«ЗАКОНОМЕРНОСТИ И МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ВОЛН ТЕРАГЕРЦЕВОГО ДИАПАЗОНА НА ЧАСТОТАХ АКТИВНЫХ КЛЕТОЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ...»

свидетельствующие о влиянии ЭМИ ТГЧ на различные физиологические системы человека и животных. Не вызывает сомнения тот факт, что в реализации биологических эффектов ЭМИ ТГЧ принимают участие центральная и периферическая нервные системы, а также защитнорегуляторные системы организма, к которым можно отнести, прежде всего, систему гемостаза, иммунную и нейроэндокринную системы.

В.Ф. Киричук, О.Н. Антипова и А.Н. Иванов (2004) отметили, что животные, подвергнутые пятидневному иммобилизационному стрессу, начиная со 2-3-х суток эксперимента, становились тревожными, агрессивными, остро и неадекватно реагировали на слабые раздражители. Отмечалось резкое увеличение двигательной активности. Некоторые животные теряли в весе и выглядели вялыми и апатичными. Исходя из собственных и литературных данных, авторы предполагают, что тяжелый стресс, обусловленный хронической гипокинезией, вызывает активацию симпатико-адреналовой системы, что является важнейшей причиной патологических изменений высшей нервной деятельности, в частности, изменений в поведении животных (высокие уровни возбудимости и тревожности). Однако при применяемом авторами ежедневном 30 минутном облучении животных, находящихся в состоянии хронического иммобилизационного стресса, ЭМИ ТГЧ на частотах нормализация их поведенческих реакций – отсутствовала выраженная тревожность, не проявлялась агрессивность, отмечалась адекватная реакция на посторонние раздражители [Антистрессорное действие …, 2004, с. 12-20].

Согласно предположениям, ЭМИ ТГЧ ограничивает развитие стрессреакции за счет возрастания функциональной активности антиноцицептивной системы и ограничения чрезмерной активации стресс-реализующих механизмов, что служит доказательством стресспротективной функции ЭМИ этого диапазона [Антистрессорное действие …, 2004, с. 12-20].

При ежедневном 30-минутном облучении животных, находящихся в состоянии хронического иммобилизационного стресса, ЭМИ ТГЧ на частотах МСИП оксида азота 150,176-150,664 ГГц наблюдалось восстановление микроциркуляторного звена системы гемостаза, что проявлялось в нормализации функций тромбоцитов: статистически достоверным уменьшением максимального размера образующихся тромбоцитарных агрегатов, максимальной скорости образования наибольших тромбоцитарных агрегатов, максимальной степени и скорости агрегации [Антистрессорное действие …, 2004, с. 12-20].

Анализ результатов исследования реологических свойств крови у таких животных показал восстановление вязкостных свойств крови при малых и больших скоростях сдвига, частичное восстановление способности эритроцитов к агрегации и снижение их деформируемости [Антистрессорное действие …, 2004, с. 12-20].

Делая выводы, авторы отмечают, что ТГЧ-облучение на частотах 150,176-150,664 ГГц проявляет выраженное антистрессорное действие, а минутное облучение животных является эффективным в восстановлении микроциркуляции и характеризуется оптимальной степенью нормализации функции тромбоцитов, эритроцитов и гемореологических показателей у животных, находящихся в состоянии длительного стресса [Антистрессорное действие …, 2004, с. 12-20; Восстановление реологических …, 2004, с. 1121Киричук, Антипова, Иванов, 2008, с. 23-25; Антипова, 2009, 48 с.;

Сравнительная эффективность …, 2009, с. 55-62].

Т.С. Великановой (2006) проводилось исследование показателей иммобилизационному стрессу. Установлено, что воздействие ТГЧ-излучения на частотах МСИП оксида азота 150,176-150,664 ГГц в течение 5 минут на крыс-самцов, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, вызывает полное восстановление нарушенных показателей гемодинамики, так как в брюшной аорте и бедренной артерии линейная скорость кровотока, систолическая скорость кровотока, диастолическая скорость кровотока и градиент давления статистически достоверно не отличаются от показателей группы контроля [Киричук, Великанова, Иванов, 2010, с. 70-76]. Выявлено, что воздействие ТГЧ-излучения на частотах МСИП оксида азота 150,176-150, ГГц в течение 15 минут, также как и 5 минутная экспозиция терагерцовых волн, приводит к полному восстановлению нарушенных в ходе стрессорной реакции показателей гемодинамики в брюшной аорте и бедренной артерии.

Установлено, что увеличение времени экспозиции до 30 минут приводит к незначительному изменению гемодинамики в брюшной аорте по сравнению с минутной экспозицией. Авторами установлено, что зависимость гемодинамического эффекта от дозы облучения нелинейная, что характерно для волн миллиметрового и субмиллиметрового диапазонов частот, и достигает плато уже при 5 минутной экспозиции электромагнитных волн. Увеличение времени облучения не приводит к нарастанию эффекта [Киричук, Кораблева, Иванов, 2007, с. 96-97].

М.О. Куртукова в своей работе указывает, что одним из важных регуляторов сосудистого тонуса является эндотелин I [Куртукова, 2009, 168 с.].

Экспериментальные исследования свидетельствуют, что ЭМИ ТГЧ диапазона на частотах МСИП оксида азота 150,176 – 150,664 ГГц вызывает тенденцию к снижению повышенной концентрации эндотелина I в сыворотке крови у белых крыс-самцов, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса.

Ежедневное ТГЧ-облучение в течение 5 дней после каждого сеанса иммобилизации вызывает статистически достоверное снижение повышенной концентрации эндотелина I в сыворотке крови у крыс-самцов, находящихся в состоянии длительного стресса. Реализация эффекта ТГЧ-волн терагерцового диапазона на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176 – 150,664 ГГц на концентрацию эндотелина I осуществляется при участии системы оксида азота: блокада стресс-лимитирующей системы оксида азота способствует выработке эндотелина I [Влияние терагерцовых волн …, 2009, с. 19-21; Влияние электромагнитного …, 2009, с. 511-516; Изменение продукции …, 2009, с. 52-56].

Морфологические исследования микроциркуляторного русла свидетельствуют, что электромагнитное облучение терагерцового диапазона на частотах МСИП оксида азота 150,176 – 150,664 ГГц животных, находящихся в состоянии острого и длительного стресса, вызывает снижение повышенной проницаемости сосудов, что проявляется отсутствием в них признаков фибринойдного набухания и отеков [Влияние электромагнитного …, 2009, с. 511-516; Куртукова, 2009, 168 с.].

Т.С. Кириязи (2011) указала на изменения перфузии тканей под действием терагерцовых волн. Обнаружено, что под влиянием облучения электромагнитными волнами терагерцового диапазона на частотах МСИП оксида азота 150,176 – 150,664 ГГц у крыс-самцов в состоянии острого иммобилизационного стресса происходит восстановление нарушеной периферической перфузии, что проявляется повышением среднего показателя перфузии, активации механизмов регуляции микрокровотока, нормализацией сниженной базальной и индуцированной вазодилатирующей активности эндотелия микрососудов, уменьшением периферического сопротивления и повышением притока артериальной крови в микроциркуляторное русло [Киричук, Иванов, Кириязи, 2011, с. 78-83; Киричук, Иванов, Кириязи, 2011, с. 259-262].

1.3. Возможности детерминированного управления терагерцовыми волнами реакционной активностью основных Фундаментальной основой функционирования сложных биологических систем являются молекулы-метаболиты, стабильные и строго воспроизводимые молекулярные структуры биосреды [Панорамно-спектрометрический …, 2001, с. 35-47]. Поэтому детерминированное управление их реакционной способностью облучением, совпадающим по спектрам их излучения и поглощения, может направленно регулировать процесс метаболизма в биосреде [Биофизические эффекты …, 2003, с. 3-6]. Анализ биомедицинских эффектов электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров атмосферных газов-метаболитов показывает прямую связь спектров заданного метаболита и его свойств в биосреде. Это соответствует представлениям о веществе и поле как о единой системе [Молекулярные HITRAN-спектры …, 2007, с. 5-9; The HITRAN molecular …, 2003, р. 5-44].

1.3.1 Молекулы-метаболиты – стабильные и строго воспроизводимые Одним из наиболее распространенных клеточных метаболитов, регулирующих течение различных процессов внутри клетки, а также участвующих в реализации многих важных физиологических функций, является оксида азота [Марков, 1996, с. 30-44; Невзорова, Зуга, Гельцер, 1997, с. 68-73; Furchgott, 1991, р. 52-61; Addicks, Bloch, Feelisch, 1994, р. 161-168;

Tavaf-Motamen, Miner, Starnes, 1998, р. 137-142; Nitric oxide as …, 1999, р. 886Starzik, 1999, р. 629-673; Vallance, Chan, 2001, р. 342-350; Stasch, Schmidt, Alonso-Alija, 2002, р. 773-783; Russo, 2002, р. 259-269; Expression of nitric …, 2012, р. 172-177].

Оксид азота (NO) – это бесцветный газ, растворимый в воде, один из самых простых представителей веществ с нечетным числом электронов [Furchgott, 1991, р. 52-61; Murad, 1995, р. 1-516; Michel, 1999, р. 5-7; Hart, 1999, р. 1407-1417; Inhibition of aconitase …, 2012, р. 1773-1784]. Его радикальные свойства обусловливаются способностью реагировать с различными соединениями и свободными радикалами. Оксиду азота присущи свойства внутри- и межклеточного вторичного мессенджера [Furchgott, Zawadzki, 1980, р. 373-376; Ignarro, Wood, 1987, р. 160-170; Furchgott, 1991, р. 52-61; Ignarro, Murad, 2003, р. 264-278; Battinelli, Loscalzo, 2000, р. 3451-3459; Murad, 2003, р. 264-278; Effect of effective …, 2007, р. 66-69; Dahiya, Dhankhar, Madaan, 2012, р. 94-97]. Он также является паракринным соединением, так как может оказывать воздействия на функции различных соседних клеток [Dysfunction of …, 2012, р. 223-234]. Комплексы оксида азота (с тиолами, белками, сахарами, ионами металлов, гемами протеинов) непрерывно циркулируют в кровотоке, выполняя гуморальную регуляцию различных функций организма [Ignarro, Wood, 1987, р.160-170; Lowenstein, Dinerman, Snyder, 1994, р. 227-237; Snyder, Bredt, 1995, р. 125-128; Killy, Baffigand, Smith, 1996, р. 363-380; Lloyd-Jones, Bloch, 1996, р. 365-375; Michel, 1999, р. 5-7; Nitric оxide-mediated …, 2012, р. 21-26].

