«МЕТОД ОПТИЧЕСКОГО ПИНЦЕТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИЛ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И МИКРОМЕХАНИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КЛЕТОК ...»

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

УДК 535.214

Хохлова Мария Дмитриевна

МЕТОД ОПТИЧЕСКОГО ПИНЦЕТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СИЛ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И МИКРОМЕХАНИЧЕСКИХ

ХАРАКТЕРИСТИК КЛЕТОК

01.04.05 - оптика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук А. А. Федянин Москва - Оглавление Оглавление Введение Глава I Обзор литературы: метод оптического пинцета для ис следования упругих и агрегационных свойств эритроцитов 1. Принцип работы оптического пинцета......................... 1.1. История создания и принцип работы оптического пинцета 1.1.1. Рассмотрение принципов работы оптического пинцета в приближении геометрической оптики........... 1.1.2. Рассмотрение работы оптического пинцета в приближении Рэлея...................................... 1.1.3. Расчет сил оптического захвата для частиц сравнимого с длиной волны размера....................... 1.2. Принципиальная экспериментальная схема оптического пинцета............................................... 1.3. Пределы возможности захвата частиц в оптическую ловушку................................................ 2. Методы калибровки установки оптического пинцета............ 2.1. Калибровка силы оптического захвата микрообъекта по силе вязкого трения..................................... 2.2. Калибровка силы оптического захвата микрообъекта по броуновскому движению............................... 2.3. Калибровка силы оптического захвата по определению его динамики............................................. 3. Практические реализации экспериментальных установок оптического пинцета................................................ 3.1. Многолучевой оптический пинцет....................... Оглавление 3.2. Особенности калибровки многолучевого оптического пинцета.................................................. 3.3. Оптический пинцет на суперконтинууме................. 3.4. Волоконно-оптический пинцет.......................... 4. Применения и задачи, решаемые методом оптического пинцета.. 5. Реологические свойства крови. Методы исследования агрегации эритроцитов и их эластичных свойств......................... 5.1. Эритроциты: функции и строение....................... 5.2. Агрегация эритроцитов: описание и механизмы.......... 5.3. Методы изучения агрегации эритроцитов................ 5.3.1. Методика измерения скорости оседания эритроцитов 5.3.2. Метод втягивания клеток в микропипетку......... 5.3.3. Фотометрические методы оценки агрегационных свойств клеток............................................ 5.3.4. Электронная микроскопия для исследования агрегации эритроцитов................................... 5.3.5. Атомно-силовая микроскопия для исследования агрегации эритроцитов............................... 5.3.6. Оптическая микроскопия для исследования агрегации эритроцитов................................... 5.3.7. Метод оптического пинцета для исследования агрегации эритроцитов................................. 5.4. Деформируемость и эластичные свойства эритроцитов... 5.4.1. Локальные методы исследования механических свойств эритроцитов....................................... 5.4.2. Методы исследования механических свойств одиночных эритроцитов как цельной клетки............... 5.5. Фликкер эритроцитов: описание и методы исследования.. Оглавление Глава II Изучение вязкоупругих свойств одиночных эритроци тов методами активной и пассивной микрореологии в оптическом пинцете 1. Материалы и методы для диагностики микромеханических свойств 2. Калибровка оптического захвата микрочастиц и более сложных 2.2. Калибровка оптического захвата микросфер: метод пассивной микрореологии для измерения авто- и кросс-корреляций 2.3.1. Сравнение сил оптического захвата края эритроцита 2.3.2. Сравнение силы оптического захвата микросферы и 2.3.3. Определение жесткости ловушки при оптическом захвате края эритроцита и эффективной жесткости клетки для малых деформаций......................... Оглавление 3.2.1. Определение упруго-вязких свойств эритроцитов на Глава III Изучение агрегационных свойств эритроцитов в ауто 1. Материалы и методы для измерения сил и скоростей агрегации 1.1. Схема экспериментальной установки двухлучевого оптического пинцета......................................... 1.2. Изготовление образцов для исследования агрегации эритроцитов в оптическом пинцете.......................... 2. Исследование агрегации эритроцитов на уровне одиночных клеток методом двухлучевого оптического пинцета.................... 2.1. Оптический захват эритроцитов, и наблюдение процесса их 2.2. Калибровка сил оптического захвата эритроцитов в аутологичной плазме....................................... 2.3. Прямое измерение сил агрегации пары эритроцитов методом двухлучевого оптического пинцета.................. 2.4. Модель взаимодействия эритроцитов в парном агрегате.. 2.5. Исследование временной динамики сил агрегации эритроцитов методом оптического пинцета..................... Оглавление 2.7. Сравнение агрегационных свойств эритроцитов для нормы Глава IV Исследование механизмов агрегации эритроцитов в растворах различных белков, а также рецепторного 1. Исследование механизмов агрегации эритроцитов в растворах различных белков плазмы крови................................. 1.1. Материалы и методы для определения сил взаимодействия одиночных эритроцитов в растворах различных белков 1.2. Калибровка силы оптического захвата эритроцита....... 1.3. Особенности взаимодействия одиночных эритроцитов в 2. Исследование рецепторного вклада в механизмы агрегации эритроцитов....................................................... 2.1. Материалы и методы для измерения сил агрегации эритроцитов, индуцированной специфическим связыванием фибриногена.............................................. Введение Диссертационая работа посвящена развитию методики двухлучевого оптического пинцета для экспериментального изучения микромеханических свойств одиночных эритроцитов в широком диапазоне частот, а также сил и особенностей взаимодействия эритроцитов на уровне одиночных клеток.

Впервые принципы работы оптического пинцета были продемонстрированы в работах Артура Ашкина [1, 2]. При фокусировке лазерного пучка в области перетяжки возникает неоднородное электромагнитное поле, которое является эффективной потенциальной ямой для микрообъектов, находящихся вблизи этой перетяжки. Методом оптического пинцета называют захват исследуемых микрообъектов в перетяжку лазерного пучка, а также управление положением этих микрообъектов в пространстве. Возможность управления захваченными микрообъектами, а также разработка методик по калибровке сил оптического захвата для различных микрообъектов позволяет применять оптический пинцет для задач, связанных с сортировкой, упорядочением или локализацией одиночных микрообъектов, взвешенных в жидкости, и количественным измерением сил взаимодействия фемтоньютонного масштаба между ними. Уникальной особенностью оптического пинцета является возможность изучения свойств одиночных микрообъектов. Достигается это тем, что, как правило, используется суспензия микрочастиц, что позволяет изучать сами микрочастицы без учета их взаимодействия с подложкой, зондом и т.п. Для избежания перегрева и разрушения образцов длину волны лазера выбирают таким образом, чтобы вещество захватываемых объектов и окружающей их среды не поглощало на этой длине волны. Именно поэтому для формирования оптических ловушек обычно используются лазеры с длиной волны, лежащей в инфракрасном диапазоне.

Оптический пинцет в настоящее время используют для исследования широкого круга биохимических и биофизических процессов, начиная от основных механических свойств биологических полимеров и тканей и заканчивая Введение внутренней динамикой одиночных клеток. В настоящее время активно развиваются методы для локального исследования микромеханических характеристик [3] и сил взаимодействия объектов на микромасштабах [4], что обусловлено как фундаментальным, так и практическим интересом в ряде областей:

в медицине [5], клеточной биологии [6, 7], коллоидной химии. Метод оптического пинцета является уникальным для решения круга задач, связанных с количественным описанием свойств объектов на микромасштабах. Он позволяет с большой точностью измерять силы от нескольких фемтоньютонов [8] до десятков пиконьютонов [9, 10]. Эти силы сопоставимы с силами межклеточных или молекулярных взаимодействий, тем самым оптический пинцет позволяет изучать биофизику отдельных клеток или молекул, открывая при этом новые горизонты во многих областях биофотоники и биомедицины. Так, например, метод оптического пинцета широко применяется для исследования молекулярных моторов [11,12], отдельных молекул [12,13], определения упругих свойств клеточных мембран [9, 10, 14], жгутиков бактерий [15], спиралей отдельных молекул ДНК [16]. Метод оптического пинцета нашел широкое распространение в приложениях клеточной биологии, так как позволяет фиксировать, перемещать и прикладывать требуемые силы к живым клеткам в среде, близкой к естественной для них. В частности, метод используется для изучения свойств эритроцитов.

На сегодняшний день актуальной задачей является изучение микромеханических свойств и сил взаимодействия одиночных эритроцитов, взвешенных в естественной для них среде. Деформационные и агрегационные свойства эритроцитов в основном определяют реологию крови на уровне микрососудов, то есть в значительной степени влияют на микроциркуляцию крови. В связи с этим особый интерес представляет развитие методик, позволяющих определять микромеханические свойства и силы взаимодействия одиночных клеток, локализованных в жидкости вдали от подложки. Эритроцит представляет собой клетку, которую можно рассматривать как систему с различными характерными временами процессов, происходящих в ней. Именно Введение поэтому большой интерес представляет исследование механического отклика эритроцитов на внешнее воздействие и их вязкоупругих свойств в широком диапазоне частот. Способность эритроцитов к агрегации является одним из важнейших компонентов в микроциркуляции крови, а значит и функционирования организма в целом. На сегодняшний день исследование этого явления актуально из-за неоднозначности в трактовке ее механизмов, а также из-за значимости этого процесса в развитии различных патологий. Известно, что повышенная агрегация является следствием некоторых тяжелых патологий, например, системной красной волчанки (СКВ). СКВ системное аутоиммунное заболевание, при котором из-за генетической предрасположенности происходит нарушение работы иммунной системы. При этом возможно повреждение или изменение свойств собственных клеток организма, в том числе, и эритроцитов. Агрегация эритроцитов больных СКВ изучены слабо, но имеются свидетельства ее усиления, например, увеличение размера агрегатов эритроцитов у больных СКВ. При заболеваниях, связанных с гемореологическими нарушениями, возрастание степени агрегации и затруднение процесса дезагрегации клеток приводит к тому, что кровоток в венулах затрудняется (“заиливание крови”) [5]. Так, повышенная степень агрегации ведет к ухудшению процесса снабжения тканей кислородом и является одной из причин развития ишемии и тромбоза. Поэтому изучение механизмов и сил агрегации имеет не только фундаментальный интерес, но и медицинское приложение. Агрегация эритроцитов изучалась различными интегральными способами, основанными на усредненном отклике большого числа эритроцитов, такими как, например, метод регистрации обратного светорассеяния [17, 18].

