«Организация и проведение учебного процесса по подготовке специалистов в области биобезопасности и лабораторной диагностики возбудителей некоторых опасных инфекционных болезней (учебно-методическое пособие для ...»

При серодиагностике инфекционных заболеваний с целью обнаружения специфических АТ исследуют сыворотку больного. Для получения сыворотки кровь у больного берут из вены при соблюдении правил асептики в количестве 3-10 мл в стерильную пробирку с этикеткой, на которой указаны фамилия больного, дата, предполагаемый диагноз и направляют в лабораторию. Кровь оставляют на 1 ч при комнатной температуре или помещают в термостат при 37°С на 30 мин.

Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой или бактериологической петлей, пробирку помещают в холодильник для лучшего отделения сыворотки, которую затем отсасывают пипеткой, снабженной резиновым баллоном. При наличии форменных элементов крови сыворотку центрифугируют (500хg, 10 мин). Для удобства хранения и транспортировки кровь можно наносить на фильтровальную бумагу около 2 см диаметром, высушивать на воздухе и направлять в лабораторию. Перед исследованием пропитанную кровью бумагу мелко нарезают, помещают в пробирку и заливают 1 мл физиологического раствора. Пробирку ставят на 1-2 ч в термостат или оставляют на 5-6 ч при комнатной температуре для экстракции AT. При необходимости длительного хранения сыворотку можно также консервировать (добавлением борной кислоты, мертиолата натрия, азида натрия, хинозола и т. д.), заморозить и хранить при низкой температуре (-20-70°С) или лиофилизировать.

Для постановки серологических реакций в исследуемую сыворотку добавляют мертиолат натрия 1:10000, разводят ФР 1:10 и прогревают на водяной бане при 56°С в течение 30 мин для инактивации комплемента и стабилизации иммуноглобулинов. Допускается инактивация сывороток при 60°С в течение 5 мин.

В качестве АГ при исследовании сывороток используют стандартные диагностикумы в виде взвеси микробов или их водных или спиртовых экстрактов.

Стандартные диагностикумы различных видов микроорганизмов выпускаются предприятиями-изготовителями в ампулах с этикетками и инструкциями по их применению. В некоторых случаях в качестве АГ используют живую культуру микроорганизмов.

При идентификации исследуемой бактериальной культуры, определении ее серовара, изучении АГ, используют специфические диагностические сыворотки, полученные в производственных или экспериментальных условиях путем гипериммунизации животных (чаще кроликов или лошадей) соответствующим АГ. В качестве АГ для иммунизации применяют взвесь живых или убитых микробов, лизаты и экстракты клеток и тканей, растворимые АГ, эритроциты и т. д. У иммунных сывороток определяют титр, т. е. то наибольшее разведение, при котором реакция АГ+АТ еще учитывается. Полученную сыворотку разливают в ампулы, указывают на этикетке наименование и титр. В большинстве случаев сыворотку высушивают и перед употреблением растворяют, как указано на этикетке.

Сыворотка может быть специфичной в пределах рода, вида, варианта (типа) и ее специфичность обусловлена тем, что она реагирует только с гомологичными АГ и не реагирует с гетерологичными. Неадсорбированные сыворотки обладают высоким титром, который достигает в РА 1:12800 и выше. Эти сыворотки не свободны от AT к микробам, имеющим общие АГ в пределах группы, рода и семейства, в результате чего способны давать групповые реакции. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью, но обладают низкими титрами-1:40- 1:320. Адсорбированные сыворотки не подлежат разведению и в основном применяются в реакции агглютинации на стекле.

При установлении родовой, видовой принадлежности микроба и определении его серовара серологическим методом имеет значение концентрация микробной взвеси, которую определяют по отраслевому стандартному образцу (ОСО) мутности. ОСО выпускаются Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича в виде набора, к которому прилагается шрифтовая таблица и пробирки, соответствующие пробиркам эталона. ОСО на ед соответствует: 0,93·109 клеток/мл микробов кишечной группы; 11·109 клеток/мл микробов коклюшной группы; 1,7·109 клеток/мл бруцелл; 2,2·109 клеток/мл холерных вибрионов; 5·109 клеток/мл туляремийного микроба. Для приготовления микробной взвеси используют 18-48-часовые культуры испытуемых штаммов, выращенные на плотной питательной среде. В стандартных пробирках готовят взвесь микробов, для чего в 3-5 мл ФР эмульгируют порциями культуру, сравнивая со стандартом мутности. Сравнение производят визуально в лучах падающего света на фоне шрифтовой таблицы.

Кроме того, для приготовления бактериальной суспензии определенной концентрации можно использовать стандарт мутности по Мак-Фарланду. При этом количественная характеристика исследуемой микробной взвеси определяется путем сравнения с ближайшими по мутности пробирками тем же способом, что и при использовании ОСО.

Агглютинационные методы Реакция агглютинации (РА) (Синонимы: классическая, развернутая, линейная, объемная, пробирочная). Применяется для ускоренной идентификации микроорганизмов, а также для серодиагностики некоторых инфекционных заболеваний.

Пробирочная РА. На салфетку, смоченную дез. раствором, ставят штатив с рядом пробирок, количество которых зависит от титра сыворотки. Работу начинают с приготовления основного разведения сыворотки, которое, в зависимости от цели исследования, может составлять 1:10, 1:25, 1:50, 1:100 (табл. 1).

Приготовление основного разведения сыворотки Ингредиенты, мл Физиологический раствор Затем сыворотку титруют двукратно в объеме 0,5 мл (табл.2).

Схема постановки пробирочной реакции агглютинации Ингредиенты, мл 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 AT AГ Физиологический раствор (ФР) В ряд пробирок, начиная со второй, вносят по 0,5 мл ФР. В первую и вторую пробирку вливают по 0,5 мл основного разведения сыворотки и, начиная со второй пробирки после тщательного перемешивания сыворотки с ФР, переносят 0,5 мл в третью пробирку, из третьей в четвертую и т. д. Из последней пробирки 0, мл сыворотки удаляют в дез. раствор для сохранения одинакового объема. В пробирку с контролем сыворотки вносят 0,5 мл ФР и 0,5 мл основного разведения сыворотки. В полученные разведения сыворотки добавляют по 0,5 мл АГ (диагностикума или взвеси микробов), взятого в концентрации 1·109 м.к./мл. В пробирку с контролем АГ вносят 0,5 мл ФР и 0,5 мл АГ.

В результате добавления АГ во всех пробирках объем жидкости равен 1 мл. Соответственно и разведение сыворотки в пробирках увеличивается в два раза.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2-4 ч (в отдельных случаях на 18-20 ч), затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Пробирочная РА с высушенной кровью. Участок фильтровальной бумаги, пропитанный двумя каплями крови, нарезают, переносят в пробирку с 1 мл ФР, выдерживают при 37°С в течение 2 ч или 5-6 ч при комнатной температуре. Прозрачный раствор служит материалом для исследования. Две капли крови, нанесенной на бумагу, равняются 0,1 мл крови и соответственно 0,05 мл сыворотки в ней. Следовательно, основное разведение исследуемой сыворотки в 1 мл ФР будет 1:20. Из полученного разведения готовят последующие разведения сыворотки. В остальном исследование проводится, как при пробирочной РА.

Учет и оценка результатов реакции: предварительный визуальный учет производят через 2-4 ч и окончательный (с использованием агглютиноскопа), спустя 18-24 ч. Пробирки просматривают до встряхивания в проходящем свете, обращая внимание на форму и величину осадка и на просветление надосадочной жидкости. Затем пробирку осторожно встряхивают, наблюдая за распределением осадка, появлением хлопьев и степенью помутнения жидкости. При положительной РА осадок покрывает все дно пробирки в виде зонтика. Надосадочная жидкость прозрачная. Осадок может состоять из легко разбивающихся хлопьев (Н-агтлютинация), из плотных мелких зерен (О-агглютинация) или из хлопьев и зерен (ОНагтлютинация). В контроле сыворотки и контроле АГ не должно быть никаких хлопьев. Степень положительной РА оценивают по 4-крестовой системе: 4+ полная агглютинация (100%) - осадок в виде перевернутого зонтика, выстилающий все дно пробирки; при встряхивании распадается на крупные зерна и хлопья;

надосадочная жидкость прозрачная; 3+ выраженная агглютинация (75%) - осадок выстилает 3/4 дна пробирки; при встряхивании распадается на крупные и средней величины зерна и хлопья; надосадочная жидкость прозрачная, слегка опалесцирует; 2+ средняя агглютинация (50%) - осадок занимает 1/2 площади дна пробирки; при встряхиваний распадается на средней и мелкой величины зерна и хлопья; надосадочная жидкость опалесцирующая, слегка мутная; 1+ слабая (сомнительная) агглютинация (25%) - осадок небольшой в центре дна пробирки; надосадочная жидкость мутная;

- отрицательная РА - осадок очень маленький в центре дна пробирки, при встряхивании поднимается в виде змейки, равномерно распределяется в жидкости; надосадочная жидкость до и после встряхивания мутная.

При серологической идентификации микроорганизма РА должна быть положительной (не менее трех плюсов) с соответствующей диагностической сывороткой до ее титра или, по крайней мере, до 1/2 - 1/4 титра.

Определение диагностического титра исследуемой сыворотки больного носит весьма условный ориентировочный характер. Существенное значение имеет нарастание уровня AT в динамике заболевания, для чего исследуют парные сыворотки, полученные в начале и в конце первой недели заболевания.

Пластинчатая РА: образование крупнодисперсных частиц агглютината в результате специфического взаимодействия корпускулярного микробного АГ с AT иммунной сыворотки на плоской поверхности (предметные стекла, фотопластинки, чашки Петри).

Пластинчатая РА по чувствительности уступает пробирочной. В этой реакции используют адсорбированные или неадсорбированные сыворотки в разведениях 1:10, 1:25; 1:50;. 1:100. Пластинчатая РА применяется для ускоренной ориентировочной сероидентификации микробов, для окончательной сероидентификации энтеробактерий, ускоренной серодиагностики некоторых инфекционных заболеваний, например, бруцеллеза (РА Хеддельсона) и др.

Техника постановки реакции. На обезжиренное предметное стекло, а при работе с возбудителями особо опасных и высококонтагиозных заболеваний - в чашку Петри вносят каплю ЗФР (для контроля АГ) и такое же количество сыворотки, взятой в небольшом разведении (1:10, 1:25, 1:50 или 1:100) в зависимости от ее титра. Адсорбированная сыворотка используется без разведения. Изучаемую культуру эмульгируют бактериологической петлей в капле ЗФР. Затем микробную массу эмульгируют в капле сыворотки. Для реакции можно использовать микробную суспензию, приливая ее по 1-2 капли в опыт и контроль АГ. В этом случае смесь перемешивают стеклянной палочкой.

Учет и оценка результатов реакции. Спустя 3-5 мин производят учет РА невооруженным глазом или с помощью лупы. Основным критерием является степень просветления жидкости, величина и количество зерен агглютината. При положительной РА уже-через 30- сек в опытной пробе начинают формироваться зерна агглютината, а жидкость постепенно просветляется. В контроле АГ - гомогенное помутнение.