Образование оксида азота в организме человека и животных основано на ферментативной трансформации гуанидинового фермента полузаменимой аминокислоты L-аргинина [Knowles, Palacios, Palmer, 1989, р. 5159-5162;

Garcia-Gardena, Fan, Shah, 1998, р. 821-824; mRNA expressions …, 2011, р. 147Shin S., Mohan S., Fung H.L., 2011, р. 660-663; The peripheral L-arginine …, 2012, р. 14-24] под воздействием ферментов семейства цитохром Р-450 – подобных гемопротеинов – NO-синтаз (NOS) с участием НАДФН как источника электронов и кофакторов – ФАД, флавинмононуклеотида (ФМН) и 5,6,7,8-тетрагидробиопротеина [Горрен, Майер, 1998, с. 870-880; Голиков, 2004, 180 с.; Ju, Venema, Venema, 1997, р. 18522-18525; Ju, Venema, Marrero, 1998, р. 24025-24029; Interaction of the …, 2005, р. 567-574; Inhibition of inducible …, 2011, р. 363-369; Single nucleotide …, 2012, р. 200-205].

высвобождением NO, и разнотипности систем, на которые действует этот регулятор метаболизма, важнейшей физиологической мишенью для NO в организме является растворимая гуанилатциклаза [Северина, 1995, с. 230-235;

Киреев, 2011, 303 с.; Regulation of nitric …, 2003, р. 12504-12509; Vasorelaxing activity …, 2011, р. 339-344; Wu, Ma, 2012, р. 129-133].

гуанозинтрифосфата циклического гуанозинмонофосфата, который является важным регулятором метаболизма клетки [Северина, 1995, с. 230-235; Role of nitric …, 2011, р. 353-362; Mujoo, Krumenacker, Murad, 2011, р. 2150-2157].

Оксид азота выполняет много важных функций в организме: является нейромедиатором, вазодилататором, антиагрегантом, мощным фактором гемостаза [Jubelin, Gierman, 1996, р. 1214-1219; Korbut, Gryglewski, 1996, р. 591Marin, Rodriges-Martinex, 1997, р. 111-134; Kirkeboen, Strand, 1999, р. 275Klabunde, 2000, р. 140-158; Stamler, Reynolds, Hess, 2012, р. 652-654].

Кроме того, NO имеет большое значение в регуляции деятельности дыхательной, пищеварительной, мочеполовой и других физиологических систем организма [Киреев, 2011, 303 с.; Nitric oxide suppresses …, 2007, р. 61Diehl, Stauffer, Greiner, 2012, р. 21-26; The protective …, 2012, р. 171-178;

Immunohistochemical and …, 2012, р. 433-439].

Эндотелиальные клетки являются источником оксида азота, который принимает участие в регуляции сосудистого сопротивления. Он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелий-зависимых вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина), тормозит образование эндотелиального сосудосуживающего фактора – эндотелина-I и высвобождение норадреналина окончаниями симпатических нейронов, препятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов (ангиотензина II, тромбоксана А2). Благодаря этому NO принимает участие в регуляции сосудистого тонуса и кровотока, системной гемодинамики и микроциркуляции [Jubelin, Gierman, 1996, р. 1214-1219; Korbut, Gryglewski, 1996, р. 591-599;

Marin, Rodriges-Martinex, 1997, р. 111-134].

Оксид азота в клетках эндотелия сосудов синтезируется III типом NOS (eсNOS). Продукция эндотелиальной синтазы оксида азота контролируется:

1) постоянно посредством увеличения уровня экспрессии ряда генов;

2) однократно за счет регуляции активности фермента [Влияние Lаргинина …, 2011, с. 77-79; Inhibition of inducible …, 2011, р. 363-369; Single nucleotide …, 2012, р. 200-205].

Постоянная регуляция активности eNOS в основном обусловлена действием на эндотелиальные клетки механических сил – касательное напряжение сосудистой стенки. Длительное увеличение напряжения сдвига приводит к увеличению уровня экспрессии eсNOS посредством транскрипционной индукции и стабилизации mRNA [Single nucleotide …, 2012, р. 200-205]. В то же время во многих экспериментах было показано, что изменение показателей гемодинамики и чрезмерное увеличение касательного напряжения сосудистой стенки могут приводить к возникновению эндотелиальной дисфункции и нарушать продукцию оксида азота. Постоянная регуляция обеспечивает поддержание базального уровня продукции оксида азота, обусловливая тонические эффекты NO [Киреев, 2011, 303 с.; Inhibition of inducible …, 2011, р. 363-369].

Помимо постоянной регуляции продукции NO существует однократная или острая регуляция, связанная с изменением скорости катализа eNOS [Inhibition of inducible …, 2011, р. 363-369]. Ключевую роль в регуляции активности eNOS играет концентрация ионов кальция в цитоплазме. [Ju H., Venema V.J., Venema R.C., 1997, р. 18522-18525].

Кроме того, существует ряд белков, которые взаимодействуют с eNOS и регулируют ее активность. Так, Hsp 90, который впервые был идентифицирован как 90 тирозин-фосфорилированный eNOS-связанный протеин, оказывает положительное влияние на активность eNOS [Nitric оxide-mediated …, 2012, р. 21-26]. Его взаимодействие с eNOS стимулируется гуморальными (гистамин) и физическими (напряжение сдвига) факторами, что ведет к активации eсNOS и в конечном итоге к увеличению продукции оксида азота [Nitric оxide-mediated …, 2012, р. 21-26].

-Dynamin-2 (GTP-связанный белок) и порин (потенциал-зависимый анионный канал) могут взаимодействовать с eNOS [Inhibition of aconitase … , 2012, р. 1773-1784]. Их взаимодействие с eNOS потенцируется ионами внутриклеточного Ca2+ и приводит к активации eNOS.

Часть синтезированного оксида азота может связываться в комплексы, которые образуют физиологически активное депо. Это депо может не только связывать, но и постепенно высвобождать NO. Депонирование оксида азота происходит в стенках сосудов и начинается при повышении его концентрации.

Формирование NO-депо является важной частью адаптивных реакций [Киреев, 2011, 303 с.; Murad, 2003, р. 264-278].

Основными формами депонирования и транспорта NO являются Sнитрозотиолы и динитрозильные комплексы железа. S-нитрозотиолы способны переносить NO между клетками и связываться с белками через их SH-группы [Снайдер, 1992, с. 15-24; Оксид азота …, 1997, 103 с.; Раевский, 1997, с. 484Северина, 1998, с. 939-997; Депонирование оксида …, 2000, с. 174-181;

Коррекция NO-зависимых …, 2001, с. 110-117; Роль свободного …, 2004, с. 4Паршина, 2006, с. 88-94; Оксид азота …, 2008, с.83-91; Оксид азота …, 2011, с. 256-259; Russo, 2002, p. 259-269].

В настоящее время известно, что из большого числа биологически активных веществ, секретируемых эндотелием, именно оксид азота регулирует активность других медиаторов. В частности, оксид азота стимулирует продукцию эндотелием простациклина, который ингибирует адгезию тромбоцитов к эндотелию и их агрегацию [Голиков, 2004, 180 с.; Киричук, Глыбочко, Пономарева, 2008, 112 с.; Snyder, Bredt, 1995, р. 125-128; Reactive oxygen …, 2011, р. 773-778], а также снижает тонус сосудистой стенки [LloydJones, Bloch, 1996, р. 365-375; Michel, 1999, р. 5-7: Porta, Steinhorn, 2012, р. 149Оксид азота повышает тромборезистентность эндотелия сосудистой стенки, блокируя стимулируемую цитокинами экспрессию адгезивных молекул эндотелия (VCAM-I, E-селектин, MCP) [Ignarro, Murad, 1995, р. 1-516; Serum Pselectin …, 2006, р. 672-677; Schmidt, Hulthe, Fagerberg, 2009, р. 108-114] и экспрессию активирующего тромбоциты фактора [Michel, 1999, р. 5-7].

Роль оксида азота в регуляции активности тромбоцитов не исчерпывается только угнетением адгезии и агрегации. Низкие концентрации оксида азота играют важную роль в реакции тромбоцитов на слабые агонисты агрегации [Ignarro, Murad, 1995, р. 1-516]. Кроме того, оксид азота является важным фактором агрегационно-зависимой секреции тромбоцитов, то есть оксид азота является фактором, усиливающим чувствительность тромбоцитов к поврежденной сосудистой стенке, и принимает участие в стабилизации тромбоцитарных тромбов, тем самым проявляя двойной эффект в регуляции функции тромбоцитов [Киреев, 2011, 303 с.; Calver, Collier, Vallance, 1993, р.

303-326; Caramelo, Riesco, Outeirino, 1994, р. 447-454; Cooke, 1998, р. 379-382;

Nitric oxide prevents …, 2000, р. 11609-11613; Briones, Alonso, Hernanz, 2002, р.

378-388; Chemical nature of …, 2003, р. 336-341].

В отличие от тромбоцитов, эритроциты человека чувствительны к индуцибельной и конститутивной формам NO-синтазы и сами обладают способностью синтезировать оксид азота [Lloyd-Jones, Bloch, 1996, р. 365-375].

Показано наличие растворимой гуанилатциклазы и фосфодиэстеразы в эритроцитах человека [Matsuoka, Suzuki, 1983, р. 5341-5353; Cyclic GMPdependent …, 2003, р. 907-916; Engelhardt, Zaarour, Crawford, 2011, р. 462-466;

Smith, Lipchock, Strobel, 2012, р.425-432]. Было сделано предположение, что оксид азота, синтезированный в эритроцитах, может принимать участие в регуляции физиологического поведения эритроцита, наряду с внешним оксидом азота [Киреев, 2011, 303 с. Lowenstein, Dinerman, Snyder, 1994, р. 227В работе C.T. Minson, L.T. Berry (2001) было показано, что оксид азота может оказывать регуляторный эффект на деформируемость и агрегацию эритроцитов и данный эффект является дозозависимым [Minson, Berry, Joyner, 2001, р. 1619-1626]. Оксид азота оказывает воздействие на транспорт ионов АТФазы и Ca+- АТФазы стимулируется донаторами оксида азота [Киреев, 2011, 303 с.; Michel, 1999, р. 5-7].

Известно, что оксид азота прямо или опосредованно влияет на транспорт ионов калия через клеточную мембрану [Murad, 2003, р. 264-278]. Блокада транспорта ионов калия через мембрану эритроцита предотвращает неблагоприятный эффект неселективных блокаторов NOS на показатели деформируемости эритроцитов [Голиков, 2004, 180 с.; Snyder, Bredt, 1991, р. 125-128].

Таким образом, оксид азота оказывает влияние на деформируемость эритроцитов и способствует поддержанию нормальных показателей деформируемости эритроцитов. В условиях in vivo эритроциты чувствительны к оксиду азота, синтезированному как в клетках эндотелия, так и в эритроцитах [Голиков, 2004, 180 с.; Furchgott, 1991, р. 52-61].

Исследование и разработка методов регулирования синтеза, поддержания физиологического уровня концентрации и функционального состояния эндогенного оксида азота в клетках, органах и в организме в целом представляет несомненный научный и практический интерес.

В настоящее время известны способы коррекции продукции оксида азота при помощи группы медикаментозных препаратов – донаторов оксида азота.

