«Организация и проведение учебного процесса по подготовке специалистов в области биобезопасности и лабораторной диагностики возбудителей некоторых опасных инфекционных болезней (учебно-методическое пособие для ...»

Техника проведения анализа: Подготовка твердой фазы: в каждую лунку двух вертикальных рядов микропланшета вносят по100 мкл специфического к искомому АГ иммуноглобулина концентрацией 50 мкг/ мл в 0,05 М КББ рН 9,6, закрывают крышкой и помещают в термостат при 37°С на 2-3 ч, либо на 16-18 ч в холодильник при 4°С. Перед постановкой реакции раствор АТ из лунок сливают в дез. раствор и трижды отмывают ЗФР-тв, оставляя отмывающий раствор в лунках каждый раз на 2-3 мин. После заключительного отмывания микропланшет встряхивают для избавления от капелек отмывающей жидкости и слегка подсушивают на воздухе. Далее в сенсибилизированные антителом лунки вносят по 100 мкл 1%-ного раствора БСА для забивки возможных оставшихся свободных участков на твердой фазе, выдерживают 30 мин при 37°С, после чего планшет освобождают от раствора инертного белка и трижды промывают ЗФР-тв. Отмывающую жидкость удаляют, в каждую подготовленную лунку вносят по 100 мкл ЗФР-тв, затем в 3-ю лунку первого вертикального ряда добавляют 100 мкл исследуемого материала и титруют в объеме 100 мкл, перенося из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д. до 7 лунки второго вертикального ряда включительно, из которой 100 мкл раствора раститрованного АГ удаляют в дез. раствор. 8 лунка второго вертикального ряда – положительный контроль - заведомо известное количество положительного АГ. Первые две лунки первого вертикального ряда – отрицательный контроль - гетерологичный АГ, либо суспензия органов от здоровых животных, или иной материал, не содержащий специфический АГ. После часовой инкубации при 37°С содержимое лунок удаляют в дез.раствор и трижды отмывают ЗФР-тв, как сказано ранее. Затем во все лунки добавляют по 100 мкл рабочего разведения раствора конъюгата (специфические АТ=Фермент). Инкубируют 1 ч при 37°С, трижды отмывают ЗФР-тв. После заключительного отмывания в каждую лунку вносят по 100 мкл раствора субстрата. Реакцию проводят 15- мин при комнатной температуре, после чего в каждую лунку добавляют по 1 капле стоп-реагента. При положительном результате в лунках развивается оранжево-коричневое окрашивание. В отрицательном – раствор прозрачен.

Непрямой вариант ИФА для обнаружения АТ Техника проведения анализа: Подготовка твердой фазы: в каждую лунку двух вертикальных рядов микропланшета вносят по100 мкл раствора АГ концентрацией 50 мкг/мл в 0,05 М КББ рН 9,6, закрывают крышкой и помещают в термостат при 37°С на 2-3 ч, либо на 16-18 ч в холодильник при 4°С. Перед постановкой реакции раствор АГ из лунок удаляют в дез.

раствор и трижды отмывают ЗФР-тв, оставляя отмывающий раствор в лунках каждый раз на 2-3 мин.

После заключительного отмывания микропланшет встряхивают для избавления от капелек отмывающей жидкости и слегка подсушивают на воздухе. Далее в сенсибилизированные антигеном лунки вносят по мкл 1%-ного раствора БСА для забивки возможных оставшихся свободных участков на твердой фазе, выдерживают 30 мин при 37°С, после чего планшет освобождают от раствора инертного белка и трижды промывают ЗФР-тв. Отмывающую жидкость удаляют, в каждую подготовленную лунку вносят по 100 мкл ЗФР-тв, затем в 3-ю лунку первого вертикального ряда добавляют 100 мкл исследуемой сыворотки (разведенной заранее ЗФР-тв 1:100) и титруют в объеме 100 мкл, перенося из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д. до 7 лунки второго вертикального ряда включительно, из которой 100 мкл раствора раститрованной сыворотки удаляют в дез. раствор. 8 лунка второго вертикального ряда – положительный контроль - заведомо положительная сыворотка больного человека или животного.

Первые две лунки первого вертикального ряда – отрицательный контроль - гетерологичная сыворотка, либо сыворотка от здоровых животных или человека.

После часовой инкубации при 37°С содержимое лунок удаляют в дез.раствор и трижды отмывают ЗФРтв, как сказано ранее. Затем во все лунки добавляют по 100 мкл рабочего разведения раствора конъюгата (антивидовые АТ=Фермент). Инкубируют 1 ч при 37°С, трижды отмывают ЗФР-тв. После заключительного отмывания в каждую лунку вносят по 100 мкл раствора субстрата. Реакцию проводят 15-30 мин при комнатной температуре, после чего в каждую лунку добавляют по 1 капле стоп-реагента. При положительном результате в лунках развивается оранжево-коричневое окрашивание. В отрицательном – раствор прозрачен.

Учет и оценка результатов ИФА: Учет результатов реакции можно проводить визуально и инструментально (с помощью ИФА-ридера). Визуально реакцию учитывают по наличию соответствующего окрашивания содержимого лунок в опытных пробах и положительном контроле и отсутствию такового в отрицательных контролях. При наличии слабого окрашивания в отрицательных контрольных образцах (что иногда имеет место при технических погрешностях: некачественной отмывке лунок планшета, использовании концентрированного раствора конъюгата, загрязнении субстрата и т. д.) реакцию учитывают по разнице в окраске отрицательных контрольных и опытных проб.

Инструментальный учет результатов реакции осуществляют на ИФА - ридерах, определяя оптическую плотность продукта реакции фермент-субстрат при соответствующей длине волны. Оптическая плотность положительных образцов должна как минимум в 1,5 - 2 раза превышать таковую в контрольных пробах.

5.1.7. Серологические реакции, протекающие с участием комплемента Реакция бактериолиза. Используется для серологической диагностики холеры. Феномен бактериолиза легко удается наблюдать in vitro. Исследуемую сыворотку наносят в последовательном двукратном разведении каплями на поверхность питательной среды, на которую предварительно засевают культуру вибриона. Чашку с посевами инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч. Под влиянием имеющихся в сыворотке АТ и комплемента холерные вибрионы разрушаются (лизируются), и в местах нанесения капель образуются стерильные пятна. АТ, разрушающие вибрионы, называют вибриоцидными. Титром вибриоцидных АТ считается максимальное разведение сыворотки, при котором она еще вызывает отчетливый лизис бактерий.

Реакция иммобилизации трепонем. Применяется для диагностики сифилиса. Живые трепонемы в присутствии имеющихся в исследуемой сыворотке специфических АТ и комплемента теряют свою подвижность.

Реакция гемолиза. Литическое действие иммунной сыворотки в присутствии комплемента особенно четко проявляется в отношении эритроцитов. Если кролика иммунизировать эритроцитами другого вида животных (барана), кроличья сыворотка приобретает специфическую гемолитическую активность, т.е. способность вызывать гемолиз эритроцитов, использованных для иммунизации. Этот эффект абсолютно зависим от комплемента. Инактивация последнего путем прогревания сыворотки при 56°С приводит к утрате ею гемолитической активности. Таким образом, наличие или отсутствие активного комплемента в гемолитической сыворотке очень четко выявляется по результатам ее взаимодействия с гомологичными эритроцитами: при наличии комплемента - гемолиз, образование «лаковой крови»; при его отсутствии - гемагглютинация, эритроциты выпадают на дно пробирки, образуя осадок в виде зонтика, жидкость бесцветна.

Реакция связывания комплемента. Уникальная способность комплемента специфически связываться с различными по своей природе комплексами АГ + АТ нашла широкое применение в реакции связывания комплемента (РСК). Особое преимущество РСК состоит в том, что природа АГ, участвующего в ней (корпускулярный или растворимый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fc-фрагментом любого АТ, относящегося к IgG и IgM, независимо от его антительной специфичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свойства комплемента: 1) способность связываться с комплексом АГ + АТ; 2) лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки. РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы - опытная, или диагностическая, и индикаторная.

Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реакции прогревают при 56°С в течение мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и АГ. К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь инкубируют при 37°С в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеются АТ, произойдет их взаимодействие с добавленным АГ, и образующиеся комплексы АГ + АТ свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке АТ отсутствуют, образования комплекса АГ + АТ не произойдет, и комплемент останется свободным.

Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяснения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроциты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37°С в течение 30-60 мин., после чего оценивают результаты реакции. В случае если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются АТ, и произошло связывание комплемента комплексом АТ + АГ, лизиса эритроцитов не будет - РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов. Если же в сыворотке специфические АТ отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произойдет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе комплемент связывается с комплексом эритроциты + АТ индикаторной системы и произойдет гемолиз - в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет.

Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без АГ) и контроль АГ (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые АГ обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или АГ, подвергаются тщательному титрованию. Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам!

Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10% раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при 37°С. В основной опыт берут сыворотку, разведенную до 1/3 своего титра.

Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаружения специфических АТ. В качестве носителя АГ используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических АТ сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.

5.1.8. Реакции нейтрализации Этот тип иммунологических реакций основан на способности АТ специфически подавлять (нейтрализовать) биологическую активность возбудителя или его токсинов в различных тест-системах - организме животных, в куриных эмбрионах, культурах клеток или каким-то иным способом. Это зависит от природы возбудителя и цели исследования. Например, для оценки эффективности иммунизации против дифтерии и столбняка определяют уровни антитоксинов в сыворотке крови привитых по их способности нейтрализовать биологическое действие определенной дозы токсина (реакция Шика). Широкое применение они получили в диагностике ботулизма, в вирусологической практике как для серологической диагностики вирусных заболеваний, так и для идентификации вирусов.

С этой целью используют реакции нейтрализации роста вирусов в культуре ткани, подавления бляшкообразования, гемадсорбции, торможения гемагглютинации (РТГА) и др.

6. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

ЭНТЕРОБАКТЕРИОЗОВ

Прежде, чем приступить к работе с возбудителями особо опасных инфекций (чума, туляремия, холера, сибирская язва, бруцеллез), слушателям предлагается изучение биологических свойств представителей родовых групп семейства Enterobacteriaceae, а также современных методов обнаружения, выделения и идентификации наиболее значимых в патологии человека микроорганизмов основных родов: Escherichia, Shigella и Salmonella.