Попытка исследования этого явления на одиночных клетках методом оптического пинцета представлена на сегодняшний момент лишь в единичных работах [19].

Целями работы является развитие методики оптического пинцета для исследования вязкоупругих и агрегационных свойств клеток на примере эритроцитов в естественной среде, а также применение этих методов для диаВведение гностики вязкоупругих свойств мембран эритроцитов в широком диапазоне частот методами пассивной и активной микрореологии, а также для прямого измерения сил и определения механизмов агрегации эритроцитов на одиночных клетках с помощью двухлучевого оптического пинцета.

Актуальность работы обусловлена как фундаментальным интересом к проблемам, связанным с выявлением неизвестных механизмов агрегации эритроцитов, диагностикой их вязкоупругих свойств в широком диапазоне частот, так и практическим интересом к развитию оптических методов диагностики реологических характеристик крови агрегационных и микромеханических свойств одиночных эритроцитов в потоке.

Достоверность полученных в работе результатов подтверждается их согласием с данными экспериментов, проведенных в Научно-исследовательским институтом механики МГУ, соответствием результатов теоретическим оценкам, многократным повторением экспериментов, согласием экспериментальных результатов с данными, полученными в работах других авторов. Результаты исследований неоднократно обсуждались на семинарах и докладывались на специализированных научных конференциях по проблемам, связанным с тематикой диссертационной работы. Результаты опубликованы в международных и российских журналах. Представленные результаты являются новыми и получены впервые.

Научная новизна результатов диссертационной работы заключается в следующих положениях:

Предложен новый метод диагностики микромеханических свойств одиночных эритроцитов с использованием оптического пинцета. Метод предполагает прямое определение эффективных вязкоупругих характеристик клетки, взвешенной в жидкости вдали от подложки, без использования вспомогательных микрочастиц, в диапазоне частот 1 Гц 250 кГц. Метод основан на корреляционном анализе случайных смещений краев эритроцита, захваченных одновременно в две оптические ловушки, для низких частот и на анализе фазового сдвига в осцилляциях противоположных краев клетки, захваченВведение ных одновременно в две оптические ловушки, положение одной из которых совершает высокочастотные колебания.

Впервые методом двухлучевого оптического пинцета напрямую измерены силы взаимодействия одиночных эритроцитов в парном агрегате, взвешенном в аутологичной плазме крови. Впервые показано различие в силе сдвиговой дезагрегации нормальных и патологически измененных эритроцитов, измеренной методом двухлучевого оптического пинцета на уровне одиночных клеток.

Впервые экспериментально продемонстрирован вклад различных белков плазмы в агрегацию одиночных эритроцитов и определены концентрационные зависимости сил сдвиговой дезагрегации клеток в растворах фибриногена, иммуноглобулина и альбумина методом двухлучевого оптического пинцета. Впервые показана значимость рецепторного механизма агрегации эритроцитов на уровне одиночных клеток.

Практическая значимость работы состоит в возможном использовании полученных результатов для задач, связанных с управлением и характеризацией микрообъектов методом оптического пинцета, развитием методов диагностики заболеваний, связанных с изменением реологических свойств крови.

Положения, выносимые на защиту:

• Метод активной и пассивной микрореологии в оптическом пинцете применим для определения эффективных микромеханических характеристик одиночных эритроцитов. Для частот до 100 Гц корреляционный анализ броуновских смещений локализованных в оптические ловушки краев эритроцита позволяет характеризовать вязкоупругие свойства клетки. Механические свойства эритроцитов для частот от 100 Гц до кГц могут быть определены методом оптического пинцета посредством регистрации амплитуд и фаз вынужденных колебаний краев эритроцита.

• На частотах в окрестности 130 кГц эритроцит имеет резонансную особенность, проявляющуюся в диссипации механической энергии, добавВведение ляемой в клетку осциллирующей оптической ловушкой, в которой локализован один из краев эритроцита.

• Силы агрегации одиночных эритроцитов могут быть измерены методом двухлучевого оптического пинцета. Силы взаимодействия между эритроцитами увеличиваются при увеличении расстояния между центрами клеток.

• Сила неспецифической агрегации одиночных эритроцитов в растворе фибриногена или иммуноглобулина, измеренная методом оптического пинцета, увеличивается при увеличении концентрации белков. Усиленная агрегация эритроцитов в норме может быть обусловлена специфическим связыванием фибриногена с рецептором на поверхности мембран клеток.

• При агрегации эритроцитов в растворе фибриногена наблюдается равномерно распределенная по всей поверхности клеток связь между мембранами. При агрегации в растворе иммуноглобулина образуются сильные точечные связи между мембранами эритроцитов.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, содержащего выводы, и списка литературы. Основная часть работы имеет следующую структуру:

• Глава 1 посвящена обзору литературы по объектам изучения и экспериментальным методам, используемым в работе.

• Глава 2 посвящена разработке метода для определения вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов, взвешенных в жидкости, в широком диапазоне частот от единиц герц до 250 кГц, при этом используются подходы пассивной и активной реологии в двухлучевом оптическом пинцете.

• Глава 3 посвящена развитию метода, позволяющего напрямую измерять силы взаимодействия между одиночными эритроцитами в аутологичной Введение среде при их дезагрегации с помощью двух оптических ловушек с калиброванными силами оптического захвата, а также определять отличия в силах и скоростях агрегации нормальных и патологически измененных эритроцитов на уровне одиночных клеток.

• Глава 4 посвящена экспериментальному определению механизмов агрегации эритроцитов путем измерения сил взаимодействия между одиночными клетками и исследованию типа их взаимодействия в растворах основных белков плазмы крови, участвующих в агрегации эритроцитов: иммуноглобулина, фибриногена и альбумина, а также определению вклада специфического рецепторного механизма агрегации эритроцитов.

Апробация работы проводилась на следующих конференциях:

• Международная конференция “Saratov Fall Meeting 2013” (Саратов, Россия, 2013) • Международная конференция “21th International Conference on Advanced Laser Technologies 2013” (Будва, Черногория, 2013) • Международная конференция “ICONO/LAT 2013” (Москва, Россия, • Международная конференция “SPIE Photonics Europe 2012” (Броссель, Бельгия, 2012) • Международная конференция “SPIE Optics + Photonics 2012” (СанДиего, США, 2012) • Всероссийская конференция “Пятая Всероссийская с Международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения” (Москва, Россия, 2012) • Международная конференция “19th International Conference on Advanced Laser Technologies” (Золотые Пески, Болгария, 2011) Введение • Международная конференция “CLEO, Optical Society of America” (Сан Хосе, США, 2010) • Международная конференция “International Conference on Lasers, Applications, and Technologies” (Казань, Россия, 2010) Глава I Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих и агрегационных свойств эритроцитов 1. Принцип работы оптического пинцета 1.1. История создания и принцип работы оптического пинцета Пионерские работы 1970-х годов в области оптического управления и захвата микрообъектов принадлежат Роберту Ашкину [1, 2]. В этих работах были представлены результаты наблюдения действия сил давления света на различные прозрачные микрочастицы, было продемонстрировано, что положение прозрачных диэлектрических микрочастиц можно изменять и контролировать, прикладывая оптические силы как в воде, так и в воздухе. Была впервые показана экспериментальная возможность оптического захвата микрочастиц в трехмерные оптические ловушки, созданные как на основе двух лазерных пучков, распространяющихся в противоположных направлениях, так и на основе одного жестко сфокусированного лазерного пучка. Именно такой однолучевой подход, позволяющий управлять положением микрообъектов, получил широкое распространение и называется методом оптического пинцета.

Соотношение между размерами захватываемых микрочастиц и длиной волны излучения определяет подход, в рамках которого рассматриваются принципы работы оптического пинцета. Существуют два важных предельных случая - приближение рассеяния Рэлея и приближение геометрической оптики.

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... 1.1.1 Рассмотрение принципов работы оптического пинцета в приближе нии геометрической оптики Для случаев, когда размеры захватываемых частиц велики по сравнению с длиной волны оптического излучения, появление оптических сил описывается явлениями преломления и отражения света. Лазерное излучение имеет высокую степень пространственной когерентности, поэтому лазерный пучок можно сфокусировать в пятно, размеры которого сравнимы с длиной волны используемого лазерного излучения. Неоднородное распределение электромагнитного поля в перетяжке жестко сфокусированного лазерного пучка формирует эффективную потенциальную яму для частиц, находящихся вблизи перетяжки. Микрочастица, показатель преломления которой превышает показатель преломления окружающей среды, при попадании в область перетяжки лазерного пучка преломляет и рассеивает падающее на нее излучение (рисунок 1).

Рис. 1: Иллюстрация принципа работы оптического пинцета (приближение геомет рической оптики). F возвращающая сила при смещении частицы перпендику лярно оси падающего оптического пучка (а), параллельно этой оси (б, в), p, p’ суммарные импульсы света до и после рассеяния и преломления на микрочастице, соответственно.

Если прозрачная микрочастица находится в центре перетяжки пучка, то направление и величина суммарного импульса света после прохождения светового пучка через частицу не меняется, она находится в положении равновесия (рисунок 1а). Если же в результате броуновского движения микрочастица смещается в любом направлении относительно центра перетяжки (рисунок Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... 1б, в), происходит изменение направления суммарного импульса света после преломления и рассеяния на частице. Вследствие закона сохранения импульса возникают действующие на микрочастицу силы, возвращающие ее в положение равновесия. В равновесном положении, то есть когда микрочастица находится в центре перетяжки лазерного пучка, равнодействующая этих сил равна нулю. Если же микрообъект имеет меньший по сравнению с окружающей средой показатель преломления (например, воздушный пузырь в воде), то под действием лазерного пучка он будет выталкиваться из перетяжки [1].

В данном рассмотрении важно также учитывать, что возможны эффекты отражения и поглощение света в частице. Это приводит к возникновению силы, пропорциональной интенсивности падающего на частицу светового потока и направленной вдоль его распространения. Если исследуемая частица недостаточно прозрачна на длине волны используемого лазерного излучения, она будет выталкиваться из оптической ловушки, эффекта оптического захвата не будет происходить.

