мелких лабораторных животных помощник сразу подает головкой вниз, брюшком к экспериментатору.

Заражающий обрабатывает место введения инокулята спиртовым тампоном, захватывает анатомическим пинцетом складку кожи вместе с брюшиной несколько выше проекции мочевого пузыря и вводит иглу, прокалывая кожу и брюшину одновременно.

При заражении морских свинок помощник располагает фиксированное животное сначала в горизонтальном положении брюшком вверх, а головкой к правой руке экспериментатора. Заражающий протирает нижнюю часть брюшка спиртовым тампоном, захватывает пинцетом складку кожи, отступая 0,5-0,8 см от белой линии живота в правую сторону по отношению к животному, приподнимает кожу и прокалывает ее. Затем фиксирует этим же пинцетом муфту иглы. В это время помощник осторожно переводит животное в вертикальное положение головой вниз, а заражающий следит за иглой, устанавливая ее перпендикулярно к брюшку животного. Затем экспериментатор колющим движением вводит иглу в полость брюшины. Последующие манипуляции не отличаются от выше указанных при подкожном методе заражения (рис. 16).

Накожный метод заражения применяют при исследовании материала, который содержит большое количество посторонней микрофлоры (загнивший труп грызуна, мокрота, содержимое кишечника, погадки птиц, земля и др.). Перед заражением кожу в области брюшка животного освобождают от волосяного покрова. У кроликов, морских свинок и крыс шерсть выстригают ножницами с закругленными концами. Для полного удаления волосяного покрова используют депилятор (за 2-3 дня до постановки опыта). Помощник крепко фиксирует животное и подает его в растянутом виде строго горизонтально, чтобы избежать стекания капель инфицированного материала с поверхности кожи в момент заражения. Заражающий обрабатывает эпилированный участок стерильным ватным тампоном, смоченным стерильной водой или физиологическим раствором, и скарифицирует лезвием скальпеля до появления капель крови кожу в области предполагаемого заражения. Затем заражающий с помощью пастеровской пипетки, скальпеля или пинцета наносит на кожу небольшое количество (2-3 капли или 0,5-1, г) исследуемого материала. Если необходимо заразить животное мокротой, используют ватный тампон, накрученный на деревянную палочку. При исследовании отдельных органов (грызуна, человека) вырезают небольшой кусочек, которым делают отпечатки на скарифицированной коже биопробного животного. После нанесения исследуемого материала следует тщательно втереть его в кожу тупой поверхностью скальпеля под прикрытием стеклянной воронки или крышки от чашки Петри. Воронку или чашку Петри, которые использовали в работе, сразу погружают в дезинфицирующий раствор.

Заражение в корень хвоста. При заражении этим методом используют белых мышей и белых крыс. Белых мышей помощник подает экспериментатору в горизонтальном положении спинкой вверх, оставляя не фиксированным хвост. Для заражения белых крыс необходимо иметь специальные металлические каркасы или банки с металлическими крышками, в средней части которых сделано небольшое отверстие для хвоста.

В исключительных случаях животное можно фиксировать с помощью корнцанга. Исследуемый материал вводят животному в подкожную клетчатку в области корня хвоста.

Крыс и мышей можно заразить в боковую вену хвоста. Перед введением материала хвост животного смазывают ксилолом или толуолом, чтобы вызвать набухание вены. Для введения материала лучше пользоваться туберкулиновыми иглами.

5. ИММУНОСЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ

БОЛЕЗНЕЙ

По данному разделу освещаются современные понятия об антигенах, антителах, характеризуются агглютинационные, преципитационные, твердофазные иммунохимические, иммунохроматографические, иммунофлуоресцентные и др. методы диагностики. На практических занятиях отрабатываются навыки проведения обеззараживания объектов, взятых для исследования; методические приемы постановки комплекса серологических реакций, наиболее часто используемых в лабораториях; правила оценки и учета полученных результатов.

Серологические методы исследования в настоящее время широко применяются в лабораторной диагностике целого ряда заболеваний различной этиологии.

Они позволяют фиксировать наличие антигенсодержащего материала, не прибегая к изоляции патогена.

В отличие от бактериологического и биологического методов, достоверность которых вытекает из факта выделения возбудителя, серологические тесты представляют доказательства присутствия в исследуемом материале искомого агента на основе специфического взаимодействия антиген-антитело (АГ-АТ). Важным преимуществом этих методов является возможность индикации не только корпускулярных, но и субкорпускулярных и растворимых АГ, а также специфических АТ.

5.1. Теоретические основы взаимодействия антигена с В иммунологических методах участвуют два специфических комплементарных по отношению друг к другу компонента: антиген и соответствующее ему антитело. Они составляют одну специфическую систему типа «ключ-замок».

АГ - это вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие специфических иммунных реакций (гуморальных, клеточных, состояние иммунологической толерантности, индуцирование иммунной памяти).

Свойства АГ определяются комплексом признаков:

иммуногенность, антигенность, специфичность, чужеродность.

Чужеродность. АГ вызывает иммунный ответ, т.е.

образование АТ только в тех случаях, когда он чужероден. К собственным АГ организм толерантен.

Антигенность - способность АГ избирательно реагировать со специфичными к нему AT или АГраспознающими рецепторами лимфоцитов. Антигенностью обладают микроорганизмы и их токсины, паразиты. Синтез АТ могут индуцировать яды белковой природы (змеиный), эритроциты, яичный альбумин, белки, сложные полисахариды (ПС), липополисахариды (ЛПС), полипептиды, комплексные соединения белков с липидами, полисахаридами, некоторые искусственные высокополимерные соединения.

Иммуногенность - способность индуцировать иммунный ответ. При анализе генетического контроля иммунного ответа выявлены линии мышей и морских свинок, одни из которых отвечают на определенный АГ, а другие остаются к нему ареактивными. Иными словами, АГ в качестве иммуногена проявляется тогда, когда иммунная система конкретного организма способна к адекватному ответу.

Иммуногенность АГ повышается по мере увеличения размера и полимерности молекул этого АГ. Низкополимерный АГ может вызывать не только более слабый, но и качественно иной иммунный ответ, чем АГ, обладающий тем же составом, но более высоким уровнем полимерности. Повышение иммуногенности АГ-ов с возрастанием полимерности их молекул имеет верхний предел. При дальнейшем возрастании полимерности молекулы АГ приобретают способность вызывать специфическую иммунодепрессию или толерантность. Иммунологическая толерантность – это состояние организма, при котором последний не способен отвечать продукцией АТ на введение АГ.

Специфичность - структурные особенности, отличающие один АГ от другого.