6.1. Характеристика семейства Enterobacteriaceae Название семейства Enterobacteriaceae (enteron - кишка) связано с тем, что средой обитания для большинства бактерий является кишечный тракт позвоночных животных и человека. В организме человека многие энтеробактерии находятся в состоянии микробных биоценозов толстой и тонкой кишок. При изменении условий существования они могут вызывать заболевания. Это так называемые условно-патогенные бактерии. Патогенные виды встречаются только у больных и бактерионосителей. С испражнениями людей и животных энтеробактерии попадают в окружающую среду, где могут сохраняться длительное время.

Микроорганизмы, принадлежащие к семейству энтеробактерий, многочисленны и разнообразны по биологическим свойствам. Их классификация и номенклатура многократно подвергались и подвергаются ревизии, дополнениям и изменениям.

Согласно определителю бактерий Берджи (1997 г., перевод 9-го американского издания 1994 г.), семейство Enterobacteriaceae включает в себя 31 род, среди которых Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morganella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella и другие. Основными свойствами, характеризующими семейство энтеробактерий, являются палочковидная форма (ширина длина - 1,0-6,0 мкм), наличие общего антигена Кунина, грамотрицательная окраска, расщепление глюкозы ферментацией, способность восстанавливать нитраты в нитриты (за исключением некоторых штаммов Yersinia, Erwinia), наличие каталазы (кроме S. dysenteriae серовара 1), отсутствие оксидазы и способности к спорообразованию, содержание Г+Ц в ДНК - 39-59 моль%.

Идентификация энтеробактерий по родам осуществляется на основе морфологических, физиологических и биохимических признаков, а также генетического анализа микроорганизмов. Особое место отводят ферментативным свойствам, так как именно они служат первоочередной основой для идентификации в пределах семейства (табл. 7). Эти свойства признаны наиболее стабильными. Для бактерий каждого рода характерен определенный спектр биохимических признаков, выявление которых технически не сложно и позволяет получать достаточно наглядные результаты. Разработана схема, включающая минимум наиболее значимых тестов (минимальный дифференцирующий ряд), необходимых для получения достоверных результатов идентификации энтеробактерий.

Дифференциация родовых групп Enterobacteriaceae Тест или субстрат мальный рующий Среда Кларка Реакция Примечание: + положительная реакция; (+) замедленно положительная реакция (позже 24 ч); - отрицательная реакция; х - различные результаты реакции При установлении родовой принадлежности культур используют серологические тесты с соответствующими поливалентными сыворотками. Достаточно полно изучена антигенная характеристика таких бактерий как сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, цитробактеры, отчасти протеи и клебсиеллы. Из числа известных антигенов энтеробактерий для идентификации имеют значение: липополисахаридные (О), жгутиковые (Н) и капсульные полисахаридные (К) антигены.

Дополнительным тестом для подтверждения принадлежности культур к патогенным энтеробактериям служат пробы с соответствующими поливалентными родоспецифическими бактериофагами. Для внутривидовой дифференциации бактерий используют серологические признаки, анализ плазмидного состава, отношение к бактериофагам и колицинам и некоторые другие тесты.

В последние годы в практике бактериологических лабораторий для экспрессной идентификации энтеробактерий все большее применение находят API-тесты, биохимический экспресс-анализатор «ATB identification» фирмы Bio-Merieux (Франция), тест-система BBL «Crystall» фирмы Becton Dickinson (Германия), а также идентификатор микроорганизмов Micro Tax фирмы SY-LAB (Австрия) и микробиологический анализатор Vitek-2 Compact (Bio-Merieux, Франция). В референслабораториях и научно-исследовательских учреждениях эффективно применяют методы генетических зондов и полимеразую цепную реакцию.

Одним из эффективных методов диагностики ОКИ является иммунохроматографический анализ, который доступен для исполнения у постели больного, в кабинете врача, для самодиагностики в домашних условиях. Многие зарубежные компании (Merck, Merieux) предлагают набор компонентов для экспресс-обнаружения E. coli О157, сальмонелл, кампилобактера, веротоксинов и других.

Для бактериологического исследования на энтеробактерии пригоден самый разнообразный материал.

Отбор проб из клинических образцов (испражнения, кровь, моча, желчь, дуоденальное содержимое, пунктаты органов, экссудат, спинномозговая жидкость, мокрота, слизь из зева, носа, уха, отделяемое ран, секционный материал) производится с учетом локализации, патогенеза патологического процесса и стадии заболевания. Пробы из объектов окружающей среды отбирают с учетом путей и факторов передачи инфекции, сроков сохранения этих микроорганизмов в тех или иных объектах. Взятый на исследование материал должен быть посеян в течение двух часов на питательные среды. Если это не представляется возможным, то его следует поместить в консервант (глицериновый, фосфатно-буферный, изотонический раствор хлорида натрия) в соотношении 1:3.

Посевы проб исследуемого материала производят в жидкие питательные среды и на чашки с плотными селективно-дифференциальными средами.

Жидкие накопительные среды предназначены для посева материала, содержащего разнообразную микрофлору (испражнения, гнойное отделяемое, секционный материал и т.п.). Они содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. К средам, предназначенным для выделения сальмонелл, относятся селенитовый бульон, магниевая среда, среда Мюллера или Кауфмана. Исследуемый материал вносят в эти среды в соотношении 1:5 и тщательно перемешивают. Кровь засевают в среды в соотношении 1:10. Обогатительные среды для материалов, обычно не обсемененных микроорганизмами (кровь, спинномозговая жидкость), содержат только вещества, стимулирующие рост искомых возбудителей болезни. Для сальмонелл это - среда Рапопорта, желчный бульон.

Плотные высокоселективные среды (ВСА, агар Плоскирева и др.) целесообразно применять для посева испражнений и другого материала, содержащего сопутствующую микрофлору.

Для выделения условно-патогенных энтеробактерий используют слабоселективные питательные среды (среда Эндо, эозин-метиленовый агар и др.). Оптимальным является одновременное применение тех и других сред. Посевы инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч (до 48 ч на ВСА).

Эшерихиозы - группа инфекционных заболеваний, вызываемых микроорганизмами рода Escherichia, в большинстве случаев - E. сoli.

Заболевания протекают, главным образом, в виде инфекций желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей, бактериемии и менингита новорожденных.

Кишечные инфекции обусловлены диареегенными E.

сoli пяти групп: энтеротоксигенными (ЭТКП), энтеропатогенными (ЭПКП), энтероинвазивными (ЭИКП), энтерогеморрагическими (ЭГКП) и энтероадгезивными (ЭАКП). Способность диареегенных E. сoli вызывать заболевания связана с наличием у них факторов патогенности:

• адгезии и колонизации (кодируется плазмидными генами);

• инвазии (белки наружной мембраны, кодируемые плазмидой м.м. 140 мДа);

• экзотоксинов (цитотонины, два типа цитотоксинов, синтез которых контролируется генами умеренных конвертирующих фагов - 933 J (SLT-I) и 933 W (SLT-II);

• эндотоксинов (липополисахариды).

ЭТКП вызывают холероподобную инфекцию у детей и взрослых. Это связано с наличием белковых энтеротоксинов, напоминающих по механизму действия холероген. ЭТКП принадлежат к сероварам О6, О8, О15, О20, О25, О27, О139 и др.

ЭПКП вызывают колиэнтериты преимущественно у детей первого года жизни. Адгезия патогена на эритроцитах происходит с участием белков наружной мембраны. В процессе развития инфекции бактерии разрушаются и освобождается эндотоксин - ЛПС, который вызывает развитие системной воспалительной реакции в тонком кишечнике больного. Колиэнтериты обусловлены ЭПКП преимущественно сероваров О44, О55, О119, О142 и др.

ЭИКП вызывают дизентериеподобные заболевания у детей и взрослых. Адгезия на эритроцитах происходит за счет капсулоподобной оболочки. Аналогично шигеллам они пенетрируют и размножаются в эритроцитах. Это приводит к гибели эритроцитов и образованию язв в толстом кишечнике. ЭИКП вырабатывают токсин, подобный токсину шигелл. ЭИКП относятся к сероварам О29, О124, О143, О144 и др.

ЭГКП (например, E. coli О157:Н7) являются представителями микрофлоры крупного рогатого скота, овец.

Они вызывают диарею с примесью крови и развитие гемолитико-уремического синдрома. Патогенез диареи связан с выработкой веротоксина двух типов, один из которых (VT-1) имеет структурное и антигенное сродство с токсином S. dysenteriae серовара 1, а другой (VT-2) является цитотоксином. Токсин связывается с субъединицей 60 S рибосом, блокирует синтез белка, разрушает эндотелий мелких кровеносных сосудов, вызывает поражение почек. В некоторых случаях это приводит к летальному исходу. К ЭГКП относятся бактерии сероваров О11, О145, О157.

ЭАКП (или аутоагглютинирующие E. coli) - плохо изученная группа. Идентификация ее представителей основывается на их способности к адгезии на поверхности клеток Hep-2. Роль ЭАКП в развитии инфекций желудочно-кишечного тракта до конца не выяснена.

Кроме диареи, E. coli вызывает гнойно-воспалительные заболевания различной локализации: пиелиты, циститы, холециститы, менингит новорожденных, нагноение ран и др. При выраженном иммунодефиците E. coli может вызывать сепсис.

Морфология и физиология. По морфологическим и тинкториальным свойствам E. coli напоминает другие энтеробактерии. Среди кишечных палочек встречаются подвижные и неподвижные варианты. Бактерии некоторых штаммов имеют капсулу или микрокапсулу и формируют на плотной среде колоний в S- и R-формах. E. coli - факультативный анаэроб, хорошо растет на обычных питательных средах при слабощелочном значении рН и оптимальной температуре 37С.

Кишечная палочка обладает высокой ферментативной активностью, утилизирует ацетат в качестве единственного источника углерода. Большинство штаммов ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа, что является одним из основных признаков при конструировании дифференциально-диагностических сред.

Антигены. E. coli имеет сложную антигенную структуру. Схема ее типирования основана на вариабельности соматических О-антигенов, жгутиковых Н-антигенов и капсульных (поверхностных) К-антигенов.

О-антигены имеют сходную химическую структуру и связаны с ЛПС клеточной стенки. О-антигены определяют серологическую группу эшерихий. В настоящее время описано около 170 О-серогрупп E. coli.

Эшерихии разных О-серогрупп в большинстве своем характеризуются перекрестными антигенными связями. Около 100 серогрупп кишечной палочки имеют перекрестнореагирующие антигены с шигеллами, сальмонеллами и другими энтеробактериями.

У эшерихий описано 50 Н-антигенов, которые типоспецифичны. Н-ан-тигены имеются только у жгутиковых форм бактерий и состоят преимущественно из белка флагеллина.