1.1.2 Рассмотрение работы оптического пинцета в приближении Рэлея Под действием внешнего электрического поля в диэлектрических микрообъектах индуцируется дипольный момент. В случаях, когда диаметр захваченной в ловушку частицы значительно меньше, чем длина волны света, удовлетворяются условия рассеяния Рэлея, и частицу можно рассматривать как точечный диполь в неоднородном электромагнитном поле. Сила, действующая на диэлектрическую частицу в приближении точечного диполя, определяется силой Лоренца [2, 20]:

где E и B вектор электрической и магнитной напряженности поля, соответственно, p индуцированный в частице диполь. Первое слагаемое определяется взаимодействием диполя с неоднородным электромагнитным полем сфокусированного лазерного пучка. Вторым членом можно пренебречь, так Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... как он представляет собой производную по времени величины, которая линейно связана с вектором Пойнтинга. При этом считается, что мощность лазера не меняется со временем, поэтому среднее значение производной этой Важно отметить, что в этом случае полная сила Лоренца, действующая на частицу в среде с показателем преломления nm, может быть разделена на две компоненты. Первую традиционно называют градиентной силой. Она пропорциональна градиенту интенсивности лазерного излучения. Градиентная сила определяется взаимодействием диполя с неоднородным электромагнитным полем [2, 20]:

где поляризуемость сферы. Видно, что градиентная сила направлена по градиенту электромагнитного поля, то есть в область наибольшей интенсивности света в центре перетяжки пучка, в случае, когда m > 1. Вторая составляющая силы сила, связанная с эффектом рассеяния лазерного излучения пропорциональна интенсивности света и направлена вдоль распространения лазерного пучка. Она определяется поглощением и переизлучением света точечным диполем. Для частицы с радиусом a эта сила может быть записана следующим образом [2, 20]:

где I0 интенсивность падающего на рассеиватель излучения, поперечное сечение рассеяния сферы, nm показатель преломления среды, скорость света в вакууме, m отношение показателя преломления частицы к показателю преломления среды (np /nm ), длина волны излучения Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... лазера, формирующего ловушку.

В результате сложения этих двух сил место равновесного положения захваченного в оптическую ловушку объекта смещается вдоль распространения пучка относительно положения максимума интенсивности (рисунок 2).

Рис. 2: Сложение силы, связанной с рассеянием излучения, и градиентной силы при оптическом захвате микрообъекта [21]. Черная линия сила, связанная с рас сеянием излучения, в зависимости от смещения захваченного микрообъекта отно сительно оси лазерного пучка. Зеленая линия градиентная сила. Синяя линия результирующая градиентной силы и силы, связанной с рассеянием лазерного излучения.

Стабильный захват микрочастицы в однолучевом оптическом пинцете возможен, когда отношение градиентной силы к силе, связанной с рассеянием, больше единицы для положения с максимальным значением градиента интенсивности. Для гауссовского пучка с размером фокального пятна 0 эти условия достигаются при аксиальном положении объекта z = 0 / 3 [2].

То есть условие стабильного оптического захвата можно записать следующим образом:

Оптический захват при указанных условиях был неоднократно продемонстрирован для микрообъектов из различного материала и с размерами от Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... десятков нанометров до микрометров [2, 22–24].

Важно подчеркнуть, что при смещении захваченного микрообъекта из центра ловушки на него начинает действовать возвращающая сила оптического пинцета. При этом сила оптического захвата линейно изменяется при небольших смещениях объекта относительно центра ловушки и принимает максимальные значения на определенном расстоянии от нее, величина которого определяется параметрами оптической ловушки. В английской литературе значения максимальной силы захвата для фиксированных параметров ловушки получили устоявшееся название escape trapping force. Будем в дальнейшем обозначать эту силу Fesc. Наблюдая за смещениями микрообъекта из оптической ловушки, для которой известна зависимость ее возвращающей силы от смещения объекта, можно определять внешнюю силу, под воздействием которой произошло это смещение. Такой подход получил название фотонно-силовой микроскопии [25–27]. Таким образом, метод оптического пинцета можно применять для прямого измерения сил, действующих на объект исследования.

1.1.3 Расчет сил оптического захвата для частиц сравнимого с длиной вол На практике часто встречаются объекты исследования, размеры которых строго не подходят под условия рассеяния Рэлея или приближение геометрической оптики размеры этих объектов сравнимы с длиной волны лазерного излучения. Более того, далеко не всегда исследуемые объекты имеют сферическую форму. Для расчета сил, действующих на такие объекты в оптической ловушке, используют метод, предложенный в работах [28, 29]. В этих работах рассматривается случай, когда размер изучаемых частиц и длина волны лазерного излучения имеют один порядок величины, а сама частица может иметь несферическую форму. Приближение плоских волн при решении задачи рассеяния света на частице в случае, когда она находится в перетяжке лазерного пучка, не верно. Картина рассеяния на захваченной частице зависит Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... от ее положения внутри пучка. Для точного решения уравнений Максвелла и расчета картины рассеяния используется метод Т-матриц, который заключается в установлении связи между волной, падающей на частицу, и рассеянной волной. Падающую и рассеянную волны можно представить в виде разложеinc) (scat) уравнения Гельмгольца:

где an, pk коэффициенты разложения для падающей и рассеянной волн, соответственно, связь между которыми можно записать следующим образом:

или:

где Tkn элементы Т-матрицы. Вид Т-матрицы определяет размер, ориентация в пространстве, форма, состав рассматриваемой частицы и длина волны излучения.

Электрические поля до и после рассеяния на частице (Ein и Eout, соответственно) могут быть разложены в ряд по векторным сферическим волновым функциям:

где Mnm (kr) = Nn hn (kr)Cnm (, ), Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... векторные сферические волновые функции, hn сферические функkr) ции Ханкеля первого и второго рода, Nn = [n(n + 1)] 2 нормировочные константы, Bnm (, ) = r Yn (, ), Cnm (, ) = (rYn (, )), Pnm (, ) = Yn (, ) векторные сферические гармоники, а Yn (, ) нормированные скалярные сферические гармоники. После вычисления векторных сферических волновых функций для одного положения начала координат, возможно вычисление изменений векторных сферических волновых функций при вращении системы координат или перемещении начала отсчета по схемам последовательных приближений. Таким образом можно определить поля Ein и Eout. Далее можно вычислить оптическую силу, действующую на исследуемую частицу, интегрируя максвелловский тензор напряжений по поверхности, окружающей частицу.

1.2. Принципиальная экспериментальная схема оптического пинцета Типичные экспериментальные установки однолучевого оптического пинцета обычно включают в себя следующие элементы. Для формирования оптической ловушки используются одномодовые лазеры, чаще всего с T EM модой, обладающие высокой стабильностью мощности излучения. Диапазон длин волн излучения таких лазеров чаще всего выбирается из ближнего ИКдиапазона, поскольку именно в этом диапазоне большая часть материалов имеет очень невысокое поглощение. Для достижения наибольшей фокусировки лазерного луча используются высокоапертурные объективы. Принципиальная схема такой экспериментальной установки оптического пинцета приведена на рисунке 3.

Свет от лазера (1) проходит через формирователь пучка (2), например, конфокальную систему линз. Таким образом пучок расширяется и поступает на вход объектива с большой числовой апертурой (3). Это необходимо для создания максимально возможного градиента электромагнитного поля в перетяжке лазерного пучка. Предметный столик, на который помещается кювета с образцом (4), должен позволять перемещать образец относительно Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... Рис. 3: Принципиальная схема установки оптического пинцета. 1 лазер, формирователь пучка, 3 объектив с высокой числовой апертурой, формирующий оптическую ловушку, 4 исследуемый образец, 5 конденсор, 6 осветитель, фотоокуляр, 8 видеокамера, 9 квадрантный фотодиод оптической ловушки в трех измерениях. Наблюдение захваченных объектов осуществляется обычно с помощью микроскопа, например, в геометрии “на просвет”: на образец свет поступает через конденсор (5) от осветителя, проходит через исследуемый образец (4) и собирается объективом (3). Затем рассеянный образцом свет отражается от диэлектрического зеркала и с помощью фотоокуляра (7) направляется на цифровую камеру (8).

Для большинства задач, связанных с использованием метода оптического пинцета, требуется возможность измерения малых смещений захваченных в ловушку микрообъектов. Это может быть реализовано различными способами. Распространенным подходом является видеорегистрация смещений микрообъектов [30, 31], при котором можно добиться субпиксельной точности определения положения объекта, вплоть до 10 нм, при использовании специальных алгоритмов обработки изображения [32]. Альтернативным подходом является прямое детектирование положения захваченного объекта с помощью квадрантных фотодиодов (КФД) [33, 34]. Квадрантный фотодиод представляет собой четыре независимых фотодиода, рабочая поверхность которых – есть квадранты одного круга. Обычно для измерения малых смещеОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... ний захваченного объекта используется либо дополнительный лазер, который также направляется и фокусируется в область захвата, либо используется лазер, формирующий оптическую ловушку (рисунок 39). Рассеянное излучение от захваченного микрообъекта направляется на квадрантный фотодиод. При смещении объекта в оптической ловушке смещается по поверхности фотодиода и рассеянный объектом лазерный пучок. Независимые измерения сигнала с каждого сектора, а также измерение суммарного сигнала со всех четырех секторов позволяют определить смещения рассеянных захваченными объектами лучей, а значит и смещения самих объектов по трем координатам.

Естественным развитием однолучевой модификации оптического пинцета являются многолучевые установки, которые позволяют создавать одновременно несколько независимых оптических ловушек в плоскости образца.

Для этого либо используются схемы с несколькими лазерами для формирования оптических ловушек, либо единственный лазерный пучок пропускают через акусто-оптический дефлектор или пространственный модулятор света (ПМС). С помощью акусто-оптического дефлектора лазерное излучение можно разделить во времени на несколько лучей, а с помощью дифракционных оптических элементов (ПМС) разбить на несколько лучей в пространстве.

1.3. Пределы возможности захвата частиц в оптическую ловушку Принципиальная возможность оптического захвата объектов определяется балансом между контрастом показателей преломления объекта и среды, в которую он помещен, размером и массой частицы, длиной волны оптического излучения и поглощения объекта на этой длине волны (4). Обычно метод оптического пинцета применяется для захвата частиц с размерами 0, мкм. При этом оптический захват возможен как для более крупных, так и для частиц меньшего размера.

Можно показать, что на микрочастицу из диоксида кремния SiO2 с диаметром d = 3 мкм, взвешенную в воде, действуют сила тяжести (Fgrav ) и сила Архимеда (FArch ). Величина разности этих двух сил равна 0,1 пН. Если таОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... кую частицу, взвешенную в воде, поместить в оптическую ловушку, на нее будет действовать сила оптического захвата. Максимальная захватывающая сила Fesc оптической ловушки обычно составляет величину порядка 1 пН на каждые 10 мВт лазерного излучения в области перетяжки для частиц микронного размера [20]. Таким образом, при мощности лазерного излучения в ловушке около 10 мВт сила оптического захвата для рассматриваемой частицы будет на порядок выше разности сил тяжести и силы Архимеда, то есть будет наблюдаться стабильный оптический захват.