АГ делятся на 2 группы:

- полноценные (полные) - иммуногенные, всегда проявляющие антигенные свойства; неполноценные (гаптены) – неимунногенные.

Способностью вызывать развитие иммунного ответа и определять его специфичность обладает фрагмент молекулы АГ - антигенная детерминанта (эпитоп).

Антигенная детерминанта – небольшой участок молекулы АГ, образующий пространственную конфигурацию за счет остатков молекул аминокислот, углеводов или липидов, который и является фактическим местом присоединения молекулы АТ. 1 молекула АГ может содержать несколько структурно отличающихся антигенных детерминант, что обусловливает поливалентность АГ. Валентность АГ-енной молекулы определяется числом однородных детерминант, способных соединиться с активным центром АТ одной и той же специфичности.

Молекулы гаптенов моновалентны. По валентности АГ можно судить о его молекулярной массе. В среднем валентность белковых АГ составляет от 5 до 15.

В ответ на большинство поливалентных антигенов АТ образуются к каждой детерминанте. Комплементарность АГ-детерминанты к АТ у специфического АГ выше, чем у перекрестно реагирующего. В основе взаимодействия перекрестно-реагирующих АГ с АТ лежит структурное подобие или полное сходство с детерминантами специфического АГ. Моноклональные AT специфически распознают только одну АГдетерминанту и связываются с ней. Поликлональные AT, как правило, распознают несколько антигенных детерминант в составе АГ.

По химическому строению, основным иммунологическим свойствам, а также по методам их изучения детерминанты можно условно подразделить на 3 больших группы:

1) Гаптены [от греч. hapto, прикрепляться] (неполные АГ) - это вещества с низкой молекулярной массой, способные вступать во взаимодействие с АТ, но не вызывающие их образование. При увеличении размера гаптенов (при конъюгировании с белками), они приобретают свойства полноценных АГ. Полугаптены - неорганические вещества (йод или хром), присоединение которых к молекуле белка меняет его иммуногенные свойства. Образующиеся AT специфичны к йоду или хрому, то есть к детерминантам на поверхности полного АГ, но не к белку-носителю. Проантигены - гаптены, способные присоединяться к белкам организма и сенсибилизировать его как аутоантигены. Например, метаболиты грибов пенициллов или продукты распада пенициллинов могут связывать белки и вызывать развитие к ним иммунных реакций.

2) Олигосахаридные детерминанты входят в состав гликолипидов (АГ клеточных стенок бактерий и главные АГ групп крови) и гликопротеинов (резусфактор). Основные АГ-нные детерминанты полисахаридов представляют собой короткие олигосахариды (1-6 остатков сахара). Специфические свойства АГ-ой детерминанты полисахарида определяются последовательностью входящих в ее состав сахаров и способом их соединения друг с другом.

3) Пептиды - АГ-енные детерминанты белковой природы состоят из аминокислотных остатков, расположенных в пространстве определенным образом. Их делят на концевые и конформационные. Специфичность 1-ых определяется, главным образом, составом короткой концевой пептидной цепочки. 2-ые находятся в середине молекулы и их специфичность определяется ее третичной структурой.

Соединение АГ-ой детерминанты с активным центром АТ обеспечивается различными типами химического взаимодействия молекул: ван-дер-ваальсовыми силами, полярным взаимодействием молекул, образованием водородных связей и гидрофобным взаимодействием. Прочность такого соединения выше для тех детерминант, в составе которых находятся радикалы, приобретающие в водном растворе сильный «+»

или «–» заряд.

Большая часть АГ способна запускать иммунные реакции, выступая в последующем в качестве мишени, в отношении которой эти реакции реализуются. Суперантигены – АГ, способные непосредственно, без предварительной обработки АГ-представляющими клетками взаимодействовать с молекулами МНС (главного комплекса гистосовместимости). При этом распознавание АГ теряет строгую избирательность, вовлекаются большие группы Т-клеток. Их активация сопровождается избыточной продукцией различных медиаторов иммунного ответа, что может привести к развитию аутоиммунных реакций (например, АГ микоплазм, стрептококков, кампилобактеров и т.д.).

Особую группу составляют АГ, способные подавлять иммунные реакции с развитием специфической неспособности отвечать на них. Это состояние известно как иммунная толерантность. Благодаря генетическому разнообразию индивидуумов, вещество-иммуноген для одного из них может быть толерогеном для другого. Действуя как иммуноген при парентеральном введении (например, внутримышечно), то же вещество может быть толерогеном при введении другим путём (например, пероральном).

В роли АГ выступают белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты; эти соединения могут образовывать комбинации между собой или с липидами. Липиды неиммуногенны, что определяется недостаточной жёсткостью структуры этих молекул и преимущественно линейной конфигурацией. Наибольшей иммуногенностью обладают белковые АГ. Чем дальше от человека в эволюционном отношении отстоят организмы, тем большую иммуногенность проявляют их белки.

АГ подразделяются на а) экзогенные – поступают извне, подвергаются эндоцитозу и расщеплению в АГпредставляющих клетках, б) эндогенные – продукты собственных клеток организма (белки, синтезируемые вирусинфицированными клетками хозяина и аномальные белки опухолевых клеток).

Молекулярная масса АГ имеет существенное значение. Вещества с массой более 5-10 кД - сильные иммуногены. Исключение - нуклеиновые кислоты, обладающие большой молекулярной массой, но слабой (по сравнению с белками) иммуногенностью.

Растворимость. Нерастворимые белки (например, кератины) не могут находиться в коллоидной фазе и не вызывают развития иммунных реакций.

АГ по специфичности делятся на 10 типов:

Видовая специфичность – особи одного вида отличаются от особей другого вида (АГ мыши отличаются от АГ кролика).

Групповая специфичность (индивидуальная) - различия среди особей одного вида организмов. Аллоантигены (изоантигены) - АГ конкретного индивидуума, обладающие иммуногенностью по отношению к другим представителям этого вида, но не к организмудонору трансплантата. Яркий пример изоантигенов - групповые Аг крови, присутствующие на мембранах эритроцитов и других клеток. Поскольку человек обладает естественными AT к групповым Аг крови, последние приобретают свойства сильных трансплантационных Аг. Поэтому перед трансплантацией и гемотрансфузией необходимо определить группы крови донора и реципиента.

Типоспецифичность – относится только к микробам.

Так пневмококки по полисахаридным АГ делятся на 4 типа, каждый из которых обладает своими особенностями.

Гетероспецифичность – обусловлена АГ, общими для представителей разных видов (сходство отдельных структурных компонентов органов и тканей человека с антигенами возбудителей чумы, бруцеллеза, холеры).