Эшерихии содержат около 97 К-антигенов, которые подразделены на три типа - A, B и L. Они различаются чувствительностью к нагреванию и химическим веществам. К-антигены способны маскировать О-антигены, которые можно выявить только после разрушения первых кипячением культуры.

Антигены E. coli обозначают антигенными формулами, указывающими на серогруппу, например, E. coli 026:К 60 (В6), или серовар E. coli 026:К 60 (В6) : Н2.

Патогенность эшерихий для людей связана с определенными серогруппами.

Лабораторная диагностика эшерихиозов основана на бактериологическом анализе биоматериала (испражнений, рвотных масс, желчи, мочи, дуоденального содержимого, крови и др.). Исследование проводится по стандартной схеме с целью выделения культуры, ее идентификации по морфологическим и биохимическим признакам и определения серовара возбудителя.

Для посева исследуемого материала используют селективно-дифферен-цирующие среды: Плоскирева, Левина, Эндо, Аселя-Либермана. С целью вы-деления и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli О157:Н7 материал от больных неосложненными диареями, острыми кишечными инфекциями с гемоколитом и гемолитико-уремическим синдромом засевают на питательную среду Сорбитол E.

coli О157:Н7 (агар) и в соотношении 1:5 - в среды накопления (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью). Посевы инкубируют при 37С в течение 18-20 ч. Колонии патогенных и непатогенных эшерихий не различаются и имеют на среде Эндо круглую форму, ровный край, матовую поверхность и малиново-красный цвет; на среде Левина - темно-синий цвет;

на среде Аселя-Либермана - розовую окраску при неизменности других признаков. Из 10 подозрительных колоний берут часть материала для оксидазной пробы, микроскопии и ориентировочной РА с поливалентными ОК-антисыворотками, Ig и адсорбированными О-сыворотками. При положительных результатах колонии пересевают на среду Клиглера (Олькеницкого, Ресселя) для выделения и дальнейшего изучения чистой культуры.

При просмотре посевов исследуемого материала на чашках с Сорбитол E. coli О157:Н7 агаром отбирают колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, прозрачные, бесцветные (сорбитолотрицательные колонии). Если на чашках выросли 1-2 сорбитолотрицательные колонии, то серологические реакции ставят после посева на одну из сред первичной дифференциации (Клиглера, Олькеницкого, Ресселя).

В случае роста однотипной культуры материал с 3- колоний серологически идентификацируют на стекле с О- и Н-сыворотками к антигенам E. coli О157:Н7 и не менее 5 сорбитол-отрицательных колоний пересевают на среду первичной дифференциации для последующего изучения.

Биохимическую активность выделенной культуры определяют с помощью стандартных наборов или проводят идентификацию на минимальном дифференцирующем ряду. Изучают образование индола, ставят реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра, определяют характер роста на цитратных агарах Симонса или Кристенсена, среде с малонатом, агаре с фенилаланином, средах с аминокислотами, на среде с 10% лактозы. Характерной особенностью энтерогеморрагических кишечных палочек E. coli О157:Н7, в отличие от других E. coli, является отсутствие способности продуцировать -D-глюкуронидазу (95% штаммов) и расщеплять сорбитол. По другим биохимическим свойствам штамм E. coli О157:Н7 практически не отличается от E. coli (табл. 8).

Основные биохимические свойства E. coli Реакция Фогеса-Проскауэра - Примечание:

+ положительный ответ - отрицательный ответ ± признак непостоянный (±) – признак непостоянный, реакция замедленная Кроме изучения биохимической активности, проводят определение подвижности, антигенной структуры бактерий и вирулентности выделенной культуры.

Токсигенность E. coli изучают на клетках почек мышей линии Y-1 или методом иммунопреципитации, инвазивность - на культурах клеток Hep-2, адгезивные свойства - на культурах клеток Hep-2, HeLa. Для обнаружения патогенных E. coli используются метод ДНКДНК гибридизации и полимеразная цепная редакция.

При выделении E. coli О157 или E. coli О157:Н7 определяют способность их продуцировать веротоксины (VT-1, VT-2). Для выявления веротоксинов предложен ряд методов: реакция пассивной латексной агглютинации, иммуноферментный анализ, биологическая проба на белых мышах, цитопатическая активность в отношении культуры клеток HeLa или почечных клеток Vero, полимеразная цепная реакция.

Бактерии рода Shigella являются возбудителями дизентерии, или шигеллеза, поражающей, главным образом, толстый кишечник. Дизентерия характеризуется общей интоксикацией организма и «кровавым поносом».

Дизентерия - полиэтиологическое заболевание. Род Shigella включает четыре вида: S. dysenteriae (серогруппа А), S. flexneri (серогруппа В), S. boydii (серогруппа С), S. sonnei (серогруппа D). Три первых вида подразделены на серовары, а S. flexneri - еще и на подсеровары.

Морфология и физиология. По морфологическим свойствам шигеллы мало отличаются от эшерихий, неподвижны, клетки некоторых штаммов имеют пили.

Возбудителя дизентерии - хемоорганотрофы, не требовательны к питательным средам. Температурный оптимум – 37°С. При выделении из организма больных микроб на плотных средах формирует, как правило, S-формы колоний. Шигеллы вида S. sonnei образуют два типа колоний: мелкие круглые выпуклые - S-формы (I фаза) и крупные плоские - R-формы (II фаза). Характер колоний зависит от наличия (I фаза) или отсутствия (II фаза) плазмиды м.м. 120 мДа, которая определяет также вирулентность шигелл Зонне.

Бактерии I фазы при пересевах образуют колонии обоих типов. Шигеллы разлагают углеводы с образованием кислоты, в некоторых случаях - кислоты и газа, но не ферментируют лактозу (за исключением S. sonnei).

Не образуют лизиндекарбоксилазу и аргининдигидролазу. Дифференциальные признаки рода Shigella представлены в таблице 9.

Основные биохимические свойства бактерий рода Shigella Ферментация + положительный ответ;

- негативный ответ ± признак непостоянный Антигены. Шигеллы имеют сложную антигенную структуру. В составе их клеточных стенок имеется О-, а у бактерий некоторых видов (S. flexneri) и К-антигены. О-антигены различаются по специфичности: общие для семейства Enterobacteriaceae, родовые, видовые, групповые, типоспецифические. В классификации учитываются только групповые и типоспецифические О-ан-тигены. В соответствии с этим род Shigella подразделяется на 4 подгруппы и включает 44 серотипа.

В подгруппу А (вид S. dysenteriae) включены шигеллы, не ферментирующие маннит. Вид включает 12 серотипов (1-12).

К подгруппе В (вид S. flexneri) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит, содержащие типоспецифические антигены (I-VI), по которым подразделяются на серотипы (1-6). Кроме того, они содержат групповые антигены, по которым серотипы подразделяются на подсеротипы. Этот вид включает два антигенных варианта - X и Y. Серотип S.

flexneri 6 не имеет подсеротипов, но его разделяют на 3 биохимических типа по особенности ферментации глюкозы, маннита и дульцита (биотипы Бойд 88, Манчестер, Ньюкасл).

К подгруппе С (вид S. boydii) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит. Вид включает 18 серотипов (1-18), каждый из которых имеет свой главный типовой антиген.

В подгруппу Д (вид S. sonnei) входят шигеллы, обычно ферментирующие маннит и способные медленно (через 24 ч и позже) разлагать лактозу и сахарозу. Вид S. sonnei включает один серотип, однако колонии I и II фаз обладают своими типоспецифическими антигенами. Для внутривидовой классификации шигелл Зонне предложено два метода: а) деление их на 14 биохимических типов и подтипов по способности ферментировать мальтозу, рамнозу и ксилозу; б) деление на фаготипы по чувствительности к набору соответствующих фагов.

Эти способы типирования имеют, главным образом, эпидемиологическое значение.

Серологическая идентификация шигелл Исследование антигенной структуры культуры начинают с ОРА на стекле со смесью № 1, в которую входят адсорбированные поливалентные сыворотки к S. flexneri 1-5, S. sonnei, S. flexneri 6. При положительной РА со смесью № 1 выделенную культуру агглютинируют отдельно каждой моносывороткой. Положительная реакция агглютинации с адсорбированной сывороткой к S. sonnei дает право дать ответ. Для установления серотипа и подсеротипа S. flexneri необходимо дополнительно поставить РА с серотипоспецифическими (к антигенам I, II, III, IV, V, VI), а затем с групповыми (3, 4, 6, 7, 8) сыворотками.

При отсутствии агглютинации со смесью № 1 ставят реакцию агглютинации с другими адсорбированными поливалентными сыворотками, при этом учитывают отношение изучаемой культуры к манниту. Так, культуры, не расщепляющие маннит, исследуют с адсорбированными поливалентными сыворотками к S. dysenteriae; расщепляющие маннит – с адсорбированными поливалентными сыворотками к S. boydii.

При наличии агглютинации выделенную культуру исследуют серотипоспецифическими сыворотками, обращая внимание на индолообразование. S. boydii сероваров 5, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17 и S. dysenteriae 2, 7, 8 сероваров способны образовать индол, у бактерий остальных серотипов это свойство отсутствует.

Схема определения биоваров S. sonnei Биовар Примечание:

+ ферментация (в скобках указанные сроки ферментации в днях);

- отсутствие ферментации Лабораторная диагностика. Основным материалом для бактериологического исследования на дизентерию служат испражнения больного, которые засевают на дифференциально-диагностические среды (Плоскирева, Левина и др.) с последующим выделением чистой культуры и ее идентификацией на средах пестрого ряда и по антигенным свойствам для определения вида и серовара. Посевы просматривают через 18-20 ч после первичного высева. На средах Плоскирева и Эндо шигеллы формируют бесцветные (не ферментируют лактозу) прозрачные или полупрозрачные круглые выпуклые с ровным краем (S-формы) колонии диаметром 1-4 мм. Для S. sonnei характерно наличие колоний в R-форме (с зазубренным краем). При микроскопии выявляют грамотрицательные короткие палочки. Подозрительные колонии пересевают в пробирки со средами Ресселя, Клиглера или Олькеницкого. С каждой чашки снимают не менее трех колоний.

При проведении массовых обследований лактозонегативные бесцветные колонии, выросшие на любой из используемых сред, исследуют в ориентировочной реакции агглютинации со смесью видовых дизентерийных сывороток.