При постановке пластинчатой РА с неадсорбированной иммунной сывороткой, взятой в невысоком разведении, результат реакции по идентификации выделенных микробов оценивается как предварительный, ориентировочный. В случае применения монорецепторной сыворотки, например, при серологической идентификации салмонелл или шигелл, результат регистрируется как окончательный, поскольку с помощью реакции определяется специфический АГ, присущий данному виду бактерий.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА, РНГА). РПГА применяют для серологической диагностики инфекционных заболеваний, определения титра иммунных сывороток, ускоренного обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды и различном биологическом материале. Реакция является достаточно специфичной и чувствительной:105 - 106 м.к./мл.

Приготовление реактивов: 1% HKC - цельную кроличью сыворотку разводят ЗФР рН 7,2-7,4 1:2-1:4, инактивируют прогреванием при 56°С в течение 30 мин и адсорбируют 3-кратно отмытыми бараньими эритроцитами. Эритроциты осаждают центрифугированием (500 х g, 5 мин), после чего надосадочную жидкость разводят ЗФР 1:100.

Подготовка проб к исследованию: перед постановкой РПГА и РТПГА исследуемый материал обеззараживают нейтральным формалином, добавляя его в пробы до 4% (0,2 мл на 2 мл пробы). Пробы оставляют при комнатной температуре на 1 ч, после чего ставят реакции. Формалин должен иметь нейтральный рН, т.к.

в противном случае могут иметь место ложноположительные результаты.

Из пробы, предварительно обработанной формалином, часть жидкости (1-2 мл) отбирают и кипятят на водяной бане 15 мин с целью экстрагирования антигенов возбудителей сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, холеры. Оставшуюся часть пробы инактивируют на водяной бане при 56°С - 30 мин, если пробу исследуют на чуму, сап, мелиоидоз. Далее в пробирки добавляют 50% взвесь формалинизированных эритроцитов барана из расчета 1 капля взвеси на 1 мл пробы с целью устранения возможных неспецифических результатов РПГА. Смесь тщательно встряхивают, выдерживают 15 мин в термостате при 37°С. Затем центрифугируют при 1000-2000 об/мин в течение 3-5 мин.

Надосадочную жидкость отсасывают для постановки РПГА и РТПГА. Пробы воды, другие относительно малозагрязненные пробы, смывы чистой культуры с чашек можно не адсорбировать 50% взвесью эритроцитов.

Подготовка исследуемых сывороток. Перед постановкой опыта в исследуемые сыворотки добавляют мертиолат натрия 1:10 000, разводят ФР 1:10 и прогревают при 56°С в течение 20 мин, затем обрабатывают 50% взвесью формалинизированных эритроцитов барана (как описано выше).

РПГА на обнаружение АГ: В лунки верхнего ряда микропланшета (за исключением предпоследней лунки) автоматическим дозатором вносят 50 мкл ЗФР, содержащего 1% НКС (разводящая жидкость). Затем в первую лунку вносят 50 мкл раствора АГ (инактивированного исследуемого материала), разведенного 1: насыщенным раствором хлорида натрия (для предотвращения возможной неспецифической реакции), и титруют, перемешивая содержимое лунок и перенося по 50 мкл из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д.

до 10 лунки включительно, из которой 50 мкл раствора АГ удаляют в дез. раствор. Предпоследняя лунка – контроль АГ, сюда вносят 50 мкл заведомо положительного АГ. Последняя лунка - контроль диагностикума. После серии двукратного разбавления исследуемого материала в каждую лунку ряда вносят по капле антительного эритроцитарного диагностикума, который предварительно встряхивают. Перемешивание исследуемого материала и диагностикума достигается завихрением жидкости при падении капли в лунку. Более интенсивное перемешивание происходит при легком встряхивании планшета на столе. Планшет оставляют на 2 ч при комнатной температуре или помещают при 37°С на 30 мин. После этого учитывают результаты.

РПГА на обнаружение АТ. Техника постановки реакции аналогична варианту на обнаружение АГ, с той лишь разницей, что в качестве исследуемого материала применяют исследуемую сыворотку в разведении 1:10 и антигенный эритроцитарный диагностикум.

Предпоследняя лунка – контроль АТ - содержит заведомо положительную сыворотку.

Учет и оценка результатов реакции. Через 2 ч с момента осаждения эритроцитов в контролях проводят предварительный учет результатов, окончательный учет результатов реакции через 12-18 ч. Характер осадков эритроцитов оценивают по 4-крестовой шкале:

+ + + + - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол (зонтик);

+ + + - по окружности равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается тонкое (“фестончатое”) кольцо;

++ - на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается кольцо меньшего диаметра с более ровным краем;

+ - четкое кольцо малого диаметра на слаборазличимом фоне агглютинировавших эритроцитов;

– - агглютинация эритроцитов отсутствует, на дне лунки образуется маленькое кольцо с четким ровным краем или компактный диск (пуговка).

Реакцию учитывают только при отсутствии гемагглютинации в контролях диагностикума. РПГА считают положительной, если в лунках с исследуемым материалом имеется гемагглютинация не менее чем на 3 креста. РПГА считают отрицательной, если во всех лунках гемагглютинация отсутствует. При наличии гемагглютинации как в опытной, так и контрольной лунке реакцию следует повторить с разведением исследуемого материала 1:5 и 1:10. Если и в этом случае эритроциты также будут агглютинировать во всех лунках, реакцию считают неспецифической и ее результаты не учитывают.

Реакция торможения пассивной (непрямой) гемагглютинации (РТПГА, РТНГА) Принцип. Взаимодействие гомологичных АГ и АТ приводит к их нейтрализации, в результате чего тормозится агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных специфическими AT (АГ). Если АГ (АТ) гетерологичны, то их взаимодействие не произойдет и свободные АГ (АТ) вызовут агглютинацию индикаторных эритроцитов. РТПГА используется в качестве контроля специфичности РПГА, эти реакции ставятся параллельно.

РТПГА на обнаружение АГ. Компоненты и материалы те же, что в РПГА. Дополнительно - специфическая иммунная сыворотка активностью 8-16 СЕ.

В лунки верхнего ряда планшета вливают по 25 мкл разводящей жидкости. В первую лунку вносят 25 мкл исследуемого материала и титруют по 25 мкл до предпоследней лунки, из которой 25 мкл жидкости удаляют в дез. раствор. Во все лунки добавляют по мкл специфической сыворотки в количестве 8-16 СЕ.

За 1 СЕ принимают предельное разведение сыворотки, в котором еще регистрируется полное склеивание эритроцитов, определяемое предварительно в РПГА.

Планшет выдерживают 30 мин при 37°С и добавляют во все лунки по 25 мкл антительного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 ч до оседания эритроцитов.

Реакцию сопровождают контролем эритроцитарного диагностикума (25 мкл разводящей жидкости и 25 мкл антительного эритроцитарного диагностикума).

РТПГА на обнаружение АТ. Компоненты и материалы те же, что в РПГА. Дополнительно – взвесь убитой культуры активностью 8-16 антигенных единиц (АЕ).

В лунки микротитровальной пластины вливают по 25 мкл разводящей жидкости. В первую лунку вносят 25 мкл исследуемой сыворотки или другого материала, содержащего АТ, и титруют по 25 мкл до предпоследней лунки, из которой 25 мкл жидкости удаляют в дезраствор. Во все лунки вносят по 25 мкл гомологичного АГ в количестве 8-16 АЕ. 1 АЕ – минимальное разведение АГ, в котором регистрируется полное склеивание эритроцитов в РПГА. Пластину встряхивают, выдерживают 30 мин при 37°С и добавляют во все лунки 25 мкл антигенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 ч до оседания эритроцитов. Реакцию сопровождают контролем диагностикума.

Учет и оценка результатов РТПГА проводится по феномену гемагглютинации аналогично учету в РПГА.

Если активность материала в РТПГА отсутствует или снижается на несколько лунок по сравнению с активностью того же материала в РПГА, то «+» результат РПГА признается специфическим.

Реакция нейтрализации АТ (РНАт) на обнаружение АГ.

В лунки верхнего ряда планшета вливают по 25 мкл разводящей жидкости. В первую лунку вносят 25 мкл исследуемого материала (АГ) и титруют по 25 мкл до предпоследней лунки, из которой 25 мкл жидкости удаляют в дезраствор. Последняя лунка – контроль диагностикума. Во все лунки добавляют по 25 мкл специфической сыворотки акттивностью 2 СЕ. Планшет выдерживают 30 мин при 37°С и добавляют во все лунки по 25 мкл антигенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 ч до оседания эритроцитов. Реакцию сопровождают контролем эритроцитарного диагностикума (25 мкл разводящей жидкости + 25 мкл специфической сыворотки (2 СЕ) и 25 мкл антигенного эритроцитарного диагностикума).

Если в исследуемом материале содержится АГ, то он нейтрализует 2 СЕ сыворотки, и последняя не сможет агглютинировать антигенный диагностикум (пуговка). В противном случае АТ сыворотки останутся свободными и в результате сенсибилизированные АГ эритроциты окажутся агглютинированными (зонтик).

Под титром материала в РНАТ принимают крайнее разведение исследуемого АГ, при котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов (пуговка).

Реакция нейтрализации АГ (РНАг) на обнаружение АТ В лунки верхнего ряда планшета вливают по 25 мкл разводящей жидкости. В первую лунку вносят 25 мкл исследуемого материала (АТ) и титруют по 25 мкл до предпоследней лунки, из которой 25 мкл жидкости удаляют в дез. раствор. Последняя лунка – контроль диагностикума. Во все лунки добавляют по 25 мкл раствора АГ в количестве 2 АЕ. Планшет выдерживают 30 мин при 37°С и добавляют во все лунки по мкл антительного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 ч до оседания эритроцитов. Реакцию сопровождают контролем эритроцитарного диагностикума (25 мкл разводящей жидкости + 25 мкл раствора АГ (2 АЕ) и 25 мкл антительного эритроцитарного диагностикума).

Если в исследуемом материале содержатся АТ, то они нейтрализуют 2 АЕ антигена, и последний не сможет агглютинировать антительный диагностикум (пуговка). В противном случае АГ останется свободным и в результате сенсибилизированные АТ эритроциты окажутся агглютинированными (зонтик). Под титром материала в РНАт принимают крайнее разведение исследуемого материала (АТ), при котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов (пуговка).

Реакция преципитации и ее варианты Преципитацией называют процесс, когда происходит агрегация АТ с растворимыми АГ; если АГ представлен корпускулами, специфическая агрегация таких АГ описывается как агглютинация. Появление преципитата при реакции АГ+АТ определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ролью Fc-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приводит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах.

В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведенную сыворотку.

Для постановки реакции преципитации необходимы:

АТ - испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); АГ; физиологический раствор как источник электролитов.

Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция кольцепреципитации) и преципитация в геле. Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы АГ и АТ смешивают в пробирке. Учет реакции производят с помощью измерения мутности получаемой системы на фотоэлектроколориметре, что позволяет определить концентрацию исследуемого АГ.

Для постановки реакции кольцепреципитации в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не допуская перемешивания, раствор АГ. В случае гомологичности АТ и АГ на границе между этими растворами в течение 3- мин появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а АГ.

Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа. Явление иммунопреципитации в геле широко используется в целом ряде важных методик, применяющихся для изучения АТ, а также для обнаружения и количественного определения растворимых АГ. Иммунопреципитация основана на очень простом принципе.

В толще геля существует водная фаза, через которую легко диффундирует большинство макромолекул. Когда сложный АГ перемещается в область, содержащую АТ, то при оптимальном соотношении концентраций взаимодействующих компонентов образуются видимые линии преципитации. Реакцию обычно проводят в расположенных горизонтально тонких слоях агарового геля на стеклянных подложках.

В 1948 г. Е. Оухтерлони разработал простой и удобный метод встречной двумерной диффузии в геле, позволяющий проводить прямое сравнение различных АГ и сывороток. Для реакций иммунодиффузии АГ и АТ вносят в лунки, вырезанные в геле напротив друг друга. Известны различные модификации метода иммунодиффузии: иммунодиффузия АГ в агаровом геле, содержащем АТ (или наоборот), приводящая к образованию колец преципитации, их диаметр пропорционален концентрации АГ (АТ); иммуноэлектрофорез - метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси АГ и встречную диффузию по Оухтерлони на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций АГ. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых АГ, содержащих до 30 компонентов, и является ценным диагностическим методом.

Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для АГ и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. АГ и АТ диффундируют в гель, соединяются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в гранулах геля, становясь видимыми как линии преципитации.

Двойную радиальную иммунодиффузию применяют главным образом для качественного анализа, например для определения числа АГ в различных жидкостях (в сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении АГ, для сравнения известных АГ и АТ с неизвестными, а также с целью наблюдения за ходом иммунизации животных.

Готовят последовательные двукратные разведения антисыворотки и равные объемы каждого из них вносят в лунки, расположенные по периферии. Центральную лунку заполняют раствором АГ. При оценке результатов иммунодиффузии учитывают: расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферической лунок; интенсивность и ширину полос преципитации; последнее разведение антисыворотки, при котором еще можно видеть преципитат.

Оценка результатов: При оптимальном соотношении между АГ и АТ линия преципитации располагается почти посередине между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунке другого реагента. АГ и АТ образуют видимые преципитаты при концентрациях белка от 5 до 50 мкг/мл.

Сравнительный анализ. Для сравнения АГ обычно в геле вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из них помещают сравниваемые растворы АГ, а в третью - антисыворотку. Принципиально возможны три варианта расположения линий преципитации:

1. Обе линии полностью сливаются. Это говорит об идентичности антигенов в обеих лунках.

2. Одна из линий длиннее другой и, выходя из последней, образует так называемую шпору. Шпора часто бывает тоньше, чем основные линии преципитации. Вторая линия сливается с линией, образовавшей шпору. В данном случае это свидетельствует о частичной идентичности антигенов. Оба АГ имеют некоторые общие детерминанты, которые, соединяясь с АТ, дают сливающиеся линии преципитации. Однако у первого АГ имеются еще и детерминанты, которых нет у второго.

3. Линии пересекаются, либо не сливаются и не пересекаются. Это указывает на неидентичность антигенных детерминант и, следовательно, на различие молекул исследуемых АГ.

Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини: используют в основном для количественного определения АГ. Чаще всего исследуют белковыеАГ: белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, секретов желез, экстрактов из органов и т.д. Метод получил широкое распространение в клинических биохимических лабораториях. На ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий АТ. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором АГ. Молекулы АГ радиально диффундируют из лунки и, встретившись с АТ, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток АГ, диаметр кольца преципитации постепенно увеличивается. Оценку результатов проводят путем измерения колец преципитации на влажных и окрашенных препаратах с помощью окулярного микрометра, который прикладывают к обратной стороне стекла.

Сушка и хранение препаратов: для длительного хранения препараты высушивают. До этого их отмывают от непрореагировавших компонентов в физиологическом растворе, инкубируя 2 -3 сут при 3 - 5 его сменах. Окрашивание препаратов: препараты окрашивают красителями, выявляющими белок. Чаще всего применяют амидо-черный, кумасси ярко голубой, бромфеноловый синий и др. Для этого стекла с отмытым и высушенным гелем помещают на 1 - 5 мин в краситель и держат до тех пор, пока окрашенный преципитат не будет отчетливо виден на фоне окружающего геля. В качестве обесцвечивающего раствора используют растворитель самой краски.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Принцип ИЭФ - вначале проводят электрофоретическое разделение смеси белков в забуференном агаровом геле. Затем в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку.

АГ и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дуги (линии) преципитации. Число, положение и форма этих линий дают представление о составе исходной смеси антигенов. ИЭФ - один из широко распространенных методов качественного анализа АГ. В клинике ИЭ чаще всего используют при диагностике иммунодефицитных состояний. Он незаменим как метод последовательного наблюдения за процессом очистки белковых препаратов.

Приготовление гелей: гель готовят так же, как для иммунодиффузии, за исключением того, что вместо ФР используют подходящий буферный раствор, чаще всего - барбиталовый или боратный буфер рН от 6,0 – 9,0.

Ракетный иммуноэлектрофорез: гель агарозы смешивают с моноспецифической антисывороткой и равномерным слоем распределяют по поверхности стекла.

В полученном геле вырезают лунки и заполняют их исследуемым АГ. В электрическом поле молекулы АГ мигрируют в гель и взаимодействуют с АТ. По мере продвижения молекулы АГ постепенно связываются АТ, образуя вытянутый в длину остроконечный преципитат. В стандартных условиях (концентрация геля, толщина его слоя, содержание в нем антисыворотки, напряжение и сила тока) длина такого преципитата прямо пропорциональна концентрации АГ. Впервые был предложен К. Лореллом в 1966 г., обычно используется для количественного определения белка в жидкостях организма. Его существенным преимуществом по сравнению с иммунодиффузией по Манчини является быстрота получения результатов.

Перекрестный иммуноэлектрофорез: на первом этапе проводят электрофоретическое разделение смеси белков (например, сыворотки) в геле агарозы. Затем разделенные белки вновь подвергают электрофорезу в направлении, перпендикулярном первому этапу. При этом гель содержит АТ, образующие с исследуемыми белками преципитаты в форме пиков. Высота или площадь этих пиков прямо пропорциональна концентрации соответствующих АГ в исследуемой смеси. Площадь пиков зависит также от концентрации антител в геле.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Основные рекомендации при постановке реакции иммунодиффузии в геле (РИД):

Приготовление гелей: чаще всего в качестве гелеобразующих агентов применяют агар или агарозу. Разнообразные фирменные типы агаров сильно различаются по степени чистоты. Некоторые марки агаров могут быть использованы без очистки, такие, как Difco Bacto Agar, Difco Special Agar, Oxoid Ion Agar, Behringwerke Rein Agar, Litex, Pharmacia. Готовить агар желательно только для одного эксперимента или, в крайнем случае, для нескольких опытов, поскольку многократное разогревание перед каждым опытом приводит к испарению жидкости и изменению концентрации и, следовательно, физико-химических свойств агара. Отвешивают определенное количество агара, переносят его в колбочку и добавляют необходимый объем ФР или буфера. Колбочку со смесью ставят в кипящую водяную баню до полного растворения агара. Затем в раствор добавляют один из консервантов для предотвращения роста микроорганизмов:

0,01-0,05%-й азид натрия (NaN3), 0,1-0,12%-й мертиолат натрия или 0,1%-й фенол. Необходимо следить за тем, чтобы агар был не только стерильным, но и максимально прозрачным. Он не должен содержать посторонних механических примесей, особенно ворсинок от марли или ваты. Для улучшения формирования иммунопреципитатов иногда добавляют 2-4%й полиэтиленгликоль или декстраны. Подготовка стекол и заливка агара: иммунодиффузию проводят на стеклах, чаще всего предметных, или фотопластинках. Обезжиренные стекла желательно покрыть тонким слоем 1%-го водного агара и высушить при комнатной температуре или при 70°С. К таким стеклам хорошо прилегает гель. Для получения одинаковой толщины агара стекла помещают на строго горизонтальную поверхность. Залитые агаром стекла помещают во влажную камеру, например, в эксикатор, на дно которого наливают воду с антисептиком. Стекла можно поместить в эксикатор во влажной чашке Петри. Приготовление лунок: для просечения лунок в агаре применяют стандартные штампы, состоящие из трубок-пробойников. В зависимости от поставленной задачи используют штампы, содержащие 4, 5 или 7 трубок-пробойников. Наружные диаметры трубок могут варьировать от 3 до 5 мм. Для постановки иммунодиффузии по Манчини используют отдельные трубки-пробойники или инъекционные иглы со сточенным концом. В этом случае под стекло с агаром кладут трафарет и пробойником просекают контуры лунок. Агаровые пробки отсасывают с помощью вакуумного насоса. Температура: результаты иммунодиффузии существенно не зависят от температуры. Опыт может быть поставлен при 4, 20 или 37°С. Удобнее всего работать при комнатной температуре. Следует лишь избегать резких колебаний температуры в ходе инкубации. Электролиты: в качестве электролитов используют 0,15 М NaCL либо фосфатный или барбиталовый буфер. Постановка опыта:

для того чтобы избежать подсыхания агара, опыт на одном стекле должен быть поставлен в максимально короткие сроки (10-15 мин). В лунки в зависимости от их диаметра вмещается от 2 до 40 мкл раствора реагента. При заполнении лунок доверху жидкость не должна переливаться через край. Сразу же после заполнения лунок реагентами стекло помещают в эксикатор. Иммунодиффузия может продолжаться от 2 до 7 сут в зависимости от задачи.

Реакция кольцепреципитации РКП (Асколи, 1906) Поочередное наслаивание друг на друга прозрачных растворов АГ и AT сопровождается взаимодействием реагентов на границе их соприкосновения и постепенном образовании серовато-мутного преципитата в виде плавающего диска. РКП применяется при серодиагностике сибиреязвенного АГ в животном сырье, индикации патогенных микроорганизмов и в судебномедицинской практике.

Техника постановки реакции: в чистые прозрачные преципитационные пробирки вносят 0,3 мл реагента с большим удельным весом (как правило, это преципитирующая сыворотка) и осторожно по внутренней стенке пробирки наслаивают пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром реагент с меньшим удельным весом, т. е. АГ, который используют в различных разведениях. В момент наслаивания пробирку с сывороткой фиксируют в наклонном положении (под углом примерно 45°). После наслаивания АГ пипетку неспеша извлекают, не отрывая от стенки пробирки.

Пробирку переводят в вертикальное положение. К каждому опыту ставится ряд контролей (табл. 3).