Органоидная специфичность – обусловлена органоидами клетки (ядро, митохондрии и т.д.).

Функциональная специфичность – связанна с функцией данной молекулы (общие АГ тканей печени человека и животного за счет их функции).

Стадиоспецифичность – введена в связи с развитием иммунологии эмбриогенеза.

Гаптеноспецифичность – любой гаптен может обеспечивать свою специфичность.

Патологическая специфичность – обеспечена специфичностью патологически измененных тканей (ожоговые, лучевые, раковые).

АГ-енная специфичность ДНК Антигены бактерий. Большинство возбудителей инфекционных заболеваний человека, их структуры и токсины - полноценные АГ, вызывающие развитие иммунных реакций.

В основе классификации АГ бактерий лежит их локализация (жгутиковый, капсульный АГ и т.д.), биологическая функция (гемолизин, энтеротоксин) или метод обнаружения (преципитиноген, агглютиноген).

Н-АГ - жгутиковые - входят в состав бактериальных жгутиков, представляют собой белок флагеллин, разрушающийся при нагревании, после обработки фенолом сохраняющий свои АГ-енные свойства. О-АГсоматический - связан с ЛПС клеточной стенки, термостабилен, сохраняется при кипячении в течение 1-2 ч, не разрушается после обработки формалином и этанолом. К-АГ - капсульные располагаются более поверхностно, чем О-АГ, тесно связаны с ЛПС клеточной стенки и капсулой. У некоторых возбудителей имеется термолабильный Vi-AГ (АГ вирулентности), выявление которого имеет важное значение для серотипирования бактерий. Поверхностные эндоАГ (жгутиковый, капсульный, соматический) характеризуются большей антигенностью, чем внутриклеточные (цитоплазматических мембран, цитоплазмы, рибосом, НК).

Для возбудителей отдельных инфекций предложены АГ-енные схемы - классификация видов бактерий по АГ-енной структуре. Первая АГ-енная классификация бактерий была разработана Уайтом. В 1934 г. Кауфман предложил использовать ее для классификации бактерий рода Salmonella. В настоящее время она значительно дополнена. Сейчас существуют АГ-енные классификации для бактерий родов Salmonella, Shigella, Citrobacter, Escherichia, Arizona и др. АГ-енные схемы используются для сопоставления с набором уже известных серотипов бактерий, выделенных в различных микробиологических учреждениях мира.

Антигенные схемы предполагают описание отдельных АГ бактерий в виде формул, характеризующих определенные серотипы. АГ бактерий обозначают цифрами или буквами. Комбинации АГ, обозначенные в виде АГ-енной формулы, характеризуют биохимически определенный вид серологически. Осуществляется постоянный контроль и дополнение существующих АГ-енных схем.

Антигенность бактерий – одно из основных свойств.

У разных возбудителей она оказывает неодинаковое влияние на возникновение, течение и исход инфекционного заболевания. Изучение АГ-енной структуры бактерий и продуктов их жизнедеятельности необходимо для создания эффективных слабореактогенных вакцин, для изучения патогенеза заболеваний и совершенствования методов лабораторной диагностики.

Особую группу бактериальных АГ составляют протективные АГ [от лат. protectio, защита] - термолабильные белки, иммунизация которыми защищает лабораторных животных от гибели после заражения летальными дозами патогенных микроорганизмов. В настоящее время подобные АГ выделены у возбудителей сибирской язвы, чумы, бруцеллёза, туляремии и коклюша. Нередко протективные АГ используют для изготовления вакцин.

АГ-нная изменчивость бактерий в настоящее время подвергается серьезному научному исследованию. В результате внешних воздействий у бактерий могут наблюдаться АГ-вариации или АГ-модуляции - изменение, частичная или полная потеря АГ. Качественные и количественные изменения АГ у определенных видов могут привести к изменению серотипа. Различают Н-О-вариации (потеря Н-АГ и переход к чистой О-форме), О-вариации (потеря или количественное изменение компонентов этого комплекса), S-R-вариации переход из гладкой в шероховатую форму), V-Wизменение формы (количественное изменение содержания V-АГ). АГ-енная изменчивость усложняет серологическую диагностику заболеваний. АГ-енные модуляции это исчезновение поверхностных АГ под влиянием АТ. АГ-енные модуляции – обратимый феномен: при удалении АТ АГ микроорганизмом экспрессируются вновь.

АГ вирусов. Заражённые вирусами клетки начинают экспрессировать вирусспецифические АГ. Вирусные АГ могут быть структурными и неструктурными. Первые представлены веществами, кодируемыми нуклеиновыми кислотами, а также клеточными метаболитами (липиды, углеводы), захватываемыми вирионами при почковании. Неструктурные АГ не входят в состав вирионов, а образуются в инфицированных клетках на различных этапах репродукции вирусов. У вирусов выделяют ядерные (сердцевинные), капсидные и суперкапсидные АГ. У пара- и ортомиксовирусов имеются также поверхностные V-AГ - гемагглютинин и нейраминидаза.

Антитела (АТ) – это белки, относящиеся к тому или иному классу иммуноглобулинов (Ig), которые вырабатываются клетками лимфоидных органов после стимуляции АГ, поступающими в организм (при естественных инфекциях, вакцинации, действии ксенобиотиков) или образующимися эндогенно. Как правило, АТ специфически взаимодействуют с комплементарным АГ. Однако существуют АТ, взаимодействующие с АГ-детерминантами, общими для различных АГ. Такие AT известны как перекрёстно реагирующие, или гетероспецифичные. AT существуют в миллионах разновидностей и каждая молекула имеет уникальный участок связывания АГ-детерминанты. Практически АТ могут быть получены к любому АГ. В большинстве случаев АТ представлены сывороточными гликопротеинами, мигрирующими в составе медленной фракции - глобулинов при электрофорезе белков сыворотки. Поэтому для обозначения сывороточной фракции АТ иногда применяют устаревший термин «- глобулины». В соответствии с международной классификацией, ныне совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами АТ, называют Ig.

AT образуют одну из основных фракций белов крови, составляя 20% массы общего белка плазмы. AT устойчивы к действию слабых кислот и щелочей, а также к нагреванию до 60°С. Существует 5 классов Ig: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, различающихся по молекулярной массе, содержанию углеводов, составу полипептидных цепей, коэффициентам седиментации и др. характеристикам.

Структурная единица AT - мономер - молекула цилиндрической формы, состоящая из 2-х идентичных тяжелых (H-heavy) и 2-х идентичных легких (L-light) аминокислотных цепей, соединенных дисульфидными S-S- связями) (рис. 17).