На 3-й день учитывают изменения в комбинированных средах, проводят серологическую идентификацию. Отбирают культуры, не ферментирующие лактозу и мочевину, но разлагающие глюкозу, и засевают их на полужидкие среды Гисса с маннитом, мальтозой, лактозой, сахарозой, 1%-ную пептонную воду с индикаторными бумажками на индол и сероводород и в пробирку с 0,3%-ным питательным агаром для изучения подвижности. При необходимости проводят другие биохимические тесты. Ставят пробу с поливалентным дизентерийным бактериофагом и ориентировочную реакцию агглютинации с адсорбированными дизентерийными сыворотками. Если выделенная культура, обладающая биохимическими признаками шигелл, не реагирует с сыворотками, то ее следует прокипятить в течение 30 мин, т.к. многие шигеллы (особенно серогрупп А и С) обладают термолабильными антигенами, ингибирующими взаимодействие антител с О-антигенами. При необходимости определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

На 4-й день исследования учитывают результаты посевов предыдущего дня.

Кроме проведения бактериологического анализа на дизентерию, для обнаружения антигенов возбудителя в крови, моче и испражнениях могут быть использованы следующие серологические реакции: РПГА, РСК, реакция коагглютинации, а также ИФА и ПЦР. Эти методы высокоэффективны, специфичны, пригодны для ранней диагностики.

Для серологической диагностики используют РПГА с соответствующими эритроцитарными диагностикумами, НМФА, реакцию Кумбса. Диагностическое значение имеет также аллергическая проба.

Род Salmonella получил название в честь американского микробиолога Сальмона (Salmon). Заболевания, вызываемые сальмонеллами, развиваются преимущественно в результате употребления инфицированных пищи и воды. Природный резервуар большинства возбудителей - человек и различные животные, в том числе пресмыкающиеся, земноводные, рыбы и птицы.

Сальмонеллы вызывают брюшной тиф, паратифы, гастроэнтероколиты, септицемию. Бактерии некоторых видов являются возбудителями внутрибольничного сальмонеллеза.

В настоящее время род Salmonella включает два вида:

S. salamae и S. choleraesuis, два одноименных подвида, из которых первый содержит около двух тысяч сероваров, а второй - четыре серовара: S. typhi, S. paratyphi A, S. gallinarum, S. pullorum.

Морфология и физиология. Сальмонеллы - мелкие грамотрицательные палочки, окруженные микрокапсулой, подвижны за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Температурный оптимум для их роста - 35-37 С. Оптимум рН - 7,2-7,4. На питательных средах большинство сальмонелл образует мелкие (2-4 мм) прозрачные голубоватые S-формы колоний. На агаре Эндо они розоватые, прозрачные;

на агаре Плоскирева - бесцветные и выглядят более плотными и мутноватыми; на висмут-сульфитном агаре - черные с металлическим блеском, окружены черным гало (S. paratyphi A, S. cho-leraesuis, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum образуют светлые зеленоватые колонии), среда под колониями также окрашена в черный цвет. Следует помнить, что компоненты висмут-сульфитного агара ингибируют рост возбудителя брюшного тифа. Сальмонеллы могут формировать также переходные и шероховатые тусклые и сухие R-колонии с неровными краями.

Сальмонеллы отличаются от E. coli меньшей ферментативной активностью. При ферментации глюкозы и ряда других углеводов образуют кислоту и газ (за исключением S. typhi и некоторых других серотипов), обладают лизин- и орнитиндекарбоксилазами, не имеют фенилаланиндезаминазы, растут на голодном агаре с цитратом (кроме S. typhi), не ферментируют лактозу (кроме S. arizonae, S. diarizonae), не образуют индола, не имеют уреазы, дают отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра.

Антигены. Сальмонеллы содержат О- (соматические), Н- (жгутиковые) и некоторые - К- (капсульный) антигены. Н-антигены могут существовать в двух разных фазах: специфической 1-й фазе и менее специфической, или групповой, 2-й фазе. Анализ антигенного строения является обязательным элементом микробиологической диагностики сальмонеллезов и проводится по схеме Ф. Кауфмана и П. Уайта, в основу которой положена общность О-антигена сальмонелл, объединенных в серологические группы: A, B, C, D, E, F и т.д. Всего известно около 65 серогрупп, в которых О-антигены обозначены цифрами. В сокращенном варианте эта схема представлена в таблице 11.

Классификация сальмонелл по антигенной структуре Серогруппа, вид или серовар О-антиген К факторам вирулентности S. typhi относится Viантиген, представляющий собой капсульный полисахарид, защищающий микроб от фагоцитоза и комплемента. У подавляющего большинства других сальмонелл Vi-антиген отсутствует.

Определение сероварианта сальмонелл (серологическая идентификация) по схеме Кауфмана-Уайта Выделенную культуру исследуют в ориентировочной реакции агглютинации на стекле с сальмонеллезной поливалентной сывороткой ABCDE. При положительном результате переходят к расшифровке сероварианта.

Определение антигенной структуры начинают с выявления О-антигена. На крышку от чашки Петри наносят пастеровскими пипетками капли сывороток, содержащих антитела против основных соматических антигенов 2, 4, 6, 9 групп А, В, С, D, соответственно.

Если с одной из сывороток наступит агглютинация (например, 0-4), дальнейшее определение вида осуществляют сыворотками против жгутиковых антигенов (Н) в специфической фазе в пределах установленной группы (0-4 группы В). Для агглютинации О-сы-вороткой следует брать верхнюю часть выросшей культуры на скошенном агаре, а для агглютинации Н-сыворотками – из конденсата или из самой нижней части роста. После установления принадлежности культуры к тому или иному виду определяют полную структуру О-антигенов и Н-антигена и таким образом устанавливают антигенную формулу (серовар) выделенной культуры. При отсутствии реакции агглютинации с поливалентной адсорбированной О-сывороткой к сальмонеллам групп ABCDE культуру испытывают с поливалентной сывороткой, включающей антитела к антигенам сальмонелл редких групп.

Лабораторная диагностика. Основу лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых сальмонеллами, выявления носительства, изучения обсемененности объектов окружающей среды, инфицированности пищевых продуктов составляет бактериологическое исследование материала по стандартной схеме.

При проведении лабораторной диагностики тифопаратифозных заболеваний учитывают патогенетические особенности этих инфекций, связанные с локализацией возбудителя в лимфоидной ткани внутренних органов, крови, желчи и выделением его с испражнениями и мочой. В первые дни заболевания выделяют гемокультуру путем посева крови в соотношении 1:10 в жидкие питательные среды, например, желчную среду Рапопорт. Накопительные среды с желчью являются элективными для возбудителей тифо-паратифозных заболеваний. Другие бактерии на них не растут или рост их замедлен.

Желчь препятствует свертыванию крови, нейтрализует нормальные антитела сыворотки, разрушает комплемент и тем самым снижает бактерицидные свойства крови при сохранении ее питательных свойств, а также препятствует действию бактериофага. Результаты посевов крови на среде Рапопорт учитывают через 18-24 ч, изучают характер роста.

При брюшном тифе среда Рапопорт окрашивается в красный цвет вследствие ферментации глюкозы, при паратифах А и В дополнительно выявляют газообразование. При отсутствии роста на среде Рапопорт посевы продолжают инкубировать и просматривают через 48, 72 ч, на 5-е и 10-е сутки. При наличии роста, после проверки на однородность выросшей культуры микроскопией окрашенного по Граму мазка, делают высев на дифференциально-диагностические среды. На 2-ой неделе заболевания выделяют копро- или уринокультуру после посева фекалий и мочи на обогатительные и дифференциально-диагностические среды. Выделенную культуру идентифицируют по биохимическим и антигенным свойствам. Из крови часто высевается брюшнотифозная культура, содержащая Vi-антиген, которая не агглютинируется О-сывороткой, т.к. Vi-антиген препятствует такой агглютинации. Если выделенный штамм не агглютинируется или агглютинируется не до диагностического (менее ) титра, ставят реакцию агглютинации на стекле с Vi-сы-вороткой. Все культуры S. typhi фаготипируют с помощью набора Vi-фагов. Определяют чувствительность патогена к антибактериальным препаратам.

Для диагностики гастроэнтероколитов, возникающих в результате пищевых токсикоинфекций, для анализа отбирают испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, мочу, дуоденальное содержимое, секционный материал. Дополнительными объектами исследования являются остатки пищи, употреблявшейся заболевшими, исходные продукты и полуфабрикаты, корма животного и растительного происхождения, смывы с различного оборудования и предметов, предполагаемых в качестве фактора передачи возбудителя.

Окончательный диагноз пищевой токсикоинфекции устанавливают только после выделения возбудителя из организма больных людей и пищевых продуктов, его идентификации с установлением вида и серовара или биовара. Определение серовара проводят с помощью монорецепторных сывороток. Наиболее часто при токсикоинфекциях выявляют серовары S. typhimurium, S. enteritidis, S. anatum.

Возбудителем внутрибольничного сальмонеллеза чаще всего является S. typhimurium, которая может встречаться в виде трех биоваров, одинаковых по антигенной структуре, но различающихся по патогенности для белых мышей при энтеральном заражении и по чувствительности к антибиотикам. Однако нередки заболевания, вызываемые S. derby, S. heidelberg, S.

wien, S. haifa и др., которые относятся к группе В. Эти сальмонеллы по своим морфологическим, физиологическим и антигенным признакам не отличаются от возбудителей пищевых токсикоинфекций.

Как правило, сальмонеллы, выделяемые при внутрибольничной инфекции, резистентны к 15-20 антибиотикам. Это связано с наличием у них конъюгативных R-плазмид, несущих множественную устойчивость к антибиотикам. Лабораторная диагностика внутрибольничных сальмонеллезов осуществляется по общепринятой схеме.

Серологические исследования. Серологическую диагностику брюшного тифа и паратифов, выявление и дифференциацию различных форм носительства проводят постановкой реакции агглютинации Видаля с О- и Н-диагностикумами. Основное диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. Н-антитела появляются позже О-антител и сохраняются после болезни или прививки более длительное время. Положительная реакция Видаля только с Н-диагностикумом указывает либо на ранее перенесенное заболевание (анамнестическая реакция) либо появляется в результате вакцинации (прививочная реакция).

Диагностический титр с О-антигеном - 1:200. Большое значение для диагностики имеет нарастание титров в течение болезни.

Постановка реакции Видаля Реакцию ставят с О-монодиагностикумом и Н-тифозными, Н-паратифа А и Н-паратифа В. На каждый диагностикум готовят ряд разведений испытуемой сыворотки. Контроль сыворотки – один для всех диагностикумов (таб.12).