Однако фармакологическая регуляция синтеза NO в живом организме может сопровождаться возникновением нежелательных, а иногда и вредных побочных эффектов. Использование в клинической практике органических нитратов в качестве донаторов оксида азота сопровождается развитием толерантности и перекрестной толерантности, кроме того, может усугублять эндотелиальную дисфункцию, еще больше снижая продукцию оксида азота эндотелием [Оксид азота …, 2008, с. 83-91; Киричук, Глыбочко, Пономарева, 2008, 112 с.]. Это диктует необходимость изыскания неинвазивных физических регуляторов синтеза эндогенного оксида азота на основе естественного физиологического регулирования.

Для оценки эндогенного синтеза оксида азота наряду с прямым измерением активности NOS (по образованию цитрулина) используют концентрацию стабильных метаболитов - нитритов и нитратов. Концентрация нитритов является объективным критерием активности нитроксидергической системы [Карпюк, Черняк, Шубич, 2000, с. 16-19; A preliminary study …, 2012, р. 31-35].

А.Н. Ивановым (2007) впервые предложен способ восстановления пониженной концентрации нитритов в плазме крови в условиях стресса, включающий облучение животных электромагнитными волнами мощностью 0,7 мВт (плотность мощности потока 0,2 мВт/см2) на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176-150,664 ГГц в течение мин. Установлено, что электромагнитное излучение терагерцового диапазона на частотах молекулярного спектра оксида азота 150,176-150,664 ГГц способно восстанавливать пониженную концентрацию нитритов в плазме крови в условиях стресса, что косвенно свидетельствует о нормализации продукции оксида азота и дает возможность нормализовать функцию эндотелия при постстрессорных состояниях. Кроме того, предлагаемый способ возможно экстрополировать на больных для лечения ряда заболеваний, сопровождающихся снижением продукции оксида азота, а следовательно, и концентрации его стабильных метаболитов – нитритов (артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца: стабильная и нестабильная стенокардия и другие заболевания сердечно-сосудистой системы).

Также в настоящее время значительный интерес вызывает использование терагерцовых волн частотой 129,0 ГГц, соответствующей спектру излучения и поглощения атмосферного кислорода [Сухова, Бондарев, 2007, с. 65].

Поскольку недостаток кислорода в органах и тканях ведет к нарушению жизнедеятельность всего организма в целом, обусловливая гипоксию и ишемию [Stepol, 1993, р. 76-77; Ziegler, 1994, р. 312-315].

С.В. Сухова (2009) указывает, что одним из важных проявлений «неселективного» действия электромагнитного излучения терагерцовой частоты является непременное присутствие кислорода в среде, окружающей электромагнитного излучения ТГЧ - диапазона в клетках и биологических образуются ферментативно за счет изменения гидратации белковых молекул и ксантиноксидазы, в результате этого их концентрация поддерживается на стационарном уровне [Поцелуева, Пустовидко, Евтодиенко, 1998, с. 415-418].

Активные формы кислорода, в свою очередь, за счет ионов кальция стимулируют растворимую гуанилатциклазу, это приводит к накоплению цГМФ в клетках эндотелия сосудов и повышению активности NO-синтазы, что увеличивает продукцию оксида азота [Механизмы передачи …, 1998, с. 958Это может быть одним из механизмов осуществления как молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129, ГГц, так как известно, что именно оксид азота регулирует функциональное освобождение вазоактивных биологически веществ, медиаторов, ингибирует адгезию лейкоцитов, Р-селектина, участвует в ремоделирования сосудистой стенки [Michel, 1999, р. 5-7: Porta, Steinhorn, 2012, р. 149-164].

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о чрезвычайной сложности проблемы взаимодействия ЭМИ ТГЧ с высокоорганизованными биологическими объектами. Клинико-экспериментальные результаты показывают, что ЭМИ ТГЧ при воздействии на организм вызывает широкий спектр физиологических, биохимических и биофизических реакций, направленных на восстановление и поддержание гомеостаза.

1.4. Применение электромагнитных волн терагерцового диапазона.

Первый опыт клинического применения терагерцовых волн у здоровых добровольцев и пациентов с различной патологией В настоящее время уже продемонстрирован эффект применения терагерцового облучения в самых разнообразных областях жизни человека. Как правило, это новые технологии, и их широкое внедрение возможно только после создания дешевых, технологичных, надежных устройств. Вероятно, самый большой потенциал использования терагерцовых волн находится в биомедицине [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Новые методы терагерцовой диагностики могут заменить существующий метод биопсии, они позволяют не только обнаруживать, но и следить за развитием и распространением раковых клеток. Этот метод позволяет получить биологически точную трехмерную картину поражения ткани. Методы ТГцдиагностики уменьшат число ненужных хирургических биопсий и ускорят постановку диагноза до нескольких минут [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Низкие уровни энергии терагерцового кванта позволяют делать статические изображения и даже наблюдать в реальном времени за морфофункциональной активностью клеток, тканей, обнаруживать изменения в структуре ДНК без вредного излучения, помогая ученым понять сложные процессы, происходящие при сворачивании белка [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Молекулы любого вещества имеют свои уникальные колебательные, вращательные и поступательные движения, и при условии совпадения их резонансных частот с частотами электромагнитного поля дают информацию о молекулярной структуре образца. Резонансные частоты многих веществ лежат в пределах терагерцового диапазона. Например, резонансные частоты эритроцитов крови находятся в диапазоне 0,5... 1 ТГц, хромосомы различной генной активности – 0,75...15 ТГц [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Одно из возможных применений терагерцовой томографии – в области биомедицинской диагностики, где образцы состоят из одной поверхности отражения, но обладают сложной морфологией. Например, изучение поверхностных или подповерхностных свойств кожи, оценка глубины и серьезности ожога. Точное и неагрессивное исследование глубины ожога имеет большую клиническую ценность [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Несомненно, после своего появления терагерцовые системы будут востребованы как средства зашиты: с их помощью будет осуществляться просмотр багажа и почтовых отправлений, обнаружение химического и биологического оружия, взрывчатых веществ, керамического оружия, наркотиков, наблюдения за объектами сквозь стены помещений, экспертиза предметов искусств [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

В производстве и торговле они будут полезны при выявлении подделок, производственного брака, для проверки сохранности и качества товаров без нарушения упаковки [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Терагерцовые волны проникают через сухие поверхности, такие как бумага, пластмассы, керамика, бетон и т.д. Эти вещества практически не поглощают указанные волны. Многие не прозрачные в оптическом диапазоне и имеющие низкоконтрастные изображения при использовании рентгена материалы могут быть легко обнаружены на основе анализа их коэффициентов отражения и преломления в терагерцовом диапазоне [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Способность волн терагерцового диапазона проникать через стены позволяет применять их для обнаружения людей при стихийных бедствиях и чрезвычайных ситуациях в разрушенных зданиях при завалах и т.п. [Бецкий, Козьмин, Яременко, 2008, с. 48-54].

Следует отметить, что впервые в клинической практике использовано ЭМИ ТГЧ диапазона на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц у здоровых добровольцах и пациентов с сердечно-сосудистой патологией. Так, в группе здоровых добровольцев во время сеанса отмечались некоторые субъективные ощущения: разнообразный дискомфорт в области шеи, чувство недостатка воздуха и жара в голове. Ни в одном случае появление вышеописанных симптомов не послужило причиной прекращения сеанса. В связи с этим авторы предполагают, что влияние ЭМИ ТГЧ на частотах оксида азота 150,176ГГц на здоровый организм способно вызвать целый каскад физиологических и биохимических реакций, выраженность которых будет зависеть от исходного состояния пациента, особенностей его нервной системы [Паршина, Киричук, 1991, с. 54-55; Паршина, 1994, 28 с.; Киричук, Паршина, Головачева, 1995, с. 6-8; Первый опыт …, 2004, с. 46-54; Паршина, Киричук, Головачева, 2005, с. 109-111; Паршина, 2006, 360 с.].

При проведении сеансов ЭМИ ТГЧ диапазона на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц у пациентов с патологией сердечно-сосудистой системы в анамнезе отмечено появление субъективных ощущений и колебаний показателей гемодинамики, аналогичных изменениям данных параметров при облучении у здоровых лиц. Вместе с тем, применение ЭМИ ТГЧ на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц у пациентов с сердечно-сосудистой патологией в стадии ремиссии показало отсутствие серьезных осложнений и позволило авторам исследования перейти к следующему этапу – использованию ЭМИ ТГЧ диапазона на частотах оксида азота 150,176-150, ГГц у пациентов, находящихся на стационарном лечении по поводу нестабильной стенокардии и гипертонической болезни. У всех больных в результате лечения отмечен выраженный антиангинальный эффект, отмечалось снижение артериального давления – как систолического, так и диастолического показателей на 15-20 мм рт. ст. Отмечено положительное действие ЭМИ ТГЧ на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц на состояние системы гемокоагуляции: отмечалось удлинение времени свертывания крови и АЧТВ, снижение уровня фибриногена [Первый опыт …, 2004, с. 46-54].

Авторы, делая выводы, отмечают, что ЭМИ ТГЧ на указанных частотах оксида азота обладает мощным вазоактивным, антиангинальным и гипокоагуляционном эффектами и является теоретически и экспериментально обоснованным методом лечения больных с сердечно-сосудистой патологией [Первый опыт …, 2004, с. 46-54; Паршина, Киричук, Головачева, 2005, с. 109-111].

Н.В. Островским (2004) установлено, что на фоне общепринятой терапии применение ЭМИ ТГЧ на частотах МСИП оксида азота 150,176-150,664 ГГц сопровождается более благоприятным течением ожогового раневого процесса.

Так, при лечении поверхностных ожогов у больных после первого сеанса ТГЧтерапии микробная обсемененность ожогового отделяемого снижалась в сотни раз. После 2-3 сеанса у всех пациентов появились островки активной эпителизации раны, практически у всех уменьшалась выраженность болевого синдрома, улучшалось общее самочувствие, нормализовался режим сна. После 5-7 сеанса наступала полная эпителизация ожоговой раны [Комплексное лечение …, 2004, с. 55-61]. По мнению авторов, механизм комбинированной терагерцовой терапии на раневой процесс заключается в вазодилатации и нормализации микроциркуляторных расстройств, улучшении сосудистой трофики и тканевого обмена, усилении фагоцитоза, угнетении процессов ПОЛ, прямым воздействием на пролиферацию фибробластов [Комплексное лечение …, 2004, с. 55-61].

С.И. Киреевым (2011) применялось ЭМИ терагерцового диапазона на частотах оксида азота у больных с патологией опорно-двигательной системы.

Обнаружено нормализующее влияние указанного облучения на сосудистый и внутрисосудистый компоненты микроциркуляции опорных тканей [Киреев, 2011, 303 с.].

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о чрезвычайной сложности проблемы взаимодействия электромагнитного излучения терагерцового диапазона с высокоорганизованными биологическими объектами. Результаты многочисленных клинико-экспериментальных исследований показывают, что воздействие электромагнитными волнами терагерцового диапазона на организм человека и животных сопровождается широким спектром физиологических, биохимических и биофизических реакций, направленных на поддержание и восстановление гомеостаза.