Схема постановки РКП по Асколи Специфическая преципитирующая сыворотка 0,3 0,3 0,3 — Нормальная сыворотка (того же вида животного или человека) преципитата на границе двух сред. Реакция считается достоверной, если 1-й контроль положительный, а 2-й и 3-й - отрицательные.

Реакция иммунодиффузии в геле Принцип: диффузия растворов АГ и AT, залитых в противостоящие лунки агарового геля, в случае их соответствия приводит к образованию в месте встречи линий преципитации.

Техника постановки реакции: реакцию проводят на чистых, обезжиренных предметных стеклах или стеклах от фотопластинок (9х12 см), либо в маленьких пластиковых чашках Петри на которые наносят подогретой пипеткой слой в 1,5 -2,0 мм 1%-ного осветленного агара, подогретого до 70°С. Стекла и чашки Петри размещают на горизонтальном столике с уровнем для формирования на них слоя геля равной толщины.

Специальным пробойником в агаре вырезают лунки. В штампах «пятерка» и «семерка» одна из трубок является центральной, а остальные расположены по окружности на равном расстоянии друг от друга. Наружный диаметр трубок составляет 3-5 мм, а расстояние между центральной и периферическими трубками - от 5 до 10 мм. Из просеченных лунок агар осторожно извлекают, отсасывая его металлической трубкой, соединенной через шланг с вакуумным насосом. Для герметизации дна лунок пастеровской пипеткой с тонко оттянутым концом осторожно вносят на донышко по 1 микрокапле горячего агара и сразу удаляют его. Растворы АГ и AT при помощи автоматических микропипеток заливают в соответствующие лунки, не переливая жидкость через края и не касаясь их.

Стекла помещают во влажную камеру, либо на крышку чашки Петри наклеивают смоченную водой фильтровальную бумагу. Реакцию проводят при 37°С в течение 4-16 ч либо при комнатной температуре – 24-48 ч.

Учет и оценка результатов реакции. Через 24-48- ч учитывают количество и расположение полос преципитации в агаровом геле в проходящем и падающем свете, а также при косом освещении на темном фоне с помощью лупы.

Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) Принцип. При встречном электрофорезе образование иммунных преципитатов в поддерживающей среде происходит в результате миграции АГ и АТ навстречу друг другу под действием электрического поля. Молекулы различных белков обладают различным зарядом и поэтому движутся при электрофорезе в щелочном буфере не только с разной скоростью, но и в разных направлениях - одни к аноду, другие к катоду.

Приготовление геля. Расплавляют 1 г агара или агарозы в 100 мл буфера на кипящей водяной бане. В качестве консерванта используют 2 мл 0,1% раствора мертиолата натрия. Горячий прозрачный раствор можно разлить на порции однократного потребления (по 20, 50 или 100 мл) и хранить при 4°С в течение нескольких месяцев.

Техника проведения ВИЭФ. На подогретую обезжиренную стеклянную пластинку наносят несколько миллилитров раствора агарозы и осторожно проводят кромкой другой пластинки, наклоненной под углом 45°. Струей горячего воздуха из фена гель высушивают в тонкую пленку. Затем на стекло, помещенное в кювету на горизонтальном столике с уровнем, выливают приготовленный гель из расчета 0,15-0,2 мл на см2 и дают ему застыть. С помощью пробойника и трафарета в геле вырезают лунки диаметром 2-5 мм, располагая их попарно на расстоянии друг от друга от 2- мм до 5-8 мм. Расстояние от краев пластинки должно быть не менее 1,5 см. Гелевые цилиндры удаляют с помощью водоструйного насоса. При использовании пластинок без агаровой пленки производят герметизацию донышка лунки, внося в них микрокаплю горячего агара (70-90°С) и сразу его удаляя. В лунки с катодной стороны вносят по 0,01 мл АГ, а с анодной - такой же объем сыворотки (AT). Опыт обязательно сопровождают отрицательным (ФР или гетерологичный АГ) и положительным (АГ стандартный) контролями. Оба отделения камеры для электрофореза заполняют буфером. Пластины с гелем укладывают в соответствии с расположением полюсов и замыкают электрическую цепь полосками бумаги, смоченными буферным раствором. Включают охлаждение и ток и ведут ВИЭФ при напряжении 10 В/см2 в течение 45 - 60 мин.

Учет и оценка результатов. Просмотр и изучение линий преципитации проводят в проходящем и падающем свете, а также при косом освещении на темном фоне с помощью лупы. От непреципитирующих белков гель отмывают путем погружения стекол 2-3 раза на 12 ч в ванночку с 0,15 М раствором NaCl. Затем поверхность геля накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде, и высушивают при комнатной температуре. Оценку осуществляют путем сравнительного изучения опытных и контрольных полос преципитации.

5.1.5. Методы иммунофлуоресценции В 1950 г. Кунс и Каплан продемонстрировали возможность ковалентного связывания флуоресцентных красителей с АТ без утраты последними способности реагировать с АГ. В результате был разработан метод, сочетающий чувствительность и специфичность иммунологических реакций с топографической точностью микроскопии. Специальное оборудование позволяет визуально регистрировать свет, испускаемый ничтожным количеством флуорохрома. Флуоресцентные метки пригодны для методики двойного окрашивания, т.е. обработки образца двумя препаратами, различающимися по специфичности и метке АТ, которые окрашивают области локализации соответствующих АГ в разные цвета. Первая работа, включившая ИФ в арсенал лабораторных методов, была выполнена с применением конъюгатов, меченых флуоресцеином.

Флуоресцеин и сейчас остается наиболее распространенным флуорохромом. Максимум светопоглощения конъюгатов, меченных флуоресцеином, регистрируется при 495 нм. Для них характерна интенсивная флуоресценция изумрудно-зеленого цвета, не свойственная аутофлуоресценции большинства тканей млекопитающих и с высокой чувствительностью воспринимаемая сетчаткой глаза. Для конъюгации с белками обычно применяют флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), изомер 1. Он легко присоединяется к белкам, образуя стабильные конъюгаты с заданным содержанием метки.

Основной альтернативой флуоресцеину может служить родамин. Конъюгаты, меченные этим красителем, имеют максимум светопоглощения при 555 нм, а их оранжевая флуоресценция хорошо контрастирует с флуоресцеином. Поэтому родамин применяют главным образом в качестве второй метки при двойной иммунофлуоресценции. Флуорохром используют обычно в виде тетраметилродаминизотиоцианата. Еще один флуорохром с оранжево-красной флуоресценцией это техасский красный. Максимум светопоглощения этого красителя (596 нм) в еще большей степени, чем у родамина, контрастирует с соответствующим значением флуоресцеина.

Флуоресцентные реагенты готовят из обладающих достаточной активностью и специфичностью препаратов АТ или АГ, которые конъюгируют с оптимальным количеством флуорохрома. Методически процедура конъюгации одноэтапна, предполагает инкубирование в течение определенного времени иммунного реагента с красителем и последующее промыванием полученного препарата от не связавшегося красителя. При наличии подходящих иммунных реагентов можно самостоятельно приготовить конъюгат, не уступающий по качеству коммерческим образцам. Свободный флуорохром может вызвать неспецифическое окрашивание и дает высокий уровень фоновой флуоресценции даже при незначительной (5 мкг/мл) концентрации свободного ФИТЦ. Кроме того, при длительном хранении конъюгаты могут диссоциировать на иммунный реагент и свободный краситель, что усиливает неспецифическое окрашивание. Это особенно свойственно конъюгатам с родаминовой меткой, этому во всех подозрительных случаях диагностикум проверяют на присутствие свободного красителя с помощью хроматографической методики (гель-фильтрация). Лучший метод удаления свободного красителя из препаратов конъюгата - гель-фильтрация на сефадексах G25 и G50.

Пик меченого белка выходит в свободном объеме.

Мерой активности иммунофлуоресцентного препарата служит то максимальное его разведение, при котором еще сохраняется способность к специфическому окрашиванию. Это свойство важно не только с точки зрения экономии препарата, но и потому, что оптимальной эффективности окрашивания можно достигнуть лишь с высокими разведениями конъюгата, при которых соотношение между интенсивностью сигнала и фона достаточно велико. При невысоких разведениях конъюгата регистрируется сильная неспецифическая флуоресценция.

Различают прямую и непрямую иммунофлуоресценцию. В основе прямой иммунофлуоресценции лежит серологическая реакция между искомым АГ и видоспецифическим флуоресцирующим иммуноглобулином.

Образующийся в результате комплекс АГ - флуоресцирующее АТ приобретает способность светиться в УФ-лучах. С помощью МФА можно в течение 1-2 ч обнаружить наличие возбудителей инфекционных заболеваний в исследуемой пробе. Чувствительность метода 5104 – 105 м.к./мл. Непрямая иммунофлуоресценция основана на применении антиглобулиновых конъюгатов, которые позволяют обнаружить участки связывания предварительно нанесенных немеченых антител.

Преимуществом непрямого МФА является то, что при его использовании отпадает необходимость иметь большой набор различных специфических флуоресцирующих АТ. В качестве антиглобулиновых АТ обычно используют сыворотку козы или барана, иммунизированных сывороткой кролика, морской свинки, мыши и т.д. Непрямой МФА применяют не только для ускоренного обнаружения возбудителя (АГ), но и для обнаружения АТ в сыворотке больного.

Одна из наиболее важных особенностей МФА состоит в возможности одновременной идентификации двух разных АГ даже при их локализации в одной и той же области (двойная иммунофлуоресценция). В наиболее простом варианте для этого служит прямая иммунофлуоресценция с двумя различными по специфичности конъюгатами, один из которых содержит флуоресцеин, другой – родамин.

Оптимальные условия распознавания АГ в МФА определяются двумя факторами, зависящими от свойств конъюгата: интенсивностью специфической флуоресценции и ее контрастом с фоновым уровнем. Важно отметить, что нежелательная (фоновая) флуоресценция может быть связана, во-первых, с истинным неспецифическим окрашиванием, обусловленным электростатическими взаимодействиями, и, во-вторых, с нежелательным, но специфическим окрашиванием, обусловленным перекрестной реактивностью меченых АТ к другим тканевым АГ. Оба вида нежелательной флуоресценции нужно свести к минимуму без заметного снижения уровня специфической реакции. Это достигается путем одновременной окраски мазков флуоресцирующими конъюгатами в сочетании с контрастирующим сывороточным альбумином, обеспечивающим отличное по цвету свечение фона (посторонних примесей, клеточных элементов, гетерологичных микробов и т.п.). Перспективным для снижения неспецифической флуоресценции в препаратах является и метод окраски мазков Fabфрагментами флуоресцирующих иммуноглобулинов без применения контрастирующих альбуминов.

Для индикации ПБА в иследуемых пробах в качестве основного следует применять прямой метод флуоресцирующих АТ. Непрямые модификации более трудоемки и требуют большей затраты времени. Их используют либо для выявления и титрования АТ в сыворотках крови людей и животных, либо для идентификации чистых культур возбудителей.