Максимальный размер частиц, с которыми можно работать с помощью метода оптического пинцета, определяется конечностью потока импульса в лазерном пучке. При увеличении размера частицы происходит непрерывный рост силы тяжести, действующий на нее. При значительном увеличении интенсивности лазерного излучения захваченные объекты начинают поглощать, их тепловая энергия растет, амплитуда броуновского движения увеличивается. В определенный момент кинетическая энергия объекта становиться больше потенциала оптической ловушки. Поэтому метод оптического пинцета становится неприменим для частиц сравнительно большого размера. Для манипулирования крупными частицами можно использовать более грубые методы, например, микропипетки.

Для частиц малого размера градиентные силы захвата пропорциональны объему частицы (см. выражение 2), в то время как силы, связанные с рассеянием лазерного излучения, действующие на частицу вдоль направления лазерного пучка, пропорциональны квадрату объема частицы (см. выражение 3). Поэтому становится возможным захват широкого круга частиц малого размера (10–1000 нм), например отражающих частиц, которые при больших размерах выталкивались бы из ловушки. В одной из первых работ Ашкина [2] экспериментально был продемонстрирован захват частиц с размерами от нм до 10 мкм в воде.

Однако вопрос о возможности оптического захвата частиц зачастую рассматривается с точки зрения удобства эксперимента. Для реальных исследоОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... ваний свойств частиц и силовых взаимодействий между ними методом оптического пинцета часто необходима их визуализация, поэтому размер частиц не должен быть существенно меньше длины волны излучения, используемого для освещения образца. По критерию Рэлея разрешающая способность объектива:

где n sin его числовая апертура. Поэтому ограничение на минимальный размер частиц, которые может разрешить объектив с числовой апертурой 1, при освещении с длиной волны 500 нм без дополнительных методов контрастирования (темное поле, дифференциально интерференционный контраст, поляризованный и фазовый контраст):

2. Методы калибровки установки оптического пинцета Метод оптического пинцета является не только инструментом для управления и манипулирования различными микро- и нанообъектами, но и прибором, который дает возможность проводить количественные измерения сил, действующих на захваченные объекты. Для этого необходима калибровка установки оптического пинцета, то есть определение силы захвата объекта оптическим пинцетом. Для этого обычно применяются методики, суть которых заключается в сравнении силы захвата с какой-либо другой известной силой, значение которой можно определить. Часто процедура калибровки позволяет определить жесткость ловушки, то есть отношение возвращающей силы, действующей на частицу со стороны оптической ловушки, к смещению этой частицы из центра ловушки. Ниже описаны некоторые способы калибровки оптического пинцета.

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... 2.1. Калибровка силы оптического захвата микрообъекта по силе вязкого Этот метод основан на сравнении силы захвата с силой вязкого трения, которая в случае сферической частицы определяется формулой Стокса F = 6rv, где r и v радиус и скорость сферической частицы соответственно, динамическая вязкость жидкости. Процедура калибровки состоит в следующем. Микрочастицу с известным размером и помещенную в жидкость с известной динамической вязкостью захватывают в оптический пинцет. Далее оптическую ловушку начинают перемещать в плоскости захвата с контролируемой постоянной скоростью. При достижении скорости перемещения ловушки определенного значения, микрочастица вылетает из перетяжки лазерного пучка. Для этого значения скорости сила вязкости со стороны окружающей жидкости равна силе максимального оптического захвата объекта.

Зная размер частицы, скорость ее перемещения и значение динамической вязкости жидкости, можно вычислить силу вязкости F, которая, в свою очередь, будет равна максимальной силе оптического захвата частицы для выбранной мощности излучения в перетяжке. Изменяя скорость ловушки, по видеоизображению измеряют значения смещения захваченной частицы из центра перетяжки. Таким образом можно определить жесткость ловушки как отношение известной силы вязкого трения, действующей на частицу, к смешению этой частицы.

2.2. Калибровка силы оптического захвата микрообъекта по броуновскому движению Калибровка данным способом является наиболее распространенной и подробно описана в обзорной работе [20].

На частицу в ловушке, кроме сил, рассмотренных в пункте 1.1.2, также действует случайная сила, соответствующая броуновскому движению частицы. Калибровку силы оптического захвата сферического микрообъекта можно провести, изучая статистику его движения в ловушке. Для этого необходиОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... мо иметь возможность измерять случайные смещения частицы в оптической ловушке. Это может быть реализовано путем регистрации смещений лазерного луча с помощью КФД при рассеянии на захваченной частице. При малых смещениях частицы в ловушке (от единиц до сотен нанометров) по сравнению с размером перетяжки лазерного излучения (обычно около 1 мкм) зависимость между смещением лазерного луча и смещением частицы считают линейной [35]. Проводя статистическую обработку данных о смещении частицы в ловушке, находят коэффициент пропорциональности между смещением луча и смещением частицы в оптической ловушке, а также определяют жесткость ловушки.

Рассмотрим подробнее эту процедуру. Захваченная оптической ловушкой частица локализуется в пространстве благодаря действию эффективного потенциала притяжения, центр которого находится вблизи перетяжки лазерного пучка. Введем систему координат Oxyz, где точка начала координат совпадает с центром потенциала, а ось z направлена вдоль оси падающего лазерного луча. При малых отклонениях частицы (в сравнении с размером самой частицы) от центра этого потенциала можно разложить величину возвращающей силы в ряд по степеням этого отклонения. С учетом оговоренной малости смещения ограничимся линейным членом данного разложения:

где Ftrap,x сила, действующая в направлении оси x. Коэффициент k называется жесткостью оптической ловушки. Аналогичные выражения можно записать для y и z составляющих возвращающей силы.

При движении частицы в жидкости на нее действует сила вязкого трения, пропорциональная скорости ее движения:

Коэффициент при скорости безвихревого движения сферической частицы выражается по формуле Стокса = 6R, R - радиус частицы, - динамическая вязкость жидкости.

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... На частицу, кроме сил (13) и (12), действует также случайная сила, соответствующая броуновскому движению частицы. Эту силу можно записать в виде [36]:

где коэффициент диффузии, согласно формуле Эйнштейна, равен D =, а n(t) определяет случайный процесс со следующими корреляционными свойствами [36]:

Записывая второй закон Ньютона для движения частицы массой m, получаем:

Оценим характерное время затухания колебаний для частицы диоксида кремния диаметром 2,5 мкм. Коэффициент вязкости воды при температуре 20 С равен = 1 мПа·с, m = 4/3R3 = 8, 18 · 1015 кг, = 2, 36 · 108 кг/с.

Таким образом, характерное время затухания t = m/ 3, 47 · 107 с. Обычно это время много меньше временного разрешения измерительного оборудования. Поэтому вкладом первого слагаемого при анализе экспериментальных данных можно пренебречь. Тогда соотношение (17) можно переписать в виде:

где k = k/. Тогда fk = k/(2) - частота отсечки. Зависимость спектра мощности от частоты выражается следующим образом:

В экспериментах смещение частицы X обычно определяется по отклонению луча V, определяемого с помощью детекторов, линейных по этому отклонению: X = S · V [20], например с помощью квадрантных фотодиодов.

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... Поэтому измеряемый детектором спектр мощности сигнала с КФД PV и реальный спектр мощности смещений при движении микрообъекта в ловушке PX связаны следующим образом:

Спектр мощности отклонения луча может быть записан в виде:

Таким образом, рассчитав спектр мощности отклонения луча и, аппроксимировав спектр соотношением типа (21), можно получить коэффициент пропорциональности S, а также определить эффективную жесткость ловушки Для определения этих параметров не обязательно находить спектр мощности. Параметры оптического пинцета можно определить через автокорреляционные функции движения оптически захваченных частиц. Рассмотрим формальное решение уравнения (18), оно запишется в виде [36]:

Откуда, учитывая свойство (16), в случае t > 0 получаем:

Заметим, что при t 1/(2k ), процесс становится полностью стационарным. Если выбрать начало координат так, чтобы x(t) = 0, и при условии, что частица находилась в ловушке достаточно долго, то автокорреляционную функцию движения вдоль координаты x можно записать следующим образом:

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... где A =, = 1/k = /k. Учитывая линейное соотношение между реальk ными смещениями частицы в ловушке X и сигналом, получаемым с КФД V, для автокорреляционной функции сигнала, получаемого с детектора, имеем Таким образом, измеряя автокорреляционную функцию смещений захваченной в оптическую ловушку частицы и аппроксимируя ее выражением 27, можно определить жесткость оптической ловушки k и калибровочный коэффициент пропорциональности S.

Тепловые флуктуации захваченного объекта также могут быть использованы для получения жесткости оптической ловушки через теорему о равнораспределении энергии по степеням свободы. Для гармонического потенциала U (x) с жесткостью k она приводит к уравнению где kB постоянная Больцмана, T температура, x смещение частицы из положения равновесия в оптической ловушке. Измеряя смещения захваченной микрочастицы, можно определить жесткость ловушки. Вероятность для смещения захваченного в потенциальную яму объекта будет определяться распределением Больцмана Но для определения жесткости из выражений (28) или (29) необходимо заранее сопоставить шкалу детектора со смещением частицы. То есть параметр S необходимо определить другим способом.

2.3. Калибровка силы оптического захвата по определению его динамики Другой подход к калибровке жесткости оптического захвата состоит в рассмотрении динамики захвата микрочастицы. В ходе эксперимента измеряются временные зависимости координаты частицы при оптическом захвате. Затем, по результатам измерений решается обратная задача восстанавливается потенциал, соответствующий взаимодействию микрочастицы с оптической Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... ловушкой. Подробное описание метода можно найти, например, в работе [37], в которой использовалась двухлучевая модификация оптического пинцета.

В эксперименте использовались две одинаковые оптические ловушки, расположенные на расстоянии 5 мкм, сравнимым с размером частиц (10 мкм).