Одним из перспективных направлений биомедицинских технологий может явиться использование указанных биофизических свойств терагерцового излучения на частотах активных клеточных метаболитов для нормализации измененных показателей метаболизма, гомеостаза и эндокринного статуса.

Для решения данного вопроса требуется проведение всесторонних исследований, направленных на уточнение особенностей возникновения постстрессорных нарушений в показателях гомеостаза организма и влияния на них различных режимов облучения терагерцовыми волнами на частотах активных клеточных метаболитов, что и явилось целью и задачами данного исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Организация экспериментов с лабораторными животными и Эксперименты проводились с 2008-2013 гг. на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 180-260 г., полученных из вивария ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России Всего было использовано 990 половозрелых животных. В ходе исследований были сформированы 73 экспериментальные группы животных. В каждой группе – от 10 до 15 белых крыс-самцов.

Все опыты проводились на кафедре нормальной физиологии им.

И.А. Чуевского ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Минздрава РФ.

Животные размещались в специально оборудованном помещении, доступ в которое был ограничен. Комната была обеспечена принудительной вентиляцией (12 объемов в час), исключающей рециркуляцию воздуха.

Температуру и относительную влажность воздуха регистрировали ежедневно;

колебания температуры составляли от 18 °С до 22 °С, влажности – от 50% Освещение было естественным.

Интактных животных рассаживали в клетки для индивидуального содержания согласно нормативам, представленным в пункте 3.3 приказа № 1045-73 от 06.04.1973 г. «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». В экспериментальных исследованиях животных использовали не ранее чем через 2 недели - период адаптации к новым условиям содержания.

Для того чтобы исключить эффекты повышения двигательной активности и других проявлений пищевых рефлексов, которые могут накладываться на действие изучаемых факторов при утренней раздаче корма, когда, как правило, производится большинство экспериментальных манипуляций, животных кормили в 14 - 16 часов. Этот режим является также более физиологичным, поскольку крыса является сумеречным животным. Такое исходное состояние у интактных животных можно считать максимально приближенным к состоянию покоя.

Крысы получали стандартный рацион питания один раз в сутки в 14 - часов из расчета 40 г сухого корма на животное, при свободном доступе к воде.

Режимы освещения и кормления животных в контрольных и опытных группах были одинаковы.

Все животные при проведении экспериментов находились в одинаковых условиях. Для устранения влияния сезонной и циркадной зависимости на изучаемые показатели эксперименты с животными осуществлялись в осеннезимний период в первой половине дня.

Содержание животных, моделирование острого и длительного иммобилизационного стрессов, а также выведение животных из опыта проведено в соответствии с этическими нормами, изложенными в Женевской конвенцией «International Guiding principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990 г.), приказе Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» (по состоянию на 20.10.2006 г.), Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (редакция октябрь 2000 г.), Федеральном законе «О защите животных от жестокого обращения» от 01.12. 1999 года.

2.1.1. Экспериментальное моделирование острого и длительного В основу работы была положена модель иммобилизационного стресса [Адаптационные реакции …, 1964, с. 47-48]. Использованы следующие экспериментальные модели:

острый иммобилизационный стресс вызывали жесткой фиксацией крыс в положении на спине за конечности мягкими марлевыми вязками (лигатурами) в течение 3 часов, однократно.

длительный иммобилизационный стресс воспроизводили жесткой фиксацией крыс в положении на спине за конечности мягкими марлевыми вязками (лигатурами) ежедневно по 3 часа, в течение 5 дней подряд.

2.2. Объекты исследования и экспериментальные группы В ходе диссертационного исследования было сформировано экспериментальные группы животных:

I. Экспериментальные группы животных, на которых изучали механизмы действия электромагнитных волн терагерцевого диапазона на частотах активных клеточных метаболитов 1. Интактные животные (n=15).

2. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=15).

3. Крысы-самцы в состоянии острого стресса, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц в течение 30 минут (n=15).

4. Крысы-самцы в состоянии острого стресса, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц в течение 30 минут (n=15).

II. Влияние терагерцевого излучения на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц на содержание и активность eNOS в крови у стрессированных крыс-самцов на фоне введения неселективного ингибитора конститутивных изоформ NO-синтаз 5. Интактные животные (n=15).

6. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=15).

7. Животные, облученные терагерцевыми волнами на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц в течение 30 минут, при остром стрессе на фоне введения ингибитора конститутивных изоформ NO-синтаз – L-NAME (n=15).

III. Крысы-самцы, на которых изучали влияние электромагнитных волн терагерцевого диапазона на частотах активных клеточных метаболитов на постстрессорные изменения эндокринного статуса Реакция гипофизарно-тиреоидной системы крыс-самцов 8. Интактные животные (n=15).

9. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=15).

10. Животные в состоянии длительного иммобилизационного стресса (n=15).

электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частотах 150,176ГГц в течение 5, 15 и 30 минут (n=45).

14, 15, 16 Экспериментальные животные в состоянии длительного стресса, облученные ежедневно в течение 5 дней подряд по 5, 15 и 30 минут терагерцевыми волнами на частотах 150,176-150,664 ГГц (n=45).

Изменения концентрации кортикостерона у экспериментальных животных 17. Интактные животные (n=10).

18. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=10).

19. Животные в состоянии длительного иммобилизационного стресса (n=10).

20, 21, 22 Самцы в состоянии острого стресса, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частоте атмосферного кислорода 129, ГГц в течение 5, 15 и 30 минут (n=30).

23, 24, 25 Экспериментальные животные в состоянии длительного стресса, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц ежедневно в течение 5 дней подряд по 5, и 30 минут (n=30).

26, 27, 28 Животные, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц по 5, 15 и 30 минут при остром стрессе, на фоне предварительного введения неселективного ингибитора конститутивных изоформ NO-синтаз – L-NAME (n=30).

IV. Крысы-самцы, на которых изучали влияние электромагнитных волн терагерцевого диапазона на частоте атмосферного кислорода 129, ГГц на измененные при стрессе показатели коагуляционного звена системы гемостаза, фибринолиза и антикоагулянтный потенциал крови 29. Интактные животные (n=15).

30. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=15).

31. Животные в состоянии длительного иммобилизационного стресса (n=15).

терагерцевыми волнами на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц по 5, и 30 минут (n=45).

35, 36, 37 Животные в состоянии длительного стресса, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц ежедневно в течение 5 дней по 5, 15 и 30 минут (n=45).

V. Крысы-самцы, на которых изучали влияние терагерцевых волн на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц на постстрессорные изменения метаболического статуса 38. Интактные животные (n=15).

39. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=15).

40. Животные в состоянии длительного иммобилизационного стресса (n=15).

терагерцевыми волнами на частотах 150,176-150,664 ГГц в течение 5, 15 и минут (n=45).

44, 45, 46 Животные в состоянии длительного стресса, облученные ежедневно в течение 5 дней по 5, 15 и 30 минут терагерцевыми волнами на частотах 150,176-150,664 ГГц (n=45).

VI. Крысы-самцы, на которых изучали влияние электромагнитных волн терагерцевого диапазона на частотах оксида азота 150,176-150, ГГц на показатели ПОЛ и антиоксидантной активности крови при стрессе 47. Интактные животные (n=15).

48. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=15).

49. Животные в состоянии длительного иммобилизационного стресса (n=15).

50, 51, 52 Крысы-самцы в состоянии острого иммобилизационного стресса, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частотах 150,176-150,664 ГГц в течение 5, 15 и 30 минут (n=45).

53, 54, 55 Животные в состоянии длительного стресса, облученные ежедневно в течение 5 дней по 5, 15 и 30 минут терагерцевыми волнами на частотах 150,176-150,664 ГГц (n=45).

VII. Крысы-самцы, на которых изучали закономерности воздействия электромагнитного излучения терагерцевого диапазона на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц на газовый и электролитный составы крови при стрессе 56. Интактные животные (n=15).

57. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=15).

58. Животные в состоянии длительного иммобилизационного стресса (n=15).

электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частотах 150,176ГГц в течение 5, 15 и 30 минут (n=45).

Крысы-самцы в состоянии длительного стресса, облученные 62, 63, ежедневно в течение 5 дней по 5, 15 и 30 минут терагерцевыми волнами на частотах 150,176-150,664 ГГц (n=45).

VIII. Стрессированные крысы-самцы, у которых исследовали влияние терагерцевых волн на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц на концентрацию стабильных метаболитов оксида азота.

65. Интактные животные (n=10).

66. Животные в состоянии острого иммобилизационного стресса (n=10).

67. Животные в состоянии длительного иммобилизационного стресса (n=10).

68, 69, 70 Самцы в состоянии острого стресса, облученные электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частоте атмосферного кислорода 129, ГГц в течение 5, 15 и 30 минут (n=30).

71, 72, 73 Животные, находящиеся в состоянии длительного стресса, облученные терагерцевыми волнами на частоте атмосферного кислорода 129, ГГц ежедневно в течение 5 дней подряд по 5, 15 и 30 минут (n=30).

2.3. Методика облучения лабораторных животных и техническая характеристика прибора, использованного в экспериментах Облучение экспериментальных животных, находящихся в состоянии острого или длительного иммобилизационного стрессов, проводили электромагнитными волнами на частотах молекулярного спектра оксида азота 150,176-150,664 ГГц и атмосферного кислорода 129,0 ГГц на участок кожи площадью 3 см 2 над областью мечевидного отростка грудины. Излучатель электромагнитных волн располагался на расстоянии 1,5 см над поверхностью тела животного. В случае использования излучателя «NO» мощность излучения составляла 0,7мВт, а плотность мощности, падающей на участок кожи размером 3 см 2, равнялась 0,2 мВт/см2. При использовании излучателя «О2 »

плотность мощности, падающей на участок кожи размером 3 см 2, равнялась 100 мкВт/см2, Доза облучения определялась плотностью мощности, падающей на кожу, и заданным временем облучения. Продолжительность однократного или ежедневного в течение 5 дней облучения составляла 5, 15 и 30 минут. В группах контроля и сравнения проводились такие же манипуляции, сопутствующие облучению, как и у животных опытных групп.

Для облучения животных использовали переносной медицинский аппарат терагерцевой терапии “Орбита”, разработанный в ОАО «Центральный научноисследовательский институт измерительной аппаратуры» (г. Саратов) (регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05497, лицензия № 99-03- от 7 июня 2010) (рис. 2.1., схема 1).

Рис 2.1. Аппарат для терагерцовой терапии «Орбита»

Схема 1. Устройство аппарата для терагерцовой терапии «Орбита»

1 - выносной излучатель, 2 - генератор КВЧ терагерцового диапазона, 3 - излучающая антенна, 4 - блок питания и управления, 5 - соединительный кабель.