Ингредиенты Сыворотка больного Конечное разведение РНГА чувствительна и специфична с эритроцитарными О- и Vi-диагностикумами. Диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. антитела к Vi-антигену невысоки. Vi-антитела после полного выздоровления быстро исчезают, но при наличии брюшнотифозного носительства они присутствуют постоянно. В связи с этим РНГА с эритроцитарным Viдиагно-стикумом применяется для выявления бактерионосительства.

Эффективным способом экспресс-диагностики сальмонеллезных и некоторых других болезней являются экспресс-тесты. Определение патогенных микроорганизмов с помощью Singlepath-тестов производства фирмы Merck (Германия) основано на методе визуальной иммунохроматографии (разновидность иммуноферментного анализа).

Singlepath-тест Salmonella представляет собой диагностическую панель с лункой для добавления обогащенного образца, тестовой (Т) и контрольной (С) зонами. Антигены определяемых в образце бактерий взаимодействуют с меченными золотом антителами, включенными в состав теста, с образованием окрашенного комплекса антиген-антитело. Окрашенный комплекс связывается с иммобилизованными антителами с образованием линий в тестовом и контрольном окнах.

Схема выявления сальмонелл из образцов продуктов:

1. Неселективное обогащение на забуференной пептонной во-де (25 г образца + 225мл BPW) при 37°С в течение 18-24 ч.

2. Селективное обогащение на среде RVS - RappaportVassiliadis (магниевая среда). 0,1 мл культуральной жидкости добавляют к 9,9 мл RVS среды. Инкубируют при 41°С 18-24 ч.

3. Инактивация. 2 мл культуральной жидкости прогревают на водяной бане при 100°С в течение 15 мин.

4. Singlepath-тест. В лунку диагностической панели вносят 160 мкл инактивированной культуральной жидкости. Результаты учитывают визуально в тестовой и контрольной зонах через 20 мин.

5. Подтверждение. Высев положительных результатов на дифференциально-диагностические среды РАМБАХ-агар, XLD-агар или висмут-сульфитный агар.

Преимущества метода:

• Экспрессность. Результат через 20 мин.

• Надежность. Высокая чувствительность и специфичность метода (99%). Ясный и четкий положительный или отрицательный результат. Встроенный положительный контроль.

• Легко использовать. Нет необходимости в ходе исследования добавлять какие-либо реагенты. Все компоненты включены в одну тест-пластинку. Отсутствуют сложные этапы в исследовании. Одноэтапный формат теста исключает возможные ошибки.

• Удобный. Необходимо добавить образец и учесть результат.

• Экономичный. Сокращает время исследования, снижает трудозатраты, уменьшает количество пересевов.

• Нет необходимости приобретать и обслуживать дорогостоящее оборудование.

Singlepath-тест одобрен Федеральным Центром Госсанэпиднадзора РФ (МР №24ФЦ/976) и разрешен к применению в лабораториях санитарно-эпидемиологической службы, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в производственных лабораториях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morga-nella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella) • Изучение морфологии роста на скошенном агаре.

• Изучение морфологии микробов в мазках, окрашенных по Граму.

• Постановка пробы Gregersen с 3% КОН.

• Посев полученной культуры на среду Клиглера, в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА, среды Эндо, Плоскирева, ЭМС, ВСА.

Примечания:

- при посеве на пластинчатые среды получить рост изолированных колоний;

- здесь и в дальнейшем посевы инкубировать 18-24 ч при 37°С;

- посевы в среду Кларка и полужидкий агар дублировать и инкубировать при 37 и 22°С.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morga-nella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella) • Изучение морфологии колоний на дифференциально-диагностических средах.

• Изучение морфологии роста культуры в бульоне.

• Подготовка мазков из бульонной и агаровой культур, окрашивание их по Граму.

• Учет результатов роста культуры на среде Клиглера и в средах минимального дифференцирующего ряда.

• При необходимости проведение предварительной серологической диагностики испытуемой культуры.

• Предварительное заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.

Примечание: при отрицательном результате реакции Фогеса-Проскауэра посевы на среде Кларка инкубировать еще 18-24 ч.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morga-nella, Proteus, Yersinia, Edwardsiella).

• Изучение морфологии 2-суточного роста культур на висмут-сульфитном агаре.

• Учет результатов роста в средах минимального дифференцирующего ряда через 48 ч.

• Постановка реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра.

• Заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.

Бактериологический диагноз эшерихиозов • Исследование испражнений больного. Посев нативного материала.

• Посев испражнения больного на 2 чашки со средой Эндо или ЭМС.

Бактериологический диагноз эшерихиозов • Исследование испражнений больного. Выделение чистой культуры.

• Просмотр первичных посевов на дифференциальных средах Эндо (ЭМС).

• Отбор различных по морфологии колонии, постановка ОРА с частью колонии с ОКА-эшерихиозной поливалентной сывороткой.

• Посев на среду Клиглера и скошенный МПА колоний (не менее трех), давших положительную ОРА.

Бактериологический диагноз эшерихиозов • Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

• Просмотр посевов на среде Клиглера, на скошенном МПА; выбор для дальнейшей работы посева с подозрительным ростом на E. coli.

• Проверка чистоты роста мазком с окраской по Граму.

• Постановка ОРА с ОКА-эшерихиозной поливалентной сывороткой, с ОКВ-, ОКС-, ОКД-, ОКЕ-эшерихиозными поливалентными сыворотками.

• Посев культуры, давшей положительную РА, в среды минимального дифференцирующего ряда, скошенный МПА.

• Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

Примечание: серологическую идентификацию культуры проводить со скошенного МПА.

Бактериологический диагноз эшерихиозов • Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

• Учет результатов роста в средах минимального дифференцирующего ряда.

• Проведение серологической идентификации выделенной культуры с О-эшерихиозными групповыми и факторными сыворотками и с Н-эшерихиозными сыворотками.

• Постановка РА с ОК-эшерихиозными иммуноглобулинами.

• Учет результата определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Бактериологический диагноз эшерихиозов • Исследование испражнений больного. Окончание исследования.

• Учет РА с ОК-эширихиозными иммуноглобулинами.

• Заключение по исследованию испражнений больного.

• Заполнение паспорта на выделенную культуту.

Бактериологический диагноз шигеллезов • Исследование испражнений больного. Посев нативного материала.

• Посев испражнения больного на чашку со средой Эндо (или ЭМС) и чашку со средой Плоскирева, чтобы получить рост изолированных колоний.

Бактериологический диагноз шигеллезов • Исследование испражнений больного. Выделение чистой культуры.

• Просмотр первичных посевов на дифференциальнодиагностических средах Эндо (ЭМС) и Плоскирева.

• Отбор 3-5 подозрительных колоний, их посев на среду Клиглера и скошенный МПА.

Бактериологический диагноз шигеллезов • Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

• Просмотр роста на среде Клиглера, скошенном МПА.

• Отбор посевов с подозрительным ростом на возбудителя дизентерии.

• Проверка чистоты роста мазком с окраской по Граму.

• Проведение ориентировочной серологической диагностики выделенной культуры.

• Посев изучаемой культуры в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА, при подозрении на возбудителя дизентерии S.

Sonnei - в среды Гисса с рамнозой, ксилозой и мальтозой.

• Постановка пробы с поливалентным дизентерийным бактериофагом.

• Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

Примечание:

- посевы инкубируют 18-24 ч.

Бактериологический диагноз шигеллезов • Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

• Учет результата роста культур в средах минимального дифференцирующего ряда.

• Определение биовара выделенной культуры для S.

sonnei.

• Учет пробы с поливалентным бактериофагом.

• Учет чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

• Проведение серологической идентификации выделенной культуры.

• Заключение по исследованию испражнений больного.

• Заполнение паспорта на выделенную культуру.

Бактериологический диагноз сальмонеллеза • Исследование испражнений больного. Посев нативного материала.

• Посев испражнения больного на чашку со средой Плоскирева и чашку ВСА.

• Посев испражнения больного в среду обогащения (магниевую).

• Исследование крови больного. Посев нативного материала.

• Посев крови больного в среду Рапопорт.

Бактериологический диагноз сальмонеллеза • Исследование испражнений больного. Выделение чистой культуры.

• Высев со среды обогащения на чашку ВСА.

• Просмотр первичных посевов на дифференциальных средах Плоскирева и ВСА (первые сутки).

• Посев подозрительных на сальмонеллы колоний на среду Клиглера и скошенный МПА.

• Исследование крови больного. Высев со среды накопления.

• Изучение роста в среде Рапопорт.

• Приготовление мазка с окраской по Граму.

• Приготовление раздавленной капли для изучения подвижности.

• Высев со среды Рапопорт на одну из дифференциальных сред: Плоскирева, Эндо или ЭМС и скошенный МПА.

• Серологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний и бактерионосительства.

• Постановка реакции Видаля с сывороткой крови больного.

• Постановка РПГА с сывороткой крови предполагаемого бактерионосителя и эритроцитарным Viдиагностикумом.

Бактериологический диагноз сальмонеллеза • Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

• Просмотр посевов на среде Клиглера, скошенном МПА, ВСА (вторые сутки).

• Отбор посевов с подозрительным ростом на сальмонеллы.

• Проверка культуры на чистоту роста мазком с окраской по Граму.

• Постановка ОРА с поливалентной сальмонеллезной сывороткой ABCDE.

• Посев изучаемой культуры в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА.

• Постановка пробы с сальмонеллезным бактериофагом.

• Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

• Просмотр посевов со среды обогащения на ВСА (первые сутки).

• Исследование крови больного. Выделение чистой культуры и идентификация выделенной культуры.

• Просмотр посевов на среде Плоскирева, ЭМС (высев со среды Рапопорт).

• Посев подозрительных на сальмонеллы колоний на среду Клиглера, скошенный МПА.

• Проверка культуры на чистоту роста на скошенном агаре мазком с окраской по Граму.

• Постановка ОРА с поливалентной сальмонеллезной сывороткой ABCDE.

• Посев изучаемой культуры в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА.

• Постановка пробы с сальмонеллезным бактериофагом.

• Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

• Серологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний и бактерионосительства.

• Учет реакции Видаля с сывороткой больного, выдача результатов исследования.

• Учет РПГА с сывороткой крови брюшнотифозного бактерионосителя и эритроцитарным Vi-диагностикумом, выдача результатов исследования.

Бактериологический диагноз сальмонеллеза • Исследование испражнений и крови больного.

Окончание исследования.

• Учет результатов роста культур в средах минимального дифференцирующего ряда, на скошенном МПА.

• Учет пробы с сальмонеллезным бактериофагом.