Частица сначала захватывалась в одну из ловушек. Затем первая ловушка выключалась, одновременно с включением второй ловушки. Процесс смены положения равновесия частицы регистрировался по видео-изображению. Закон движения частицы в таких условиях выражается как m + k x + x = 0, где x расстояние между центром частицы и фокусов лазерного пучка, m масса частицы, k x сила трения между частицей и окружающей ее жидкостью с вязкостью, жесткость оптической ловушки. Решением этого уравнения является затухающее движение частицы x(t) = x0 exp( t), где x0 расстояние между переключающимися ловушками. Таким образом, зная диаметр частицы и вязкость окружающей ее жидкости, можно получить значение жесткости оптической ловушки. Экспериментальные результаты динамики захвата, приведенные в этой статье, показаны на рисунке 4.

Рис. 4: Калибровка оптической ловушки по динамике оптического захвата. На ри сунке приведены результаты измерения интенсивности рассеянного микрочастицей размером 10 мкм света от времени. Каждый “слой” на графике соответствует раз личным экспериментальным реализациям оптического захвата [37].

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... 3. Практические реализации экспериментальных установок опти ческого пинцета Значительная часть существующих экспериментальных установок оптического пинцета являются однолучевыми и собраны на базе оптических микроскопов [23, 38, 39] с использованием штатных оптических схем микроскопа для визуализации эксперимента. Однако существуют и другие реализации экспериментальных установок, причем в ряде случаев необходимо создание нескольких независимых оптических ловушек.

3.1. Многолучевой оптический пинцет Для захвата и управления протяженными микрообъектами, а также для изучения взаимодействия между несколькими микрообъектами с помощью метода оптического пинцета необходимо создание нескольких оптических ловушек, работающих одновременно. Оптические пинцеты, позволяющие работать с несколькими оптическими ловушками, в литературе называются мно голучевыми.

Существует несколько подходов для создания многолучевых оптических пинцетов. О некоторых из них упоминалось в разделе 1.2. Часто применяется несколько источников лазерного излучения, и реализуются схемы с независимыми лазерными пучками. Так же существуют способы получения нескольких оптических ловушек из одного лазерного пучка. Для осуществления развертки и временной модуляции лазерного луча с частотой (порядка 1 МГц), высокой по сравнению с характерными частотами броуновского движения частиц в ловушке (порядка 100 Гц), используются акустооптические или электрооптические дефлекторы [11]. Акустооптический дефлектор (АОД) представляет собой кристалл, к одному из краев которого прикреплен пьезоэлемент. При подаче напряжения на пьезоэлемент по кристаллу распространяется акустическая волна, которая создает динамическую дифракционную решетку для лазерного пучка, проходящего через кристалл. Изменяя и модулируя напряжение на АОД, первый дифракционный максимум лазерноОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... го пучка отклоняется на контролируемые углы. Быстрая модуляция приводит к тому, что оптическая ловушка переключается между различными положениями в пространстве, создавая эффективно несколько одновременно работающих ловушек. В электрооптических дефлекторах показатель преломления кристалла изменяется при приложении внешнего электрического поля. Отклонение лазерного луча в таком кристалле на углы порядка 20 мрад может быть достигнуто за времена порядка 100 нс [20]. Однако электрооптические дефлекторы не получили широкого распространения в системах оптического захвата ввиду своей высокой стоимости и ограниченности углов отклонения лучей. Распространенным способом является использование традиционных гальванических сканирующих зеркал. Существующие коммерческие решения позволяют достигнуть значения частоты изменения положения зеркал около 1 – 2 кГц при точности угла отклонения лазерного пучка около 8 мрад [20].

Другим подходом для создания одновременно большого количества ловушек является метод голографического пинцета [40–43]. Чтобы разбить исходный лазерный луч на несколько для формирования нескольких независимых оптических ловушек с задаваемыми параметрами, используется пространственный модулятор света (ПМС). ПМС позволяет использовать динамическую голограмму для формирования произвольного наперед заданного распределения интенсивности лазерного излучения в области исследуемого образца.

Принципиальная схема голографического оптического пинцета с использованием ПМС представлена на рисунке 5а. Такой метод позволяет захватывать заданное количество частиц с заданным размером в заданной конфигурации и независимым образом управлять их положением в трех измерениях [30].

Например, на рисунке 5б приведен характерный вид голограммы, формирующий из лазерного пучка ряд оптических ловушек, в которые можно захватить массив одинаковых микрочастиц, упорядоченных в шестиугольник. Рисунок 5в, г иллюстрирует возможность искусственного упорядочения микрочастиц размером 1 мкм в решетку 5 5 и сортировки микрочастиц SiO2 по размеру методом голографического оптического пинцета [42].

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... Рис. 5: а. Принципиальная схема установки голографического оптического пинце та. б. Типичный вид голограммы и выстроенного с ее помощью массива микро частиц. в. Возможность искусственного упорядочения микрочастиц. г. Сортировка микрочастиц по размеру с помощью метода голографического пинцета. [41, 42] Применение голограмм и других дифракционных оптических элементов дает возможность создавать не только лазерные пучки с гауссовым профилем, но так же и моды более высокого порядка, например, лагерр-гауссовы моды, позволяющие передавать захваченному объекту крутящий момент и вращать его внутри оптической ловушки [44, 45].

3.2. Особенности калибровки многолучевого оптического пинцета При работе с многолучевыми модификациями оптического пинцета зачастую возникают случаи, когда исследуемые объекты находятся в непосредственной близости друг от друга, будучи взвешенными в жидкости. Поэтому появляется необходимость учитывать гидродинамическое взаимодействие между ними как при калибровке сил оптического захвата этих объектов, так и при измерении сил взаимодействия между ними. В работе [33] проводится теоретический анализ гидродинамического взаимодействия в случае двух захваченных полистироловых частиц размером 1, 000 ± 0, 025 мкм, взвешенных в воде.

Рассматривается движение этих частиц в жидкости во внешнем потенциале оптической ловушки. Уравнение Ланжевена для стохастического движения частиц можно записать следующим образом:

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... где rn – радиус вектор n-ой захваченной частицы, Ftrap,m = k(rm rtrap,m ) – возвращающая сила оптического захвата, действующая на частицу в m-ой ловушке с эффективной жесткостью k и положением rtrap,m, а Fn – случайная броуновская сила, действующая на эту частицу, которая имеет следующие корреляционные свойства [36]:

Тензор Hnm в уравнении 30 описывает гидродинамическое взаимодействие частиц с окружающей их средой. Его компоненты можно записать следующим образом:

где I – единичная матрица, а rnm = rn rm. Учитывая, что обычно броуновские смещения малы по сравнению с расстоянием между захваченными частицами, rnm = R, R – расстояние между ловушками, x единичный векx тор в направлении оси x, взятой в направлении соединяющей частицы линии.

Получаем систему дифференциальных уравнений для смещений центров частиц из соответствующих ловушек вдоль оси x и перпендикулярной ей оси где x =, y =, а kx, ky – жесткости оптических ловушек в направлении оси x и y, соответственно. Заменой u = x1 +x2, v = x1 x2, = y1 +y2, = y1 y система сводится к независимым уравнениям, решения которых аналогичны Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... решению (22), описанному в предыдущем пункте. Из этой системы получаются следующие выражения для автокорреляционных функций где i = /ki.

Интересным оказывается вид кросс-корреляционных функций смещений двух частиц:

Они неположительны во всем временном диапазоне и имеют минимум при ний x и y, соответственно, равны 3.3. Оптический пинцет на суперконтинууме Традиционно для создания оптического пинцета используют монохроматическое лазерное излучение. Однако довольно большой круг задач связан с локальной спектроскопией микрообъектов. В работе [46] предлагается использовать суперконтинуум в качестве источника излучения, формирующего оптическую ловушку. С одной стороны, суперконтинуум имеет очень высокую степень пространственной когерентности, поэтому может быть жестко сфокусирован в малое пятно для формирования эффективной трехмерной ловушки. С другой стороны, характерный для суперконтинуума широкий Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... спектр позволяет совмещать возможности захвата, управления и спектроскопии единичных частиц в одной установке. Схема предложенной установки приведена на рисунке 6.

Рис. 6: Схема установки оптического пинцета на суперконтинууме. а Пустая опти ческая ловушка, б рассеяние света на захваченной частице из латекса диаметром 2 мкм [46].

Фемтосекундный лазерный импульс титан-сапфирового лазера поступает на фотонно-кристаллическое оптоволокно, на выходе из которого излучение уже имеет сплошной спектр в диапазоне длин волн от 500 нм до 1500 нм.

Это происходит из-за совокупности нелинейных эффектов в кристаллическом оптоволокне, которые приводят в сверхуширению спектра выходящего излучения. В работе [46] представлены спектры пропускания захваченных частиц диаметрами 1,5, 2, 2,5 мкм.

3.4. Волоконно-оптический пинцет В такой реализации метода оптического пинцета лазерное излучение подается через оптическое волокно. Волокно подбирается таким образом, чтобы на выходе из него существовал такой градиент интенсивности лазерного излучения, чтобы при установке двух оптических волокон соосно, как показано на рис.7, вблизи центрального положения образовалась оптическая ловушка.

Поперечная стабильность захвата микрообъектов в такой ловушке достигается за счет наличия градиентных сил в области наложения излучения от двух волокон. Стабильность захвата вдоль оси распространения излучения достиОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... гается за счет равенства сил давления света на объект со стороны противоположных источников. Такая реализация значительно проще по сравнению с Рис. 7: Схема работы волоконно-оптического пинцета. а оптическое волокно, б захваченная частица.

оптическими пинцетами на базе микроскопов, так как не требует дорогостоящих и сложных оптических элементов. Еще одно достоинство данного метода заключается в том, что оптические волокна и захваченный в ловушку объект достаточно далеко разнесены друг от друга в пространстве, что позволяет одновременное использование других оптических или механических методов изучения объекта. Подобный метод позволяет не только захватывать микрообъекты, но и управлять ими, изменяя мощность излучения на выходе одного из волокон [47–49].

4. Применения и задачи, решаемые методом оптического пинцета С момента изобретения в 80-х годах метод оптического пинцета стал широко применяться в различных научных областях из-за возможности точного бесконтактного позиционирования объектов микронного размера в трех измерениях, а также измерения малых сил взаимодействия между микрообъектами. Например, применение метода голографического пинцета дает возможность не только создавать трехмерную ловушку произвольной формы, но и управлять частицами, находящимися в ней, в режиме реального времени [30].

Поэтому метод широко используют для изготовления двух- и трехмерных микроструктур [50].

Метод оптического пинцета позволяет проводить сортировку частиц или сближать их на заданное расстояние и изучать взаимодействие между ними.

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... В работе [42] проводилась сортировка частиц SiO2 размерами 1 мкм и 1, мкм. Сначала с помощью голографического оптического пинцета захватывались все частицы, попадающие в поле зрения микроскопа, затем проводилась программная обработка полученного изображения, в результате которой частицы различных размеров разделялись на группы. Финальный результат подобной сортировки микрочастиц по размерам изображен на рисунке 5г. В работе [51] было показано, что метод голографического пинцета позволяет захватывать и осаждать на подложку кремниевые нанотрубки. Далее нанотрубки упорядочивались в различные структуры. В работе исследовались нанотрубки диаметром 1,3 нм, поэтому агрегаты из нескольких нанотрубок регистрировались с помощью метода темного поля.

Широкое распространение получило сочетание метода оптического пинцета и спектроскопии комбинационного рассеяния света. КР-спектроскопия эффективный метод изучения состава и строения веществ. Сущность явления комбинационного рассеяния состоит в том, что в спектре рассеянного света помимо рэлеевского рассеяния на частоте линий возбуждающего света присутствуют дополнительные линии, расположенные с длинноволновой (стоксовы) и коротковолновой стороны (антистоксовы) от каждой спектральной линии возбуждающего рассеяние света. Эти дополнительные линии характеризуют собственные внутримолекулярные, межмолекулярные и решеточные колебания вещества [52, 53]. Большой интерес представляет спектроскопия живых клеток, помещенных в естественную для них жидкую среду. Однако одной из основных проблем здесь является точное позиционирование клеток или других микрообъектов в пространстве для получения информативных и качественных спектров. Именно поэтому метод оптического пинцета оказался необычайно полезен в этой области, так как он позволяет захватывать требуемое число объектов в нужной конфигурации и ограничивать их броуновское движение. Например, в работе [54] были сняты КР-спектры с захваченных в оптическую ловушку различных живых клеток размером 10–15 мкм. Клетка захватывалась методом голографического пинцета и передвигалась отноОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... сительно неподвижного луча, возбуждающего комбинационное рассеяние. В каждом положении снимались спектры, по виду которых можно было определить распределение концентрации различных веществ внутри клетки.

Ввиду уникальной особенности неразрушающего управления положением микрообъектов, метод оптического пинцета получил широкое распространение для исследования биологических микрообъектов. Это происходит в связи с тем, что большинство биологических микрообъектов практически не поглощают в инфракрасном диапазоне длин волн, которые обычно используются для формирования оптических ловушек. Однако, существует ряд работ, направленных на исследование эффекта нагрева биологических объектов, которые находятся в оптической ловушке. Обычно интенсивность излучения в лазерной ловушке при фокусировке в пятно размером около 1 мкм имеет порядок МВт/см2. Поэтому оценка нагрева исследуемых объектов является важной для корректной интерпретации экспериментов. В работе [55] эффект нагревания в оптической ловушке был измерен для липосом, имеющих размер порядка 1 мкм. В сфокусированном в пятно размером 0,8 мкм лазерном пучке с длинной волны 1064 нм и интенсивностью излучения 107 Вт/см липосома, захваченная в оптическую ловушку, нагревалась на 1, 45 ± 0, К/0,1 Вт. Таким образом, для интенсивностей лазерного излучения в оптических ловушках меньше 50 –100 мВт на инфракрасных длинах волн эффект нагревания биологических объектов мал и может носить разрушающий характер только при длительном пребывании биологического микрообъекта в оптической ловушке. Поэтому для изучения биологических объектов используют инфракрасное лазерное излучение [14, 39, 56].

Количественная характеризация микромеханических свойств различных сред, в частности растворов полимеров, биологических тканей и мембран клеток на сегодняшний день является актуальной задачей. Более того, интересным является вопрос разработки различных методик, позволяющих проводить эту характеризацию для широкого диапазона частотных и пространственных масштабов. На сегодняшний день существует устоявшийся термин, Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... объединяющий все методики, суть которых заключается в использовании частиц микронного размера в качестве зондов при их смещениях внутри исследуемых сред для определения локальных вязкоупругих свойств сред микрореология [57, 58]. При этом различают так называемую пассивную рео логию, которая предполагает анализ низкочастотных (1 – 100 Гц) случайных тепловых смещений микрозондов, статистика движений которых определяется свойствами окружающей среды, и активную реологию, которая предполагает анализ отклика исследуемой среды на частоте внешнего воздействия при вынужденном колебании зонда внутри этой среды. Метод оптического пинцета значительно расширил возможности применения активной и пассивной реологии, позволяя контролируемо позиционировать и смещать оптически захваченные микрочастицы. В частности, в работе [57] использовалось сочетание метода оптического пинцета и метода активной реологии для измерения сдвиговых модулей и вязкости различных жидкостей в диапазоне частот 0,1 Гц – 100 кГц.

Метод оптического пинцета широко используется для определения микромеханических свойств биологических объектов. В ряде работ, например в [55], изучались механические свойства молекул ДНК, измерялись коэффициенты упругости спиралей ДНК. Метод оптическогo пинцета позволяет изучать механизмы и динамику молекулярных моторов, таких как кинезин, миозин и динеин [59]. Еще одними объектами, исследование которых осуществляют с помощью метода оптического пинцета, являются форменные элементы крови, в частности эритроциты.

5. Реологические свойства крови. Методы исследования агрегации эритроцитов и их эластичных свойств Кровь состоит из концентрированной взвеси форменных элементов в плазме.

Плазма крови, в свою очередь, состоит из воды на 91,5%, солей и мелких органических молекул на 1,5% и высокомолекулярных белков (фибриноген, альбумин, иммуноглобулины) на 7%. Форменными элементами крови являОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... ются эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. В количественном соотношении в крови на 1 лейкоцит приходится около 25 тромбоцитов и около 500 эритроцитов [60].

Реология область механики, изучающая особенности течения и деформации реальных сплошных сред. Изучение текучести крови, соответственно, составляет предмет гемореологии. Реологические свойства крови определяются в основном объемными свойствами эритроцитов, поскольку эти клетки занимают примерно 45% объема всей крови. Решающую роль играет характер их поверхностного межклеточного взаимодействия, а также взаимодействия с плазмой, что способствует образованию и распаду эритроцитарных агрегатов в кровотоке, вращению и деформации клеток, их перераспределению и ориентации в микрососудах.

Кровь по своим реологическим свойствам является неньютоновской жидкостью. Ньютоновскими называют однородные жидкости, для которых возникающие при течении касательные напряжения линейно связаны с градиентом скорости, причем коэффициент пропорциональности называется вязкостью. Например, плазма крови в человеческом организме является ньютоновской жидкостью. Неньютоновская жидкость характеризуется неодонородностью, наличием крупных образований. Для нее характерна зависимость вязкости от градиента скорости ее течения. Кровь плазма и форменные элементы крови проявляет свойства неньютоновской жидкости. При повышении температуры вязкость крови возрастает, при повышении градиента скорости потока падает. Также вязкость крови сильно зависит от ориентации эритроцитов в потоке и от гематокрита (объемной доли эритроцитов в плазме). Например, повышенное содержание углекислого газа увеличивает размеры эритроцитов и изменяет их форму. Именно этим обусловлена повышенная вязкость венозной крови по сравнению с вязкостью артериальной.

Таким образом, вязкость крови в разных сегментах сосудистой системы является величиной непостоянной. Эта величина в литературе называется видимой вязкостью.

Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... Для модельного описания движения крови по кровеносным сосудам часто пользуются уравнением Хагена-Пуазейля:

где R гидродинамическое сопротивление, P перепад давления, Q секундный объёмный расход жидкости, L длина трубки, динамическая вязкость, r радиус трубки. Однако применение этой модели имеет серьезные ограничения. Модель справедлива для ламинарного потока гомогенной жидкости в жестких трубках со смачиваемой поверхностью. Все эти свойства не соответствуют системе кровообращения, в которой кровеносные сосуды являются эластичными структурами с турбулентными пульсирующими потоками неоднородной крови, что усложняет теоретическое описание микроциркуляции.

5.1. Эритроциты: функции и строение Основными функциями эритроцитов является перенос кислорода из легких к тканям тела и транспорт углекислого газа в обратном направлении. Это происходит за счет наличия в них гемоглобина, который, соединяясь с кислородом воздуха, содержащемся в легочных альвеолах, образует оксигемоглобин.

Оксигемоглобин, являясь непрочным соединением гемоглобина с кислородом, легко отдает кислород клеткам организма.

Эритроциты представляют собой безъядерные клетки, имеющие в покое форму двояковогнутого диска, что обеспечивает избыточную площадь поверхности клетки: поверхность эритроцита больше, чем если бы он имел форму шара того же объема. Это способствует прохождению эритроцитов через узкие сечения капилляров, так как клетки легко могут изменяют свою форму. Характерные размеры эритроцитов: 7,2–9,2 мкм в длину, 1,7–2,4 мкм в толщину в широкой части на периферии клетки и 0,9 мкм в центре. Объем эритроцита составляет 70 – 100 мкм3.

Содержимое эритроцита почти насыщенный раствор (32% по массе) гемоглобина, обусловливающего красный цвет крови. Важную роль в эритОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... роците выполняет клеточная мембрана, пропускающая газы, ионы и воду.

Мембрана эритроцита состоит из фосфолипидного бислоя и спектринового скелета двумерная сеть из тетрамеров спектрина, которые объединены в узлах этой сети олигомерами актина (рисунок 8). При этом липидный бислой пронизан трансмембранными (интегральными) белками, на различной глубине внутри мембраны находятся полуинтегральные белки, а на наружной или внутренней поверхности мембраны – периферические белки. В состав мембраны также входят гликопротеины (олиго-и полисахаридные цепи, связанные с молекулами белка), которые образуют так называемый гликокаликс – надмембранный комплекс толщиной около 10 нм. Именно в нем находятся рецепторы клетки, с его помощью происходит адгезия эритроцитов. Трансмембранные белки контактируют с жидкой средой по обеим сторонам мембраны, образуют каналы, через которые в клетку и из клетки проникают вещества. Они также выполняют защитную и сигнальную функцию. Спектриновый скелет во многом определяет механические свойства мембраны.

Взаимодействие белкового цитоскелета с липидным бислоем мембраны обеспечивает стабильность структуры эритроцита и его поведение как упругого тела при деформациях [61,62]. Толщина мембраны составляет около 7–10 нм.

Такая общепризнанная модель называется жидкостно-мозаичной. Белки, углеводы и липиды мембраны подвижны и могут перемещаться в плоскости мембраны.