Излучатель терагерцовых волн (1) состоит из генератора (2) на диоде Ганна, согласующей мембраны, закрытой круглой металлической диафрагмой с диаметром отверстия 4 мм, корпуса, антенны (3). С помощью соединительного экранированного кабеля (5) с разъемом излучатель терагерцовых волн (1) подключен к блоку питания и управления (4). Блок питания и управления (4) обеспечивает питание и управление миллиметровым излучателем (1). Блок питания и управления (4) состоит из силового трансформатора, выпрямителя, таймера, ключевого устройства автоматического отключения питания излучателя (на чертеже не показаны). На корпусе блока (4) расположены цифровое табло и кнопки задания времени процедуры. Кроме того, в блоке электромагнитных колебаний излучателя относительно его центральной частоты.

Структура молекулярного терагерцового спектра электромагнитного излучения оксида азота и атмосферного кислорода формируется в нем в детерминированных шумов для биофизических исследований, разработанном в ОАО «Центральный научно-исследовательский институт измерительной аппаратуры» [Панорамно-спектрометрический …, 2001, с. 35-47].

Основные технические характеристики аппарата изложены в таблице 2.1.

Атмосферный кислород 6. выключенной генерации в циклическом режиме сеанса терапии, не менее Выходная мощность излучения, мкВт не менее 100 и не более 10. потребляемая аппаратом, ВА 11. производится от сети, В; частоты, Гц 2.4. Забор образцов крови у лабораторных животных Забор крови у крыс во всех экспериментах проводили в изолированном тихом помещении, в которое животное приносили в индивидуальной клетке, начиная с 10 часов утра. Забирали кровь у экспериментальных животных в экранированные (для предотвращения влияния внешних электромагнитных полей) пластиковые пробирки путем пункции сердца экранированным одноразовым шприцем. При необходимости в качестве стабилизатора крови использовали 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 9:1.

2.5. Приготовление анализируемых образцов крови Плазму крови получали путем центрифугирования стабилизированной крови при 1000 об/мин. (при относительной центробежной силе RCF 240 g) в течение 7 минут. Богатую тромбоцитами плазму переносили в другую пластиковую пробирку и повторно центрифугировали при 3000 об/мин. (при относительной центробежной силе RCF 1200 g) в течение 15 минут для получения бедной тромбоцитами плазмы.

Центрифугирование проводилось непосредственно после взятия крови, а отбор плазмы на исследование - сразу же после центрифугирования. Не допускался анализ плазмы крови, имеющей сгустки, гемолиз.

При необходимости использовать сыворотку крови ее получали путем отстаивания свернувшейся крови при комнатной температуре в течение 1 ч для образования сгустка и затем центрифугировали со скоростью вращения 1500об./мин (при относительной центробежной силе RCF 500-1000 g) не более 15-20 мин. Более высокая скорость вращения не применялась, так как это могло привести к гемолизу сыворотки. Полученную сыворотку отделяли от форменных элементов крови, переносили в пробирку и плотно закрывали крышкой. Липемическая или гемолизированная сыворотка не использовалась для анализа.

При получении сыворотки не допускали ее длительной экспозиции над форменными элементами крови, так как ряд гормонов может поглощаться и инактивироваться эритроцитами и лейкоцитами, что в конечном итоге может привести к изменению их концентраций в исследуемой пробе.

Если анализ сыворотки проводился сразу, то её образцы хранили при комнатной температуре, но не более 1,5-3 часов.

В случае отсроченного исследования – образцы сыворотки быстро замораживали и хранили при температуре минус 20°С ограниченное время.

Следует отметить, что при медленном замораживании в исследуемом растворе могут образоваться кристаллы льда, которые способны разорвать молекулы некоторых анализируемых веществ, в частности белков, гормонов. Образцы замороженной сыворотки хранили в хорошо закрытых пробирках, так как потеря в образце влаги в замороженном состоянии могла привести к концентрированию исследуемого вещества и получению в итоге ошибочного результата анализа.

При размораживании сывороток избегали теплового шока образцов, который может наступить при переносе пробы с температурой минус 20°С в комнатную температуру. Размораживание проводили медленно и постепенно.

Накануне постановки анализа исследуемые сыворотки из морозильной камеры помещали в холодильник с температурой 4° С, где они размораживались в течение всей ночи. На следующий день совместно с диагностическим набором их прогревали 1 час до комнатной температуры. Перед постановкой анализа тщательно перемешивали анализируемый образец, так как при размораживании проб в них может образоваться градиент концентрации сывороточных белков.

Набор реагентов и анализируемые образцы сывороток имели одинаковую (комнатную) температуру.

Размораживание и повторное замораживание не проводилось.

2.6. Методы исследования состояния гипофизарно-тиреоидной системы 2.6.1. Количественное определение концентрации тиреотропного гормона в сыворотке крови методом твердофазного Тиреотропный гормон (ТТГ) имеет гликопротеиновую природу с молекулярной массой около 30000 дальтон, состоит из альфа- и бетасубъединиц. Биологическая активность ТТГ обусловлена его бетасубъединицей. ТТГ секретируется передней долей гипофиза и стимулирует синтез и высвобождение гормонов щитовидной железы [Пальчикова, 2004, 200 с.; Киричук, Иванов, 2008, 99 с.]. Гипофизарная секреция тиреотропного гормона крайне чувствительна к изменению концентрации трийодтиронина и тироксина. Количественное определение содержания ТТГ в сыворотке крови имеет диагностическое значение при оценке тиреоидного статуса и может быть использовано для диагностики функциональных нарушений щитовидной железы, гипотиреоза, гипертиреоза.

Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе с применением двух типов моноклональных антител. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца и раствора для разведения сывороток во время первой инкубации происходит связывание ТТГ с моноклональными антителами к бета-субъединице тиреотропного гормона, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. Во время второй инкубации конъюгат моноклональных антител к альфа-субъединице тиреотропного гормона с пероксидазой связывается с ТТГ, иммобилизованным тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации ТТГ в анализируемых образцах.

После измерения величины оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрации ТТГ в анализируемых образцах.

Содержание ТТГ в сыворотке крови определяли в мМЕ/л.

2.6.2. Количественное определение концентрации общего тироксина в сыворотке крови методом твердофазного Тироксин – тиреоидный гормон с молекулярной массой около дальтон, синтезируемый щитовидной железой. В сыворотке крови тироксин находится в основном в комплексе с тироксин-связывающими белками, доля несвязанного - свободного гормона составляет примерно 0,03% от общей концентрации тироксина [Пальчикова, 2004, 200 с.; Киричук, Иванов, 2008, 99 с.]. Количественное определение содержания Т4 общ в сыворотке крови может быть использовано для оценки функционального состояния щитовидной железы.

иммуноферментном анализе с применением моноклональных антител. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца и конъюгата происходит разрушение комплексов тироксин – транспортный белок и конкурентное связывание сывороточного тироксина и тироксина, конъюгированного с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках.

Степень окраски обратно пропорциональна концентрации общего тироксина в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация Т 4 общ в анализируемых образцах.

Концентрацию общего тироксина в сыворотке крови выражали в нмоль/л.

2.6.3. Количественное определение концентрации общего трийодтиронина в сыворотке крови методом твердофазного Трийодтиронин – тиреоидный гормон с молекулярной массой дальтон. Трийодтиронин является одним из гормонов, синтезируемых щитовидной железой. В сыворотке крови гормон находится в основном в комплексе с транспортными белками, доля не связанного – свободного гормона составляет примерно 0,2% от общей концентрации Т3 [Пальчикова, 2004, 200 с.; Киричук, Иванов, 2008, 99 с.].

Количественное определение содержания общего трийодтиронина в сыворотке крови может быть использовано для оценки функционального состояния щитовидной железы.

Метод определения Т3 основан на твердофазном конкурентном иммуноферментном анализе с применением поликлональных антител. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца и конъюгата происходит разрушение комплексов трийодтиронин-транспортный белок и конкурентное связывание сывороточного трийодтиронина и трийодтиронина, конъюгированного с пероксидазой, с поликлональными антителами к трийодтиронину, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках.

анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация Т3 общ в анализируемых образцах.

Уровень общего трийодтиронина в сыворотке крови выражали в нмоль/л.

2.6.4. Иммуноферментное определение концентрации свободной Концентрация тироксина в сыворотке крови – наиболее общепринятый показатель функции щитовидной железы, позволяющий довольно четко разграничивать гипер-, гипо- и эутиреоз. Концентрация свободной фракции тироксина не зависит от уровня связывающих белков и отражает истинный тиреоидный статус [Пальчикова, 2004, 200 с.; Киричук, Иванов, 2008, 99 с.].

иммуноферментном анализе с применением моноклональных антител. В лунках планшета, при добавлении исследуемого образца и конъюгата, во время инкубации происходит конкурентное связывание свободной фракции сывороточного тироксина и тироксина, конъюгированного с пероксидазой, с моноклональными антителами к тироксину, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски обратно пропорциональна концентрации Т4 анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация Т4 СВ в анализируемых образцах.

Концентрацию свободной фракции тироксина в сыворотке крови в определяли в пмоль/л.

2.6.5. Иммуноферментное определение концентрации свободной фракции трийодтиронина в сыворотке крови Трийодтиронин – гормон щитовидной железы с молекулярной массой дальтон, содержащий 3 атома йода (58% от общей массы молекулы). В щитовидной железе синтезируется небольшая часть Т3, а основное его количество образуется путем ферментативного дейодирования Т4 в периферических тканях (печени, почках, сердечной мышце и других органах).

Следует отметить, что лишь незначительная часть трийодтиронина около 0,2%-0,3% находится в кровотоке в свободной форме, но именно она принимает непосредственное участие в реализации множества регуляторных функций в организме человека [Пальчикова, 2004, 200 с.; Киричук, Иванов, 2008, 99 с.].

иммуноферментном анализе с применением поликлональных антител. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца и конъюгата происходит конкурентное связывание свободной фракции сывороточного трийодтиронина и трийодтиронина, конъюгированного с пероксидазой, с поликлональными антителами к трийодтиронину, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина, происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски обратно пропорциональна концентрации Т3 в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация Т3 в анализируемых образцах.

Количество свободной фракции трийодтиронина в сыворотке крови определяли в пмоль/л.

2.6.6. Количественное определение концентрации Тиреоглобулин (ТГ) – гликопротеин, в состав которого входят йодированные производные аминокислоты тирозина. ТГ синтезируется в тиреоцитах и секретируется в просвет фолликулов, где осуществляется синтез тиреоидных гормонов. В щитовидной железе ТГ выполняет функцию накопления йодпроизводных тирозина, использующихся по мере функционального состояния щитовидной железы [Пальчикова, 2004, 200 с.;

Киричук, Иванов, 2008, 99 с.].

Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе с применением двух типов моноклональных антител с различной эпитопной специфичностью к ТГ. В лунках планшета при инкубации поверхности лунок, и конъюгатом моноклональных антител с пероксидазой. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски пропорциональна концентрации ТГ в анализируемых образцах.

калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания ТГ в калибровочных образцах.

Концентрацию ТГ в сыворотке крови определяли в нг/мл.

2.6.7. Иммуноферментное определение концентрации антител к тиреопероксидазе в сыворотке крови Антитела к тиреопероксидазе (Анти-ТПО) – это циркулирующие гетерогенные иммуноглобулины, преимущественно класса G, против фермента, являющегося основным антигенным компонентом микросом [Пальчикова, 2004, 200 с.].

Они участвуют в реализации сложного механизма аутоиммунного поражения щитовидной железы и, следовательно, являются основными определение содержания Анти-ТПО в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы [Пальчикова, 2004, 200 с.].

Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца во время первой инкубации происходит связывание антител к тиреопероксидазе с тиреопероксидазой, иммобилизованной на внутренней поверхности лунок. Во время второй инкубации при добавлении конъюгата происходит связывание антител к IgG, конъюгированных пероксидазой, с антителами к тиреопероксидазе, иммобилизованными в ходе первой реакции. После удаления избытка несвязавшегося конъюгата, во время инкубации с раствором тетраметилбензидина, происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации антител к тиреопероксидазе в анализируемых образцах.

После измерения величины оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация Анти-ТПО в анализируемых образцах.

Количество антител к тиреопероксидазе в сыворотке крови выражали в МЕ/мл.

2.6.8. Иммуноферментное определение концентрации Антитела к тиреоглобулину (Анти-ТГ) относятся преимущественно к классу IgG и являются гетерогенными, направленными против различных эпитопов молекулы тиреоглобулина [Пальчикова, 2004, 200 с.].

Они участвуют в реализации сложного механизма аутоиммунного поражения щитовидной железы и, следовательно, являются маркерами тиреоидных аутоиммунных заболеваний. Количественное определение содержания Анти-ТГ в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.

иммуноферментном анализе. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца во время первой инкубации происходит связывание антител к тиреоглобулину с тиреоглобулином, иммобилизованным на внутренней поверхности лунок. Во время второй инкубации при добавлении конъюгата происходит связывание антител к IgG, конъюгированных пероксидазой, с антителами к тиреоглобулину, иммобилизованными в ходе первой реакции. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации Анти-ТГ в анализируемых образцах.

После измерения величины оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация Анти-ТГ в анализируемых образцах.

Количество антител к тиреоглобулину в сыворотке крови определяли в МЕ/мл.

2.7. Определение концентрации кортикостерона в сыворотке крови у Кортикостерон – стероидный гормон, синтезируемый корой надпочечников, пучковой зоной [Киричук, Иванов, 2008, 99 с.].

Метод определения концентрации кортикостерона в сыворотке крови основан на твердофазном конкурентном иммуноферментном анализе с применением моноклональных антител. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца сыворотки и конъюгата происходит конкурентное связывание сывороточного кортикостерона с моноклональными антителами к кортикостерону, иммобилизированными на внутренней поверхности лунок. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски обратно пропорциональна концентрации кортикостерона в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывали концентрацию кортикостерона в анализируемых образцах.

Концентрацию кортикостерона у экспериментальных животных выражали в нмоль/л.

2.8. Методы исследования коагуляционного звена системы гемостаза, антикоагулянтного потенциала крови и ее фибринолитической активности у экспериментальных животных Состояние коагуляционного звена системы гемостаза исследовали с гемокоагулометре CGL 2110 «Solar» (Республика Беларусь, г. Минск) с использованием реактивов фирмы НПО “РЕНАМ” (г. Москва, Россия).

частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) При добавлении к цитратной плазме активатора (эллаговой кислоты) и фосфолипидов (сои) время образования сгустка фибрина зависит только от активности в данной плазме факторов свертывания крови: I, II, VIII, IX, X, XI, XII. Тест АЧТВ позволяет выявить функциональную недостаточность всех факторов внутреннего пути механизма свертывания крови, а также дефицит прекалликреина (фактор Флетчера) и высокомолекулярного кининогена (фактор Фитцджеральда).

гипокоагуляционных сдвигов в системе гемостаза, тромбоэмболических состояний, ДВС-синдрома различной этиологии.

Величину АЧТВ у экспериментальных животных выражали в секундах.

2.8.2. Определение протромбинового времени и международного нормализованного отношения (МНО) Тест определения протромбинового времени применяется для анализа активности факторов протромбинового комплекса, для анализа функций печени, дефицита витамина К и для оценки эффективности лечебного действия антикоагулянтов.

При добавлении к цитратной плазме ионов кальция и избытка тканевого тромбопластина время образования сгустка фибрина зависит только от активности факторов протромбинового комплекса (факторов внешнего пути механизма свертывания крови): II, V, VII, X.

1.Протромбинового времени (ПВ), сек;

2.МНО (усл. ед.) = протромбиновое отношениеISI, где протромбиновое отношение = чувствительности тромбопластина. Таким образом, протромбиновое отношение возводят в степень (ISI ).

В 1983 году ВОЗ совместно с Международным обществом тромбозов и гемостаза постановили считать тромбопластин из мозга человека референтным и ISI этого тромбопластина приняли за 1,0.

При расчете МНО в наших экспериментах международный индекс чувствительности (ISI) тромбопластина равнялся 1,0 (рекомбинантный эталон тканевого тромбопластина экстракта из головного мозга человека).

Полученную величину протромбинового времени у экспериментальных животных выражали в секундах, а величину МНО – в условных единицах.

2.8.3. Унифицированный гравиметрический метод определения Фибриноген – один из плазменных белков, с большой молекулярной массой, представляющий собой удлиненную димерную молекулу, состоящую из трех пар полипептидных цепей, соединенных дисульфидными мостиками [Кузник, 2010, 832 с.].

Принцип метода основан на высушивании и взвешивании сгустка, образующегося при добавлении к определенному объему плазмы раствора тромбина стандартной активности.

Концентрацию фибриногена у лабораторных животных выражали в г/л.

2.8.4. Определение величины тромбинового времени коагуляционной системы. Определение тромбинового времени позволяет оценить конечный этап свертывания крови (превращение фибриногена в фибрин) [Кузник, 2010, 832 с.].

Метод оценки тромбинового времени заключается в определении времени свертывания плазмы крови при добавлении в нее тромбина со стандартной активностью, который обладает способностью индуцировать превращение фибриногена в фибрин без участия других факторов свертывания крови.

Полученную величину тромбинового времени у экспериментальных животных выражали в секундах.

2.8.5. Определение активности фактора XIII (фибриназы) Завершающий этап процесса свертывания крови характеризуется самосборкой фибрин-мономеров с последующей сшивкой образовавшихся олигомеров фибрина фактором XIII (фибринстабилизирующим фактором) В результате образуется сгусток фибрина, обладающий гораздо большей прочностью и стойкостью к действию фибринолитических агентов и растворителей (мочевина, монохлоруксусная кислота и др.), по сравнению со сгустком, полученным из плазмы, дефицитной по фактору XIII [Кузник, 2010, 832 с.].

В данном способе субстратом для фактора XIIIа служит сгусток фибрина, получаемый в результате добавления к плазме специально приготовленного реагента - растворимого фибрина. Определяют то наибольшее разведение исследуемой плазмы, в котором такой сгусток еще не лизировался под действием монохлоруксусной кислоты. Активность фактора XIII рассчитывают в процентах от нормы, сравнивая искомые разведения, полученные при исследовании контрольной нормальной плазмы и исследуемой плазмы.

Активность фактора XIII выражалась в процентах.

2.8.6. Определение активности естественного прогрессивного антикоагулянта антитромбина III (Баркаган З.С., Момот А.П., 1999) Антитромбин III – гликопротеид, ингибирующий тромбин (путем образования необратимого комплекса тромбин-антитромбин) и ряд активных факторов свертывания крови (Ха, XIIа, IXа и др.). На его долю приходится около 80% всей антикоагулянтной активности. Синтезируется в эндотелии и клетках печени [Баркаган, Момот, 1999, 290 с.; Воробьев, 2004, 140 с.].

Антитромбин III разведенной исследуемой плазмы в присутствии гепарина быстро инактивирует -тромбин. Это приводит к удлинению времени свертывания крови, по которому оценивают активность антитромбина III образца в секундах.

Активность антитромбина III выражалась в секундах.

Протеин С – относится к витамин K-зависимым протеолитическим ферментам (сериновая протеаза), который активируется под действием тромбина. При этом он превращается в активированный протеин С, который способен связываться с протеином S и расщеплять факторы коагуляции Va и VIIIа. Активированный протеин С является основным ферментом каскадного антитромботическую активность крови и обладает также выраженными противовоспалительной и антиапоптозной активностями [Баркаган, Момот, 1999, 290 с.; Воробьев, 2004, 140 с.].

Под действием активатора из яда змеи щитомордника протеин С активируется и действует как антикоагулянт через протеолиз факторов Vа и VIIIа в присутствии своего кофактора протеина S и фосфолипидов. Поэтому, после добавления активатора протеина С к нормальной плазме происходит удлинение времени свертывания. При недостаточном количестве протеина С, протеина S или резистентности фактора Vа к действию протеина С удлинение времени свертывания выражено в меньшей степени.

По полученным данным рассчитывают нормализованное отношение (НО):

НО= ----------где С1 и С2 – время свертывания в стандарт- плазме с добавлением соответственно дистиллированной воды и активатора протеина С;

В1 и В2 – время свертывания в плазме исследуемого образца с добавлением соответственно дистиллированной воды и активатора протеина С.

Нормализованное отношение, отражающее активность протеина С, выражалось в условных единицах.

2.8.8. Определение XIIа- калликреин - зависимого фибринолиза Определение фибринолитической активности эуглобулиновой фракции плазмы крови (время лизиса эуглобулиновых сгустков) является важнейшим базисным методом исследования системы фибринолиза, позволяющим оценить состояние внутреннего и внешнего механизмов образования плазминогена.

В основу метода положен факт ускорения лизиса эуглобулинов, полученных из обработанной каолином бедной тромбоцитами плазмы. Из исследуемой плазмы выделяют эуглобулиновую фракцию, в которой с помощью каолина активирован «мост»: «фактор XIIа калликреин плазминоген». Определяют эуглобулиновый лизис при такой активации.

Результат выражали в минутах.

2.8.9. Определение индуцированного стрептокиназой Стрептокиназа способствует активации (превращению) всего содержащегося в плазме крови плазминогена в плазмин – фермент, обладающий прямым фибринолитическим действием. Определяют время индуцированного стрептокиназой лизиса сгустка, получаемого при свертывании эуглобулиновой фракции плазмы тромбином.

Результат учитывали в секундах.

2.8.10. Вычисление индекса резерва плазминогена (ИРП) Индекс резерва плазминогена представляет собою отношение среднего времени лизиса эуглобулинов в контроле к среднему времени лизиса эуглобулинов в исследуемом образце. Индекс резерва плазминогена свидетельствует об изменении уровня активности плазминогена.

Таким образом, определение резерва плазминогена имеет значение для диагностики массивных тромбозов, ДВС-синдрома и других патологических состояний.

Среднее время лизиса эуглобулинов в контрольном образце ИРП, (%) = ------------------------------------------------------------------------ x Среднее время лизиса эуглобулинов в исследуемом образце Индекс резерва плазминогена у лабораторных животных определяли в процентах.

2.8.11. Определение ранних продуктов деградации фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов Фенантролиновая проба (РФМК-тест) основана на определении времени появления в плазме хлопьев (зерен) фибрина после добавления к ней о-фенантролина. Это время тем короче, чем выше концентрация в плазме ранних продуктов деградации фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов.

РФМК-тест предназначен для выявления тромбинемии как одного из основных признаков внутрисосудистого свертывания крови при тромбозах, ДВСсиндромах различного генеза. В отличие от распространенного этанолового, -нафтолового и протаминсульфатного тестов фенантролиновая проба (РФМКтест) благодаря количественному выражению результатов и простоте постановки позволяет проводить динамический контроль за содержанием ранних продуктов деградации фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме по ходу эксперимента.

В норме содержание растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме крови по фенантролиновому тесту составляет в среднем 3,38±0,02 мг/100мл, с верхним пределом нормы – 4,0 мг/100мл.

2.8.12. Определение ранних продуктов деградации фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов Тест склеивания стафилококков (клампинг-тест) в отличие от других методов, основан на способности некоторых штаммов золотистого стафилококка специфически взаимодействовать с ранними продуктами деградации фибриногена и фибрин - мономерными комплексами. Такое взаимодействие учитывается визуально по агглютинации бактериальных клеток.

Нормальное содержание ранних продуктов деградации фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов в этом тесте составляет от 0 мкг/мл до 4 мкг/мл.

2.8.13. Определение D-димеров в плазме крови (NycoCard D-Димер с использованием NycoCard Reader II) D-димеры являются фрагментами волокон фибрина, которые образуются в процессе фибринолиза при расщеплении фибринового сгустка плазмином.

Иными словами, D-димеры – это специфические продукты деградации фибрина, входящие в состав тромба. Концентрация D-димеров в сыворотке пропорциональна активности фибринолиза и количеству лизируемого фибрина [Третьякова, 2010, с. 22-29]. Этот тест позволяет судить об интенсивности процессов образования и разрушения фибриновых сгустков.

Обнаружение D-димеров – это показатель того, что в процессе фибринолиза расщепляется именно фибрин, а не фибриноген или фибринмономеры. Повышение содержания D-димеров в плазме крови в настоящее время рассматривается как один из главных маркеров активации системы гемостаза, который отражает процессы как образования фибрина, так и его лизиса (уровень D-димеров не меняется при первичном фибринолизе, дисфибриногенемиях) [Третьякова, 2010, с. 22-29]. Определение содержания Д-димеров широко используется в лабораторной практике для исключения тромбозов.

В настоящее время определение содержания D-димеров рассматривается как наиболее надежный метод диагностики ДВС синдрома.

сэндвичевого типа. Образец плазмы вносится в одну из шести ячеек на поверхности пластиковой карты. При впитывании образца в карту молекулы D-димеров связываются с специфичными к ним моноклональными антителами, нанесенными на поверхность мембраны в реакционной ячейке. Фиксированный на мембране D-димер связывает коньюгат частиц золота с антителами, добавляемый на следующем этапе реакции, с образованием сэндвича.

Несвязавшийся коньюгат удаляется с мембраны промывающим раствором. В присутствии патологическогих количеств D-димеров мембрана рабочей ячейки окрашивается в красный цвет, интенсивность окраски пропорциональна концентрации D-димера в образце. Интенсивность окраски определяется количественно с использованием NycoCard Reader II.

предназначенный для быстрых и надежных измерений NycoCard-тестов.

NycoCard Reader II измеряет отражения в трех частях видимого спектра. Свет, испускаемый светодиодами и отраженный от образца, измеряется датчиком и затем передается микропроцессору. Микропроцессор пересчитывает концентрацию.

Единицы измерения: мг/л.

2.9. Методы исследования процессов липопероксидации и активности экспериментальных животных исследовали с использованием общепринятых методов определения первичных и вторичных продуктов липопероксидации (малонового диальдегида, гидроперекисей липидов) внутриклеточно и в плазме крови, параллельно проводили определение перекисной резистентности эритроцитов и наличие маркеров протеолиза и аутолиза – молекул средней массы в сыворотке крови.

Для изучения состояния ферментативного и неферментативного звеньев супероксиддисмутазы в эритроцитах, а также содержание витамина Е и количества общих сульфгидрильных групп в сыворотке крови.

2.9.1. Колориметрический метод определения малонового диальдегида в эритроцитах и плазме крови Малоновый диальдегид (МДА) – вторичный продукт перекисного окисления жирных кислот, определяли фотометрически по окраске комплекса МДА - тиобарбитуровая кислота [Афанасьева, 2009, 47 с.].

окрашенный комплекс в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой.

В опытную пробирку вносили 0,5 мл плазмы / 0,1 мл эритроцитов, предварительно трижды отмытых 0,15 М хлорида натрия, гемолизировали 2 мл дистиллированной воды, добавляли 1 мл 17% раствора трихлорацетата и 1 мл 0,8% тиобарбитуровой кислоты. После инкубации при 100° С в течении минут охлаждали, в последующем центрифугировали в течении 10 минут при 3000 об/мин и измеряли оптическую плотность против контрольной пробы на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 540 нм.

Расчёт количества проводится с учётом разведения по формуле:

МДА = Е- экстинкция опытной пробы;

1,56105 - коэффициент молярной экстинкции;

6,2 - разведение плазмы.

Содержание МДА выражали в мкМоль/мл.

2.9.2. Спектрофотометрический метод определения Гидроперекиси липидов (ГПЛ) образуются при оксидативном окислении жирных кислот и рассматриваются, как первичный продукт перекисного окисления биополимеров [Афанасьева, 2009, 47 с.].

Метод определения концентрации ГПЛ основан на интенсивном поглощении коньюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов в области 232-234 нм.

К 0,2 мл плазмы добавляли 4 мл смеси гептан-изопропанол. После минутного встряхивания в опытную пробирку добавляли 1 мл раствора соляной кислоты. После повторного встряхивания пробу оставляли для расслоения жидкостей на 30 минут, после чего отбирали гептановый слой, в котором на спектрофотометре СФ-26 определяли величину экстинкции в дальнем ультрафиолете (233 нм) против контрольной пробы.

Расчёт проводили по формуле:

D = _, где D233 - измеренное значение оптической плотности;

Vэ - конечный объём гептанового слоя;

V пл - объём крови.

Результаты измерений выражали в единицах величины оптической плотности на мл.

2.9.3. Определение молекул средней массы в (Габриэлян Н.И., Левицкий Э.Р., Щербанева О.И. и соавт., 1983) Молекулы средней массы (МСМ) – эндогенные компоненты различные по своей химической структуре, молекулярная масса которых составляет 300 дальтон [Афанасьева, 2009, 47 с.].

К пробным образцам добавляли 10% раствор трихлоруксусной кислоты, что вызывало осаждение грубодисперсных белков исследуемой жидкости, центрифугировали в течении 20 минут при 3000 об/мин, с последующей детекцией элюируемой фракции в супернатане на спектрофотометре при длине волны 254 нм против холостой пробы.

Результат измерений выражали в единицах оптической плотности.

2.9.4. Фотоколориметрический ультрамикрометод определения общих сульфгидрильных групп сыворотки крови SH-соединения проявляют своё протекторное действие преимущественно в цитоплазме клеток или плазме крови. В связи с коротким периодом жизни они не подвергаются ферментативной активации в биологических системах при различных воздействиях и способны проявлять как антирадикальное, так и антиперекисное действие [Афанасьева, 2009, 47 с.].

молекулярного йода со свободными сульфгидрильными группами белков и низкомолекулярных соединений в присутствии йодида калия, а также фосфатного буфера.

К 0,1 мл сыворотки крови добавляли 1 мл дистиллированной воды, 1 мл 6 М раствора KI, 3 капли 5% раствора крахмала и 3,9 мл фосфатного буфера pН 7,6. Пробу перемешивали и в кювете с длиной оптического пути 20 мм помещали в фотоэлектроколориметр КФК-2 против контрольной пробы. Затем в пробу вносили 0,3 мл 0,001 М раствора йода и через 10 секунд после внесения колориметрировали, используя светофильтр 500 нм.

О количестве сульфгидрильных групп судили по количеству йода (в эквивалентах), прореагировавшего с тиогруппами по результатам сравнения опытной и контрольной проб.

Расчёт проводили по формуле:

X = _, где X - количество SH - групп в ммоль/л;

0,3 - количество йода, вносимого в пробу;

Ек и Ео - экстинкции контрольной и опытной проб.

Содержание сульфгидрильных групп определяли в ммоль/л.

2.9.5. Спектрофотометрический метод определения (Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. и соавт., 1988) Каталаза – гемсодержащий фермент, локализованный преимущественно в пероксисомах в концентрации 10-6 М, катализирующий двухэлектронное восстановление перекиси водорода до воды при дисмутации супероксидного аниона [Афанасьева, 2009, 47 с.].

образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

В опытную и контрольную пробирки к 2,0 мл 0,03% раствора перекиси водорода добавляли 0,1 мл гемолизата или 0,1 мл дистиллированной воды.

Затем в каждую пробирку добавляли 1 мл 4% молибдата аммония.

Интенсивность развивающейся окраски измеряли на спектрофотометре (СФпри длине волны 410 нм против контрольной пробы.

Активность каталазы рассчитывали по формуле:

Е - активность каталазы;

Ахол - Аоп - экстинкция холостой и опытной проб;

V - объём вносимой пробы;

Т - время инкубации 600 с;

К - коэффициент миллимолярной экстинкции равный 22,2 х 103 мМ-1см- Активность каталазы выражали в мкЕд/ л.

2.9.6. Спектрофотометрический метод определения активности Супероксиддисмутаза (СОД) – антиоксидантный энзим, катализирующий диспропорционирование супероксидных радикалов и препятствующий электронному возбуждению кислорода [Афанасьева, 2009, 47 с.].

нитроформазана – продукта восстановления нитротетразолия синего феназинметасульфата.

В опытную пробирку, содержащую 1 мл гемолизата добавляли 0,5 мл спирта, 0,25 мл хлороформа и 300 мг КН2РО4. После перемешивания центрифугировали при 5000 об/мин в течении 30 минут. В последующем в контрольную и опытную пробирки добавляли по 1,5 мл инкубационной смеси, 0,05 мл раствора НАДН, 0,1 мл супернатана. Через 10 минут измеряли поглощение на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Расчёт проводили по формуле:

СОД = _ 100, где Ек - Ео - экстинкции контрольной и опытной проб.

Активность фермента выражали в условных единицах на 1 мл крови.

2.9.7. Спектрофотометрический метод определения Перекисная резистентность эритроцитов (ПРЭ) – гемолитическая стойкость эритроцитов под влиянием определённых концентраций перекиси водорода [Афанасьева, 2009, 47 с.].

Сущность метода сводится к определению количества эритроцитов, гемолизирующихся в стандартных условиях под влиянием определённых концентраций перекиси водорода в физиологическом растворе. Степень гемолиза определяли на ФЭКН-57. ПРЭ находится в обратной зависимости по отношению к степени гемолиза, определяемого в стандартных условиях опыта.

В микроцентрифужную пробирку вносили 0,02 мл крови и 0,4 мл цитрата физиологического раствора, центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин. Центрифугат сливали в осадок и заливали 0,4 мл буфернофизиологическим раствором NaCl и 1/15 М фосфатного буфера pН 7,4. После 15 минут инкубации в термостате при 37° С эритроцитарную взвесь повторно центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин. Центрифугат сливали и к осадку добавляли 0,25 мл физиологического раствора. Для определения перекисной резистентности в микропробирки вносили 0,05 мл приготовленной суспензии.

Пробы инкубировали в течении 15 минут при 37°С, добавляли растворы, повторно центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин. Степень гемолиза определяли колориметрированием центрифугатов на ФЭКН-57 при длине волны 536 мкм. О перекисной резистентности эритроцитов судят по степени гемолиза, вызванного влиянием раствора перекиси водорода.

Расчёт проводили по формуле:

А = _, где А - степень гемолиза (%);

а - средний показатель ФЭК для опытных проб;

б - показатель ФЭК при полном гемолизе;

в - показатель ФЭК для контрольной пробы.

2.9.8. Спектрофотометрический метод определения (Черняускене Р.Ч., Варшкявичене 3.3., Грибаускас П.С., 1984) -токоферол – антиоксидант, концентрирующийся в гидрофобном слое мембран митохондрий, эритроцитов и плазматических мембран [Афанасьева, 2009, 47 с.].

К 0,2 мл сыворотки крови добавляли 1 мл бидистилированной воды, встряхивали в течение 30 секунд. Затем добавляли 1 мл этилового спирта, встряхивали в течение 40 минут, центрифугировали 10 минут при 500 об/мин.

Отделившийся 3 мл гексановый слой подвергают спектрофотометрии при длине волны 295 нм и флюоресценции 320 нм.

Концентрацию витамина Е в сыворотке определяли по формуле:

С обр = иФ - интенсивность флюоресценции образца сыворотке и стандарта;

С ст - концентрация вещества в рабочем стандартном растворе.

Активность выражали в единицах оптической плотности.

2.10. Методы исследования метаболического статуса у электромагнитного облучения терагерцового диапазона на частотах активных исследование основных показателей метаболического статуса, в частности, липидного (холестерин, триглицериды), углеводного обменов (глюкоза крови), показателей обмена азотистых соединений, трансаминаз (АСТ, АЛТ) и лактатдегидрогеназы на автоматическом биохимическом анализаторе Vitalab Flexor «E» (фирма Vital Scientific, Голландия).

Определение других исследуемых показателей метаболического статуса у лабораторных животных выполняли по стандартным методикам, характеристика которых приведена ниже.

2.10.1. Унифицированный метод определения общего белка сыворотки (Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., и соавт., 1987) Белки крови относятся к высокомолекулярным соединениям, различным по своему химическому строению и пространственной конфигурации макромолекул. В биологических жидкостях 90% общего белка составляют альбумины, фибриноген, иммуноглобулины, липопротеиды, трансферрин и другие белки, присутствующие в плазме крови в небольших количествах [Ослопов, 2005, 64 с.].

Принцип метода определения содержания общего белка основан на биуретовой реакции, возникающей после реагирования протеинов в щелочной среде с сульфатом меди.

В опытной пробирке проводили смешивание 0,1 мл сыворотки крови и 5 мл рабочего раствора биуретового реактива, через 30 минут измеряли на фотометре при длине волны 500-560 нм против холостой пробы. В контрольной пробирке к 5 мл биуретового реактива добавляли 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия. Расчёт проводили по калибровочному графику.

Концентрацию общего белка рассчитывали в г/л.

2.10.2. Унифицированный метод определения содержания альбумина в сыворотке крови по реакции с бромкрезоловым зелёным коллоидно-осмотического давления в плазме крови и играющий важную роль в транспорте различных веществ эндогенного и экзогенного происхождения [Ослопов, 2005, 64 с.].

Спектрофотометрический метод основан на определении альбумина по реакции с бромкрезоловым зелёным (БКЗ): при взаимодействии альбумина в слабокислой среде с бромкрезоловым зелёным в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс синего цвета.

В опытную пробирку вносили 10 мкл сыворотки крови, 4 мл рабочего раствора БКЗ, перемешивали. Через 10 минут измеряли экстинкцию на спектрофотометре при длине волны 625 нм против холостой пробы. Расчёт проводили по калибровочной кривой.

Количество альбуминов вычисляли в г/л.

2.10.3. Определение белковых фракций сыворотки крови путём электрофоретического разделения на бумаге (Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., и соавт., 1987) Белковые фракции определяли унифицированным электрофоретическим методом, основанном на свойстве коллоидных частиц белка перемещаться в электрическом поле постоянного тока [Ослопов, 2005, 64 с.].

Предварительно заполняли камеры прибора буферным раствором. На катодный край ленты наносили 5 мкл сыворотки крови в виде поперечной полосы. Электрофоретическое разделение проводили в течении 6 часов при напряжении 3 В на 1 см пути тока с последующей обработкой бумажных полос.

Измерения проводили на денситометре после элюирования.

Результаты выражали в процентах.

2.10.4. Унифицированный метод определения активности электрофильных соединений путем их коньюгации с восстановленным глутатионом. GST локализованы преимущественно в цитозоле клеток.

Основная функция GST – защита клеток от ксенобиотиков и продуктов перекисного окисления липидов посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или нуклеофильного антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных метаболитов, образующих при окислительном стрессе [Ведунова, Блесткина, Конторщикова, 2008, с. 92-96].

Принцип метода основан на том, что активность глутатион-Sтрансферазы определяют по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между восстановленным глутатионом (GSH) и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ). Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион-S-ХДНБ) готовили добавлением к одному объему упакованных эритроцитов двадцати объемов дистиллированной воды, охлажденной до 0°С. В кювету с длиной оптического пути 1,0 см, содержащую 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН 6,5, добавляли 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию инициировали внесением в кювету 0,2 мл 0,015 М 1-хлор-2,4-динитробензола (ХДНБ), который готовили на абсолютном метаноле. Параллельно опытной готовили контрольную пробу, в которую вместо гемолизата вносили дистиллированную воду. Регистрацию оптической плотности проводили при температуре 25°C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции для глутатион-S-ХДНБ при длине волны 340 нм равный 9,6 мМ-1см-1.

Активность фермента выражали ммоль/минл.

2.10.5. Колориметрический модифицированный метод Церулоплазмин (ЦП) – металлогликопротеин, относится к семейству голубых оксидаз. ЦП – белок с большой молекулярной массой, представленный одной полипептидной цепью, но имеющий несколько изоформ и характеризующийся сложной картиной распределения в тканях. Молекула ЦП состоит из 1046 аминокислотных остатков, содержит около 8 % углеводов и 6-7 атомов меди [Кузьмина, Ерлыкина, Сергеева, 2011, с. 37-41].

ЦП является одним из основных антиоксидантов плазмы крови.

Особенностью этого белка является высокая стабильность к токсическому действию активных форм кислорода, что позволяет ему сохранять биологическую активность в условиях их интенсивной генерации [Карякина, Белова, 2010, с. 180-189].

Принцип метода основан на окислении р-фенилендамина при участии церулоплазмина.

В пробирки вносят по 8 мл ацетатного буфера и 0.1 мл плазмы крови. В контрольную пробирку добавляют 2 мл раствора фтористого натрия (для инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем во все пробирки вносят по 1 мл раствора р-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивают, помещают в термостат и инкубируют в течение часа при температуре 37°С. После инкубации во все пробирки (за исключением контрольной) добавляют по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивают, затем их переносят в холодильник, где выдерживают 30 мин при 4°С. Пробы колориметрируют против контроля в кюветах с шириной слоя 1,0 см при длине волны 530 нм.

Умножая значение оптической плотности на коэффициент пересчета 875, получают величину концентрации церулоплазмина в мг/л.

2.11. Определение основных показателей газового и электролитного составов крови у экспериментальных животных Показатели газового и электролитного составов крови: рН (величина активной реакции среды); напряжение углекислого газа (рCO2); напряжение кислорода (рO2); концентрация бикарбоната (НСО3), количество ионов натрия (Na+) и калия (K+) у интактных белых крыс-самцов и в опытных группах исследовали при помощи анализатора газового и электролитного составов крови Rapidlab 348 (фирма Bayer diagnostics, USA).

2.12. Определение концентрации нитритов в сыворотке крови у экспериментальных животных по методу L. Green c модификациями Сущность метода состоит в проведении реакции, основанной на способности нитритов диазотировать сульфаниловую кислоту с образованием красно-фиолетового окрашивания. Интенсивность окраски, измеряемая на спектрофотомере (СФ-46, ЛОМО) при длине волны 540 нм, пропорциональна содержанию нитритов, которое рассчитывали по градуировочному графику.

Непосредственно перед проведением анализа готовили реактив ГриссаИлосвая. В состав указанного реактива входят: кислота сульфаниловая безводная, раствор с массовой долей 1%; кислота уксусная ледяная, химически чистая; 1-нафтиламин; порошок цинковый.

Приготовление реактива Грисса-Илосвая (согласно ГОСТу 4517-87):

0,1г 1-нафтиламина растворяли в 100 мл воды при кипячении в течение 15 мин. Раствор охлаждали, подкисляли 5 мл уксусной кислоты и прибавляли 100 мл раствора сульфаниловой кислоты. Реактив должен быть бесцветным.

Выполнение определения:

К 1 мл сыворотки добавляли 1 мл 0,12 ммоль/л раствора NaOH, 4 мл 5,4 г/л раствора ZnSO4 и нагревали 6 минут на кипящей водяной бане. После охлаждения жидкость центрифугировали 5 минут на скорости 6600 об./мин.

Для анализа брали 900 мл надосадочной жидкости, добавляли 100 мкл 3 М NH3, 200 мкг 0,1 М соляной кислоты и 600 мкл 1 мкг/мл раствора NaNO2 для усиления возникающей впоследствии окраски. Далее приливали 1,8 мл свежеприготовленного раствора реактива Грисса-Илосвая. Через 15 минут измеряли интенсивность окраски на спектрофотомере (СФ-46, ЛОМО) при длине волны 540 нм.

Концентрацию нитритов у лабораторных животных выражали в мкг/мл.

2.13. Флуоресцентная спектроскопия облученного терагерцовыми волнами раствора альбумина Молекулярную спектроскопию, в частности, флуоресцентную 2,5 % раствора альбумина, производили на однолучевом люминесцентном спектрометре «LS 55 Fluorescence Spectrometer», фирмы PerkinElmer (США).