• Серологическая идентификация выделенной культуры по схеме Кауфмана-Уайта.

• Учет чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

• Заключение, выдача результата исследования испражнений больного.

• Заполнение паспорта на выделенные культуры.

Занятие 17 (демонстрационное).

Определение генотипа, ассоциированного с патогенностью salmonella sp., методом полимеразной В качестве одной из стабильных и перспективных мишеней в ДНК сальмонелл при использовании молекулярно-диагностических методов экспресс-диагностики (ПЦР и ДНК-зондирование) и анализа потенциальной патогенности штаммов выбран и используется фрагмент гена инвазивности inv, расположенный в пределах «острова патогенности» SP-I на хромосоме бактерий Salmonellae sp. Наличие данного гена (или всего «острова патогенности») у тестируемого штамма свидетельствует о наличии у него инвазивных свойств и потенциальной патогенности.

• Приготовление суспензии 107 КОЕ/мл в дистиллированной Н2О из «чистой» культуры анализируемых штаммов сальмонелл.

• Проведение термоинактивации и экстракции тотальной ДНК сальмонелл путем прогревания суспензии микробов при 100 оС в течение 15 мин.

• Приготовление 1,4% агарозного геля и трисборатного буфера для гель-электрофореза.

• Осуществление программирования амплификатора «Терцик» для ПЦР-детекции гена инвазивности (inv) сальмонелл.

• Подготовка реакционной смеси для постановки ПЦР и осуществление амплификации проб на термоциклере.

• Выполнение гель-электрофореза ампликонов и учет результатов ПЦР.

• Предварительное заключение о патогенности изучаемой культуры.

ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников для внесения всех компонентов амплификационной смеси. Устанавливают в штатив и маркируют пробирки для амплификации по числу исследуемых проб и две дополнительные пробирки (положительный и отрицательный контроли).

На одну пробу объемом 25 мкл готовят амплификационную смесь следующего состава:

1. 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

2. 1 мкл 2,5 мМ раствора дНТФ;

4. Дистиллированная вода до - 20 мкл;

5. 5-10 пкм каждого праймера (по 1 мкл);

6. 0,2 мкл Таq-ДНК-полимеразы.

Приготавливают общую амплификационную смесь на все число проб и две пробы (положительный и отрицательный контроли). Перемешивают полученную смесь пипетированием и вносят в амплификационные пробирки по 20 мкл в каждую. Исследуемые образцы тотальной ДНК сальмонелл в количестве 5 мкл вносят в амплификационные смеси с помощью отдельных наконечников для каждого образца, после чего смесь перемешивают пипетированием и наслаивают 40- мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В качестве положительного контроля применяют 2 мкл образца ДНК, экстрагированной методом кипячения из суспензии клеток штаммов S. typhimurium 4244 или другого вирулентного тестштамма сальмонелл, с концентрацией 1··107 КОЕ. В качестве от рицательного контроля используют 5 мкл дистиллированной воды. Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей температурновременной программой:

«горячий» старт – 94°С - 3 мин, затем 35 циклов: денатурация при температуре 94°С - 1 мин, «отжиг» 50°С мин, элонгация цепи при 72°С - 1 мин; завершающий этап при 72°С - 5 мин.

После амплификации препараты смешать с 3 мкл лидирующего красителя - бромфенолового синего. Для проведения электрофореза используется заранее приготовленный 1,4% агарозный гель. Гель-электрофорез проводится в трис-боратной буферной системе в течение 30 мин при напряжении 10 v/см. Визуализацию продуктов ПЦР осуществляют окрашиванием геля в течение 10 мин бромистым этидием в кoнцентрации 0,5 мкг/мл и видеорегистрацией результатов электрофореза цифровой камерой при помощи УФ-трансиллюминатора с длиной волны 260-300 нм.

В положительных образцах должна наблюдаться интенсивно окрашенная полоса ампликонов ДНК, соответствующая размеру 240 п.н.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диско-диффузионным методом При тестировании микроорганизмов семейства Enterobac-teriaceae рекомендуется использовать отдельные наборы антибактериальных препаратов (АБП) для определения чувствительности возбудителей:

• внекишечных инфекций (кроме инфекций мочевыводящих путей);

• кишечных инфекций (Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp.);

• внебольничных инфекций мочевыводящих путей.

Готовят взвесь 18-20-часовой культуры в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащей примерно 1,5108 КОЕ/мл. Инокулят в объеме 1 мл наносят на поверхность агаровой среды и равномерно распределяют путем покачивания чашки. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают 10-15 мин. Стандартные диски с антибиотиками накладывают с помощью пинцета на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку следует помещать не более 6 дисков. Инкубация 18-20 ч при 37С, при 35С - если использованы диски с цефалоспоринами и их комбинациями с клавулановой кислотой.

Результаты учитывают, измеряя диаметр зон задержки роста с точностью до 1 мм.

Интерпретация результатов оценки антибиотикочувствительности заключается в отнесении исследуемого микроорганизма к одной из трех категорий: резистентный (Р), промежуточный (П) и чувствительный (Ч) согласно таблице 13.

Критерии интерпретации результатов определения Enterobacteriaceae: пограничные значения диаметров зон подавления роста (мм) и МПК (мг/л) АБП Антибактери- ние альные препараты в диске

БЕТА-ЛАКТАМЫ

Ампициллин/ сульбактам Амоксициллин/ клавуланат Цефуроксим аксетил

АМИНОГЛИКОЗИДЫ

ХИНОЛОНЫ

Налидиксовая кислота Ципрофлоксацин

ТЕТРАЦИКЛИНЫ

ДРУГИЕ ПРЕПАРАТЫ

Нитрофурантоин Примечание.* Для определения МПК фосфомицина необходимо использовать метод серийных разделений в агаре. При определении чувствительности к этому антибиотику как методом серийных разведений в агаре, так и ДДМ, в питательную среду необходимо вносить 25 мг/л глюкозо-6-фос-фата.

7. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ

7.1. Биологические свойства холерных вибрионов Холера – особо опасная инфекционная болезнь, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, водным, пищевым и контактно-бытовым путями распространения инфекции.

Холерные вибрионы относятся к сем. Vibrionaceae, роду Vibrio, виду Vibrio cholerae, который включает как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные к эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие в воде вибрионы, безопасные для человека или обусловливающие спорадические случаи диарей и инфекций с внекишечной локализацией возбудителя.

Холерные вибрионы грамотрицательные, аспорогенные полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки, варьирующие в размерах (0,2-0,6 мкм в ширину и 1,5-3,0 мкм в длину), с одним полярно расположенным жгутиком, благодаря которому очень подвижны.

Холерные вибрионы хорошо растут на щелочных питательных средах pH 7,6-8,6, содержащих до 2% NaCl.

Оптимальная температура выращивания - 35-38 C. На щелочных жидких питательных средах - мясо-пептонном бульоне (МПБ) и 1% пептонной воде (ПВ) - через 6-8 ч инкубирования при 37 C наблюдается образование нежной пленки на поверхности и легкое помутнение среды. На пластинках щелочного мясо-петонного агара (МПА) холерные вибрионы в типичной S-форме через 18-24 ч выращивания образуют гладкие, прозрачные, влажные с ровным краем колонии, диаметром 2-3 мм. Могут встречаться атипичные колонии – шероховатые, мутные, пигментированные (коричневые или желтые), коккоподобные. На элективной среде TCBS на зеленом фоне среды колонии вибрионов круглые, гладкие с ровным краем, плоские, желтого цвета. При более длительной инкубации желтый цвет колоний часто переходит в зеленый цвет.

Холерные вибрионы, как и другие представители рода Vibrio, продуцируют индофенолоксидазу, ферментируют до кислоты без газа глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, декарбоксилируют лизин и орнитин, не обладают дигидролазой аргинина. Холерные вибрионы относятся к 1 ферментативной группе по Хейбергу: расщепляют до кислоты сахарозу и маннозу и не разлагают арабинозу. Отношение к лактозе непостоянное. Вибрионы разжижают желатину, казеин, фибрин; вырабатывают лецитиназу, липазу, нейраминидазу, хитиназу, пенициллиназу.

V.cholerae по наличию специфического O-антигена распределяются на серологические группы, их более 200. Возбудителями холеры являются холерные вибрионы O1 и O139 серологических групп. Холерные вибрионы других не O1/не O139 серологических групп могут вызывать спорадические или групповые случаи диарей, не склонные к эпидемическому распространению.

Холерные вибрионы, относящиеся к О1 серогруппе делятся на три серовара - Огава, Инаба, Гикошима.

Принадлежность культур к V. cholerae О1 серогруппе устанавливают по результам агглютинации видоспецифической холерной сывороткой О1. Вариантоспецифические холерные сыворотки Огава и Инаба позволяют определить соответственно серовар культуры.

Холерные вибрионы, реагирующие в одинаковых титрах с сыворотками обоих вариантов – Инаба и Огава, относятся к серовару Гикошима. Типичные штаммы холерных вибрионов в S-форме агглютинируются видо- и вариантоспецифической сывороткой не меньше, чем до 1/2 титра. Культуры в R-форме взаимодействуют с холерной RO-сывороткой, при этом агглютинация с видоспецифической холерной сывороткой О серогруппы снижена или отсутствует совсем.

Холерные вибрионы в пределах O1 серогруппы делятся на два биовара: классический и эльтор, имеющие существенные фенотипические и генетические отличия.

При выделении атипичных культур проводят дополнительные исследования. Штаммы, агглютинирующиеся диагностическими сыворотками О1, RО, Инаба (Огава) ниже 1/2 титра или агглютинирующиеся только RО сывороткой, с полной или частичной утратой способности лизироваться диагностическими холерными бактериофагами, изучают в тестах, определяющих их принадлежность к роду Vibrio (табл. 14).

Слабоагглютинирующиеся холерной О1 сывороткой и фагорезистентные культуры исследуют также в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), флюоресцентно-серологическим методом (МФА), реакцией иммобилизации вибрионов (РИВ) или адсорбцией по Кастеллани. Культуру, агглютинирующуюся сывороткой О139, относят к холерным вибрионам О139 серогруппы.