Внешняя поверхность мембраны эритроцитов покрыта сиаловыми кислотами (олигосахаридами), заряженными отрицательно [60], поэтому сама мембрана клетки несет отрицательный поверхностный заряд (-потенциал).

Находясь в электролите, заряженные элементы мембраны эритроцита притягивают к себе ионы, формируя двойной электрический слой (ДЭС) вокруг клетки. Первое теоретическое описание ДЭС было развито Гельмгольцем.

ДЭС представлялся в виде сферического конденсатора, внутренняя обкладка которого находился в твердой фазе, а внешняя в окружающей клетку жидкости на небольшом расстоянии порядка расстояния одного иона. Потенциал Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... электрического поля внутри ДЭС в этом случае линейно уменьшается при увеличении расстояния от поверхности r. Согласно другой модели (модель Гуи) ионы электролита образуют вблизи поверхности эритроцита диффузную ионную атмосферу в следствие своего теплового движения. Уменьшение потенциала с расстоянием в этом случае происходит нелинейно. Общепринятая на данный момент теория Штерна учитывает как адсорбцию ионов электролита, так и их тепловое движение. Часть ионов находится на расстояниях порядка диаметра иона от поверхности мембраны, образуя так называемый слой Гельмгольца (адсорбционный слой), а другая часть ионов образует диффузный слой (слой Гуи). Потенциал диффузной части ДЭС называется электрокинетическим потенциалом или дзета-потенциалом (-потенциал).

По различным литературным данным -потенциал составляет 13 40 мВ.

Отрицательно заряженная мембрана эритроцита стремится притянуть противоположные по знаку ионы раствора, но диффузия и тепловое движение не позволяет образовываться большим скоплениям ионов вокруг клетки. В то же время вблизи поверхности клетки сила электростатического притяжения преобладает, и ионы окружающего электролита образуют ДЭС [63]. Также известно, что поверхностный заряд рассредоточен по мембране эритроцита Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... не равномерно, а отдельными очагами [64].

5.2. Агрегация эритроцитов: описание и механизмы Одним из фундаментальных свойств эритроцитов является их склонность к агрегации. Агрегация эритроцитов динамичный и обратимый процесс их взаимодействия площадями с наибольшими поверхностями. Взаимодействуя друг с другом, эритроциты слипаются и образуют так называемые “монетные столбики”. Физиологическая агрегация в микрососудах имеет характер линейных цепочек в виде монетных столбиков состоящих из 5 – 10 клеток (рисунок 9) [65]. Физиологическая агрегация эритроцитов процесс обраРис. 9: Микро-фотография эритроцитов, образовавших “монетный столбик” [65].

тимый: в здоровом организме непрерывно происходит динамический процесс “агрегация дезагрегация”. В системе микроциркуляции вязкость крови значительно зависит от агрегации эритроцитов. Считается, что физической основой зависимости видимой вязкости от скорости потока в значительной мере является агрегация эритроцитов [65].

Агрегация эритроцитов была обнаружена в 18 веке Хэвсом [66]. Систематическое исследование механизмов агрегации началось с работы [67]. Было замечено, что при агрегации эритроцитов существенное влияние оказывает окружающая клетки среда – плазма, электростатическое отталкивание между эритроцитами, их поверхностное натяжение и степень гидратации.

Общеизвестно, что для образования агрегатов эритроцитов необходимо наличие в плазме крупных молекул белков, в основном, фибриногена [67]. В Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... отсутствие таких молекул (например, эритроциты, взвешенные в физрастворе) агрегация не происходит. Тем не менее, до сих пор ведется дискуссия о физических механизмах, вызывающих агрегацию эритроцитов.

Для ее объяснения используют две основные теории. В основу первой, классической “мостиковой” теории [68] положено представление о том, эритроциты способны адсорбировать на своей поверхности крупномолекулярные белковые структуры. Сближаясь в кровотоке, эритроциты могут адсорбировать эти крупные структуры, которые становятся своего рода “мостиками”, связывающими эритроциты (рисунок 10 а). Известно, что существует корреляция между концентрацией крупномолекулярных белков плазмы, в частности фибриногена, и усилением агрегации эритроцитов. Длина молекулы фибриногена в раскрученном состоянии составляет около 45 нм. Полагают, что взаимодействие фибриногена с эритроцитом носит неспецифический характер и осуществляется за счет слабых ван-дер-ваальсовых и водородных связей [69]. Аргументы в пользу данной теории получены в основном из электронной микроскопии. Была выявлена зависимость расстояния между эритроцитами в агрегате от молекулярного веса добавляемых полимеров, например, декстрана от 19 нм для декстрана 40 кг/моль до 32 нм для декстрана 2000 кг/моль. Сила, способствующая агрегации может увеличиваться, так как возрастает число зон связывания, а сила электростатического отталкивания уменьшается из-за большего разделения клеточных поверхностей ввиду большого размера связывающих клетки молекул [68, 69].

Согласно второй теории (теории “истощенного слоя”), напротив, считается, что вблизи поверхности эритроцитов может образоваться область истощения, в которой концентрация белковых молекул меньше, чем в окружающей плазме крови (рисунок 10 б). Впервые эффект появления областей истощения в коллоидных растворах был объяснен в работе [71]. Было показано, что присутствие в растворе небольших сфер (или макромолекул) вызывает появление эффективных сил взаимодействия между крупными частицами раствора, если расстояние между ними мало. Если крупные частицы приближаются друг Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... Рис. 10: a. Мостиковая модель аграгции эритроцитов. Адсорбция крупномолекуляр ных веществ на поверхности одиночных клеток и образование мостиков. б. Модель “истощенного слоя”. Образование обедненной зоны около поверхности мембраны клетки, образование агрегата из-за появляения градиента осмотического давления около мембран сблизившихся эритроцитов [70].

к другу на расстояние меньшее, чем размер взвешенных небольших макромолекул, они вытесняются из области между крупными частицами. Соответственно, между частицами образуется область пространства с пониженной концентрацией макромолекул по сравнению с окружающей жидкостью зона истощения. Возникающий градиент осмотического давления приводит к притяжению крупных частиц. Позже интерпретация этого механизма взаимодействия между частицами в растворе была расширена на эритроциты, взвешенные в плазме крови или растворе декстрана. При сближении эритроцитов в потоке между ними появляется истощенный слой. Возникающий при этом градиент онкотического давления (доля осмотического давления, создаваемая высокомолекулярными компонентами плазмы белками) приводит к дальнейшему сближению эритроцитов [72]. Экспериментальные подтверждения существования истощенного слоя заключались, например, в наблюдении увеличения электрофоретической подвижности эритроцитов в растворе электролитов при добавлением дектрана (70 кг/моль). Значения электрофоретической подвижности в присутствии декстрана были значительно выше, чем ожидаемые исходя из вязкости раствора. Толщина истощенного слоя оцениОбзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... валась в величину от 2,9 нм до 4,4 нм [73]. В работе [72] толщина “истощенного слоя” рассчитывается как функция концентрации высокомолекулярных веществ в растворе и имеет порядок 10–20 нм.

Таким образом, ключевую роль в агрегации эритроцитов играют основные белки плазмы - фибриноген, глобулины и альбумин. Общепринято, что в норме, для здоровых людей на агрегацию эритроцитов значительно влияет фибриноген. Фибриноген белок с молекулярной массой 340 кг/моль, вырабатываемый в печени. Его содержание в плазме повышается при появлении острых воспалительных заболеваний, отмирании тканей. Физиологическая концентрация этого белка в плазме составляет 150–300 мг/мл. Увеличение концентрации фибриногена приводит к возрастанию вязкости плазмы и эффективного размера агрегатов эритроцитов в кровотоке. Как уже отмечалось выше, считается, что молекулы фибриногена способны образовывать “мостики” между мембранами эритроцитов, способствуя их агрегации.

Наряду с фибриногеном при различных патологиях вклад в агрегацию эритроцитов способны оказывать и другие белки [74], например, иммуноглобулин G (IgG), составляющий 20% всех белков плазмы. Однако данные о вкладе иммуноглобулина в процесс агрегации эритроцитов на данный момент противоречивы. Существуют данные, указывающие на отсутствие влияния этого белка на агрегацию [75], другие свидетельствуют о существовании иммуноглобулин-индуцированной агрегации эритроцитов [76]. Введение иммуноглобулина в кровь широко используется в клинической практике для лечения иммунодефицита и некоторых аутоимунных заболеваний. Однако при этом могут возникать осложнения, связанные с ухудшением микроциркуляции организма, поскольку введение иммуноглобулина может значительно усилить агрегацию эритроцитов в областях с малыми сдвиговыми напряжениями ( и частотным спектром колебаний (спектральной мощностью) G(), где u смещение элемента мембраны из равновесного положения, q = 2/ волновой вектор, длина волны колебаний, f частота колебаний, = 2f, угловые скобки статистическое усреднение. Измерения и теоретический анализ [98, 99] показывают, что частотный спектр фликкера эритроцитов не содержит резонансных частот, а спектральная амплитуда очень быстро убывает с ростом частоты. Также возможно экспериментальное определение корреляционных функций смещений мембраны эритроцита. Согласно теореме Винера-Хинчина, спектральная мощность и корреляционная функция связаны Фурье-преобразованием.

Впервые экспериментальное измерение частотного спектра фликкера Обзор литературы: метод оптического пинцета для исследования упругих... эритроцита было проведено в работе [97], где было представлено исследования параметров фликкера в диапазоне 0,1 - 30 Гц и предложена первая количественная модель, описывающая это явление. Позже фликкер исследовался в ряде работ, в которых было продемонстрировано, что параметры частотного спектра фликкера значительно зависят, например, от уровня оксигенации клетки концентрации гемоглобина [100], ее формы [100] и области клетки, с которой регистрируются колебания мембраны [97, 101], а также параметров окружающей клетку среды [102].

Интерес к явлению фликкера эритроцитов вызван его значимостью для понимания биомеханики клеточных мембран и связью параметров, описывающих это явление, с вязко-упругими свойствами клеток. Характерные частоты и времена затухания собственных колебаний мембраны определяются механическими параметрами, а именно, модулями упругости и вязкости эритроцита и среды, а также геометрическими параметрами клетки. При этом величины этих модулей для живой клетки зависят от ее физиологического состояния, от условий окружающей среды.

Наиболее распространенными экспериментальными подходами для исследования фликкера клеток на сегодняшний день являются методы отражательного интерференционного контраста и фазового контраста [101,103]. При этом основным недостатком таких методов исследования является отсутствие точного соотношения между регистрируемыми статистическими характеристиками фликкера, например, спектра колебаний, и истинным спектром колебаний мембраны. В случае применения микроскопии отсутствует возможность локализации клетки в требуемом месте и в требуемой геометрии, а также невозможно исключить влияние подложки, на которую осаждается клетка при подобных исследованиях. Поэтому задача разработки методики для прямой регистрации и анализа фликкера эритроцита вдали от подложки является актуальной и не решенной на данный момент.

Глава II Изучение вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов методами активной и пассивной микрореологии в оптическом пинцете В диссертационной работе была разработана методика оптического пинцета для экспериментального исследования вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов в широком диапазоне частот. Методическим аспектом этой части работы являлось объединение метода двухлучевого оптического пинцета и подходов, известных в литературе как методы активной и пассивной микрореологии. Для определения чувствительности методики были проведены калибровочные измерения корреляционных характеристик гидродинамического взаимодействия микрочастиц в воде. Для характеризации эластичности клеток в низкочастотном диапазоне до 100 Гц применялся подход, называемый методом пассивной микрореологии в оптическом пинцете, заключающийся в анализе статистических характеристик броуновского движения мембран оптических захваченных в жидкости клеток. Для исследования более высокочастотных особенностей упругих свойств эритроцитов (вплоть до 150 кГц) использовался метод активной микрореологии в оптическом пинцете. Для диапазона частот 100 Гц - 1 кГц была разработана методика измерения эффективного времени релаксации мембраны клетки при внешнем периодическом воздействии и показана чувствительность методики при контролируемом изменении эластичных свойств мембраны. Экспериментально исследовано воздействие излучения в оптических ловушках на эластичные свойства клеток во время эксперимента.

Изучение вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов 1. Материалы и методы для диагностики микромеханических свойств эритроцитов 1.1. Схема экспериментальной установки двухлучевого оптического пинце Схема экспериментальной установки двухлучевого оптического пинцета приведена на рисунке 17. В установке реализуется двухлучевая модификация оптического пинцета. Для формирования оптических ловушек использовались два непрерывных инфракрасных лазера с длиной волны излучения 980 нм (1, 2). Будем называть ловушку, создаваемую лазером (1), первой, а ловушку, создаваемую лазером (2) второй. Мощность излучения лазеров плавно изменялась в пределах от 0 – 330 мВт. Лазеры имеют поляризационно-сохраняющий волоконный выход, поэтому для получения параксиальных лучей использовались асферические линзы (3, 4) с фокусным расстоянием 4,5 мм. Луч лазера (1) проходили через систему конфокально расположенных линз (5) и объектива (6) с фокусными расстояниями 25,4 мм и 25,7 мм соответственно, причем объектив (6) представлял собой дуплет из двух линз с фокусными расстояниями 50 мм каждая. Эта система линз позволяла управлять положением оптической ловушки внутри образца путем перемещения линзы (5) перпендикулярно оптической оси. Луч лазера (2) направлялся на акустооптический дефлектор (7), с помощью которого изменялось положение второй оптической ловушки. Далее первый и второй лазерные лучи попадали на систему из двух линз (8) (f=30 мм), (10)(f=150 мм) и (9) (f=30 мм), (10), соответственно, которая предназначена для расширения лазерных пучков до полной входной апертуры объектива. При этом линзы (5),(6),(8),(9),(10) были подобраны таким образом, чтобы смещение лазерных пучков не приводило к существенному изменению засветки входной апертуры объектива (12), и, тем самым, не приводило к изменению мощности излучения, формирующего оптическую ловушку. Для одновременного заведения обоих лазерных лучей в объектив использовался широкополосный делительный поляризациИзучение вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов Рис. 17: Схема экспериментальной установки. 1, 2 диодные лазеры с волоконны ми выходами; 3, 4 асферические линзы; 5, 6 система линз для смещения пучка лазера 1; 7 акусто-оптический дефлектор; 8, 10 формирователь пучка лазера 1; 9, 10 формирователь лазерного пучка 2; 11 делительный поляризационный куб; 12 объектив; 13 образец с исследуемой суспензией; 14 светодиод; ахроматический дуплет; 16 объектив; 17 линза; 18 ПЗС-камера; 19 диэлек трическое зеркало; 20, 21 квадрантные фотодиоды; 22 лазер с длиной волны излучения 635 нм; 23 лазер с длиной волны излучения 670 нм; 24 делительный поляризационный куб; 25, 27 формирователь пучка лазера 22; 26, 27 форми рователь пучка лазера 23; 28 линза; 29 делительный поляризационный куб;

30, 31 линзы; 32, 33 зеркала, на 99% отражающие излучение на длинах волн лазеров 22 и 23 (“red reectors”).

онный куб (11). Лазерные пучки попадали на план полу-апохроматический масляно-иммерсионный объектив Olympus (12) с фокусным расстоянием 1, Изучение вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов мм, корректированым на бесконечность. На длине волны падающего излучения 980 нм пропускная способность этого объектива составляет около 60%.

Числовая апертура объектива контролировалась встроенной ирисовой диафрагмой и могла изменяться от 0,6 до 1,3, при этом в работе использовалась числовая апертура 1,3. Рабочее расстояние объектива (12) составляло 0,2 мм при работе с покровными стеклами 0,17 мм. С помощью этого объектива лазерные лучи фокусировались внутри образца (13), расположенного на предметном столике. Образец представлял собой суспензию исследуемых объектов (микрочастиц или эритроцитов). Предметный столик был оборудован моторизованной системой трехкоординатного смещения, которая позволила перемещать ячейку с образцом перпендикулярно оптической оси объектива на 17 мм вдоль каждой оси. Минимальный шаг смещения составлял 39 нм.

Освещение для визуализации образца проводилось в геометрии “на просвет”. Система осветителя состояла из массива белых светодиодов со встроенным коллиматором и ирисовой диафрагмой (14), ахроматического дуплета (15) с фокусным расстоянием 200 мм и объектива (16), который представлял собой полуплан микрофлюар с фокусным расстоянием 4 мм и числовой апертурой 0,85. Свет, проходящий через образец, собирался объективом (12) и линзой (17) (f=150 мм) на матрице ПЗС-камеры (18), подключенной к персональному компьютеру. Для заведения видимого излучения на ПЗС-камеру использовалось дихроичное диэлектрическое зеркало (19). На одну из поверхностей этого зеркала нанесено интерференционное покрытие, имеющее хорошее пропускание для инфракрасного излучения и высокий коэффициент отражения для видимого диапазона при угле падения 45. Вторая поверхность зеркала имеет просветляющее покрытие для ближнего ИК диапазона длин волн излучения.

Изучение вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов 1.2. Система регистрации малых смещений микрообъектов, локализован ных в оптических ловушках Регистрация малых смещений захваченных в оптические ловушки микрочастиц и краев эритроцитов осуществлялась с помощью системы на основе четырехсекционных (квадрантных) фотодиодов (КФД) (20) и (21). Квадрантные фотодиоды представляют собой четыре независимых фотодиода, рабочая поверхность которых квадранты одного круга. Независимые измерения сигнала с каждого сектора КФД позволяют определить интенсивности и смещения рассеянных захваченными объектами лучей. Определение положения частицы, захваченной ловушкой, формируемой лазером (1), осуществлялось по рассеянному излучению дополнительно установленного лазера (22) с излучением на длине волны 635 нм. На квадрантном фотодиоде (20) объективом (16) собиралось рассеянное излучение от лазера (22). Для определения положения частицы, захваченной оптической ловушкой, формируемой лазером (2), был установлен лазер (23) с длиной волны излучения 670 нм и квадрантный фотодиод (21). Система линз (25), (26) с фокусным расстоянием 60 мм и (27) с фокусным расстоянием 175 мм была установлена для расширения лазерных пучков (22) и (23) до входной апертуры объектива (12). Система линз (28) с фокусным расстоянием 60 мм и (30), (31) с фокусными расстояниями 15 мм были необходимы для того, чтобы точка на обратной фокальной плоскости объектива (16) и соответствующая точка на поверхности квадрантного фотодиода были сопряженными. Тогда малые смещения оптически захваченных объектов внутри образца будут соответствовать таким же смещениям лучей от лазеров (22) и (23) на поверхностях квадрантных фотодиодов. Рассеянное исследуемыми объектами излучение лазеров (22) и (23) заводится на квадрантные фотодиоды (20) и (21) с помощью широкополосных делительных поляризационных кубов (24) и (29), рассчитанных на диапазон длин волн 620 - 900 нм и зеркал (32),(33), которые отражают более 99% излучения на длинах волн лазеров (22), (23) при падении под углом 45. Для того, чтобы на КФД не попадало переотраженное излучение от светодиода (14), сразу после Изучение вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов него был выставлен фильтр СЗС-11, поглощающий красную часть спектра излучения светодиода. Используемые КФД сопряжены с блоками электроники, которые осуществляют преобразование исходных токов через секции КФД. Каждый блок имеет 3 выхода. Напряжения на этих выходах пропорциональны следующим величинам:

где Ii – интенсивность света падающего на i-тый сектор КФД.

Тогда смещения лучей по осям х и у пропорциональны, соответственно, Vx /V0 и Vy /V0.

Мощность световых пучков, формирующих оптические ловушки, определялась следующим образом. Вместо верхнего объектива (16) устанавливался объектив Olympus, идентичный объективу (12). Измеритель мощности оптического излучения (ИМО) устанавливался сразу после верхнего объектива так, чтобы все излучение попадало на чувствительную поверхность ИМО.

Лучи от первого и второго лазера поочередно перекрывались, позволяя отдельно измерить мощность от каждого (P1 и P2 для каждого из лучей, соответственно). После этого ИМО устанавливался перед нижним объективом (12). Измерения мощности проводились для каждого из лучей отдельно (P1 и P2 ). Мощность каждой из ловушек внутри образца вычислялась исходя из следующего:

где t коэффициент прохождения лазерного излучения через объектив (12) и одно покровное стекло.

График зависимости мощности одного из лазерных лучей внутри образца P2 от выходной мощности лазера (2) P2 представлен на рисунке 31.

Изучение вязкоупругих свойств одиночных эритроцитов Рис. 18: Градуировка мощности излучения во второй ловушке.

Для первого луча зависимость мощности излучения в ловушке от мощности выходного лазерного излучение аналогична.