Молекулярная масса легких цепей составляет около 23 кД, и они состоят примерно из 214-220 аминокислотных остатков. Молекулярная масса тяжелых цепей варьирует в пределах 50-73 кД. При обработке папаином молекула Ig распадается на 3 фрагмента. Два из них – одинаковые, состоят из легкой цепи и половины тяжелой цепи и обладают способностью соединяться с АГ. Эти два фрагмента обозначают как F(ab)1 и F(ab)2, т.е. фрагменты, связывающие АГ (от англ. antigen binding). Установлено, что Fab-фрагменты определяют АТ-ельную специфичность Ig. Fab-фрагменты AT взаимодействуют с антигенными детерминантами (принцип «ключ-замок»). Связывание АГ с AT нековалентно и обратимо. Третий фрагмент с мол. массой около 55 кД состоит из двух половин Н-цепей. В связи с постоянством аминокислотного состава, его обозначили как Fc – фрагмент (от англ. constant- постоянный). Fc – фрагмент не обладает способностью связывать АГ, но определяет ряд других важных видов биологической активности, необходимых для полного проявления всех функций АТ. С Fc – фрагментом связана способность АТ проходить через плаценту, усиливать фагоцитоз, нейтрализовать вирусы, связывать комплемент.

Fc- фрагмент взаимодействует со своим рецептором в мембране различных типов клеток (макрофаг, нейтрофил, тучная клетка).

В зависимости от структуры H-цепей выделяют классов (изотипов) АТ: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM), отличающихся физическими, функциональными, химическими и антигенными свойствами. Значительную помощь для постановки более обоснованного диагноза оказывает определение не только суммарного титра, но и класса Ig.

IgM – пентамер из 5 субъединиц, соединенных дисульфидными связями, имеет 10 АГ-связывающих участков, молекулярная масса 900000 Д (рис. 18), составляет около 10% антител сыворотки крови.

В сыворотке здорового человека могут также циркулировать мономерные и 2-х валентные IgM (в высоких титрах их выявляют при макроглобулинемии Вальденстрема). IgM - филогенетически наиболее древний Ig, что находит отражение в особенностях этого Ig (прежде всего его относительная неспецифичность). IgM – наиболее ранний класс АТ, обнаруживаемый при первичном попадании АГ в организм, выявление IgM указывает на наличие острого инфекционного процесса. Синтез других классов АТ при первичном контакте с конкретным АГ начинается позднее; несмотря на это, образование IgM к некоторым АГ (например, жгутиковым АГ бактерий) осуществляется постоянно.

IgM – основной класс АТ, синтезируемых у новорожденных и младенцев. Пик их образования приходится на 4-5 сутки с последующим снижением титра. Период полужизни IgM составляет 5,1 дня. Fс – фрагмент IgM может участвовать в классическом пути активации комплемента. Молекулы IgM опсонизируют, агглютинируют, преципитируют и лизируют содержащие АГ структуры. В отличие от прочих Ig синтез Ig M мало подвержен действию иммунодепрессантов.

После первичного контакта с АГ синтез Ig М обычно сменяется образованием более дифференцированных IgG.

IgG составляет около 75% антител сыворотки крови.

Имеется 4 подкласса – IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4. Мономер, имеет 2 эпитоп-связывающих участка.

Maксимальные титры IgG при первичном ответе наблюдают на 6-8 сутки. Обнаружение высоких титров IgG к АГ конкретного возбудителя указывает на то, что организм находится в стадии реконвалесценции или конкретное заболевание перенесено недавно, а также на обострение хронического заболевания. В большом количестве IgG синтезируются при вторичном иммунном ответе.IgG – основной класс АТ, защищающий организм от бактерий, вирусов и токсинов.

Период полужизни IgG составляет 7-23 дня в зависимости от подкласса. IgG непосредственно участвуют в реакциях нейтрализации, а также усиливают фагоцитоз, действуя как опсонины и связывая рецепторы Fс – фрагмента в мембране фагоцитирующих клеток, в результате чего фагоциты поглощают и лизируют микроорганизмы. Fс – фрагмент IgG может участвовать в классическом пути активации комплемента. Особенностью IgG является высокая скорость связывания с АГ. Фракция IgG вызывает преципитацию растворимых АГ, а также агглютинацию и даже лизис (в присутствии комплемента) корпускулярных АГ. Только IgG беременной женщины форсируют плацентарный барьер путем опосредованного рецепторами эндоцитоза. Транспорт IgG через плаценту обеспечивает формирование пассивного иммунитета у плода.

IgА (мол.масса 170 тыс. Да) (составляют 15-20% всех Ig) секретируются поверхностью эпителиев, присутствуют в слюне, слезах, молоке, выделяются на поверхность слизистых оболочек, где взаимодействуют с АГ, усиливая защитные свойства слизистых оболочек пищеварительного тракта, дыхательных, половых и мочевыводящих путей.

В сыворотке крови IgА циркулирует в виде мономеров, а в секретируемых Ig преобладают 4-х- валентные димеры, имеющие секреторный компонент, который защищает антитело от разрушения ферментами. Период полужизни Ig А составляет 5,8 дня.

IgЕ (м.м. 180 тыс. Да) составляют 0,002% АТ сыворотки крови. Мономер, имеет два эпитопсвязывающих участка.

Участвуют в противопаразитарном иммунитете и в ответе на аллергены. Fав фрагменты молекулы IgЕ специфически взаимодействуют с АГ, попавшим в организм. Сформированный иммунный комплекс взаимодействует с рецепторами Fc- фрагментов IgЕ, встроенных в клеточную мембрану базофила или тучной клетки. Это взаимодействие является сигналом для экзоцитоза гистамина, других биологически активных веществ и развертывания острой аллергической реакции. Защитные потенции Ig Е направлены преимущественно против гельминтов. Синтез IgЕ увеличивается при паразитарных инвазиях, IgЕ – моноклональной миеломе. Период полужизни IgЕ составляет 2,3 дня.

IgD – составляют около 0,2% АТ сыворотки крови.

Мономер, имеет два эпитопсвязывающих участка.

Биологическая роль этих Ig не установлена. IgD обнаружен на поверхности развивающихся В-лимфоцитов, контролируя их активацию и супрессию. Увеличение содержания IgD достигает максимума к 10 годам жизни, некоторое увеличение титров находят у беременных, у больных бронхиальной астмой, системной красной волчанкой и лиц с иммунодефицитами. Период полужизни IgD составляет 2,8 дня.