Если культура не агглютинируется холерными сыворотками О1, О139, но по совокупности признаков относится к виду холерных вибрионов, ее изучают в реакции агглютинации с набором диагностических холерных сывороток О2-О83 серогрупп по отечественной классификации. Кроме того, штаммы V. cholerae не О1/О139 серогрупп типируют бактериофагами диагностическими холерными ТЭПВ 1-7. Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1 группы относятся преимущественно к О2, О5, О6, О8, О9, О14, О17, О22, О24, О28, О34, О36, О41, О42, О47, О5О серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

Основные дифференциальные признаки рода Vibrio и некоторых других микроорганизмов Окраска по Граму, Грамотрицательные полиморфные прямые или слегка Рост на средах без NaCl Чувствительность к 0- 129 1) О/Ф глюкозы в среде Хью-Лейфсона Орнитиндекарбокси лаза Ферментация:

лактозы Образование:

ацетилметилкарбинола Примечания: 1) – бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-диизопропил-птериоидин;

Х - нет данных;

+ - положительный результат в 90%;

– - отрицательный результат в 90%;

+/– - положительный и отрицательный результаты встречаются в равной степени;

+(–) или –(+) - в скобках редко наблюдается результат.

Основными признаками дифференциации биоваров холерных вибрионов являются проба с холерными диагностическими фагами классическим и эльтор, реакция агглютинации с эритроцитами цыпленка или морской свинки, тест на чувствительность к 50 ед/мл полимиксина и образование ацетилметилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра (табл. 15).

Дифференциальные признаки биоваров V. cholerae О Признаки Лизабельность холерными фагами:

классический Чувствительность к 50 ед полимиксина Образование ацетилметилкарбинола – +(–) Условные обозначения см. в таблице 14.

Холерные вибрионы являются носителями умеренных фагов с низкой литической активностью. Известны фаги, активные в отношении холерных вибрионов O1 и не O1, включая O139 серологическую группу, а также с более узким спектром литического действия, в пределах отдельных групп штаммов, например ctx+ и ctx холерных вибрионов.

Одним из основных факторов вирулентности (и эпидемической значимости) холерных вибрионов, определяющих тяжесть клинической картины при холере, является холерный энтеротоксин, синтез которого контролируется кластером генов ctxAB.

Понятие эпидемической значимости базируется на определении комплекса показателей:

- прямые - выявление гена холерного токсина в ПЦР и определение активности его продукции на кроликах-сосунках;

- косвенные - отсутствие гемолитической, липазной активности, поздняя ферментация маннита, высокая адгезивная активность in vitro (на модели эритроцитов).

Холерные вибрионы имеют две хромосомы: большую размером 2 960 т.п.н. и малую размером т.п.н.. На большой хромосоме V. cholerae расположены гены патогенности: ctxAB, кодирующий биосинтез CT, гены, определяющие продукцию дополнительных холерных токсинов, гены tcpA-F, кодирующие продукцию TCP, а также гены, необходимые для репликации, транскрипции, репарации ДНК, биосинтеза клеточной стенки и O-антигена. Биосинтез O1 антигена определяет кластер генов, обозначенный как wbe. Продукция O139 антигена кодируется кластером генов, также локализованном на большой хромосоме и имеющим обозначение wbf. Выявление с помощью ПЦР генов wbe и wbf, специфичных для холерных вибрионов O и O139 серологических групп, позволяет определить серогруппу возбудителя холеры. На малой хромосоме, помимо генов с неустановленной функцией, локализованы структурные гены hlyA, отвечающие за синтез термолабильного гемолизина, а также остров интегронов, содержащий гены, кодирующие антибиотикоустойчивость, и участвующий в приобретении новых генов. Следует отметить, что ген hlyA присутствует в хромосоме всех штаммов V. cholerae, как способных к биосинтезу термолабильного гемолизина, так и не продуцирующих этот белок. Однако в гене hlyA холерных вибрионов классического биовара, в отличие от такового V. cholerae эльтор, имеется делеция протяженностью 11 п.н., вследствие чего продукция гемолизина вибрионами этого биовара невозможна.

Штаммы холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, содержащие гены ctxAB и tcpA-F, вызывают холеру и являются эпидзначимыми. Эти штаммы не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Эпидемически не значимые штаммы холерных вибрионов, не содержащие генов ctxAB и tcpA-F, лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина) ctxAB варианты холерных вибрионов O1, также как и других серогрупп могут вызывать спорадические (единичные) или групповые (при общем источнике инфицирования) заболевания, не склонные к эпидемическому распространению.

Чувствительным и специфичным методом детекции ctxAB-оперона является генодиагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод применяют при исследовании выделенной культуры, проб воды, испражнений больных холерой людей или сред накопления.

Наличие гена холерного токсина (ctxAB), независимо от его экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих холерных вибрионов О и О139 серогрупп; кроме того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка TOX T, передающего сигналы запуска синтеза холерного токсина (CT), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные вибрионы О1 черезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.

Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы вызывают гибель в течение первых двух суток с типичным «синдромом холерогенности» кроликов-сосунков, зараженных 1х105 и 1x107 м.к. Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина, не вызывают гибели животных и изменений в кишечнике или обуславливают накопление в кишечнике выживших или павших животных мутной, коричневато-желтой жидкости, т.е. развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Обязательной проверке на модели кроликов-сосунков в отсутствии возможности определения гена холерного токсина подлежат следующие штаммы V. cholerae О1 и О139 серогрупп:

а) выделенные от людей:

• гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы;

• гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;

• гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы, атипичные по серологическим свойствам и устойчивые к фагу эльтор и ctx+;

б) выделенные из объектов окружающей среды:

• гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, выделенные при отсутствии эпидемических осложнений по холере.

Для полной характеристики штаммов изучают чувствительность к антибиотикам (табл. 16).

Пограничные значения диаметров зон ингибиции роста (мм) и величин МПК (мкг/мл) антибиотиков в отношении Enterobacteriaceae Беталактамы Минимальная заражающая доза для мышей, м.к.

Примечание: н/д – нет данных, +(–) – признак характерен для большинства выделенных штаммов.

Липополисахарид туляремийного микроба является основным иммунодоминантным антигеном и мишенью специфического антительного ответа макроорганизма на возбудитель. На выявлении специфических туляремийных антител против эпитопов ЛПС основана серологическая диагностика туляремии у человека и животных. Структура и антигенная специфичность ЛПС бактерий F. tularensis трёх основных подвидов (кроме F. tularensis subsp. novicida) идентична. В отличие от классических эндотоксинов, препараты ЛПС возбудителя туляремии характеризуются биологической инертностью – они являются слабыми индукторами цитокинов и не токсичны для лабораторных животных. Экзотоксин у бактерий туляремии не обнаружен. Для человека высокопатогенен подвид tularensis, подвиды holarctica и mediasiatica умеренно патогенны.

Геном туляремийного микроба представлен хромосомой, размер которой около 1830 т.п.н. У большинства представителей семейства Francisellaceae не обнаружены собственные фаги и плазмиды. Исключение составляет только F.

tularensis subsp. novicida, у которой выявлена мелкая криптическая плазмида pFN. Для обнаружения ДНК возбудителя туляремии в исследуемом материале используется молекулярно-генетический метод – полимеразная цепная реакция (ПЦР). В основе ПЦР – выявление в геноме возбудителя нуклеотидных последовательностей, детерминирующих факторы патогенности F. tularensis. Причина высокой патогенности туляремийного микроба до конца не определена. Из числа возможных факторов вирулентности рассматриваются: липополисахарид (ЛПС), белок размером 23 kD, ферменты биосинтеза пуринов, пептидогликанов, Clp-протеаза теплового шока, белки патогенности Pdp, регуляторные белки MglA и MglB. Все они имеют значение для персистенции патогена в макрофагах – важного этапа в развитии инфекционного процесса.

Однако наиболее специфичными из изученных генов являются fopA, отвечающий за синтез наружной мембраны и igl ABCD оперон, кодирующий синтез белка размером 23 kD. Они имеют высокую степень сходства у всех подвидов туляремийного микроба и на их основе осуществляется синтез туляремийных родоспецифичных праймеров для ПЦР.

Генетическую вариабельность подвидов и отдельных штаммов туляремийного микроба связывают с наличием областей дифференциации RD, с вариабельными тандемными повторами (VNTR) и полиморфизмом единичных нуклеотидов (SNP). VNTR- и SNP-типирование F. tularensis позволяет проводить межподвидовую и межштаммовую дифференциацию, устанавливать географическое происхождение возбудителя.

Возбудитель туляремии обладает выраженными аллергизирующими свойствами. Аллергенное действие характерно как для живых, так и убитых бактерий туляремии – различной степени вирулентности. На этом свойстве F. tularensis основан аллергический метод диагностики туляремии у человека. Туляремийный микроб патогенен для многих видов животных и человека. Из лабораторных животных высокую чувствительность к туляремии проявляют белые мыши и морские свинки. При подкожном заражении инфицированным материалом белые мыши в среднем погибают на 3–4 сутки, и при вскрытии у них обнаруживают:

резкую гиперемию и отечность сосудов подкожной клетчатки; воспалительный инфильтрат в месте введения материала; увеличение, гиперемию и уплотнение регионарных лимфатических узлов, печени, селезенки; гиперемию стенок кишечника.

Морские свинки при подкожном заражении инфицированным материалом погибают на 6–9 сутки. Патологоанатомические изменения в органах морской свинки при гибели от туляремийной инфекции хорошо выражены. При вскрытии у них обнаруживают: гиперемию и отек сосудов подкожной клетчатки, воспалительный инфильтрат с геморрагиями и участками некроза в месте введения материала; резкое увеличение, гиперемию и уплотнение регионарных лимфатических узлов, печени, селезенки. На поверхности и в глубине ткани селезенки, печени хорошо заметны некротические узелки сероватого цвета («саговая селезенка»). В брюшной полости накапливается серозно-геморрагический экссудат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Приготовление питательных сред для выращивания Среда Мак-Коя Свежие куриные яйца тщательно моют щеткой с мылом в теплой воде, обтирают спиртом и быстро обжигают в пламене горелки. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка. Желток помещают в стерильный градуированный сосуд и смешивают с физиологическим раствором (рН 7,0–7,2) в соотношении: 60% желтка и 40% физиологического раствора. Полученную смесь разливают стерильной пипеткой по 5 мл в стерильные бактериологические пробирки и свертывают в аппарате Коха в наклонном положении при 80°С в течение ч.

Правильно приготовленная желточная среда должна иметь конденсационную жидкость.

Для проверки стерильности среды ее помещают на сутки в термостат при 37°С. Готовая среда хранится в холодильнике при 4°С и используется в течение месяца с момента приготовления.

Среда Анциферова Среду Анциферова готовят на основе сухого питательного агара Иркутского научно-исследовательского противочумного института с добавлением 5% желточной смеси.