Прямой МФА для специфической индикации ПБА: для специфической индикации ПБА применяют прямой МФА в сочетании с контрастированием неспецифического свечения. С этой целью для окраски мазков используют смесь, состоящую из равных объемов специфических флуоресцирующих АТ, меченных флуоресцеин-5-изотиоцианатом (излучающим зеленый цвет), и контрастирующего альбумина нормальной сыворотки (лошадиной, бычьей, кроличьей), конъюгированного с родаминовым красителем (обладающим оранжевой люминесценцией). При окраске препаратов такой смесью специфический флуоресцирующий Ig сообщает зеленое свечение только гомологичному АГ, тогда как остальные компоненты препарата (тканевые элементы, гетерологичные микроорганизмы и их АГ, прочие примеси) приобретают способность светиться оранжево-красным цветом благодаря неспецифической физико-химической сорбции меченого альбумина.

Непрямой МФА (НМФА): в основе иммунофлуоресцентной серодиагностики (выявления и титрования специфических АТ в сыворотках крови) лежит применение непрямого метода флуоресцирующих антител как в модификации иммунофлуоресцентной окраски видовых сывороточных глобулинов, так и окраски комплемента морских свинок. При этом искомым в комплексе АГ + АТ + флуоресцирующий антисывороточный иммуноглобулин или АГ + АТ + комплемент + флуоресцирующий антикомплементарный глобулин являются АТ исследуемых сывороток людей или животных. Обработка мазков, содержащих заведомо известные микроорганизмы (диагностикумы), нисходящими разведениями исследуемых сывороток позволяет не только выявить специфические АТ, но и определить их титр.

При идентификации с помощью НМФА выделенных микроорганизмов используют наборы заведомо известных нефлуоресцирующих иммунных сывороток (иммуноглобулинов), которые берут для обработки мазков в различных (в зависимости от их активности) разведениях. Искомыми в этом случае оказываются АГ бактерий, риккетсий, хламидий или вирусов, содержащиеся в мазке и подлежащие идентификации.

Идентификация микроорганизмов с помощью НМФА.

Для идентификации микроорганизмов с помощью НМФА необходимо располагать набором нефлуоресцирующих иммунных сывороток, специфичных в отношении различных бактерий, риккетсий или вирусов. Эти сыворотки используются на первом этапе обработки мазков, приготовленных из взвесей подлежащих идентификации микроорганизмов (клеточных культур, инфицированных вирусом). На втором этапе обработанные специфической сывороткой препараты докрашиваются антивидовым флуоресцирующим иммуноглобулином, гомологичным в отношении белков сыворотки, использованной на первом этапе (например, при обработке мазков на первом этапе специфической нефлуоресцирующей кроличьей сывороткой для второго этапа используют люминесцирующий иммуноглобулин к сывороточным глобулинам кролика). Техника люминесцентной микроскопии препаратов, окрашенных НМФА, аналогична применяемой при прямом варианте МФА.

Раньше неизбежное «выцветание» флуоресцентной метки при микроскопии было для МФА неотъемлемой и неразрешимой проблемой. Оно уменьшало популярность данного метода и способствовало более широкому применению других, нефлуоресцентных индикаторных систем для иммуноспецифического определения локализации антигенов. Позднее было описано применение парафенилендиамина, который значительно замедлял выцветание флуоресцентной метки, но был подвержен быстрому окислению на свету. Кроме того, он активно сенсибилизировал кожу.

Более подходящий реагент - 1,4-диазобициклооктан (ДАБЦО). Он менее активно замедляет выцветание флуоресцентной метки, но более стабилен, дешев, не сенсибилизирует кожу, не диссоциирует на ионы и может храниться без дополнительной защиты.

Микроскопия. Для получения правильных результатов МФА необходимо до начала исследования тщательно сцентрировать всю осветительную систему микроскопа и подобрать опытным путем оптимальную комбинацию первичных и запирающих светофильтров. При использовании флуоресцирующих Ig, меченных ФИТЦ, чаще всего применяют возбуждающие светофильтры СС-4, СС-8 или СЗС-7 в комбинации с запирающим светофильтром типа ЖС-18.

Просмотр мазков под микроскопом рекомендуется проводить в отраженных лучах, падающих на мазок через объектив. При иммунофлуоресцентном исследовании препаратов используют иммерсионные системы. При этом для выявления бактерий, риккетсий, грибов применяют масляную иммерсию (нефлуоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат).

Для выявления вирусов в препаратах из клеточных культур или в мазках-отпечатках органов животных целесообразно использовать вводно-иммерсионные системы). Специальное нефлуоресцирующее масло (в случае его отсутствия – диметилфталат или трисглицериновую смесь) наносят перед микроскопией на мазок. При использовании водно-иммерсионной системы на окрашенные препараты предварительно наносят трис-глицериновую смесь, затем препарат накрывают покровным стеклом, на которое сверху наносят каплю дистиллированной воды. При просмотре таких мазков объектив микроскопа погружают в каплю воды. При микроскопии окрашенных препаратов обычно используют окуляры 7х или 5х.

Для получения достоверных результатов исследования рекомендуется рассматривать под микроскопом не менее 20-25 полей зрения в каждом мазке (если морфологически типичные возбудители встречаются почти в каждом поле зрения, можно ограничиться просмотром меньшего числа полей зрения). В мазках, приготовленных из жидкой фазы пробы, особое внимание следует обращать на края капли (мазка), где чаще концентрируются клетки возбудителя.

Учет и оценка результатов.

При оценке результатов учитывают специфичность свечения и морфологию микроорганизмов. Специфически люминесцирующие микроорганизмы должны обладать характерной морфологией, иметь увеличенные размеры (по сравнению с их размерами в световом микроскопе) и более яркое свечение периферической части клетки. Неспецифическая флуоресценция характеризуется равномерным свечением всего тела клетки.

Морфологические и структурные особенности микроорганизмов позволяют отчетливо дифференцировать их от бесструктурных люминесцирующих конгломератов, которые могут наблюдаться в препаратах.

Результаты МФА считаются положительными, если в мазке обнаруживаются хотя бы единичные (для мелких бактерий и риккетсий не менее 10 особей) морфологически типичные микроорганизмы либо пораженные вирусом (или риккетсиями) тканевые клетки (не менее 3-5 в препарате), специфически флуоресцирующие на 3-4 креста, при отрицательных контролях.

Контрольные исследования при постановке МФА.

При исследовании любого неизвестного материала основным контролем специфичности являются все остальные мазки (препараты) данной пробы, которые оказались окрашенными гетерологичными по отношению к выявленному в пробе агенту флуоресцирующими иммуноглобулинами. Наряду с этим, МФА должен сопровождаться микроскопией препаратов, приготовленных из не содержащих микроорганизмы материалов (незараженные клеточные культуры, отпечатки органов здоровых животных) и окрашенных теми же специфическими люм. препаратами. Специфическая зеленая флуоресценция во всех контрольных мазках должна отсутствовать.

В заключение следует отметить, что методы, основанные на иммунофлуоресценции, не могут быть полностью стандартизованы. Многие детали методики, определяющие чувствительность, весьма вариабельны. Они включают, наряду с другими, свойства выбранного субстрата, активность реагентов, уровень фоновой флуоресценции, возможности микроскопа и квалификацию исследователя.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Метод флуоресцирующих антител Прямой МФА: взаимодействие специфических АГ и AT приводит к образованию комплекса АГ+АТ, выявляемого по флуоресцентной метке одного из компонентов в люминесцентном микроскопе.

Техника постановки реакции. На тщательно обезжиренное предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и растирают бактериологической петлей для получения тонкого мазка. Из органов и тканей животных и секционного материала от людей делают, по возможности, тонкие мазки-отпечатки. Мазки подсушивают на воздухе и фиксируют 30 мин в этаноле, либо смеси Никифорова или охлажденном ацетоне. После фиксации препараты вновь подсушивают на воздухе.

Сухую люминесцирующую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. Непосредственно перед окраской препаратов люминесцирующую сыворотку разводят ЗФР до рабочего разведения (указано на этикетке ампулы), которое предварительно перепроверяют. Для этого микроскопируют мазки из эталонных культур микроорганизмов (диагностикумов), окрашенных люм. сывороткой, взятой в разных разведениях (обязательно на 1-2 разведения выше и ниже рабочего титра, указанного на этикетке). Максимальное разведение сыворотки, которое обеспечивает яркое (на 4+ и 3+) флуоресцентное окрашивание микробных клеток, называют ее красящим титром. В качестве рабочего разведения сыворотки, используемого для окрашивания исследуемых препаратов, применяют удвоенный красящий титр. Например, если красящий титр сыворотки оказался 1:32, то ее рабочее разведение будет 1:16.

На фиксированный мазок наносят 1-2 капли люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. Препарат помещают во влажную камеру (чашку Петри, кювету с крышкой с увлажненной фильтровальной бумагой, ватой) при 37°С на 30 мин или при комнатной температуре на 30-40 мин. Затем препарат промывают в сменах ЗФР в течение 5-10 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной водопроводной воде в течение 1-2 мин. Препараты высушивают на воздухе в вертикальном положении, не применяя фильтровальную бумагу.

Учет и оценка результатов. Учет результатов проводят визуально на основе выявления морфологических особенностей и локализации возбудителя, а также оценки интенсивности и специфичности (структуры) его свечения. Оценку интенсивности специфической флуоресценции объекта проводят с учетом ее структурных особенностей по следующей шкале: ++++ - яркая сверкающая флуоресценция изумрудно-зеленого цвета, четко выявляются морфологические особенности микроорганизма, вокруг корпускулярных агентов может наблюдаться ярко светящийся ободок;

+++ - яркая флуоресценция зеленого цвета, морфологические особенности микроорганизма выявляются достаточно отчетливо, нередко хорошо видны периферические ободки; ++ - слабая флуоресценция желтовато-зеленого цвета, морфологические особенности микроорганизмов выявляются еще достаточно четко, периферические ободки почти не видны; + - очень слабая флуоресценция неопределенного цвета, микроорганизмы различаются с трудом; - -флуоресценция объекта отсутствует.

Положительным результатом считается люминесценция клеток на 4+ и 3+ при наличии не менее 3-5 специфически светящихся клеток в препарате.

Прямой МФА для специфической индикации ПБА:

Приготовление мазков. На тщательно обезжиренное предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и растирают бактериологической петлей для получения тонкого мазка. Из органов и тканей делают тонкие мазки-отпечатки. Мазки подсушивают на воздухе и фиксируют в течение 30 мин. в 96 этаноле, смеси Никифорова или охлажденном ацетоне. После фиксации препараты вновь подсушивают на воздухе (не обжигают) и подвергают окрашиванию. Для спорообразующих видов микроорганизмов фиксатором служит 96 этанол с 10% формалина или с 3% перекиси водорода.

Окраска препаратов флуоресцирующими Ig: на фиксированные и высушенные мазки наносят пипеткой рабочую смесь специфического флуоресцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина так, чтобы вся площадь мазка была покрыта конъюгатом. Обработку мазков проводят во влажной камере при 37 С в течение 30 мин. Затем конъюгат смывают ЗФР, мазки дважды промывают по 10 мин ЗФР, после чего ополаскивают дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре.

До начала работы флуоресцирующие иммуноглобулины и контрастирующий альбумин растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы. К использованию пригодны лишь те конъюгаты, которые легко и без осадка растворяются в течение 1-2 мин. Растворенные препараты могут затем храниться при 2-4 С в течение 2-3 недель, будучи плотно закрытыми. Окраску мазков производят так называемой рабочей смесью конъюгатов, которую готовят также заблаговременно, но срок ее хранения при 2-4 С не должен превышать семи дней.

Важнейшим условием правильного составления рабочей смеси конъюгатов является оптимальный подбор в ней соотношения флуоресцирующего Ig, меченного ФИТЦ, и альбумина, меченого родамином. Эти соотношения для каждой новой партии флуоресцирующих конъюгатов подбирают опытным путем, поскольку указанные на этикетке ампулы рабочие разведения являются ориентировочными. Титрование флуоресцирующих конъюгатов целесообразно проводить на контрольных мазках, содержащих гомологичные флуоресцирующим иммуноглобулинам микроорганизмы или их АГ.

Определение красящего титра контрастирующего альбумина. Из цельного раствора альбумина, меченного родамином, готовят ряд двукратных разведений в стерильном ЗФР рН 7,2 от 1:2 до 1:128, наносят на контрольные «грязные» мазки (с посторонней микрофлорой) и инкубируют во влажной камере при 37 С в течение 30 мин. Затем мазки промывают дважды по мин ЗФР, ополаскивают дист. водой, подсушивают на воздухе и микроскопируют. В полевых условиях вместо ЗФР мазки можно промывать проточной водой, а затем ополаскивать дистиллированной водой. Последнее разведение контрастирующего альбумина, дающее оранжево-красное свечение микробных клеток в мазке на 1-2 креста, принимают за красящий титр. Соответственно рабочее разведение меченого альбумина будет в 2 раза выше красящего титра (табл. 4).

Пример титрования флуоресцирующего альбумина Препараты Мазок-отпечаток с тампона (смыв) Мазок-отпечаток селезенки мыши Перевиваемые клетки амниона человека Условные обозначения:

+++ - отчетливо выраженное оранжево-красное или красно-бурое свечение + + - красное свечение различных оттенков + - серо-желтое (бурое) свечение - - свечение отсутствует или видна аутолюминесценция Определение красящего титра специфических флуоресцирующих Ig в смеси с контрастирующим альбумином, меченым родамином. Двукратные разведения испытуемого конъюгата специфических флуоресцирующих Ig смешивают с двойным рабочим разведением контрастирующего альбумина и окрашивают контрольные мазки, приготовленные из взвеси гомологичных микроорганизмов, как сказано выше. Последнее разведение, обеспечивающее яркое зеленое изумрудное специфическое свечение микробов на 3-4+ на оранжево-красном фоне препарата, является красящим титром испытуемого специфического Ig.

Для дальнейшей работы смешивают в равных объемах удвоенные рабочие разведения альбумина и специфического флуоресцирующего Ig (табл. 5).

Пример титрования флуоресцирующего иммуноглобулина в присутствии альбумина Препараты флуоресценконъюгата в смеси с альбумином, взяции из смыва МазокСпец- отпечаток селезенки Монослой амниона зеленая человека Примечание: Красящий титр флуоресцирующего иммуноглобулина в этом примере равен 1:32. Однако для окраски мазков специфический конъюгат, как и контрастирующий альбумин, используется в рабочем разведении, которое должно быть в два раза концентрированнее его красящего титра. Следовательно, рабочая смесь конъюгатов, выбранная на основании приведенных в данном примере результатов, должна состоять из разведенного 1:16 специфического флуоресцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина, взятого в разведении 1:16. Чтобы получить в рабочей смеси эти оптимальные соотношения, оба конъюгата должны быть сначала разведены 1:8, а затем смешаны в равных объемах.

Непрямой МФА. Подготовка мазков для проведения серологических анализов. Мазки с заведомо известными микроорганизмами (бактериями, риккетсиями) готовят либо из стандартных корпускулярных АГ и диагностикумов (например, из корпускулярных антигенов для реакции агглютинации), либо из взвесей 1-2-суточных культур живых аттенуированных вакцин (EV, СТИ, туляремийной, бруцеллезной и др.).

Для выявления противовирусных АТ используют пластинки с монослоем культуры клеток, инфицированных соответствующим вирусом. Взвеси из корпускулярных АГ или живых культур вакцинных штаммов бактерий готовят на ФР концентрацией примерно 500 млн м.к./мл (по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Взвеси, приготовленные из сухих корпускулярных АГ, целесообразно предварительно выдержать в течение 2 - 4 ч при температуре 4 – 10°С для более полной регидратации и только потом использовать их для приготовления мазков. Это снижает в ряде случаев неспецифическую сорбцию на АГ сывороточных протеинов и позволяет избежать ошибок при интерпретации результатов анализа. Мазки готовят на специальных графленых предметных стеклах со шлифованной поверхностью на одном конце (для маркировки стекла). Микробную взвесь (АГ) наносят на стекло тонкой пастеровской пипеткой (по 6-8 капель на каждом стекле). Затем мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют в течение 15 мин на холоде ацетоном или 96° этиловым спиртом. Мазки из микробной взвеси или корпускулярного АГ можно готовить впрок. При условии их хранения при температуре не выше 0°С они могут быть пригодны для использования в течение месяца. Монослои инфицированных вирусом клеточных культур, длительному хранению не подлежат и должны быть использованы в течение ближайших 2-3 дней.

Подготовка исследуемых сывороток: исследуемые с помощью НМФА сыворотки людей и животных какой-либо предварительной специальной обработке не подвергаются. Их инактивацию проводят путем прогревания при 56°С в течение 30 мин. Для определения титра специфических АТ испытуемые сыворотки разводят ФР в пределах от 1:10 до 1:1280 и более (в случае необходимости). Используемые контрольные сыворотки (заведомо нормальная или гетерологичная содержащимся в мазке антигенам) берут в разведении 1:20 - 1:40.

Подготовка антивидовых флуоресцирющих. иммуноглобулинов. При выявлении АТ в сыворотках крови с помощью НМФА используют (в зависимости от применяемой модификации метода) либо антивидовые флуоресцирующие иммуноглобулины, гомологичные белкам исследуемой сыворотки, либо флуоресцирующие иммуноглобулины к комплементу морской свинки. Сухие конъюгаты растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке ампулы (обычно в 0,5 мл). К использованию годны лишь те конъюгаты, которые легко и без осадка растворяются в течение 1 -2 мин. Для обработки мазков готовят рабочие смеси, состоящие из равных объемов флуоресцирующего антивидового (антикомплементарного) иммуноглобулина и контрастирующего альбумина, взятых в рабочих разведениях. Поскольку указанные на этикетках ампул рабочие разведения флуоресцирующих конъюгатов являются ориентировочными, рекомендуется предварительно (для каждой новой серии препаратов) определить их красящий титр и рабочее разведение.

Методика титрования конъюгатов и выбора оптимальных соотношений при составлении рабочей смеси аналогична используемой при подготовке препаратов для прямого варианта МФА.

При титровании антивидового (антикомплементарного) флуоресцирующего иммуноглобулина на первом этапе обработки мазков используют заведомо положительную (гомологичную содержащемуся в мазке АГ) нефлуоресцирующую сыворотку в разведении 1:5-1:10.

Техника титрования исследуемых сывороток. Исследование сывороток с помощью НМФА включает в себя два этапа обработки мазков, содержащих заведомо известные микроорганизмы (АГ). На первом этапе, в зависимости от избранной модификации метода, на мазки наносят последовательные двукратные разведения испытуемых сывороток (иммунофлюоресцентная окраска сывороточных иммуноглобулинов) или смеси равных объемов комплемента морской свинки, взятого в разведении 1:10 (сухой комплемент) или 1:20 (свежий, жидкий комплемент), и последовательных двукратных разведений испытуемой сыворотки (иммунофлуоресцентная окраска комплемента). При нанесении и распределении по мазку соответствующих разведений сыворотки (или их смесей с комплементом) не следует допускать их слияния и перемешивания. Мазки с нанесенными на них разведениями сыворотки инкубируют 20 мин во влажной камере при температуре 37°С, затем в течение нескольких секунд промывают под легкой струей воды, отмывают в двух сменах (по 10 мин каждая) ЗФР и ополаскивают дистиллированной водой. После отмывки препараты высушивают на воздухе при комнатной температуре. На втором этапе окраски на высохшие мазки наносят по капле рабочей смеси соответствующего антивидового (антикомплементарного) флуоресцирующего иммуноглобулина и контрастирующего альбумина. Мазки вновь выдерживают 20 мин во влажной камере при температуре 37°С. После этого с мазков стряхивают остатки смеси конъюгатов, отмывают в двух сменах (по 10 мин каждая) буферного раствора и споласкивают дистиллированной водой. В полевых условиях вместо ЗФР мазки можно промывать 10 мин проточной водой, а затем ополаскивать дистиллированной водой. Окрашенные мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Учет и оценка результатов микроскопии. О наличии специфических антител в исследуемых сыворотках (серодиагностика) судят по степени яркости свечения микроорганизмов в окрашенных препаратах. За титр сыворотки принимают то наибольшее ее разведение, которое еще обеспечивает свечение гомологичных микроорганизмов интенсивностью не менее чем на 2 креста при отрицательных результатах в контроле. При оценке диагностического значения положительных результатов анализа обращают внимание не только на высоту титра обнаруженных АТ, но и на динамику их нарастания при исследовании парных сывороток. Повышение титра АТ в сыворотках, взятых повторно через 7-10 дней, указывает на инфекционный процесс. Отсутствие динамики может свидетельствовать об анамнестическом характере выявленных АТ.

При идентификации с помощью НМФА выделенных микроорганизмов о видовой (групповой) принадлежности последних судят по результатам титрования заведомо известных диагностических сывороток. Гомологичные микроорганизмы реагируют со специфическими сыворотками в максимальном разведении, близком к их титру.

Контрольные исследования. Контрольные исследования при иммунофлуоресцентной серодиагностике предусматривают:

1. исследование препаратов, обработанных на первом этапе заведомо «отрицательной» сывороткой и докрашенных соответстветствующим ей антивидовым флуоресцирующим иммуноглобулином;

2. исследование препаратов, обработанных непосредственно (без первого этапа) смесью флуоресцирующего антивидового иммуноглобулина с контрастирующим альбумином.

В обоих случаях специфическая флуоресценция должна отсутствовать.

При иммунофлуоресцентной идентификации выделенных микроорганизмов препараты обрабатывают на первом этапе серией нефлуоресцирующих специфических сывороток, а затем докрашивают соответствующими рабочими смесями конъюгатов. Специфическое свечение при этом может наблюдаться лишь в одном из окрашенных препаратов, а именно в обработанном на первом этапе гомологичной изучаемому агенту сывороткой. Все остальные препараты являются контрольными. Специфическая флуоресценция в них должна отсутствовать 5.1.6. Варианты иммуносорбентного анализа на твердой фазе Твердофазные методы исследования предполагают использование твердой фазы в качестве основы для сорбции на ней иммунных реагентов: АТ (АГ). Все этапы реакции протекают на границе 2-х фаз: твердой и жидкой. Не прореагировавшие компоненты удаляются с помощью отмывания. Чувствительность этих методов превышает аналогичный показатель агглютинационных реакций.

Иммуноэритроадсорбционный метод (ИЭАМ).

Принцип иммуноэритроадсорбционного метода обнаружения АГ (АТ) состоит в том, что специфические АТ (АГ), адсорбированные на стенках U-образной лунки твердой фазы, специфически взаимодействуют с искомым АГ (АТ), а последний затем иммунологически связывается со специфическими АТ (АГ), мечеными эритроцитами. Меченые эритроцитами АТ (АГ), вступившие во взаимодействие с АГ (АТ), остаются на стенках иммуносорбента (с образованием регистрируемого визуально “зонтика”), при отсутствии АГ (АТ) в исследуемом материале эритроциты под действием силы тяжести скатываются на дно лунки, формируя “пуговку”. В качестве твердой фазы в ИЭАМ используют 60-луночные микрокамеры с объемом лунок мкл – камеры Терасаки. Используемые в ИЭАМ эритроцитарные конъюгаты могут также применяться в РПГА в качестве антительного (антигенного) диагностикума.

Радиоиммунный анализ (РИА) – метод, в котором в качестве маркера АТ (АГ) используются радионуклиды – 125I, 14C, 3H, 51Cr и т.д. После взаимодействия АГ с АТ отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение):

при этом интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул АГ или АТ.

Иммуноферментный анализ (ИФА) (ELISA) – (от англ. ezyme-linked immunosorbent assay) - метод, в котором в качестве маркеров АТ (АГ) используют ферменты. Благодаря простоте и высокой чувствительности твердофазные иммуноферментные системы удобны для выявления АГ, АТ и иммунных комплексов. Проблемы специфичности ИФА по характеру и сложности те же, что и у других иммунологических методов. Они могут быть сведены к минимуму путем постоянного контроля качества реагентов и стандартизации методических приемов. Применение в ИФА моноклональных антител, обладающих строго определенной специфичностью и одинаковой аффинностью, позволяет повысить качество исследований (специфичность).

Твердофазными носителями для проведения ИФА могут быть различные материалы. В ранних разработках, как правило, использовали пластмассовые пробирки, на смену которым быстро пришли панели для титрования с лунками, имеющими плоское прозрачное дно, и удобные для измерения оптической плотности продуктов реакции на специальных приборах-ИФА-ридерах (от англ. to read-читать). Последние модификации в качестве твердой фазы предусматривают использование палочек и шариков, а также нитроцеллюлозных мембран, активно сорбирующих белки. Модификация с использованием мембран получила название «дот»ИФА. Планшетный вариант ИФА на протяжении еще многих лет останется наиболее распространенным для решения большинства научных и прикладных задач.

Основные принципы твердофазного ИФА: Возможность проведения иммуноферментного анализа независимо от его модификации основана на следующих четырех принципах: 1. Различные ферменты, наибольшее распространение из которых получили пероксидаза хрена (ПХ) и щелочная фосфатаза (ЩФ), можно ковалентно присоединить к АГ или АТ различными химическими методами в таких условиях, когда оба компонента конъюгата сохраняют свою биологическую активность (способность взаимодействовать с субстратом и антигенсвязывающую активность). 2.

Большинство АГ, в том числе белки, пептиды, полисахариды и бактериальные липополисахариды самопроизвольно сорбируются на поверхности пластика. АТ, будучи белками, тоже сорбируются на пластике и при этом сохраняют антигенсвязывающую активность.

Именно на этом принципе основан первый этап реакции, заключающийся в «сенсибилизации» панелей АГ или АТ. Адсорбированные на твердой фазе АГ и АТ уже не смываются буфером, содержащим детергент, тогда как не связавшиеся реагенты легко удаляются отмыванием. 3. В «сенсибилизированных» лунках инкубируют исследуемый образец и стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы, состоящие из одного или нескольких слоев. Не связавшиеся компоненты на каждом этапе удаляют отмыванием, что позволяет добиться высокой специфичности анализа в реакции входящего в состав конъюгата фермента с индикаторным субстратом. 4. При связывании конъюгата АТ=фермент или АГ=фермент с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для взаимодействия с субстратом.

Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит, как правило, к развитию цветной реакции. Эту реакцию останавливают на нужной стадии, а выраженность окрашивания оценивают визуально, сравнивая со стандартами, или инструментально по оптической плотности. Некоторые варианты метода, например, «дот»-ИФА и «метод индикаторной полоски» предполагают окрашивание самой твердой фазы. В этих случаях используют хромогенные субстраты, дающие продукты в виде нерастворимых, иммобилизованных на твердой фазе окрашенных преципитатов (табл.6).

Мета-малеигалак- мидобензол – N- Орто- нитрофетозидаза гидроксисукци- нил- -D галактозид (-Г) Пеницилодноэтапный Иод и крахмал обесцвечилиназа Методические варианты ИФА для определения антител и антигенов Для выявления и количественного определения АТ и АГ используют различные модификации ИФА с сенсибилизацией твердой фазысоответствующим иммунным реагентом.

«Сэндвич»-вариант ИФА для определения АГ и иммунных комплексов Благодаря методической простоте, специфичности и высокой чувствительности широкое распространение получил так называемый «сандвич» -вариант ИФА.

Его несложно модифицировать в «дот» - ИФА. В соответствии со схемой данного варианта анализа АТ (лучше моноклональные или высокоаффинные), адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом (а также с положительным и отрицательным контрольными образцами и разведениями стандартного АГ). После отмывания в лунки вносят меченные ферментом АТ к тому же АГ и далее раствор субстрата к используемому в конъюгате ферменту. Через определенное время развившуюся цветную реакцию останавливают ингибитором фермента.

Непрямой ИФА для выявления АТ Этот вариант ИФА наиболее удобен для повседневного анализа образцов сывороток на наличие специфических АТ. Для проведения анализа в лунках панелей адсорбируют АГ (экстракт из бактерий, паразитов или вирусов), далее в них инкубируют образцы сывороток или другого материала (например, молока, слюны, спинномозговой жидкости). Специфические АТ, связавшиеся с сенсибилизированными АГ, выявляют с помощью антиглобулиновых антител либо стафилококкового белка А, меченых ферментом. Стафилококковый белок А=Ф является универсальным конъюгатом, с помощью которого можно исследовать на наличие специфических АТ сыворотки крови людей и любых видов животных (кроликов, мышей, баранов, лошадей и т.д.). Визуализация реакции происходит при добавлении в лунки соответствующего ферменту раствора субстрата.

Для постановки ИФА важное значение имеют следующие моменты:

1. Панели для ИФА и их способность адсорбировать АТ или АГ. Полистироловые и полихлорвиниловые панели, выпускаемые различными производителями, могут сильно различаться по способности адсорбировать иммунные реагенты. Серьезные различия возможны и между отдельными партиями панелей одной марки. Лучше всего использовать высококачественные панели, предназначенные специально для ИФА. В этом случае «краевые» эффекты и различия в адсорбционной способности между отдельными планшетами и партиями сведены к минимуму, а оптические свойства лунок обеспечивают высокую точность учета результатов.

2. Оптимальная концентрация АТ или АГ для сенсибилизации панелей. Подбор оптимальной концентрации АТ или АГ для сенсибилизации панелей - один из наиболее ответственных этапов в ИФА. От него во многом зависят результаты проведения анализа. Сенсибилизация панелей недостаточным количеством АТ или АГ снижает чувствительность анализа и создает условия для неспецифической адгезии конъюгата непосредственно на пластике, неэкранированном сенситином. Это приводит, в конечном счете, к повышению фонового уровня реакции и неверной оценке результатов. Сенсибилизация чрезмерным количеством АТ или АГ может привести к неспецифическому связыванию реагентов с иммобилизованным сенситином.

3. Неспецифическое связывание и свойства конъюгата. Для высокочувствительного ИФA необходимо использование конъюгатов с возможно более высоким соотношением между уровнем сигнала (положительный результат) и шума (фоновый уровень). Высокое неспецифическое связывание может быть вызвано большими размерами полимеров конъюгатов. Для этого целесообразно использовать не концентрированные растворы конъюгатов, а разведенные до рабочего титра. Кроме того, неспецифическое связывание удается уменьшить, блокируя ответственные за этот процесс участки твердой фазы слабым раствором инертного белка в буфере для сенсибилизации. С этой целью обычно рекомендуют бычий сывороточный альбумин (БСА). После сенсибилизации твердой фазы соответствующими иммунными реагентами раствор БСА инкубируют в лунках панелей (30-45мин) при комнатной температуре. Панели затем отмывают и проводят последующие этапы анализа.

4. Свойства субстрата. Ортофенилендиамин (ОФД), применяемый в качестве субстрата для ПХ, светочувствителен и на свету в смеси с перекисью водорода (H2O2) спонтанно окрашивается в желтый цвет.

Поэтому субстрат готовят непосредственно перед постановкой реакции в сосуде, полностью обернутом фольгой. Панели после внесения раствора субстрата инкубируют в темноте. Реакцию следует остановить в тот момент, когда оптическая плотность (ОП) положительного контроля достигнет оптимального уровня при отсутствии окрашивания в отрицательных образцах. Для обеспечения стандартности результатов необходимо точно знать время оптимального развития цветной реакции и температуру ее проведения.

5. Хранение сенсибилизированных панелей. Панели, сенсибилизированные АТ и некоторыми АГ, после отмывания и тщательного высушивания можно хранить в герметичной упаковке с вложенным влагопоглотителем (гранулами силикагеля) при температуре 4 С.

Устойчивость разных АГ к высушиванию и хранению после иммобилизации на пластике неодинакова.

Интерпретация результатов ИФА При визуальной оценке. Интенсивность окрашивания в лунках с отрицательными контролями должна быть низкой. Ее оценивают как отрицательную (-) или неопределенную (±). В тех лунках, где прошла положительная реакция, степень окрашивания оценивают по четырехбальной шкале: от 4+ до 1+. Образцы, при титре которых получены неясные пограничные результаты, необходимо исследовать вновь в меньших разведениях, проводя повторно отрицательные контроли.

При спектрофотометрической оценке. Оценка результатов по пороговому уровню реакции. В простейшем случае результат считают положительным, если ОП исследуемого образца превышает максимальную ОП в лунках с отрицательными контролями.

Варианты твердофазного иммуноферментного анализа Известно несколько методических вариантов ИФA, различающихся по типу твердой фазы.

ИФA на стрипах ИФA обычно проводят в планшетах для микротитрования. Помимо целых панелей выпускаются и отдельные полоски (стрипы) с одним рядом лунок, из которых затем можно собрать панель необходимого размера и добиться таким образом экономии расходных материалов.

Результаты анализа в таких сборных панелях учитывают визуально или на обычном ИФА-ридере.

ИФА со стержнями Эта модификация заключается в том, что в каждую лунку панели погружают стержень, сенсибилизированный АГ или АТ. Таким образом, иммунные комплексы формируются на стержнях, а окрашивание растворимого субстрата обычно происходит в лунках. Результаты реакции учитывают так же, как и при традиционном ИФА в панелях. Вместо растворимого субстрата при осуществлении данного варианта ИФА можно использовать нерастворимый - в этом случае окрашивание регистрируют на «стержнях». Такой вариант, однако, менее удобен для точного количественного учета.

ИФА в кюветах Кюветы имеют больший объем по сравнению с лунками панелей и, следовательно, большую адсорбционную емкость, а также оптически прозрачные боковые стенки для измерения ОП на специальном ридере с горизонтальным направлением луча, что позволяют достичь более высокой чувствительности анализа. Однако данный вариант ИФА более дорогой, так как изза больших объемов кювет происходит значительный расход реагентов. ИФА в кюветах применяют главным образом для проведения одноэтапного гомогенного анализа низкомолекулярных веществ.

ИФА с нейлоновыми нитями или бусами Нити или шарики помещаются в лунки планшета и используются в качестве твердой фазы. Благодаря увеличению площади связывания иммунных реагентов повышается чувствительность ИФА, однако возникают большие неудобства при постановке анализа, в частности, при проведении процедур отмывания от не связавшихся компонентов.

Дот-ИФA ИФА можно проводить на листах или узких полосках мембран, обладающих адсорбционной активностью, в частности, - нитроцеллюлозной с применением нерастворимого субстрата. Лучшими реагентами для тестсистем, основанных на данной модификации, служат высокоаффинные моноклональные антитела. Методика точечной реакции на нитроцеллюлозной мембране получает все более широкое распространение под названием «дот» - ИФА. При осуществлении «дот» - ИФA АГ (АТ) в очень небольшом объеме ~ 1-2 мкл адсорбируют в виде пятен на нитроцеллюлозной мембране.

В качестве диагностикума в дот-ИФА используется тот же ферментный конъюгат, что и в планшетном варианте. Однако ферментные метки имеют ряд недостатков: значительная потеря активности фермента и лиганда в процессе получения конъюгата; необходимость хранения самого фермента и препаратов на его основе при низких температурах или в консерванте;

подверженность результатов анализа влиянию примесей в исследуемом образце, способных инактивировать фермент или провоцировать спонтанную реакцию;

токсичность отдельных компонентов проявляющей системы.

В связи с этим все более широкое распространение в настоящее время приобретают в качестве альтернативы ферментным меткам неорганические хромогенные маркеры: металлы - платина, золото, серебро, медь, кобальт, железо, палладий и неметаллы - селен, теллур, сера, кремний, углерод и др. Преимуществом указанных меток являются простота получения коллоидных частиц, связывание золя с иммунореагентами щадящим сорбционным способом, стабильность в относительно широком диапазоне физико-химических условий, безопасность для здоровья персонала.

Иммунохроматография. Иммунохроматографический метод анализа, появившийся в конце 1980-х годов (ZukR.F. etcd., f978), хорошо зарекомендовал себя как экспресс-метод выявления возбудителей инфекционных заболеваний и токсинов. Небольшое время анализа (несколько минут), отсутствие промежуточных стадий подготовки образца, возможность визуальной регистрации результатов анализа, высокая специфичность метода и достаточно высокая чувствительность делают его весьма привлекательным.

На основе иммунохроматографического (ИХ) метода с использованием частиц коллоидного золота разработаны иммунохроматографические индикаторные элементы для выявления спор сибирской язвы, возбудителей чумы, туляремии, сапа, холеры, ботулинического токсина типа A и других инфекционных болезней.

Создана производственная технологическая линия на базе Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии. Прошли процесс госрегистрации в ФС Росздравнадзора РФ иммунохроматографические индикаторные тест-системы для лабораторной диагностики чумы (2), туляремии, сибирской язвы (споры). Данные наборы тест-систем выпускаются в виде хаузенг-стрипов (индивидуальная пластиковая упаковка для каждого анализа) или готовых к использованию мембранных ИХ - полосок, упакованных по 10-20 штук в пластиковую пробирку.

ИХ - простой и удобный метод определения патогенных микроорганизмов, в отличие от традиционного ИФА, не требующий проведения процедур отмывки и других манипуляций. Основная проблема практического использования ИХ-тестов связана с повышением их чувствительности. С этой целью проводятся исследования по использованию систем концентрирования образца с применением магноиммуносорбентов, иммунофильтрации, а также использованию флуоресцентных маркеров иммунных реагентов с соответствующей детекцией флуоресценции специальными индикаторами. Параллельно идут исследования по разработке детектирующего оборудования для документирования результатов и программного обеспечения ИХ-исследований.

Мультиплексный фосфоресцентный микроанализ Современные тенденции в развитии методов лабораторной диагностики инфекций связаны с повышением не только чувствительности и специфичности, но и мультиплексности разрабатываемых тестов, то есть возможности одновременного определения нескольких маркеров в одной пробе без разделения последней на отдельные порции. Создание таких тестов является актуальным в связи с существованием «сочетанных»

природных очагов и «смешанных» инфекций и составляет основу разработки комплексного подхода к одновременному выявлению всего спектра потенциально возможных заболеваний при проведении скрининговых сероэпидемиологических исследований эндемичных территорий. Для реализации такого подхода возможно использование диагностической технологии на основе фосфоресцентного мультикомпонентного микроанализа (ФОСФАН). В настоящее время разработана биочип-технология ФОСФАН для индикации возбудителей особо опасных инфекций (рис. 20).

Рис. 20. Фосфоресцентный микроанализатор ФОСФАН.

В отличие от иммуночипов, формируемых на стекле, предлагаемый подход позволяет одновременно анализировать до 96 образцов и использовать для анализа стандартное оборудование (шейкеры, промыватели и т.п.). Комплект состоит из индикатора фосфоресценции (ИФИС), укладки для отбора проб и набора реагентов (тест-систем) для обнаружения и идентификации возбудителей сибирской язвы, чумы, туляремии, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, заболеваний ортопоксвирусной природы, Крымской геморрагической лихорадки, сыпного тифа, клещевой пятнистой лихорадки, токсинов ботулинического типа А и стафилококкового типа В. Принцип построения индикационных тестов универсален. На твердой фазе дна лунки полистиролового микропланшета сорбируют в виде отдельных микрозон специфические АТ. Формирование микрозон осуществляется контактным способом с помощью роботизированных наноплоттеров.

Стадии анализа включают инкубацию анализируемой пробы в лунках микропланшета, промывку лунок для удаления не связавшихся компонентов реакции, биоспецифическое связывание выявляемого в пробе патогена или его АГ с индикаторными АТ, конъюгированными с биотином. «Проявление» реакции осуществляют с помощью универсального фосфоресцирующего реагента - конъюгата стрептавидина с Pt копропорфирином. Сигнал фосфоресценции регистрируют при последовательном сканировании отдельных участков дна лунки микропланшета светодиодом с длиной волны излучения 380 нм. Чувствительность системы детекции составляет около 10б молекул Pt копропорфирина в освечиваемой площадке сканирования диаметром около 1 мм. Результаты сканирования регистрируют как число фотоимпульсов от каждой из микрозон. После компьютерной обработки графическая картина распределения сигнала в микрозонах представляется в виде объемных цветных гистограмм или окрашенных пятен. Интенсивность сигнала в виде цветовой шкалы отражает концентрацию патогена в исследуемой микрозоне.

В ходе анализа обеспечиваются требования противоэпидемического режима. Индикатор фосфоресценции размещается в боксированной зоне и управляется радиосвязью через персональный компьютер. После завершения иммунной реакции адсорбированный биоматериал сохраняет стабильный уровень фосфоресценции в течение нескольких месяцев. Это позволяет архивировать микропланшеты и, при необходимости, осуществлять повторное измерение сигнала.

Технология ФОСФАН сочетает преимущества твердофазного микропланшетного сэндвич-иммуноанализа с потенциалом биочип-технологий. По сравнению с классическими схемами твердофазного ИФА она имеет ряд очевидных преимуществ благодаря возможности осуществления мультикомпонентного анализа.

Микропланшетный формат выгодно отличает ее и от традиционных биочип-технологий на слайдах. Это обусловлено более благоприятными условиями для дозирования проб и реагентов и, как следствие, возможностью создания количественных тестов и многократного повышения производительности лабораторных исследований. Следует также добавить ряд важных экономических моментов, создающих очевидные конкурентные преимущества для данной технологии: уменьшение расхода АТ, используемых для сорбции на твердой фазе (почти в 100 раз); снижение расхода иммунореагентов (конъюгатов, биотинилированных АТ и стрептавидина) в 5-10 раз за счет обработки только дна лунок микропланшета. Благодаря высокой стабильности фосфоресцентной метки, дополнительным преимуществом метода является возможность отсроченного и (или) повторного измерения результатов анализа биоматериала в высушенных и герметично упакованных планшетах, которые могут храниться в архиве в течение длительного периода времени (месяцев, лет).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) Сэндвич-вариант ИФА для обнаружения АГ Принцип метода. Взаимодействие АГ с AT, меченым ферментом. Учет реакции осуществляется измерением ферментативной активности реакционной смеси, что дает возможность оценить количество искомого АГ в исследуемых образцах. Высокая чувствительность ИФА связана с каталитическими свойствами ферментов, одна молекула которых может реагировать с большим количеством (несколько тысяч) молекул субстрата.

Реактивы:

а) 0,05 М КББ рН 9,6: 5,25 г Nа2СОз и 4,2 г NaHCO доводят дистиллированной водой до объема 1 л. На 1 л NaHCO3 требуется 300 мл Nа2СO3. Хранят в холоде не более 2 недель.

б) ЗФР рН 7,2: 8 г NaCl, 0,2 г КН2РO4, 0,2 г КС1 и 2, г Na2HPO4 ·12Н2O растворяют в 1 л дистиллированной воды, рН доводят КН2РО4.

в) Отмывающий раствор: к 100 мл ЗФР рН 7,2 добавляют 50 мкл Твина-20.

г) 1%-ный БСА: в 100 мл ЗФР рН 7,2 растворяют 1 г БСА д) Субстрат: 10 мг дианизидина или диаминобензидина растворяют в 1 мл метанола, добавляют последовательно 99 мл дистиллированной воды и 0,1 мл 3% перекиси водорода. Раствор должен оставаться прозрачным. Готовить в химически чистой посуде!

е) Стоп-реагент- 3%-ный азид натрия: В 100 мл дистиллированной воды растворяют 3 г азида натрия.

Материал для исследования в ИФА обрабатывается так же, как для гемагглютинационных методов исследования.