Важными характеристиками АТ являются: аффинность – прочность связывания АТ с АГ, которая зависит от пространственного соответствия реагирующих поверхностей, соотношения концентраций связанных и свободных АГ и AT, электростатических, гидрофобных воздействий и сил Ван дер Ваальса. Аффинитет – мера специфичности АТ. Авидность – интегральная характеристика силы связи (прочности) между АГ и АТ, учитывающая взаимодействие всех активных центров АТ со всеми эпитопами АГ. Это свойство АТ, определяет степень их сродства к АГ и реакцию формирования комплекса АГ-АТ. Авидность зависит как от аффинности, так и от числа активных центров на молекуле АТ. Авидность возрастает при избытке АГ, т.к. молекула АТ может формировать множественные связи с АГ. Валентность – равна числу активных (АГсвязывающих) центров АТ. Ig разных классов бывают 2-х валентными (IgG) (такие АТ известны как полные АТ), или поливалентными (IgM). Это свойство АТ выявляется при взаимодействии их с АГ: связываясь с АГ-енными детерминантами, IgG и IgM вызывают их видимую агрегацию. Мономерные же молекулы IgA, хотя и имеют два активных центра, не осаждают АГ, т.к. их активные центры настолько сближены, что IgA не может выполнять роль связующего мостика.

Наряду с двухвалентными, в организме существуют также неполные АТ. Такие АТ называют еще моновалентными или блокирующими. Эти Ig отличаются наличием на молекуле 1-ого активного специфического участка. Соединяясь с АГ, они не могут агрегировать частицы в крупные конгломераты, а лишь блокируют их. Это не значит, что второй активный центр молекулы отсутствует, он просто экранирован различными структурами, либо обладает низкой авидностью. Для выявления неполных АТ существуют специальные реакции – проба Кумбса, блокирующая проба и др.

«Нормальные» АТ (синоним – природные АТ) – АТ, появление которых не связано с иммунизацией или инфекцией. Таких АТ два рода: 1-ые направлены против определенных изоантигенов. 2-ые направлены против антигенов, не относящихся к изоантигенам.

Например, в сыворотке крови в небольших титрах обнаруживаются АТ против бактерий кишечной группы, многих кокков, некоторых чужеродных клеток. В крови человека и животных обнаруживают АТ, которые могут реагировать с различными АГ (эритроцитами, бактериями и т.д.), несмотря на то, что организм не подвергался иммунизации этими АГ. Не исключено, что часть нормальных АТ является обычными иммунными АТ, выработанными на инфекционный агент, проникший в небольшой дозе и вызвавший латентное заболевание. Возникновение нормальных АТ может быть обусловлено попаданием АГ с пищей.

Важной характеристикой АТ является специфичность. Специфичность АТ определяется по их способности отличать АГ, против которого они были получены (гомологичный АГ), от любого другого АГ.

Иммунологический перекрест – это способность АТ взаимодействовать со сходными АГ, отличными от гомологичного. В большинстве случаев перекрестнореагирующие АТ имеют к данным АГ более низкую аффинность, чем к гомологичному. Однако могут быть исключения. Это явление называется гетероклитичностью, а АТ, обладающие большим аффинитетом к гетерологичному АГ, называются гетероклитичными.

В последнее время предлагается концепция полиспецифичности, заключающаяся в том, что каждое АТ в действительности может с высокой аффинностью связываться с множеством совершенно разных АГ. Перекрестно-реагирующие или гетероспецифичные Ig – это АТ, взаимодействующие с АГ-детерминантами, общими для различных АГ.

Взаимодействие АТ с АГ носит специфический характер. Продуктами этой реакции являются иммунные агрегаты (комплексы АГ=АТ), которые могут образовывать преципитат в случае растворимого АГ, или агглютинат - в случае корпускулярного АГ.

Реакции АГ=АТ in vitro имеют большое диагностическое значение, т.к. благодаря своей специфичности они позволяют количественно и качественно обнаруживать АГ или АТ. Существующие серологические и иммунохимические методы дают возможность определять любые антигены, используя моноспецифические сыворотки. Специфичность – способность АГ или АТ реагировать только с гомологичным АТ или АГ, соответственно. Чем выше специфичность, тем меньше регистрируется ложно+ и ложно - результатов.

Чувствительность – возможность определения минимальных количеств АГ или АТ.

В серологических реакциях участвуют АТ, принадлежащие, главным образом, к Ig классов G и M.

5.1.3. Взаимодействие антитела с антигеном Реакция взаимодействия АТ с АГ имеет несколько типичных физико-химических характеристик:

А) Потребность в электролитах. Взаимодействие АТ с АГ происходит только в среде электролитов. Оптимальная концентрация электролитов соответствует 0,85% раствору NaCl, pH = 6,4-8,6, ионная сила раствора 0,05-0,1.

Б) Скорость соединения. Соединение специфических участков АГ и АТ происходит в 1-е же секунды или минуты реакции – фаза взаимодействия. Визуально наблюдаемый эффект – фаза проявления (агглютинация, преципитация, лизис) может развиваться через несколько часов (2-18-24 ч.) В) Обратимость. Комплекс АТ-АГ может диссоциировать с высвобождением (элюцией) АТ. Элюцией пользуются для получения высокоспецифических АТ против конкретного АГ или АГ-ой детерминанты.

Она происходит при увеличении pH среды до 9-10 или понижении pH до 5-3, при повышении концентрации NaCl до 15% и более, а также температуры до 60 0С.

Г) Экзотермичность. При взаимодействии АГ и АТ выделяется небольшое количество тепла.

AT обычно разделяют в соответствии с типом их реакций с АГ:

• Антитоксические AT к токсинам и анатоксинам нейтрализуют или флоккулируют АГ.

• Агглютинирующие AT агрегируют АГ. Их выявляют в реакциях с корпускулярными АГ и растворимыми АГ, сорбированными на поверхности видимых корпускулярных частиц (эритроциты, латекс).

• Преципитирующие AT образуют комплекс АГ-АТ с растворимыми АГ только в растворах или гелях.

• Лизирующие AT вызывают разрушение клетокмишеней (обычно взаимодействуя с комплементом).

• Опсонизирующие AT взаимодействуют с поверхностными структурами клеток микробов или заражённых клеток организма, способствуя поглощению их фагоцитами.

• Нейтрализующие AT инактивируют АГ (токсины, микроорганизмы), лишая их возможности проявлять патогенное действие.

AT, взаимодействуя в организме с различными АГ, предотвращают инфицирование или элиминируют возбудитель, либо блокируют развитие патологических реакций, активируя при этом все системы специфической защиты.

Реакции специфического взаимодействия АТ с АГ проявляются в виде нескольких основных феноменов:

феномен агглютинации - корпускулярные АГ-енные частицы (бактерии, эритроциты и т.д.) под влиянием АТ склеиваются между собой и оседают на дно пробирки в виде хлопьев или зерен. Склеивание микроорганизмов или эритроцитов друг с другом - проявление реакции прямой агглютинации - т.е. АТ действуют непосредственно на корпускулярные АГ-енные частицы (реакция агглютинации [РА] на стекле, объемная РА). Механизм РА соответствует теории «решетки», согласно которой агглютинат образуется при соединении одного активного центра АТ с детерминантной группой одного АГ, второго активного центра – с детерминантной группой другого АГ и т.д. Избыток или недостаток АТ или АГ задерживают агглютинацию.

Феномен преципитации – эффект укрупнения растворимых АГ-енных субстанций под влиянием АТ с появлением помутнения прозрачных растворов (явление агрегации растворенных частиц). Нерастворимый комплекс АГ=АТ выпадает только в определенном диапазоне эквивалентных концентраций реагирующих молекул. В случае избытка АТ или АГ преципитация не развивается. Это не значит, однако, что взаимодействия не произошло, просто образовался растворимый комплекс АГ=АТ. Феномен лизиса – способность некоторых АТ растворять клетки, против которых они возникли. Эти АТ применительно к бактериям называются бактериолизины, к эритроцитам – гемолизины. Реакции иммунного лизиса характеризуются тем, что они не происходят при наличии только 2-х ингредиентов: АТ и АГ. Необходимо присутствие третьего компонента – комплемента. Вначале реакция идет по типу агглютинации, затем к комплексу АГ=АТ присоединяется комплемент и происходит локальное растворение оболочки бактерий, эритроцитов или др.

клеток. Феномен цитотоксичности – АТ проявляют токсический эффект, лишая клетки жизнеспособности. Реакцию по выявлению цитотоксинов ставят с взвесью микробных клеток в солевом буферном растворе. Если к взвеси микробных клеток + иммунную сыворотку, содержащую цитотоксины + комплемент + краситель (эозин, трипановый синий), то клетки будут гибнуть и при пробе с красителем - окрасятся. Живые клетки не красятся.% погибших клеток свидетельствует о количестве цитотоксинов в сыворотке. Феномен специфической задержки - часто используется для сравнения 2-х изучаемых АГ. Например, готовят иммунную сыворотку против эритроцитов мыши. Чтобы определить содержатся ли там АТ против эритроцитов родственного вида животных (крысы), сыворотку обрабатывают эритроцитами крысы. Если уровень АТ в сыворотке снизился, то имеются родственные АГ, если совсем падает, то АГ идентичны. Феномен опсонизации (иммунный фагоцитоз) - AT (через Fabфрагменты) связываются с клеточной стенкой микроорганизма, Fc-фрагментом AT взаимодействует с соответствующим рецептором фагоцита. Это опосредует последующее эффективное поглощение фагоцитом образовавшегося комплекса, т.е. АТ усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов в отношении тех АГ-енных субстанций или микроорганизмов, против которых они получены. Активация комплемента - AT (IgM и IgG) после связывания с АГ (микроорганизм, опухолевая клетка и др.) активируют систему комплемента, что приводит к уничтожению этой клетки путём перфорации её клеточной стенки, усиления хемотаксиса и иммунного фагоцитоза. Антителозависимая цитотоксичность. Опсонизируя АГ, AT стимулируют их разрушение цитотоксическими клетками. Аппарат, обеспечивающий распознавание мишеней, - рецепторы к Fc-фрагментам AT. Разрушать опсонизированные мишени способны макрофаги и гранулоциты (например, нейтрофилы).

До тех пор, пока не была выяснена химическая природа АТ, полагали, что каждая реакция иммунной сыворотки опосредуется особым видом АТ, которые получили соответственно название агглютининов, преципитинов, опсонинов, антитоксинов и т. п. Хотя эти названия сохранились, они имеют чисто феноменологическое значение, т. е. отражают конечный результат взаимодействия АТ с АГ. В настоящее время уже ясно, что нет специальных АТ - агглютининов, преципитинов и т.д., а есть 5 классов иммуноглобулинов. Специфичность АТ, относящихся к любому классу иммуноглобулинов, определяется структурой активного центра, причем АТ данной специфичности могут относиться к разным классам. Конечный исход взаимодействия АГ с АТ зависит от природы АГ (корпускулярный - агглютинация, растворимый - преципитация); от участия системы комплемента (бактериолиз, бактерицидное действие); от того, к какому, классу иммуноглобулинов относится данное АТ; от свойств его Fc-фрагмента. Разные классы иммуноглобулинов в неодинаковой степени участвуют в различных иммунологических реакциях. Высокая нейтрализующая активность АТ, принадлежащих к IgG, свидетельствует о важной роли их в антитоксическом иммунитете. IgM особенно активны в реакциях фагоцитоза с корпускулярными АГ и поэтому играют существенную роль в антимикробном иммунитете. В реакции нейтрализации вирусов особенно активны IgA, следовательно, им принадлежит значительная роль в противовирусном иммунитете. Кроме того, секреторные IgA обусловливают местный иммунитет слизистых оболочек. Наконец, IgE опосредуют реакции гиперчувствительности немедленного типа.

На скорость образования AT влияет ряд факторов: доза АГ (сила АГ-воздействия), частота АГ-стимуляции и состояние иммунной системы индивида. Если организм впервые встречается с АГ, то развивается первичный иммунный ответ, а при повторном контакте - вторичный ответ.

Первичный ответ. Появлению AT предшествует латентный период продолжительностью 3-5 сут. В это время происходит распознавание АГ и образование клонов плазматических клеток. Затем наступает логарифмическая фаза, соответствующая поступлению AT в кровь; её продолжительность - 7-15 сут.

Постепенно титры AT достигают пика и наступает стационарная фаза продолжительностью 15-30 сут.

Её сменяет фаза снижения титров AT, длящаяся 1- мес. В основу пролиферации клеток-продуцентов AT заложен принцип селекции. В динамике антителообразования титры высокоаффинных AT постепенно нарастают: после иммунизации аффинность AT к АГ постоянно увеличивается. Первоначально образуются IgM, но постепенно их образование уменьшается и начинает преобладать синтез IgG. Так как переключение синтезов от IgM к IgG не меняет идиотипа AT (то есть его специфичности по отношению к конкретному АГ), то оно не связано с клональной селекцией. Особенности первичного ответа - низкая скорость антителообразования и появление сравнительно невысоких титров AT.

Вторичный ответ. После антигенной стимуляции часть В- и Т-лимфоцитов циркулирует в виде клеток памяти. Особенности вторичного иммунного ответа - высокая скорость антителообразования, появление максимальных титров AT и длительное (иногда многолетнее) их циркулирование. Основные характеристики вторичного ответа: образование AT индуцируется значительно меньшими дозами АГ; индуктивная фаза сокращается до 5-6 ч; среди AT доминируют IgG с большой аффинностью, пик их образования наступает раньше (3-5 сут); AT образуются в более высоких титрах и циркулируют в организме длительное время.

Благодаря своей способности специфически взаимодействовать с бактериальными клетками и продуктами их жизнедеятельности, в том числе с токсинами и ферментами, АТ играют важную роль в формировании приобретенного постинфекционного, поствакцинального и пассивного иммунитета. Эта их роль заключается в том, что, связываясь с токсинами, они нейтрализуют их действие и обеспечивают формирование антитоксического иммунитета. Связываясь с вирусами, особенно блокируя рецепторы, с помощью которых вирусы адсорбируются на клетках, АТ создают иммунитет против вирусов. Образование комплекса АТ=АГ запускает классический путь активации системы комплемента со всеми его эффекторными последствиями (лизис бактерий, опсонизация, формирование очага воспаления, стимуляция системы макрофагов).

АТ, взаимодействуя с бактериями, опсонизируют их, т.е. делают их фагоцитоз более эффективным. В результате взаимодействия АТ с растворимыми АГ, выделяющимися в кровь, образуются так называемые растворимые иммунные комплексы, с помощью которых АГ выводятся из организма, в основном желчью и мочой.

5.1.4. Иммуносерологические методы исследования Взаимодействие АГ с АТ проявляется в форме различных серологических (от лат. serum - сыворотка) реакций. В связи с их высокой чувствительностью и специфичностью они нашли широкое диагностическое применение. Серологические реакции активно используют при проведении полного объёма диагностических исследований. Они применяются с одинаковым успехом для двух целей. Во-первых, по известному антигену (диагностикуму) определяют в исследуемой сыворотке наличие и количественное содержание специфических к данному АГ антител.

Последнее устанавливают путем титрования сыворотки. Титром иммунной сыворотки считают то ее максимальное разведение, которое еще дает положительную реакцию. Увеличение титров AT - зачастую единственный дифференциально-диагностический признак, указывающий на инфекционное заболевание.

Выявление AT особенно актуально при неудачных попытках выделить возбудителя инфекции. Во-вторых, с помощью известного антитела, т.е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического АГ или осуществляют серологическую идентификацию выделенного возбудителя.

С диагностической целью используют следующие серологические реакции: реакция агглютинации в ее различных вариантах, реакция преципитации и ее различные модификации, реакции иммунофлуоресценции в прямом и непрямом вариантах, реакции с участием комплемента, реакции с участием фагоцитов, реакции иммуносорбентного анализа на твердой фазе, реакции нейтрализации биологической активности возбудителя или токсинов.

Реакция агглютинации. Реакция агглютинации (РА) [от лат. agglutinatio, склеивание] - склеивание антигеннесущих корпускулярных частиц (микроорганизмы, клетки различного происхождения, частицы латекса и др.) молекулами специфических АТ в присутствии электролитов, которое заканчивается образованием видимых невооруженным глазом хлопьев или осадка (агглютината). Характер осадка зависит от природы АГ: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевидный осадок, безжгутиковые и бескапсульные – мелкозернистый, капсульные – тяжистый. Различают агглютинацию прямую, при которой во взаимодействии со специфическими АТ непосредственно участвуют собственные АГ бактериальной или любой другой клетки; и непрямую, или пассивную, при которой бактериальные клетки, или эритроциты, или частицы латекса являются носителями не собственных, а сорбированных на них чужих АГ (или АТ) для выявления специфических к ним АТ (или АГ). В реакции агглютинации участвуют главным образом антитела, относящиеся к классам IgG и IgM. Она протекает в две фазы: вначале происходит специфическое взаимодействие активного центра АТ с детерминантой АГ, эта стадия может происходить в отсутствие электролитов и не сопровождается видимыми изменениями реагирующей системы. Для второй стадии - образования агглютината необходимо наличие электролитов, которые снижают электрический заряд комплексов АГ + АТ и ускоряют процесс их склеивания. Эта фаза заканчивается образованием агглютината.

РА ставят либо на стеклянных, либо на гладких пластиковых пластинках, либо в стерильных агглютинационных пробирках.

Реакции агглютинации (прямые и пассивные) на стекле обычно применяют в качестве ускоренного метода обнаружения специфических АТ в сыворотке больного или для серологической идентификации возбудителя.

В последнем случае обычно используют хорошо очищенные (адсорбированные) диагностические сыворотки, содержащие только монорецепторные АТ или их набор к различным антигенам. Несомненным достоинством РА на стекле является простота ее постановки и то, что она протекает несколько минут или даже секунд, так как оба компонента в ней используются в концентрированном виде. Однако она имеет лишь качественное значение и менее чувствительна, чем пробирочная. Разновидности РА для выявления AT - кровяно-капельная проба на туляремию (с нанесением диагностикума на каплю крови и появлением видимых белёсых агглютинатов) и реакция Хеддльсона на бруцеллёз (с нанесением на каплю сыворотки крови диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).

Развернутая РА в пробирках дает более точные результаты, ибо она позволяет определить количественное содержание АТ в сыворотке (установить ее титр) и при необходимости зарегистрировать факт нарастания титра антител, что имеет диагностическое значение.

Необходимо учесть, что при смешивании растворов гомологичных АГ и АТ не всегда наблюдаются видимые проявления РА. Осадок образуется только при некоторых оптимальных соотношениях обоих компонентов реакции. Вне этих пределов, при значительном избытке АГ или АТ, реакции не наблюдается. Это явление получило название «феномена прозоны». Появление прозоны в иммунных реакциях объясняется тем, что участвующие в них АГ, как правило, являются полидетерминантными, а молекулы IgG имеют два активных центра. При избытке АТ поверхность каждой частицы АГ покрывается молекулами АТ так, что не остается свободных детерминантных групп, поэтому второй, несвязанный активный центр антител не может взаимодействовать с другой антигенной частицей и связывать их друг с другом. Образование видимого агглютината или преципитата подавляется также при избытке АГ, когда не остается ни одного свободного активного центра АТ, и поэтому комплексы АГ + АТ + АГ не могут более укрупняться.

Реакции прямой гемагглютинации. Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов или гемагглютинация, применяемая, в частности, для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-Вагглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые АГ - естественные компоненты эритроцитов. Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация (рис. 19).

Рис. 19. Реакции вирусной гемагглютинации (а) Многие вирусы способны спонтанно агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, их добавление к суспензии эритроцитов вызывает образование агрегатов.

Варианты реакций агглютинации Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты. Классическая реакция агглютинации предусматривает использование корпускулярных АГ. Однако в ней могут участвовать и растворимые АГ. Чтобы это стало возможным, такие АГ адсорбируют на иммунологически инертных частицах. В качестве носителя можно использовать частицы латекса или бентонита, однако в настоящее время наиболее часто применяют эритроциты животных или человека, улучшая их адсорбирующие свойства обработкой растворами танина, формалина или бензидина. Эритроциты, адсорбировавшие на себе АГ (АТ), называются сенсибилизированными данным АГ (АТ), а иммунная реакция, в которой они участвуют, - реакцией непрямой, или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА), так как эритроциты участвуют в ней пассивно.

РПГА ставят в специальных полистироловых пластинках с луночками, имеющими полусферическое дно. В этих луночках готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (ФР) исследуемой сыворотки, и затем добавляют к ней в качестве диагностикума взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Учет результатов проводят через 2 ч инкубации при 37°С по четырехкрестной системе. При положительной реакции агглютинировавшие эритроциты оседают на дно луночки и равномерно покрывают его в виде перевернутого зонтика. При отрицательной реакции эритроциты тоже оседают, жидкость становится прозрачной, осадок выглядит как маленький диск в центре луночки. Титром сыворотки в РПГА считается последнее ее разведение, которое еще дает ярко выраженную гемагглютинацию без значительных признаков наличия диска.

Вариантами использования РПГА являются: реакция нейтрализации антигена (РНАг), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используют антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы.

Реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) контролирует специфичность РПГА. Включает три компонента: АГ (АТ), AT (АГ) и АТ (AГ), адсорбированные на эритроцитах. Первоначально АГ (АТ) реагирует с определенным количеством AT (стандартная антисыворотка) (АГ), затем в смесь вносят эритроциты, сенсибилизированные АТ (AГ). За счет уменьшения количества АГ (АТ) в исследуемом материале после связывания с АТ стандартной сыворотки (АГ), отмечается разница в титрах РПГА и РТПГА (торможение агглютинации). Учет результатов реакции аналогичен учету в РПГА.

Реакция нейтрализации антител (РНАт) - суспензию, содержащую искомыйАГ, смешивают со специфической иммунной сывороткой, содержащей известныеАТ в соответствующих объемах, и инкубируют при 37°С. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3-4 ч и окончательно - через 18-24 ч. Если в исследуемом материале имеетсяАГ, он свяжет добавленные специфические АТ (нейтрализует их), и поэтому гемагглютинации не произойдет. При положительной реакции на дне луночки формируется диск, при отрицательной – «зонтик».

По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг). Только в этом случае в исследуемом материале обнаруживаютАТ. СпецифическийАГ, добавленный к такому исследуемому материалу, будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т. е. произойдет нейтрализация антигена антителами, и поэтому гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диагностикума не произойдет. Учет результатов реакции аналогичен учету в РНАт.

Реакция коагглютинации. Является одним из вариантов пассивной реакции агглютинации на стекле.

В основу этой реакции положено уникальное свойство золотистого стафилококка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fcфрагментами IgG и IgM.

При этом активные центры АТ остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами АГ. На предметное стекло наносят каплю 2% взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими АТ, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена антителам через 30-60 секунд происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Реакция агглютинации латекса (РАЛ). Носителем иммунных реагентов в этой диагностической системе являются мелкие стандартные частицы латекса. У нас в стране используют полистироловые монодисперсные латексы с разным диаметром частиц (0.3, 0.66, 0.75, 0. мкм). РАЛ выполняют на стекле. Основным условием успешной постановки реакции является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы. Специфичность контролируют с помощью 3-х контрольных тестов: заведомо + реакция, заведомо – и контроль качества латексной суспензии по взаимодействию несенсибилизированного латекса с исследуемым материалом. РАЛ можно использовать как для экспресс-детекции микроорганизмов или их АГ в исследуемом материале, так и выявления АТ в сыворотках.

Иммуномагнитное обнаружение антигенов. Один из вариантов ускоренной реакции агглютинации на стекле связан с применением супермагнитных полимерных частиц, покрытых специфическимиАТ. Одна такая частица связывает до 107- 108 клеток микроорганизмов, благодаря чему чувствительность данного метода достигает 5 КОЕ/мл.

Реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА). Позволяет быстро обнаружить в крови больных как свободно циркулирующие АГ (антигенемия), так и циркулирующие иммунные комплексы (АТ+АГ). Для РАГА используют эритроциты, сенсибилизированные соответствующими АТ. Добавление сыворотки крови больного, в которой содержатся АГ, к сенсибилизированным эритроцитам, на которых фиксированы АТ, приводит к склеиванию (агглютинации) эритроцитов и иммунных комплексов.

Антиглобулиновая проба Кумбса (реакция р.Кумбса). При помощи реакций прямой и пассивной агглютинации определяют полные (двухвалентные) АТ. Неполные (моновалентные, блокирующие) АТ не выявляются в этих реакциях, так как, соединяясь с АГ, блокируют его, но не могут вызвать агрегации АГ в крупные конгломераты. Неполными (блокирующими) называют антитела, у которых функционирует только один активный центр; второй активный центр по неизвестной причине не срабатывает. Для выявления неполных АТ применяют специальную реакцию Кумбса, в которой используются сыворотка больного, корпускулярный антиген-диагностикум, антиглобулиновая сыворотка, содержащая АТ к используемому (человеческому) глобулину. Реакция протекает в два этапа: 1. Взаимодействие АГ с неполными АТ. Видимых проявлений при этом нет. Первый этап заканчивают отмывкой АГ от остатков сыворотки больного.

2. Взаимодействие антиглобулиновой сыворотки с неполными АТ, адсорбированными на АГ. В силу того, что антиглобулиновые АТ двухвалентны, они связывают два одновалентных АТ отдельных комплексов АГ + неполное АТ, что приводит к их склеиванию и появлению видимого осадка.

Р. Кумбса применяют, например, при серологической диагностике бруцеллеза, при анализе групп крови, в диагностике аутоиммунных заболеваний и др.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Иммуносерологические методы исследования В соответствии с решаемыми задачами иммуносерологические методы исследования применяются для серологической диагностики инфекционных болезней, идентификации неизвестной культуры микроорганизмов, выделенной от больных или из объектов внешней среды, выявления АГ в различных биологических образцах и др.