К 100 мл стерильного расплавленного и остуженного до 45°С агара добавляют 5 мл смеси куриного желтка с физиологическим раствором (рН 7,0–7,2) в соотношении 3:2. Желточную смесь готовят как на среду МакКоя. Среду разливают по 5 мл в стерильные пробирки и скашивают в наклонном положении.

Готовую среду помещают в термостат при 37°С на сутки для контроля на стерильность, после чего используют для посевов.

Изучение биологических свойств туляремийного микроба • Изучение характера роста культуры на средах МакКоя и Анциферова.

• Изучение морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму и обработанных туляремийной люминесцирующей сывороткой.

• Окрашивание мазков-отпечатков из органов животных по Романовскому-Гимза и их просмотр:

• Постановка ориентировочной реакции агглютинации (ОРА) с туляремийной диагностической сывороткой 1:10.

• Постановка развёрнутой РА с туляремийной диагностической сывороткой 1:50.

• Посев изучаемой культуры в пробирку каждой среды: Мак-Коя, Анциферова, скошенного МПА, скошенного агара с глицерином, на среду с цитруллином.

Определение чувствительности выделенной культуры к эритромицину Для определения чувствительности выделенной культуры к эритромицину готовят суспензию культуры в концентрации 109 м.к./мл по оптическому стандарту мутности. 0,3–0,5 мл суспензии равномерно распределяют покачиванием по поверхности среды Анциферова и подсушивают. В центр чашки накладывают диск с эритромицином, содержащий 15 мкг антибиотика. Результат учитывают через 2 суток инкубирования при 37°С.

Культура, чувствительная к эритромицину (I биовар) дает выраженную зону задержки роста вокруг диска.

Культура, резистентная к эритромицину (II биовар), равномерно растет по всей поверхности чашки.

• Изучение характера роста культуры на средах МакКоя и Анциферова.

• Проверка чистоты роста культуры мазком, окрашенным • Учет отсутствия роста изучаемой культуры на МПА.

• Учет ферментации глицерина.

• Определение цитруллинуреидазной активности.

• Учет чувствительности изучаемой культуры к эритромицину.

• Учет и внесение результатов изучения биологических свойств туляремийного микроба в таблицу 18.

Биологические свойства туляремийного микроба Вид возбудителя Примечание: учет результатов изучения биологических свой-ств туляремийного микроба провести через 48 ч. инкубации.

8.2. Лабораторная диагностика туляремии Лабораторная диагностика туляремии осуществляется в соответствии с методическими указаниями «Эпидемиологический надзор за туляремией» МУ 3.1.2007– 05 и основана на комплексном подходе, направленном на выявление как живых бактерий, так и специфических агентов или специфичнеских антител против туляремийного микроба. Однако эффективность диагностики во многом зависит от правильности сбора и доставки исследуемого материала.

При проведении лабораторной диагностики исследуют:

– от больных людей: содержимое бубона, материал из зева, коньюнктивы глаза, отделяемое язвы, мокроту, кровь и сыворотку крови;

– от умерших людей: увеличенные лимфатические узлы, измененные участки легких и селезенки;

– при эпизоотологическом обследовании: диких млекопитаю-щих или их трупов, подснежные гнезда грызунов, продукты жизнедеятельности млекопитающих, погадки птиц, помет хищных млекопитающих, а также солому, мякину, талую воду и другие объекты, загрязненные выделениями грызунов, воду из естественных водоемов и колодцев, гидробионтов, членистоногих (преимущественно иксодовых клещей), мелких эктопаразитов, собранных с млекопитаюих (вшей, гамазовых и краснотелковых клещей, блох). При трансмиссивных вспышках исследуют кровососущих двукрылых (комаров, слепней и др.).

Серологические исследования сывороток крови домашних животных проводят при соответствующих эпизоотологических и эпидемиологических показаниях.

При исследовании на туляремию в лабораторию поступает патологический материал от больных или переболевших людей, домашних животных, погадки хищных птиц, кровососущие членистоногие (клещи, блохи, вши, комары, слепни и т.д.), объекты окружающей среды (вода, пищевые продукты, зерно, фураж и т.д.).

Лабораторная диагностика туляремии базируется на серологических (МФА, ИФА, реакция агглютинации, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации антител), молекулярно-генетических (ПЦР), бактериологических (бак бактериоскопия, посевы на питательные среды), биологических (заражение биопробных животных) и аллергических методах исследования.

Лабораторная диагностика туляремии у людей базируется, главным образом, на сероаллергических методах. Из аллергических методов используют накожную и внутрикожную пробу с тулярином, реакцию лейкоцитолиза. Из серологических реакций ставят реакцию агглютинацию (РА), микрореакцию агглютинации с цветным туляремийным диагностикумом, реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), кровяно-капельную реакцию. Бактериологические методы не всегда эффективны, что определяется особенностями течения инфекции у человека, малой обсемененностью органов и тканей возбудителем. Выделение возбудителя наиболее вероятно в течение первых 2–3 недель от начала заболевания и реже в более поздние сроки. В эти же сроки с материалом от больного человека ставят ПЦР.

Домашних животных на туляремию исследуют иммунологическими методами.

При эпизоотологическом обследовании территорий, существенную роль играют серологические методы исследования, позволяющие с меньшими трудозатратами и в короткий срок дать заключение об эпизоотическом состоянии территории. В последние годы находит применение высокочувствительный метод ПЦР, позволяющий по обнаружению специфической ДНК судить о наличии возбудителя туляремии в пробе и выявлять «некультивируемые» формы микроорганизма. В практике эпизоотологического исследования на туляремию основное место принадлежит бактериологическим методам, обеспечивающим выявление и выделение возбудителя. Отловленных с одной территории животных вскрывают, группируют по 5– особей и включают в одну биологическую пробу. При групповом анализе мазки и посевы от каждого зверька не делают. Для серологического исследования от грызунов, отловленных живыми, берут кровь из сердца на обнаружение антител к туляремийному микробу.

Животных, у которых на вскрытии обнаружены характерные для туляремии патологоанатомические изменения, исследуют индивидуально. Просматривают окрашенные по Романовскому-Гимза и обработанные люминесцентной сыво сывороткой мазки-отпечатки из органов. Производят посевы органов на плотные питательные среды. Забирают материал для серологического исследования на обнаружение туляремийного антигена (РНГА, РНАт реакция кольцепреципитации) и на обнаружениие специфической ДНК (ПЦР). Ставят индивидуальную биопробу.

Животных, погибших в природе, исследуют индивидуально. Органы трупа, если они не подверглись сильному разложению, засевают на плотные питательные среды с антибиотиками, готовят мазки-отпечатки и заражают биопробных животных. Параллельно ставят серологические реакции на обнаружение туляремийного антигена, ПЦР на обнаружение специфической ДНК. Если на исследование поступает труп грызуна, с выраженными процессами гниения, посевы на питательные среды не делают, а ограничиваются накожным или подкожным заражением белых мышей. В некоторых случаях от трупа исследуют только костный или головной мозг. Павших биопробных животных немедленно вскрывают. Выживших – хлороформируют (белых мышей на 15 сутки, морских свинок на сутки) и делают посев селезенки на свернутую желточную среду.

Кроме грызунов, биологическим методом исследуют добытых в природе и снятых с грызунов кровососущих членистоногих и других беспозвоночных животных. Иксодовых клещей объединяют до 50 экземпляров в одну биологическую пробу. Гамазовых клещей, блох, вшей сортируют по родам, видам и группируют в отдельные пробы. Комаров объединяют до 100, мошек до 250, слепней по 25–50 экземпляров на одну биопробу.

Объекты окружающей среды также исследуют биологическим методом. Непосредственный посев материала на питательные среды не эффективен в виду его незначительной обсемененности возбудителем и загрязнением посторонней микрофлорой, подавляющей рост микроба туляремии. В этом случае можно использовать высокоселективные среды с антибиотиками. Идентификацию возбудителя туляремии проводят на основании следующих признаков:

• морфологии и окраски микроба в мазках;

• специфического свечения в МФА;

• характера роста на плотных питательных средах;

• отсутствия роста на простых питательных средах (МПА, МПБ);

• РА со специфической туляремийной сывороткой;

• выявление родоспецифичной ДНК в ПЦР;

• патогенности для лабораторных животных (белые мыши, морские свинки).

Культура должна иметь характерный для микроба туляремии рост на плотных питательных средах (МакКоя, Анциферова, FT–агаре и др.), не расти на простых питательных средах (кроме F. tularensis subsp. novicida), агглютинироваться диагностической туляремийной сывороткой до титра или до 1/2 титра, вызывать гибель биопробных животных. Выделенные штаммы желательно типировать до подвида и дифференцировать на биологические варианты.

К серологическим методам диагностики туляремии относятся:

- реакции, направленные на выявление антител к туляремийному микробу (кровяно-капельная, РА, РНГА, РТНГА и др.);

- реакции, направленные на выявление антигенов туляремийного микроба (РНАт, кольцепреципитации, МФА, РА, РНГА, РТНГА и др.).

Серологические реакции используют для обследования и выявления природных очагов туляремии, для диагностики туляремии у людей. С целью рекогносцировочного обследования значительных территорий используют реакции, направленные на выявление антигенов туляремийного микроба в исследуемом материале.

Серологически исследуют материал, который не содержит живых туляремийных бактерий и непригоден для бактериологического исследования: от диких позвоночных животных, погадки хищных птиц, помет хищных млекопитающих, субстраты гнёзд грызунов, почву и т. д.

На антитела к туляремийному микробу исследуют сыворотки грызунов, добытых при эпизоотологическом обследовании территории, сельскохозяйственных животных, больных или переболевших туляремией людей.

К аллергическим методам относится:

- реакции in vivo – внутрикожная и накожная туляриновые пробы;

- реакции in vitro – лейкоцитолиза, показатель повреждения нейтрофилов (ППН), бласттрансформации и др.

Экспрессные и ускоренные методы поиска антигена (РА, РHГА, РТHГА, реакции кольцепреципитации, МФА, ИФА) в исследуемом материале или антител к нему (РНАт, РА, РНГА, РТНГА, кровяно-капельная реакция, МФА, ИФА), а также обнаружение специфической ДНК возбудителя (ПЦР) позволяют получить результат в течение 2–5 ч.

При использовании экспрессных и ускоренных методов диагностики получают лишь предварительный результат, который должен быть подтвержден выделением чистой культуры возбудителя туляремии.

Современные методы исследования позволяют быстро и в определенной степени надежно поставить диагноз туляремии у человека и осуществить выявление возбудителя при обследовании территорий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

• Вскрытие трупа грызуна: