«Данилова Ольга Витальевна НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук ...»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение наук

и Институт

микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

На правах рукописи

Данилова Ольга Витальевна

НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ

БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.02.03 – микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Д.б.н. С.Н. Дедыш Москва - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Часть 1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы…………………………………………………………………. Цель и задачи работы…………………………………………………………………….. Научная новизна и значимость работы………………………………………………... Апробация работы………………………………

Публикации………………………………………………………………………………... Объем и структура………………………………………………………………………... Место проведения работы и благодарности…………………………………………... Часть 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………….............. Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот…… ……

1.1. Роль метанотрофных организмов в круговороте метана в биосфере……………. 1.2. Общая характеристика аэробных метанотрофных бактерий………...…………… 1.3. Энергетический метаболизм метанотрофов……………………….......…………… 1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов……………………..……

1.5. Известное разнообразие аэробных метанотрофов…………………………………. Глава 2. Молекулярные подходы, используемые в исследовании экологии метанотрофных бактерий……………………………………………………………….. 2.1.Амплификация и анализ филогенетических генов……………………………….... 2.2. Амплификация и анализ функциональных генов…………………………………. 2.3. Количественная ПЦР………………………………………………………………… 2.4. Микрочипы…………………………………………………………………………… 2.5. Метод FISH…………………………………………………………………………... 2.6. Метод стабильных изотопов (SIP)………………………………………………….. Глава 3. Метанотрофы как компонент микробных сообществ северных сфагновых болот………………………………………………………………………….. 3.1. Исследование экологии и разнообразия метанотрофов в болотах с помощью молекулярных методов…………………………………………………………………… 3.2. Культуральные приемы и характеристика полученных болотных метанотрофов……………………………………………………………………………… 3.3. Пробелы в знаниях о метанотрофных сообществах сфагновых болот…………… Часть 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………

Глава 4. Объекты и методы исследования…………………………………………….. 4.1. Образцы нативного торфа, использованные в исследовании……………………... 4.2. Определение активности окисления метана образцами торфа…………………… 4.3. Оценка численности метанотрофных бактерий с помощью метода FISH………. 4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа……………………………………….. 4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами……………. 4.3.3. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов для детекции метанотрофов..…………………………………………………………... 4.3.4. Разработка новых зондов и проверка их специфичности……………….…. 4.3.5. Микроскопический анализ…………………………………………………….. 4.3.6. Детекция и учет клеток микроорганизмов в образцах торфа……………. 4.4. Молекулярная идентификация болотных метанотрофов с помощью ПЦРанализа.…………………………………………………………………………………... 4.4.1. Экстракция тотальной ДНК из образцов торфа…………………………… 4.4.2. Экстракция ДНК из микробных клеток……………………………………… 4.4.3. ПЦР-амплификация филогенетических и функциональных генов исследуемых культур…………………………………………………………………. 4.4.4. Получение библиотек клонов генов pmoA болотных метанотрофов и генов 16S рРНК метанотрофов I типа………………………………………….. 4.4.5. Выделение плазмидной ДНК, очистка, секвенирование…………………… 4.4.6. Филогенетический анализ……………………………………………………. 4.5. Культивирование болотных бактерий……………………………………………. 4.5.1. Получение накопительных культур метанотрофов I типа………………. 4.5.2. Получение изолятов метанотрофов………………………………………… 4.5.3. Выделение других бактерий - компонентов метанотрофных сообществ……………………………………………………………………………... 4.6. Изучение свойств изолятов болотных бактерий………………………………….. 4.6.1. Методы изучения морфологических и физиологических характеристик………………………………………………………………………... 4.6.2. Аналитические методы ………………………………………………………. 4.6.3. Электронная микроскопия……………………………………………………. 4.6.4. Энзимологические исследования……………………………………………… 4.6.5. Определение состава хинонов………………………………………………… 4.6.6. Анализы состава жирных кислот и липидов………………………………… 4.6.7. Анализ пигментов……………………………………………………………… 4.6.8. Определение нуклеотидного состава ДНК………………………………….. 4.6.9. Фотодокументирование материалов и обработка данных……………….. Глава 5. Оценка активности окисления метана и дифференцированный учет клеток метанотрофов в кислых сфагновых болотах……………………………….. 5.1. Активность окисления CH4 сфагновым торфом…………………………………. 5.2. Учет клеток метанотрофов I и II типов в сфагновых болотах различного географического положения……………………………………………………………. Глава 6. Оценка филогенетического разнообразия метанотрофов в сфагновых болотах………

6.1. Состав метанотрофного сообщества по данным анализа генов pmoA………….. 6.2. Оценка разнообразия метанотрофов I типа с помощью анализа генов 16S рРНК………………………………………………………………………………… Глава 7. Выделение метанотрофных представителей Gammaproteobacteria из сфагновых болот……………………………………………………………………... 7.1. Представители рода Methylomonas………………………………………………… 7.1.1. Морфология…………………………………………………………………….. 7.1.2. Физиологические характеристики…………………………………………… 7.1.3. Пути ассимиляции углерода…………………………………………………… 7.1.4. Анализ филогенетических и функциональных генов………………………… 7.2. Представители рода Methylovulum………………………………………………… 7.3. Новые метанотрофы спирилло-подобной морфологии………………………….. 7.3.1. Морфология…………………………………………………………………….. 7.3.2. Анализ филогенетической принадлежности………………………………… 7.3.3. Разработка и применение зондов для детекции нового метанотрофа спирилло-подобной морфологии.…………………………………………………………… 7.3.4. Анализ функциональных генов………………………………………………… 7.3.5. Физиологические характеристики……………………………………………. Глава 8. Выделение первого представителя нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофам II типа………………………………………………………………….. 8.1 История выделения и первичный анализ………………………………………….. 8.2. Изучение морфо-физиологических особенностей……………………………….. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………….. ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Метан (СН4) является одним из наиболее активных парниковых газов Земли. Из всего разнообразия микроорганизмов лишь метанотрофные бактерии способны использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии. Аэробные метанотрофы ныне известны в пределах классов Gamma- и Alphaproteobacteria (метанотрофы I и II типов, соответственно), а также филума Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1986;

Гальченко, 2000; Trotsenko, Murrell, 2008; Троценко, Хмеленина, 2008; Op den Camp et al., 2009).

экосистемы (Matthews et al., 1987), среди которых наиболее распространены кислые (pH 3.5-5.5) сфагновые болота. Эмиссия метана из болот в атмосферу контролируется аэробными метанотрофными бактериями, населяющими верхние слои болотного профиля. Исследования последних полутора десятков лет позволили установить, что основным компонентом «метанокисляющего фильтра» кислых северных болот являются метанотрофные представители Alphaproteobacteria, относящиеся к семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (Dedysh et al., 2001; Chen et al., 2008; Dedysh, 2009).

Выделенные из болот метанотрофы родов Methylocystis, Methylocapsa, Methylocella и Methyloferula были охарактеризованы как умеренно ацидофильные организмы, способные окислять метан в кислых и холодных условиях (Dedysh et al., 2000, 2002, 2007; Vorobev et al., 2011; Belova et al., 2013). Помимо адаптации к физико-химическим условиям кислых болот, эти метанотрофы имеют и ряд других экологических преимуществ, в числе которых – способность некоторых представителей к росту на ацетате (Dedysh et al., 2005;

Belova et al., 2011, 2013) и обладание мембранной метанмонооксигеназой высокого сродства к СН4 (Belova et al., 2013).

В общей картине состава метанокисляющего сообщества болотных экосистем, тем не менее, остается ряд существенных пробелов. Первый из них, это нерешенный вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в процесс окисления метана метанотрофов I типа. До недавнего времени, среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было.

По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий (Dedysh et al., 2001; 2003). Все же, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и pmoA, обнаруживающие сходство с таковыми у представителей родов Methylobacter и Methylomonas, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al., 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Kip et al., 2010, 2011a). Первый аргумент в пользу существования ацидофильных метанотрофов I типа был получен голландскими исследователями, выделившими два штамма Methylomonas- и Methylovulum-подобных бактерий из кислого торфа (Kip et al., 2011б).

Эти изоляты, однако, были лишь частично охарактеризованы, а их роль в окислении метана в кислых болотах оставалась неподтвержденной.

Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (Raghoebarsing et al., 2005). Последовательности генов 16S рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер принадлежит к Alphaproteobacteria и филогенетически равноудален от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae.

Физиологические характеристики представителей этого кластера неизвестны, так как получить культуры представляющих его организмов до последнего времени не удавалось.

Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам II типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах.

Настоящее исследование было предпринято для восполнения вышеперечисленных пробелов в знаниях о метанотрофных бактериях северных болотных экосистем.

Цели и задачи исследования Цель работы – оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в кислых сфагновых болотах, выделение и описание новых представителей болотных метанотрофов, а также филогенетически родственных им неметанотрофных организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение популяционной численности и молекулярная идентификация метанотрофов I типа, населяющих сфагновые болота.

2. Получение репрезентативных изолятов метанотрофов I типа из кислых торфов, изучение их рН-предпочтений и установление таксономической принадлежности.

3. Изучение биологии представителей нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофным бактериям семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae.

Научная новизна и значимость работы Впервые проведена комплексная оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в северных сфагновых болотах России.

Описан и узаконен первый ацидотолерантный вид рода Methylomonas - Methylomonas paludis sp. nov., который также является первым ацидотолерантным представителем семейства Methylococcaceae. Установлена способность метанотрофов этого вида развиваться в кислых средах (рН 3.8-4.5). Типовой штамм нового вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.

Впервые из нескольких болот переходного типа получен в накопительных культурах метанотроф необычной спиралевидной формы Candidatus Methylospira palustris, представляющий новый род и вид семейства Methylococcaceae. С помощью анализа библиотек клонов генов pmoA и 16S рРНК установлено присутствие этих метанотрофов в различных местообитаниях.

Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, факультативно анаэробных бактерий-бродильщиков, Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov. Это первый представитель обширного кластера ранее некультивируемых микроорганизмов, филогенетически равноудаленного от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae, и представленного клонами из различных болот и почв. Типовой штамм нового рода и вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.

Практическая значимость Существенно расширена база данных последовательностей генов pmoA и 16S рРНК метанотрофных бактерий, населяющих северные сфагновые болота. Совокупность полученных в работе новых последовательностей депонирована в GenBank.

Разработаны и апробированы 16S рРНК-специфичные флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды для детекции новой группы метанотрофов-спирилл Candidatus Methylospira palustris.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:

1. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.

2. VII Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2011.

3. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.

4. IX Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2013.

Публикации Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 4 тезисах конференций.

Объём и структура диссертации Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 97 страницах, включая 11 таблиц, 25 рисунков и списка литературы из 224 наименований, из них 21 - на русском и 203 – на английском языке.

Место проведения работы и благодарности

Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2010 по 2013 годы.

Использованные в работе образцы торфа были предоставлены автору к.б.н. И.С.

Куличевской и к.б.н. С.Э. Беловой, а также отобраны автором. Изоляты MG30T и Pf56T были выделены и предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской (ИНМИ РАН, Москва).

Исследования ультратонкого строения клеток были проведены к.б.н. Н.Е. Сузиной, а энзимологический анализ - к.б.н. О.Н. Розовой (ИБФМ РАН, Пущино). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б. П. Баскуновым (ИБФМ РАН, Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены совместно с к.б.н. Е. Н. Детковой, а анализ продуктов брожения – с В.В. Кевбрином (ИНМИ РАН, Москва). Автор выражает глубокую признательность научному руководителю С.Н. Дедыш, а также всему составу лаборатории за всестороннюю помощь и советы при выполнении работы.

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № 12-04-00768).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот.

Метанотрофы представляют собой уникальную группу прокариотных микроорганизмов, структурно и функционально специализированных на использовании метана (СН4) в качестве единственного источника углерода и энергии (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Trotsenko, Murrell, 2008). Первый метанотроф был описан в году немецким исследователем Зенгеным, который выделил c поверхности растений пресноводного пруда бактерию, способную расти на метане, и назвал ее ‘Bacillus methanicus’ (Shngen, 1906).

Метанотрофы играют ключевую роль в глобальных циклах углерода и азота. Не менее важное свойство данных организмов заключается в способности к деградации опасных загрязнителей (Singleton et al., 2007), что побуждает ученых более внимательно взглянуть на них как на потенциальные агенты биоремедиации загрязненных территорий.

Большинство из описанных ныне метанотрофов являются мезофиллами, растущими в диапазоне температур 20 - 35°С и предпочитающими около-нейтральные значения рН (5Однако, среди них также встречаются термофильные (> 40°С) и психрофильные 9.0), тогда как другие представители этих бактерий обитают в кислых условиях (рН 2.5 µмоль/г клеток) синтезируется мембранная форма фермента – мММО, при низком – рММО (Троценко, Хмеленина, 2008).

пиридиннуклеотидзависимое окисление метана молекулярным кислородом до метанола:

рММО детально изучена у Mc. capsulatus Bath и Methylosinus trichosporium OB3b (Stafford et al., 2003; Сsaki et al., 2003). Фермент состоит из трех компонентов:

гидроксилазы (MmoA), редуктазы (MmoC) и регуляторного белка (MmoB) (Green, Dalton, 1985).

Гидроксилазный комплекс (MmoA) представляет собой негемовый гексамерный металлопротеин (250 кДа), состоящий из трех субъединиц –,, и (65, 45 и 20 кДа, соответственно). Содержащий два атома железа негемовый центр -субъединицы катализирует образование метанола из метана и кислорода (Fox et al., 1989; Green, Dalton, 1985).

Редуктаза (MmoC) представляет собой Fe-S флавопротеин (39 кДа), при восстановлении которого происходит внутримолекулярный перенос двух электронов от НАДН2 к Fe2S2 центру, имеющему одноэлектронную емкость. Затем электроны передаются от Fe2S2 центра редуктазы к гидроксилазе, имеющей сайт окисления метана и восстановления кислорода (Троценко, Хмеленина, 2008).

Регуляторный белок (MmoB) представляет собой небольшой полипептид (16 кДа). Он абсолютно необходим для гидроксилазной активности у Mc. capsulatus Bath (Green, Dalton, 1985)и у Ms. trichosporium OB3b (Fox et al., 1989), несмотря на отсутствие в своем составе атомов металла и простетической группы.

Все компоненты рММО образуют стабильный ферментный комплекс, для которого предложен следующий механизм реакции (Fox et al., 1989). Метан связывается с активным центром окисленного фермента, возможно, растворяясь в гидрофобном кармане, поскольку не выявлено его непосредственное связывание с атомом железа.

Затем один из атомов железа восстанавливается с образованием смешанной валентности (Fe2+/Fe3+) фермента. Второе одноэлектронное восстановление активного центра приводит к полному восстановлению (Fe2+/Fe3+) фермента (Троценко, Хмеленина, 2008).

Связывание молекулы кислорода с биядерным железным центром приводит к образованию активного пероксида (Fox et al., 1989; Woodland, Cammack, 1985) и его последующему разложению. рММО катализирует включение кислорода не только в метан, но также в широкий спектр субстратов, включая алканы, алкены, ароматические углеводороды, галогенированные алканы и галогенированные ароматические углеводороды. Как следствие этого, метанотрофы, имеющие рММО, выполняют важную экологическую функцию и перспективны для использования в биотехнологии (Троценко, Хмеленина, 2008).

Мембранная метанмонооксигеназа (мММО). В отличие от рММО, мММО крайне нестабильна, что существенно сдерживает ее изучение. Лишь относительно недавно была выделена и охарактеризована мММО из Mc. capsulatus Bath (Nguyen et al., 1994, 1998;

Kitmitto et al., 2005). В отличие от рММО, она способна окислять субстраты более ограниченного спектра (алканы и алкены с длиной цепи до С5). Однако ее присутствие повышает эффективность конверсии метана в биомассу на 34%, по сравнению с клетками, содержащими только рММО. Как правило, фермент локализован во внутрицитоплазматической мембране (ВЦМ) и составляет до 60-80% общего содержания мембранных белков (Nguyen et al., 1998).

Фермент мММО представляет собой тример ()3 и состоит из 3 субъединиц с молекулярной массой 45, 27 и 23 кДа. Активная форма мММО содержит 2 атома железа и около 15 атомов меди на молекулу фермента, что, однако, лишь частично подтверждено и требует дальнейших уточнений (Zahn, Dispirito, 1996; Choi et al., 2003; Lieberman, Rosenzweig, 2004). С мММО ассоциированы медь-связывающие соединения (метанобактины), которые синтезируются при исчерпании меди в среде и, очевидно, ответственны за ее транспорт, являясь своеобразным «медным челноком» (DiSpirito et al., 1998; Kim et al., 2004; Graham, Kim, 2011).

В хромосоме Mc. capsulatus Bath имеется 2 копии гена мММО (pmoCAB) и дополнительная копия pmoC (Stolyar et al., 1999). У нитрифицирующих бактерий установлено подобная дупликация гена amoCAB, кодирующего аммоний монооксигеназу (АМО). Сравнение последовательностей pmo и amo генов свидетельствует в пользу их эволюционной связи (Троценко, Хмеленина, 2008).

Недавно у Methylocystis sp. SC2 были обнаружены две изоформы мММО, имеющие разные кинетики окисления метана – ранее известную форму PmoA, или PmoA1 и новую форму PmoA2 (Dunfield et al., 2002; Baani, Liesack, 2008). При концентрации метана выше 600 ppm происходила экспрессия гена pmoCAB1, кодирующего мММО1.

Напротив, при следовых количествах метана (до 100 ppm) конститутивно экпрессировался кластер генов pmoCAB2, кодирующий мММО2. Примечательно, что гены pmoCAB2 в большинстве своем присутствуют у метанотрофов II типа, в то время как у метанотрофов I типа они пока не обнаружены (Yimga et al., 2003). Возможность использовать метан в широком диапазоне его концентрации, очевидно, объясняет доминирование метанотрофов II типа в автоморфных почвах и их выживание за счет потребления атмосферного метана.

Несмотря на общий механизм реакции окисления метана, рММО и мММО существенно различаются между собой. Для работы мММО необходимо большое количество меди (15 атомов на 1 молекулу фермента). Данный фермент имеет высокое сродство к СН4 (Km=1-2 µM) и О2 (Km=0.1 µM), но обладает узкой субстратной специфичностью, окисляя лишь короткие алканы и алкены. С другой стороны, рММО имеет пониженное сродство к метану (Km=3 µM) и О2 (Km=16.8 µM). Поскольку для функционирования рММО необходим НАД(Ф)Н2, этот фермент энергетически менее эффективен (Троценко, Хмеленина, 2008).

Окисление метанола. Метанол образуется при окислении метана, а также доступен из экзогенных источников, например, будучи продуктом деградации пектина и лигнина.

Метанотрофы окисляют метанол посредством периплазматической метанолдегидрогеназы (МДГ). Детальное строение и активность данного фермента была изучена на примере грамотрицательных метилотрофных бактерий (Anthony, Williams, 2003). МДГ представляет собой тетрамер 22, включающий две большие (67 кДа) и две малые (8.5 кДа) субъединицы (Anthony, 1992; Anthony et al., 1994). Две -субъединицы, сцепленные характерным мотивом, образуют радиально-симметричную структуру в виде «пропеллера». -субъединица не составляет структурно выраженного домена в молекуле фермента и функция ее пока не выяснена (Anthony, Ghosh, 1998).

Ген, кодирующий большую субъединицу МДГ, mxaF, крайне консервативен у метано- и метилотрофов, что позволяет использовать его в исследованиях молекулярной экологии (Anthony, Williams, 2003).

Окисление формальдегида. Формальдегид является ключевым интермедиатом в процессе окисления метана до СО2. Большая часть восстановительных компонентов, необходимых для оксигенирования метана, образуется при окислении ФА через формиат до СО2. Метанотрофы имеют несколько ферментов, окисляющих ФА. В соответствии с природой акцептора электронов, ФА-окисляющие ферменты разделены на 2 группы:

НАД(Ф)+-специфичные и связанные с цитохромами. В свою очередь, НАД(Ф)+специфичные ФАДГ подразделяются на основе зависимости от вторичных кофакторов, тетрагидрометаноптерин (ТГМП) (Троценко, Хмеленина, 2008).

Окисление формиата до СО2 является конечной стадией в полиферментной цепи окисления метана. За данный процесс отвечает присутствующая у всех изученных метанотрофов НАД+-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ), которая у Ms. trichosporium OB3b состоит из двух субъединиц (53 и 102 кДа, соответственно), локализованных в цитоплазме. ФДГ содержит негемовое железо и сульфидные группы и наиболее активна в диапазоне pH (6.5-7.5), обладая низкими значениями Km к формиату и НАД+ (Yoch et al., 1990). В геноме Mc. capsulatus Bath были обнаружены три последовательности генов, гомологичных ФДГ, роль которых еще предстоит выяснить (Ешинимаев, 2006).

1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов.

Метанотрофы используют окисленные и замещенные производные метана, строя клеточные компоненты из С1-субстратов. Благодаря исследованием Квейла известно, что метанотрофы реализуют два основных пути первичной С1-ассимиляции – рибулозомонофосфатный и сериновый. В этих циклах фосфотриозы синтезируются из формальдегида – ключевого интермедиата центрального метаболизма (Троценко, Хмеленина, 2008). Ассимиляция углерода возможна также на уровне СО2 (посредством анаплеротического карбоксилирования (фосфоенол)пирувата или РБФ путем (Quayle, 1980; Anthony, 1982)).

Рибулозомонофосфатный цикл.

Ассимиляция формальдегида через РМФ путь осуществляется у метанотрофов I типа.

В данном цикле синтезируется одна молекула триозы из трех молекул формальдегида (Anthony, 1982). В первой части РМФ-пути фомальдегид конденсируется с рибулозо-5фосфатом с образованием 3-гексулозо-6-фосфата в реакции, катализируемой гексулофосфатсинтазой (ГФС). Далее 3-гексуло-6-фосфат изомеризуется во фруктозо-6фосфат фосфогексулоизомеразой (ФГИ). С участием этих ферментов происходит образование С-С связи и центральных метаболитов у метанотрофов класса Gammaproteobacteria (Троценко, Хмеленина, 2006).

Во второй части РМФ-цикла фосфогексозы распадаются до (фосфо)триоз. В дальнейшем из (фосфо)триоз образуется рибулозо-5-фосфат, т.е цикл завершается регенерацией акцептора ФА (Троценко, Хмеленина, 2006). ГФС – индикаторный фермент РМФ пути (Рис. 4).

Рис. 4. Схематическое изображение пути ассимиляции формальдегида метанотрофами I типа. ГФС – гексулофосфатсинтаза - индикаторный фермент РМФ пути (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008).

РМФ путь, первоначально обнаруженный у аэробных метилотрофов, достаточно широко распространен и у неметилотрофных бактерий, где он выполняет функцию детоксикации формальдегида (Ешинимаев, 2006).

Сериновый путь.

Метанотрофы II типа ассимилируют ФА через сериновый путь, в котором первичным акцептором ФА является тетрагидрофолат (ТГФ). В первой части две молекулы ФА, конденсируясь ТГФ, реагируют с двумя молекулами глицина, с образование серина и оксипирувата. Последующие превращения включают образование и изомеризацию фосфоглицерата, карбоксилирование фосфоенолпирувата в оксалоацетат и образование малата с дальнейшей активацией до малил-КоА. Последний в дальнейшем распадается на глиоксилат и ацетил-КоА, который является первичным продуктом серинового пути. Во второй части серинового пути ацетил-КоА окисляется в глиоксилат, из которого впоследствии регенерируется глицин – первичный акцептор ФА. Серинглиоксилатаминотрансфераза (СГАТ), оксипируватредуктаза (ОПР) и малил-КоА-лиаза являются индикаторными ферментами серинового пути (Рис. 5).

Рис. 5. Схематическое изображение пути ассимиляции формальдегида серинглиоксилатаминотрансфераза (СГАТ), оксипируватредуктаза (ОПР), малил-КоАлиаза (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008).

Ассимиляция СО2. У метанотрофов I типа от 5 до 15% углерода биомассы происходит из углекислоты, тогда как у метанотрофов II типа – до 50%. За анаплеротическую фиксацию СО2 у этих бактерий ответственна ФЕП-карбоксилаза (Шишкина, Троценко, 1986). Интересно, что у представителей рода Methylococcus в ассимиляции СО2 также участвует рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа (РБФК/О) (Taylor et al., 1981). Гены РБФК/О (cbbl) выявлены у Methylococcus и Methylocaldum и также доказана способность у Mc. capsulatus Bath расти автотрофно (Baxter et al., 2002). Эти факты подтверждают ранее постулированную эволюционную связь путей первичного С1 метаболизма у метанотрофов и автотрофов (Quayle, Ferenci, 1978; Whittenbury, 1980; Троценко, Хмеленина, 2008).

1.5. Известное разнообразие аэробных метанотрофов.

Метанотрофы относятся к наиболее широко распространенным микроорганизмам.

Они населяют самые разнообразные экосистемы: болота, разнообразные почвы, озера, моря, осадки, сточные воды, рисовые чеки, полигоны ТБО. Кроме прямого окисления вновь образованного в анаэробных зонах этих местообитаний метана, некоторые метанотрофы способны использовать атмосферный СН4, что делает их высоко приспособленными к обитанию в разнообразных эконишах (Semrau et al., 2010).

Термофильные и термотолерантные метанотрофы. Как упоминалось выше, большинство метанотрофов являются умеренными организмами и предпочитают обитать в условиях около-нейтрального значения рН при 25-30 °С. Тем не менее, известен ряд метанотрофных бактерий, оптимально растущих при повышенных температурах. Все известные на настоящий момент метанотрофы-термофилы относятся к классу Gammaproteobacteria. Первый описанный из них - Methylococcus capsulatus предпочитает расти при температуре 45°С и является одним из наиболее изученных метанотрофных организмов. Чуть позже был описан еще один род термофильных метанотрофов – род Methylocaldum. Виды Methylocaldum tepidium и Methylocaldum gracile характеризуются, скорее как термотолерантные бактерии, с оптимумом роста при температуре 42 °С. В отличие от них, Methylocaldum szegendiense является истинным термофилом, поскольку температура 55 °С является для него оптимальной (диапазон 37 С). Другими представителями метанотрофов-термофилов среди Proteobacteria являются метанотрофы рода Methylothermus. На настоящий момент описано два представителя данного рода - Methylothermus thermalis и Methylothermus subterraneus.

Первый из них был выделен из термальных источников Японии, и был способен расти в диапазоне температур 37 – 67°С (Tsubota et al., 2005). Другой вид рода Methylothermus, M.

subterraneus, был выделен относительно недавно, в 2011 году, из горячих шахтных вод Японии. В отличие от M. thermalis, он предпочитает расти в более кислых и менее соленых условиях. Рост культуры наблюдался в диапазоне температур 37 - 65°С (Hirayama et al., 2011). Необходимо отметить, что верхняя планка температуры в 65°С показана лишь для описанных видов термофильных метанотрофов, однако, ныне утерянный штамм Methylothermus sp. HB, выделенный из термальных источников Венгрии, был способен к росту и при температуре 72 °С (Bodrossy et al., 1997). Таким образом, возможность существования экстремально-термофильных метанотрофов не исключена. Необходимо отметить, что метанотрофы-термофилы имеют ряд отличий от остальных метанотрофов класса Gammaproteobacteria. Так, для представителей родов Methylococcus и Methylocaldum показано наличие генов, кодирующих некоторые ферменты серинового пути ассимиляции формальдегида, что характерно для метанотрофов II типа. А у метанотрофов рода Methylothermus в клетке присутствуют в равной доле жирные кислоты с 16-ю и 18-ю атомами углерода, индикаторные для метанотрофов I и II типов, соответственно (Троценко, Хмеленина, 2008; Hirayama et al., 2011).

Как уже было сказано выше, к термофильным метанотрофам относятся также метанотрофные представители Verrucomicrobia, выделенные недавно из различных геотермальных местообитаний – грязевых вулканов Южной Италии, геотермальных полей Новой Зеландии, а также кислых горячих источников Камчатки (Op den Camp et al., 2009). Независимо друг от друга разными исследователями были получены в чистую культуру три представителя таких метанотрофов: ‘Acidomethylosilex fumarolicum’ штамм SoiV (Pol et al., 2007), ‘Methyloacida kamchatkenesis’ штамм Kam1 (Islam et al., 2008) и ‘Methylokorus infernorum’ штамм V4 (Dunfield et al., 2007), ни один из которых на настоящий момент не описан таксономически. Дальнейшие исследования физиологии, биохимии и генетического потенциала новых метанотрофов показали что они очень близки между собой, вследствие чего были отнесены к роду ‘Methylacidiphilum’. О метаболических особенностях метанотрофных веррукомикробий пока известно мало.

Показано, что у них отсутствуют гены ключевых ферментов РМФ пути ассимиляции формальдегида – гексулофосфатсинтазы и гексулофосфатизомеразы (Hou et al., 2008). В то же время, некоторые ферменты серинового пути (глицераткиназа и малил-КА-лиаза) также не обнаружены у новых метанотрофов, что ставит под сомнение возможность использования данных путей в процессах ассимиляции углерода. У метанотрофов Verrucomicrobia присутствуют гены глиоксилатного шунта – изоцитратлиаза и малатсинтаза, а добавление CO2 стимулирует рост, что может быть следствием использования в процессах ассимиляции углерода ферментов цикла Кальвина-Бенсона (Hou et al., 2008; Op den Camp et al., 2009).

Психрофильные и психротерантные метанотрофные организмы.

Природные экосистемы, где господствуют низкие температуры, являются одними из наиболее распространенных на Земле. К крупнейшим из них относятся обширные тундровые и северные болотные экосистемы, а также большая часть мирового океана, где средняя температура воды держится на уровне +5 – 7°С. Несмотря на низкие температуры, данные экосистемы, за счет обширных анаэробных зон, являются мощными источниками метана. Следовательно, метанотрофы являются одними из ключевых организмов в микробном сообществе этих местообитаний.

Истинно психрофильных метанотрофов пока описано мало. Все они принадлежат к классу Gammaproteobacteria и предпочитают расти при температурах ниже 15°С. К метанотрофам-психрофилам относятся Methylobacter psychrophilus (Омельченко и др., 1996), выделенный из почв тундровой зоны России, а также Methyloshaera hansoni и Methylomonas scandinavica, изолированные из антарктического озера и холодных глубоководных вод вблизи побережья Балтийского моря (Bowman et al., 1997;

Kalyuzhnaya et al., 1999). Эти метанотрофы несколько отличаются в температурных предпочтениях, однако температура 10°С для большинства из них является оптимальной.

Метанотрофы соленых и щелочных экосистем.

Экосистемы с повышенным содержанием солей достаточно широко распространены в природе. К ним относятся моря, эстуарии, некоторые арктические почвы, соленые водоемы, а также содовые озера. За исключением содовых озер, в большинстве своем, они характеризуются нейтральными значениями рН среды.

По отношению к солености среды метанотрофные организмы разделяются на галотолерантов и галофилов. Последние облигатно зависят от присутствия NaCl в среде.

Среди галлофилов следует отдельно выделить экстремальных галлофилов, способных расти при очень высокой концентрации NaCl в среде. Например, Methylohalobius crimeensis, выделенный из гиперсоленого озера полуострова Крым, предпочитает развиваться при 5.8 – 8.7 % NaCl в среде. Максимальная же концентрация соли, при которой наблюдался рост, составляет около 15%, что является верхним пределом для известных на настоящий момент метанотрофных бактерий (Heyer et al., 2005).

В большинстве своем, галофильные и галотолерантные метанотрофные организмы, принадлежат к классу Gammaproteobacteria. К ним относятся представители родов Methylobacter и Methylomicrobium, выделеные из различных соленых местообитаний (Bowman et al., 1993; Khmelenina et al., 1997, 1999; Kaluzhnaya et al., 2001, 2008;

Wartiainen et al., 2006). К галофильным метанотрофам относится также описанная ранее психрофильная метанотрофная бактерия Methylosphaera hansoni, требующая для роста присутствия в среде культивирования морской воды, что соответствует около 3.5 % NaCl (Bowman et al., 1997). Недавно из морской гидротермы был выделен еще один представитель галофильных метанотрофов – Methylomarinum vadi, растущий оптимально при 3% NaCl (Hirayama et al., 2013). Большинство морских метанотрофов являются нейтрофилами.

Из содовых озер был выделен также ряд галофильных метанотрофов, растущих при высоких значениях рН. Содовые озера представляют собой уникальные экстремальные природные экосистемы. В щелочных средах большинство катионов металлов переходят в осадок, тем самым обеспечивая доступность фосфата, который в содовых озерах перестает быть лимитирующим фактором. Для эукариотных организмов, в том числе высших, щелочные и соленые условия содовых озер являются малопригодными для существования. Микробное разнообразие в данных экосистемах представлено многочисленными алкалофильными прокариотами, относящимся практически ко всем известным физиологическим группам микроорганизмов. Благодаря способности большинства из них фиксировать атмосферный азот, для активного развития микроорганизмов в содовых озерах практически отсутствуют лимитирующие факторы (Заварзин, 2006; Троценко, Хмеленина, 2008). Из содовых озер были выделены представители рода Methylomicrobium – M. alcaliphilum, M. buryatense и M. kenyense (Kaluzhnaya et al., 2008). M. kenyense, выделенный из содовых озер Кении, был способен расти при рН 10, являясь тем самым истинным алкалофильным метанотрофом (Sorokin et al., 2000).

Присутствие метанотрофов класса Alphaproteobacteria в щелочных озерах было неоднократно подтверждено с помощью методов молекулярной экологии (Lin et al., 2004, 2005). Однако, попытки выделить алкалофильных метанотрофов II типа в чистую культуру остаются малоэффективными, и, на данный момент, удалось поучить лишь один изолят таких бактерий, принадлежащих к роду Methylocystis и способных расти при высоких значениях рН (6.0 – 9.7) (Ешинимаев и др., 2008).

Сведения об ацидофильных метанотрофах детально изложены в главе 3.

Как следует из вышеприведенных данных, метанотрофные бактерии чрезвычайно разнообразны по своим экофизиологическим характеристикам. Они населяют аэробные и анаэробные зоны различных экосистем с контрастными характеристиками: от холодных соленых озер до термальных кислых источников. Высоко специализированные метаболитические пути позволяют метанотрофам успешно использовать С1-соединения.

Отсутствие конкурентов в борьбе за использование метана в качестве единственного источника углерода и энергии приводит к широкому распространению данных организмов практически во всех экосистемах, где доступен метан. Метанотрофы способны развиваться в самых бедных условиях, не требуя факторов роста и витаминов, а также деградировать широкий спектр органических хлорзамещенных соединений, что делает их перспективными агентами технологий биоремедиации. Тем не менее, многие аспекты метаболизма метанотрофов на настоящий момент остаются изучены слабо. В силу сложностей культивирования метанотрофов и отсутствия универсальных сред и приемов, использование культуральных подходов для исследования метанотрофных сообществ тех или иных экосистем во многих случаях является малоэффективным.

Хорошей альтернативой культуральным подходам в исследованиях метанотрофных бактерий являются современные методы молекулярной экологии, краткая характеристика которых дана в главе 2.

Глава 2. Молекулярные подходы, используемые в исследовании экологии метанотрофных бактерий.

Исследования разнообразия и распространения метанотрофных организмов в различных экосистемах, их участия в глобальных биогеохимических циклах находятся в фокусе внимания международного научного сообщества. Метанотрофы населяют широкий спектр различных местообитаний, таких как почвы, болота, пресноводные и морские осадки, горячие источники, ткани животных, моллюсков, растений, захоронения бытовых отходов и др. (Conrad, 2009). Среди подходов, используемых для изучения экологической роли данной группы микроорганизмов, значительным потенциалом обладают молекулярные методы. Методические сложности культивирования и получения изолятов, трудоемкость изучения особенностей метаболизма метанотрофных бактерий относят их к категории сложных в работе организмов. Попытки выделения новых метанотрофов из какого-либо местообитания могут потребовать годы работы исследователя. Ростовые потребности и кинетические характеристики метанотрофов разных групп настолько различны, что приходится констатировать невозможность введения некой универсальной среды и условий культивирования этих бактерий (Дедыш, 2006).

В качестве метода, альтернативного трудоемкому процессу культивирования до недавних пор широко применялся анализ экстрагируемых из нативных образцов жирных кислот. Как отмечалось выше (см. главу 1), клетки метанотрофов содержат необычные жирные кислоты, которые почти не встречаются у других бактерий - кислоты 16:18с и 18:18с. Их было предложено использовать в качестве ‘индикаторных’ жирных кислот метанотрофов I и II типов, соответственно (Андреев, Гальченко, 1978; Гальченко и др., 1986; Bowman et al., 1991; Guckert et al., 1991). Однако впоследствии был описан ряд метанотрофных организмов, составляющих исключение и нарушающих универсальность такого подхода. Таким образом, как культуральные приемы, так и метод анализа жирных кислот имеют очень значительные ограничения для анализа состава и численности популяций метанотрофных бактерий in situ (Дедыш, 2006).

молекулярные методы, позволяющие идентифицировать и всесторонне исследовать метанотрофные организмы, ранее не описанные и не культивируемые в лабораторных условиях, а также оценить их разнообразие и роль в различных экосистемах (Murrell et al., 1998, 2000; Wise et al., 1999; Graef et al., 2011; Gupta et al., 2012).

2.1. Амплификация и анализ филогенетических генов.

Наиболее оптимальным целевым маркером для создания специфичных праймеров и олигонуклеотидных зондов является ген 16S рРНК, так как рибосома является эволюционным изменениям (Троценко, Хмеленина, 2008). Применение генов 16S рРНК как маркеров в исследованиях экологии метанотрофных бактерий основано на принадлежности последних к нескольким филогенетически тесным группам. Как упомянуто выше (см. главу 1), все ныне известные аэробные метанотрофные организмы относятся лишь к двум филогенетическим ветвям домена Bacteria - Proteobacteria и Verrucomicrobia (Дедыш, 2006). К двум классам в пределах Proteobacteria – охарактеризованные и хорошо изученные метанотрофы (Hanson, Hanson, 1996;

последовательностей генов 16S рРНК, связанное с выделением и описанием новых родов и видов метанотрофных бактерий, привело к поискам целевых последовательностей, специфичных для метанотрофов I и II типов (Costello, Lidstrom, 1999; Brusseau et al., 1994;

McDonald et al., 1996; Aumann et al., 2000). Однако при дальнейшем расширении спектра известных метанотрофов оказалось, что ранее разработанные праймеры теряют свою группо-специфичность, поскольку ни одна из групп не является монофилетичной.

Methylosinus/Methylocyctis и Methylocella/Methylocapsa, а в пределах метанотрофов I типа - группы Methylococcus и Methylobacter/Methylosarcina (Дедыш, 2004; Kolb et al., 2003).

олигонуклеотидных зондов для гибридизации все больше внимания уделяется поиску целевых последовательностей, имеющих родовую специфичность. Для адекватной местообитаниях групповые зонды уже не обладают требуемым уровнем специфичности.

Основные целевые последовательности, используемые в исследованиях экологии метанотрофных организмов, приведены в Таблице 2. Одними из первых были созданы праймерные системы 1035-RuMp, 1041-5 и 1034-Ser, позволяющие селективно амплифицировать фрагменты нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК метанотрофов I и II типов (Brusseau et al., 1994). Однако последующее расширение базы данных за счет описания новых метанотрофов показало, что данные праймерные системы, к сожалению, не являются универсальными и выявляют лишь небольшую часть известных метанотрофов. В дальнейшем усилия исследователей были направлены на создание родо- и видоспецифичных праймерных систем. Так появилась целая группа праймеров, специфически амплифицирующих нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК родов Methylobacter (Holmes et al., 1995; Gulledge et al., 2001), Methylococcus и Methylomonas (Gulledge et al., 2001), Methylosphaera (Калюжная и др., 2004), Methylocaldum (Gulledge et al., 2001), Methylosinus (Holmes et al., 1995). С расширением базы данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК метанотрофных организмов были разработаны более совершенные праймерные системы, позволяющие эффективно идентифицировать метанотрофов I и II типов в экосистемах (Chen et al., 2007).

2.2. Амплификация и анализ функцинальных генов.

Анализ гена 16S рРНК является достаточно быстрым и точным способом установить филогенетическое положение искомых организмов. Однако он не дает возможности сделать точное заключение о принадлежности исследуемых бактерий к метанотрофам в случае, если они занимают достаточно отдаленное филогенетическое положение от известных метанотрофных организмов. Дополнительную информацию, в таком случае, дает анализ функциональных генов. Функциональные гены метанотрофных бактерий кодируют ключевые ферменты метаболизма этих микроорганизмов – мембранную и растворимую формы метанмонооксигеназы (гены pmoA и mmoX, соответственно), а также метанолдегидрогеназу (ген mxaF). Основные праймерные системы, используемые для амплификации фрагментов этих генов, приведены в таблице 2.

Наиболее универсальным молекулярным маркером метанотрофов является ген pmoA, который кодирует белок, несущий активный центр мембранной ММО. Филогенетические деревья, построенные на основе последовательностей данного гена, в большинстве своем, когерентны филогенетическим деревьям, постоенным на основе гена 16S рРНК (Kolb et al., 2003; Holmes et al., 1995; McDonald, Murrell, 1997b; Heyer et al., 2002). Изначально считалось, что мембранная ММО присутствует в клетках всех метанотрофов. Недавно, однако, были описаны ацидофильные метанотрофы родов Methylocella и Methyloferula, которые обладают лишь растворимой формой ММО. Ген pmoA у данных метанотрофов отсутствует. Тем самым, существование подобных метанотрофных организмов несколько ограничивает использование гена pmoA в качестве универсального маркера.

На настоящий момент существует несколько праймерных систем, используемых для амплификации гена pmoA у метанотрофов. Самая универсальная пара праймеров, A189f/A682r, была разработана довольно давно, в середине 90-x годов прошлого века (Holmes et al., 1995). Она обладает широким спектром детекции, однако амплифицирует не только ген pmoA, но и ген amoA, кодирующий аммоний-монооксигеназу (АМО На настоящий момент существует несколько праймерных систем, используемых для амплификации гена pmoA у метанотрофов. Самая универсальная пара праймеров, A189f/A682r, была разработана довольно давно, в середине 90-x годов прошлого века (Holmes et al., 1995). Она обладает широким спектром детекции, однако амплифицирует не только ген pmoA, но и ген amoA, кодирующий аммоний-монооксигеназу (АМО) – фермент, эволюционно родственный ММО. Тем не менее, данная праймерная система широко используется при изучении состава метанотрофных сообществ различных местообитаний (Bourne et al., 2001; Heyer et al., 2002; Holmes et al., 1999; Horz et al., 2002;

Kalyuzhnaya et al., 2002; Radajewski et al., 2002) и способна выявлять новые группы метанотрофов (Holmes et al., 1999; Knief et al., 2003; Pacheco-Oliver et al., 2002).

Большинство праймеров более позднего поколения не амплифицируют ген amoA, однако они либо менее универсальны (Kolb et al., 2003), либо позволяют амплифицировать слишком короткий фрагмент гена pmoA (Cheng et al., 1999; Дедыш, 2006). Так, сравнение наиболее используемых на настоящий момент праймерных пар A189f/A682r, A189f/mb661r и A189f/A650r на примере исследования метанотрофного сообщества почв показало существенное различие полученных результатов (Bourne et al., 2001).

Праймерная система A189f/mb661r наиболее широко охватывала метанотрофное разнообразие в исследуемой экосистеме, в то время как две другие пары праймеров былименее специфичны, однако позволяли улавливать потенциально новые группы метанотрофных организмов. В настоящее время широко используется комбинирование данных праймерных пар (Hutchens et al., 2004; Knief et al., 2005; Lin et al., 2005; Morriset al., 2002). Например, при использовании метода «вложенной» ПЦР праймеры A189f/A682r используются в ПЦР на первом этапе, в то время как последующая, более селективная ре-амплификация полученных ПЦР-продуктов осуществляется с помощью праймерных пар A189f/mb661r или A189f/A650r (Horz et al., 2005). Такой подход позволяет максимально полно охватить разнообразие метанотрофов в природных экосистемах.

Таблица 2. Праймеры, используемые для специфической амплификации фрагментов филогенетических и функциональных генов метанотрофных бактерий.

CATCTCTGRCSAYCATACCGG

Type IF ATGCTTAACACATGCAAGTCGAACG

Type IR CCACTGGTGTTCCTTCMGAT

CCTGAAATTCCACTCTCCTCTA

CCCTCCTTGCGGTTAGACTACCTA

ACAGATTCTCTGGATGTC

GGGGGAACTTCTGGGGITGGAC

GGGGGRCIACGTCITTACCGAA

mmoX882f/mmoX1403r GGCTCCAAGTTCAAGGTCGAGC Метанотрофы, обладающие McDonald et al.,

GGCTCGACCTTGAACTTGGAGCCATACTCG

ACCCANGGCTCGACYTTGAA

TGGCACTCRTARCGCTC

CACTCGTAGCGCTCCGGCTC

TGGGAGGGCGAYGCCTGGAA

CCCGGCCARCCGCCGAC

Другим важным функциональным геном метанотрофных бактерий является ген mmoX, кодирующий -субчастицу гидроксилазного компонента растворимой ММО.

Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей данного гена, также формируют два различных кластера, соответствующие метанотрофам I и II типов, что позволяет использовать их для идентификации этих бактерий. На настоящий момент существуют разнообразные праймерные системы, позволяющие амплифицировать гены mmoX метанотрофов как в экологических исследованиях, так и при изучении чистых культур (Auman, Lidstrom, 2002; Baker et al., 2001; Fuse et al., 1998; Horz et al., 2001; McDonald et al., 2006; Shigematsu et al., 1999).

Однако, использование генов mmoX для детекции метанотрофных организмов в природных образцах существенно ограничено как недостаточной универсальностью данных праймеров, так и относительно редкой встречаемостью рММО у метанотрофов.

Ген mxaF кодирует главную субчастицу метанолдегидрогеназы, второго фермента в цепочке окисления метана. Использование его в качестве маркера в исследованиях экологии метанотрофов ограничено, так как он присутствует не только у метанотрофов, но и у грамотрицательных метилотрофных организмов. Гены mxaF метанотрофов и метилотрофов часто образуют общие кластеры, что затрудняет идентификацию организмов. Тем не менее, многие исследователи успешно используют данные гены в исследованиях метанотрофных сообществ различных экосистем (McDonald, Murrell, 1997a; Neufeld et al., 2007).

2.3. Количественная ПЦР.

Количественная оценка метанотрофных организмов в природных экосистемах является достаточно сложной задачей. Одним из традиционных способов определения численности различных групп микроорганизмов является метод определения наиболее вероятного числа - most probable number (MPN). Однако, в случае с метанотрофными организмами он малоэффективен. Так как на настоящий момент не существует универсальной для всех метанотрофов среды культивирования, то результаты количественного учета данной группы микроорганизмов методом MPN напрямую зависят от условий культивирования (Bussmann et al., 2007; Воробьев, Дедыш, 2008).

Альтернативный способ оценки численности метанотрофов в природных экосистемах предполагает использование метода количественной ПЦР - кПЦР (Knief et al., 2006; Kolb et al., 2003, 2005; Halet et al., 2006). Особенностью данного метода является возможность наблюдения процесса амплификации в режиме реального времени, что позволяет оценить численность целевых организмов в образцах. Количественная ПЦР, однако, дает информацию лишь о количестве копий целевого гена в полученных экстрактах, а не о количестве клеток исследуемых организмов. Было показано, что в геномах Methylococcus capsulatus Bath, Methylosinus trichosporium OB3b и Methylocystis sp. M содержится по две копии гена pmoА (Semrau et al., 1995; Stoylar et al., 1999; Murrell et al., 2000). Также, при исследовании метанотрофов, обитающих в озерных осадках было показано, что количество копий генов pmoA варьировало от одного до трех (Aumann et al., 2000). Таким образом, применение метода кПЦР для количественной оценки метанотрофов в природных или лабораторных образцах способно вносить существенную ошибку в оценку численности, поскольку не существует каких-либо фиксированных коэффициентов пересчета.

Известно также, что клетки метанотрофов I и II типов лизируются с различной эффективностью (Meyer et al., 1986; Лысенко и др., 1998; Bowman et al., 1993), что в результате приводит к неадекватной представленности ДНК данных групп метанотрофов в полученных экстрактах, используемых для дальнейших молекулярных исследований.

Подтверждением этому служит исследование по разработке метода кПЦР на основе гена pmoA (Kolb et al., 2003). В качестве апробации разработанной методики авторами была предпринята попытка оценки численности внесенных в почву популяций метанотрофов I и II типов. Применительно к метанотрофам I типа – Methylococcus capsulatus и Methylomicrobium album – метод показал 100% эффективность, однако в опыте с метанотрофами II типа – Methylosinus trichosporium, удалось зарегистрировать лишь 20% внесенных клеток (Дедыш, 2006). Необходимо отметить, что недавно описанные ацидофильные метанотрофы рода Methylocapsa требуют еще более жестких условий для эффективного лизиса клеток (Дедыш, 2004). Таким образом, методы, подразумевающие экстракцию ДНК из образца, вряд ли могут служить источником строго количественной информации в исследованиях экологии метанотрофных бактерий (Дедыш, 2006).

2.4. Микрочипы.

Технология микрочипирования позволяет одновременно анализировать большое количество образцов, и в настоящее время активно используется в диагностике.

Например, в медицине, ветеринарии, растениеводстве, при контроле качества воды и пищи с помощью микрочипов возможна быстрая детекция патогенов или контаминантов.

В качестве мишеней могут выступать как филогенетические, так и функциональные гены микроорганизмов. Микрочипы представляют собой нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны, с нанесенными на них рядами олигонуклеотидных проб, количеством до нескольких тысяч (Bodrossy et al., 2003). Американскими исследователями было проанализировано бактериальное разнообразие некоторых природных образцов с использованием микрочипов с более чем 30 тысячами вариантами 16S рРНК олигонуклеотидных проб (Wilson et al., 2002). Кроме использования микрочипов на основе нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК, позволяющих детектировать лишь известные организмы, широко применяются микрочипы с различными функциональными генами в качестве мишеней. В случае метанотрофных организмов основой для разработки таких «функциональных зондов» служат последовательности генов pmoA и mmoX. Так, на основе базы данных последовательностей гена pmoA недавно был создан диагностический микрочип, состоящий из 68 проб и позволяющий быстро оценить разнообразие метанотрофов в различных экосистемах (Bodrossy et al., 2003).

Уровень специфичности данных проб варьирует от штаммовой до родовой и групповой, что обеспечивает широкий спектр детекции и высокую разрешающую способность анализа (Дедыш, 2006). Однако, данный метод имеет ряд недостатков, связанных, в основном, с невозможностью оптимизировать условия гибридизации для всех проб, что может привести к неспецифическому связыванию и, как следствие, неверным результатам качественного и количественного анализа.

2.5. Метод FISH.

Метод FISH (fluorescent in situ hybridization) совмещает в себе возможности идентификации и определения численности целевой популяции микроорганизмов в любых природных средах (Дедыш, 2006). Он основан на гибридизации клеток с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-меченными олигонуклеотидными зондами и дальнейшей детекции связавшихся клеток. Достоинством метода FISH является непосредственная визуализация целевых объектов, оценка их морфологии и локализации в нативных образцах. Данный метод позволяет проводить прямую количественную оценку искомых групп микроорганизмов в природных образцах, что делает его по-своему уникальным. Из недостатков метода FISH следует отметить невозможность детекции покоящихся форм микроорганизмов из-за низкого содержания молекул 16S рРНК в этих клетках, вероятность неспецифической детекции и недоучет клеток неизвестных организмов.

Интенсивность сигнала FISH связана с количеством копий гена 16S рРНК в клетке.

Когда их численность меньше порогового уровня, что часто бывает в случае мелких форм бактерий или при стагнации роста, сигнал не может быть детектирован. В этом случае используют модифицированный вариант данного метода – метод CARD-FISH (catalyzed reporter deposition fluorescence in situ hybridization), который предусматривает значительное (до 20 раз) усиление сигнала (Teira et al., 2004).

Ряд FISH-зондов различного уровня специфичности (от видо- до родо- и группоспецифичных) был разработан и для метанотрофных бактерий. Спектр их пока относительно невелик (Таб. 3). Область применения этих «метанотрофных» зондов до недавнего времени ограничивалась лишь анализом смешанных и накопительных культур (Holmes et al., 1995; Bourne et al., 2000). Примером первого количественного исследования состава метанотрофной популяции с использованием метода FISH является детальный анализ метанотрофов кислых сфагновых болот России (Dedysh et al., 2001, 2003), который показал доминирование в кислых торфах ацидофильных метанотрофов родов Methylocystis, Methylocella и Methylocapsa, принадлежащих к Alphaproteobacteria. Напротив, численность метанотрофных представителей Gammaproteobacteria в данных образцах не превышала 1% общей численности метанотрофного сообщества сфагновых болот (Дедыш, 2006).

2.6. Метод стабильных изотопов (SIP).

Отдельного упоминания заслуживает метод SIP, позволяющий связать организм с его биологической ролью в природных образцах без выделения в чистую культуру. Суть метода заключается в кратковременной инкубации анализируемых нативных образцов с отдельными субстратами, содержащими стабильный изотоп углерода 13С, последующим выделением С-меченной ДНК и ее ПЦР-анализом (Dumont, Murrell, 2005; Friedrich, 2006). Так как природное обогащение С не превышает 1%, то добавление к нативным образцам >99% С-меченного субстрата приводит к его встраиванию в метаболически активные клетки. В дальнейшем С-ДНК отделяют от С-ДНК бактерий, которые не Таблица 3. 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды, разработанные для специфической детекции метанотрофных бактерий (цитировано по Dedysh et al., 2003).

- концентрация формамида в гибридизационном буфере, - температура гибридицазии, - концентрация NaCl в буфере для промывки.

ассимилировали меченый субстрат, ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCl (Троценко, Хмеленина, 2008). Одним из преимуществ метода SIP является возможность использовать в качестве ПЦР-мишеней не только филогенетические, но и загрязнители окружающей среды, такие как бензоат, нафталин и др. (Jeon et al., 2003;

продемонстрировать на аэробных метано- и метилотрофных бактериях (Radajewski et al., 2000). В качестве мишени в таких экспериментах, помимо ДНК, может быть использована и РНК (РНК-SIP). Такая модификация метода, однако, является болеетрудоемкой и технически сложной, чем ДНК-SIP (Whiteley et al., 2006). Выделение РНК из нативных образцов является достаточно сложным процессом ввиду ее нестабильности, однако метод РНК-SIP имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с методом ДНК-SIР. Во-первых, РНК-SIP позволяет выявить метаболически активные, но неделящиеся клетки, в то время как меченый углерод встраивается в молекулу ДНК только в процессе репликации, что происходит при делении клетки. Вовторых, несвязанное с процессом репликации накопление копий РНК позволяет оценить степень активности того или иного метанотрофа в процессе окисления метана при кратковременной инкубации с СН4 (Manefield et al., 2002; Dumont et al., 2011). Еще одной разновидностью данного подхода является метод PLFA-SIP, который позволяет идентифицировать активный компонент метанотрофного сообщества на основании анализа состава жирных кислот (Bodelier et al., 2009). Данные PLFA анализа, однако, не всегда можно однозначно интерпретировать, что несколько ограничивает его применение. Различные варианты метода SIP широко востребованы ныне для выявления и идентификации метаболически активного метанотрофного компонента микробных сообществ различных природных экосистем – от кислых лесных почв и торфяников до осадков пресноводных и содовых озер (Radajewski et al., 2002; Lin et al., 2004; Maxfied et al., 2006; Cebron et al., 2007; Bodelier et al., 2009; Dumont et al., 2011).

В целом, необходимо признать, что прогресс в понимании роли и разнообразия метанотрофных организмов в микробных сообществах связан, прежде всего, с развитием и усовершенствованием методов молекулярной экологии. Сложности получения метанотрофов в чистых культурах стимулировали активный поиск косвенных методов изучения этих бактерий. Эти методы позволяют не только визуально оценить локализацию метанотрофов в природных местообитаниях, но и определить вклад отдельных организмов в процесс окисления метана, а также выявить потенциально новые группы метанотрофов. В настоящее время все больше внимания уделяется исследованию роли метанотрофных организмов в природных экосистемах, а также их влияния на микробное сообщество и экосистему в целом.

Глава 3. Метанотрофы как компонент микробных сообществ северных сфагновых болот.

Одним из наиболее распространенных типов северных болотных экосистем являются верховые сфагновые болота. Это типичные представители автономных ландшафтов.

Верховые болота развиваются на водоразделах и в своем питании ограничены тем, что поступает к ним из воздуха с атмосферными осадками и пылью. От минерального грунта они отделены слоем торфа. Вода в верховых болотах отличается низкой минерализацией, составляющей 5-100 мг/л, низкой электропроводностью, низким значением рН 3-5, обусловленным органическими кислотами, углекислотой и ионным обменом на поверхности растений (Заварзин, 2004). Большую часть вегетационного сезона уровень воды находится вблизи или на поверхности почвы, что приводит к стагнации процессов аэробного разложения растительных остатков. В результате, северные сфагновые болота представляют собой глобальный сток CO2, со скоростью процессов захоронения углерода около 10-30 мг С в год на один квадратный метр. Северные торфяники занимают около 3-5% общей площади поверхности суши и содержат в себе одну треть мирового запаса органического углерода (Gorham, 1991). В то же время, сфагновые болота являются одними из важнейших источников парникового газа метана (Matthews, Fung, 1987;

Gorham, 1991; Panikov, 1999; Friborg, 2003). Конечный этап разложения органических веществ в глубоких анаэробных слоях болотного профиля приводит к образованию значительных количеств метана, который диффундирует сквозь торфяную толщу и попадает в атмосферу. Эмиссию метана из болот контролируют метанотрофные организмы, формирующие своеобразный бактериальный фильтр. Эти бактерии, развитие которых приурочено к уровню стояния болотных вод, способны эффективно перехватывать метан на его пути в атмосферу (Dedysh, 2009).

Начиная с момента их открытия, метанотрофные организмы превратились в объекты активного изучения для целого поколения исследователей. Поиск новых метанотрофов осуществлялся во всех экосистемах, где имеет место образование метана. Несмотря на то, что первая метанотрофная бактерия была описана в далеком 1906 году, прорыв в массовом культивировании новых метанотрофов произошел только в 1970 годах (Whittenbury et al., 1970). В последующие 40 лет было получено большое количество изолятов, среди которых встречались представители различных экофизиологических типов: термофилы, психрофилы, алкалофилы (См. табл. 1, стр.18). В этом перечне, однако, долгое время отсутствовали ацидофильные метанотрофы, населяющие кислые сфагновые болота.

Первое сообщение о молекулярной детекции метанотрофных организмов в кислых торфяниках было опубликовано около 20-ти лет назад (McDonald et al., 1996).

Полученные из сфагнового торфа нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и ряда функциональных генов принадлежали метанотрофам II типа, однако представляли филогенетически обособленную подгруппу без охарактеризованных организмов.

Параллельно с этими первыми молекулярными анализами предпринимались попытки выделения неизвестных болотных метанотрофов в чистую культуру. Однако эти попытки долгое время они оставались безрезультатными. Тщательное изучение физикохимических особенностей болотной экосистемы привело к созданию новой селективной среды, на которой впоследствии и были выделены первые ацидофильные метанотрофы (Dedysh et al., 1998), которые оказались приспособлены к существованию в экстремальных условиях кислых сфагновых болот (см. раздел 3.2).

Основные этапы в изучении метанотрофов кислых сфагновых болот условно можно разделить на две большие группы: данные, полученные с помощью молекулярных методов и данные, полученные с помощью культуральных подходов.

3.1. Исследование экологии и разнообразия метанотрофов в болотах с помощью молекулярных методов.

В середине 1990 годов был впервые проведен молекулярный анализ состава сообществ метанотрофов в ряде сфагновых торфяников Великобритании (McDonald et al., 1996). В этой работе на основании анализа последовательностей генов 16S рРНК, амплифицированных из экстрактов ДНК образцов кислых торфов, удалось показать присутствие метанотрофов, филогенетически близких родам Methylosinus и Methylocystis, но формирующих отдельную ветвь в пределах Alphaproteobacteria. Дополнительное доказательство наличия метанотрофов в кислых торфах было получено при использовании в качестве ПЦР-мишеней функциональных генов метанотрофов, таких как pmoA и mmoХ, кодирующих мембранную и растворимую формы метанмонооксигеназы, а также гена mxaF, кодирующего большую субъединицу метанолдегидрогеназы.

Результаты этих исследований подтвердили гипотезу о существовании в кислых болотах неизвестной группы метанотрофов (McDonald et al., 1995а; 1995b, 1997). Как мы знаем сейчас, данные последовательности принадлежали метанотрофам новых видов рода Methylocystis, типичным обитателям сфагновых болот (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013).

До определенного времени, исследования разнообразия метанотрофного сообщества болот с помощью молекулярных методов были в значительной степени ограничены лишь кругом известных на тот момент метанотрофов. Однако первые успехи в выделении ацидофильных метанотрофов и описание представителей новых родов Methylocapsa и Methylocellа существенно расширили спектр праймерных систем и зондов, доступных для успешной идентификации основных групп болотных метанотрофов (Dedysh et al., 2001;

2003). Было также показано, что представители рода Methylocella не содержат мембранную ММО, а имеют лишь ее растворимую форму. Следовательно, при исследовании разнообразия метанотрофного сообщества на основании анализа гена pmoA как минимум одна группа метанотрофов оставалась неучтенной.

Применение метода FISH для анализа ряда кислых олитотрофных болот Северной Германии и Западной Сибири показало, что общая численность метанотрофных бактерий в них достигала 106 – 107 клеток на грамм сырого торфа (Dedysh et al., 2001, 2003).

Болотные метанотрофы были представлены родами Methylocapsa, Methylocella и Methylocystis. Представители рода Methylocystis составляли абсолютное большинство от общей численности метанотрофов. Метанотрофы класса Gammaproteobacteria, олигонуклеотидных зондов М84 и М705, не представляли численно значимого компонента и составляли не более 0.1-1.0% от всех болотных метанотрофов. Было также отмечено, что численность и разнообразие болотных метанотрофов существенно варьировали в зависимости от особенностей болотных экосистем. Например, в кислых сфагновых болотах (рН 3.9 – 4.2) доминировали метанотрофы класса Alphaproteobacteria, достигая в некоторых случаях 107 клеток в грамме торфа (Dedysh, 2009). В то же время, в менее кислых (рН 5.0 - 6.0) и более холодных болотах тундры численная представленность метанотрофов I и II типов была приблизительно одинакова, что неудивительно, поскольку среди метанотрофов класса Gammaproteobacteria имелись психрофильные представители - например, Methyloshaera hansoni и Methylobacter psychrophilus - но до последнего времени ацидофилы известны не были.

Метод стабильных изотопов (SIP) также был использован для идентификации метаболически активных метанотрофов в кислых болотах. Так, в исследованиях метанотрофного сообщества мезотрофного болота на основе анализа С-ДНК, выделенной из нативных образцов торфа после их инкубирования с СН4 был выявлен ряд последовательностей гена 16S рРНК, принадлежащих представителям родов Methylocella, Methylocystis/Methylosinus, а также Methylobacter (Morris et al., 2002). Анализ последовательностей фрагментов гена pmoA, амплифицированных из этого же образца ДНК, подтвердил преобладание метанотрофных альфапротеобактерий. Из разновидностей метода SIP при исследовании болот применялся также метод PLFA-SIP, позволяющий оценить активную составляющую метанотрофоного сообщества на основании анализа выделенных жирных кислот. Так, группой голландских исследователей при анализе кислого торфа были идентифицированы жирные кислоты 16:17, 18:19 и 18:17 (Chen et al., 2008). Последняя являлась индикаторной для болотных метанотрофов Methylocella, Methylocapsa и Methylocystis (Dedysh et al., 2000, 2002, 2004а, 2007). Присутствие кислоты 16:17 достаточно сложно интерпретировать.

Она является индикаторной для метанотрофов I типа, однако, недавние исследования показали, что она присутствует и у некоторых представителей рода Methylocystis.

Например, в клетках ацилофильных M. heyeri и M. bryophila данная кислота является одной из доминирующих (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013). Таким образом, оценка метанотрофного сообщества сфагновых болот на основании анализа жирных кислот не является методически безупречной, хотя и косвенно подтверждает доминирование метанотрофов класса Alphaproetobacteria.

Еще один подход, примененный для анализа разнообразия метанотрофов кислых торфяников, это метод микрочипирования (Bodrossy et al., 2003). Так, при исследовании осокового (рН 4.6) и сфагнового (рН 4.6 – 4.8) болот было обнаружено существенное различие в составе населяющих их метанотрофных организмов. В сфагновом болоте доминировали Methylocystis spp., а также присутствовали представители Methylocella и Methylocapsa. Болото же с преобладанием осоковых растений населяли как Methylocystis и Methylocella, так и неизвестные представители метанотрофов I типа (Сhen et al., 2008).

Таким образом, использование метода микрочипов также подтверждает численное доминирование присутствие в сфагновых болотных экосистемах метанотрофов класса Alphaproteobacteria.

Как видно, результаты исследования метанотрофного сообщества кислых болот с использованием перечисленных выше молекулярных методов однозначно свидетельствовали в пользу доминирующей роли метанотрофов II типа в процессах окисления метана в этих экосистемах. Тем не менее, первое же использование метода высокопроизводительного пиросеквенирования гена pmoA показало необычайно высокую долю метанотрофов класса Gammaproteobacteria в метанотрофном сообществе сфагновых болот. Так, в работе голландских исследователей было показано равноценное присутствие представителей родов Methylocystis и Methylomonas в микробном сообществе сфагнового болота (Kip et al., 2011). Интерпретация данного факта до последнего времени оставалась затруднительной, так как ацидофильные представители метанотрофов I типа были ранее неизвестны.

3.2. Культуральные приемы и характеристика полученных болотных метанотрофов.

Ключевым приемом, позволившим успешно выделить первых метанотрофов из кислых болот, стало применение кислых (4.5 – 5.8), разбавленных культуральных сред, содержащих 100-500 мг солей в литре и обладающих низкой буферной емкостью (Dedysh et al., 1998). При использовании метана в качестве единственного источника углерода и энергии на данной среде удалось получить стабильные накопительные культуры, присутствие в которых метанотрофных бактерий было подтверждено с помощью метода FISH со специфическими для метанотрофов II типа зондами. Для получения изолятов использовали либо метод рассева на плотные среды, либо метод предельных разведений (Dedysh et al., 1998, 2002, 2004a, 2007; Dedysh, 2009).

К моменту начала настоящей работы все доступные в культурах болотные метанотрофы принадлежали к классу Alphaproteobacteria. Первые из них были выделены в начале 2000 годов и представляли собой новый род метанотрофов – Methylocella. На настоящий момент этот род насчитывает три вида – M. palustris, M. silvestris и M. tundra (Dedysh et al., 2000, 2003, 2004). Они представляют собой грамотрицательные короткие палочки, отличительным признаком которых является наличие на полярных концах клетки гранул полигидрооксибутирата, что позволяет легко идентифицировать их в накопительных культурах. Метанотрофы рода Methylocella являются уникальными организмами. Это первые известные метанотрофы, у которых отсутствует мембранная форма ММО. Гены, кодирующие мММО, в геноме Methylocella отсутствуют. В отличие от всех остальных метанотрофов, представители рода Methylocella не обладают развитой системой ВЦМ, а имеют лишь слабовыраженные везикулярные мембраны (Dedysh et al., 2000, 2002, 2004). Первоначально, представители рода Methylocella были описаны как облигатные метанотрофы, однако позже оказалось, что они способны утилизировать не только метан, но и ацетат, пируват, сукцинат, малат и этанол (Dedysh et al., 2005б). Более того, скорость роста на ацетате у этих бактерий значительно выше скорости роста на метане. Таким образом, представители рода Methylocella являются первыми истинно факультативными метанотрофными организмами. По своим физиологическим характеристикам метанотрофы рода Methylocella относятся к мезофилам (диапазон температур 4-30°С) и умеренным ацидофилам (диапазон рН 4.2-7.5). Они чувствительны характеристикам представители рода Methylocella сходны с метанотрофами II типа (Dedysh, 2009).

Вслед за метанотрофами рода Methylocella из нативных образцов сфагновых болот Западной Сибири были получены новые болотные метанотрофы. Они представляли собой короткие изогнутые палочки, образующие клеточные конгломераты, покрытые плотным полисахаридным матриксом. Филогенетически данные метанотрофы были наиболее близки роду Methylocella, однако, в отличие от последних, содержали мММО и являлись облигатными метанотрофами. Данные организмы были описаны впоследствии как первые представители нового рода Methylocapsa - Methylocapsa acidiphila (Dedysh et al., 2002). Интересной особенностью новых метанотрофов явилось уникальное расположение ВЦМ, при котором они сгруппированы на одной половине клетки. M.

acidiphila способна к активной фиксации N2. Последовательность гена nifH, кодирующего один из компонентов нитрогеназного комплекса у M. acidiphila практически идентична таковой у гетеротрофов-азотфиксаторов рода Beijerinckia (Dedysh et al., 2004б). По основным физиологическим характеристикам M. acidiphila сходна с представителями рода Methylocella: эта бактерия является мезофилом и умеренно ацидофильным организмом, предпочитающим низкоминерализованные среды. Позже, из образцов кислой лесной почвы был изолирован другой представитель рода Methylocapsa, M. aurea (Dunfield et al., 2010). В отличие от M. acidiphila он был способен к факультативному росту на ацетате и предпочитал более нейтральные значения рН среды (рН 6.0 – 6.5).

Позже, еще один болотный метанотроф, Methyloferula stellata, был получен из образцов сфагнового болота севера России (Vorobev et al., 2011). Клетки этой бактерии представляли собой тонкие палочки, собирающиеся в процессе роста в розетки или крупные конгломераты. Подобно Methylocella, клетки нового метанотрофа обладали лишь рММО и не образовывали ВЦМ. Однако, в отличие от метанотрофов рода Methylocella, M. stellata была неспособна к факультативному росту. Примечательно, что этот микроорганизм являлся более ацидофильным, чем все выделенные до него болотные метанотрофы, и был способен расти при рН 3.5, имея оптимум рН 4.8 – 5.2.

Необходимо отметить, что представители родов Methylocella, Methylocapsa и Methyloferula впервые были выделены из сфагновых болот. Как уже было отмечено выше, Methylocellа и Methyloferula не обладают мММО, а большая часть исследований метанотрофного разнообразия болот была выполнена на основе анализа последовательностей гена pmoA, кодирующего мММО. Очевидно, что в таких работах метанотрофы родов Methylocella и Methyloferula не фигурировали в качестве ключевых агентов процессов окисления метана в болотах. Основной же группой метанотрофов, выявленных в кислых торфах путем анализа гена pmoA, были представители рода Methylocystis. Эти болотные метанотрофы впоследствии также были успешно выделены в чистую культуру и описаны в качестве двух новых видов рода Methylocystis – M. heyeri и M. bryophila (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013). Первым, из сфагнового болота на севере Германии был изолирован M. heyeri штамм H2T. Клетки данного штамма представляли собой короткие прямые или слегка изогнутые палочки, покрытые обширной полисахаридной капсулой. По основным характеристикам он являлся типичным представителем метанотрофов II типа, за исключением одной особенности. В составе жирных кислот клетки в большую долю составляла кислота 16:18c, которая ранее была предложена в качестве «маркерной» для метанотрофов I типа (Dedysh et al., 2007). Таким образом, данные сообщений о находке этой кислоты в общем пуле жирных кислот, выделенных из кислого торфа, может быть потенциально быть объяснено не присутствием в болотах неизвестных болотных метанотрофов I типа, а вкладом M. heyeri.

Другой вид рода Methylocystis – M. bryophila - был выделен из образцов сфагнового торфа болот северной Германии и центральной России (Belova et al., 2013). Морфология клеток этого вида типична для представителей рода Methylocystis. Одной из ключевых особенностей M. bryophila явилось присутствие у него двух изоформ мММО, обладающих высоким и низким сродством к метану, а также и кодирующих их генов pmoA и pmoA2.

M. heyeri и M. bryophila – это первые и пока единственные известные ацидотолерантные представители рода Methylocystis, растущие в диапазоне рН 4.4 – 7.6.

Это мезофилы (диапазон температур 5 - 30°С), способные кроме метана и метанола использовать также ацетат. В отличие от представителей рода Methylocella, однако, предпочтительным субстратом болотных Methylocystis spp. является метан (Belova et al., 2010). Ацетат используется для поддержания жизнеспособности этих бактерий в периоды отсутствия метана.

Таким образом, все выделенные и описанные к моменту начала настоящей работы болотные метанотрофы относились к классу Alphaproteobacteria и представляли собой умеренно ацидофильные и психротолерантные организмы, хорошо адаптированные к существованию в кислых и холодных северных сфагновых болотах. Они имели ряд особенностей, отличающих их от ранее известных метанотрофов II типа. В числе этих особенностей - отсутствие мММО у представителей родов Methylocella и Methyloferula, присутствие индикаторной для метанотрофов I типа жирной кислоты 16:18c у Methylocystis heyeri и существование двух изоформ мММО у Methlocystis bryophila.

Главной же особенностью большинства (хотя и не всех) болотных метанотрофов является факультативность по отношению к метану. За исключением Methylocapsa acidiphila и Methyloferula stellata все болотные метанотрофы при отсутствии СН4 способны переключаться на использование ацетата, а в некоторых случаях и других субстратов (например, этанола). Метанотрофы рода Methylocella являются исключением, так как предпочитают расти на ацетате, хотя и способны к росту на метане в отсутствие ацетата.

По всей видимости, факультативная метанотрофия является специфической адаптацией именно болотных метанотрофов, которые населяют экосистему, богатую сложным органическим веществом и продуктами его анаэробной деградации.

3.3. Пробелы в знаниях о метанотрофных сообществах сфагновых болот.

В общей картине состава метанокисляющего сообщества болотных экосистем, тем не менее, остается ряд существенных пробелов. Первый из них, это нерешенный вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в процесс окисления метана метанотрофов I типа. До недавнего времени, среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было.

По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий (Dedysh et al., 2001; 2003).

Тем не менее, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК, а также некоторых функциональных генов метанотрофов класса Gammaproteobacteria, принадлежащие родам Methylobacter, Methylomonas и Methylococcus, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al., 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Dumont et al., 2008). Привлечение метода высокопроизводительного пиросеквенирования для анализа разнообразия метанотрофов в болотах дало неоднозначные результаты. Так, при использовании в качестве мишени гена 16S рРНК метанотрофы I типа в торфе были выявлены в крайне низком количестве (Serkebaeva et al., 2013), тогда как при анализе пула генов pmoA метанотрофы класса Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria были представлены практически в равном соотношении (Kip et al., 2011а; Bragina et al., 2012). Подавляющее последовательности, близкие к таковым у представителей рода Methylonomas.

Интерпретация этих результатов до последнего времени оставалась затруднительной, так как отсутствовали культуры ацидофильных Methylonomas spp., равно как и других метанотрофов I типа, способных расти в кислых средах. Единственный изолят болотных метанотрофов рода Methylomonas был получен недавно из сфагнового болота Нидерландов (Kip et al., 2011б). Этот изолят, однако, был лишь частично охарактеризован, и его роль в процессе окисления метана в болотах оставалась неясной.

Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (Raghoebarsing et al., 2005). Последовательности генов 16S рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер относится к Alphaproteobacteria и филогенетически равноудален от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae.

Голландским микробиологам удалось доказать тесную метаболическую связь между метанотрофами и мхами (Raghoebarsing et al., 2005). Они постулировали симбиоз потенциально метанотрофных организмов со сфагновым мхом, однако в чистую культуру эти бактерии выделены не были. Как следствие, физиологические характеристики представителей этого филогенетического кластера до последнего времени оставались неизвестны. Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам II типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах.

Таким образом, настоящая работа была предпринята для восполнения вышеупомянутых пробелов в знаниях о метанотрофных бактериях северных болотных экосистем.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Объекты и методы исследования.

4.1. Образцы нативного торфа, использованные в исследовании. В работе использовали образцы торфа, отобранные в июне-июле 2011-2012 г. на границе аэробной и анаэробной зон (глубина 5-10 см) профилей болотных массивов Шумново и Тарлаковский мох Тверской области, болота Обуховское Ярославской области, а также трех болот Архангельской области - Шоля, Солза и Цигломень (Табл.4). Объекты исследования представляли собой типичные верховые олиготрофные болота бореальной и тундровой зон России, с величиной рН болотной воды 3.9-4.2. Болото Шумново граничило с участком горелого леса, что привело к повышению рН болотной воды до величины 4.7 за счет внесения зольного компонента. Отобранные образцы транспортировали в лабораторию в пакетах с охлаждением и немедленно использовали для определения метанокисляющей активности торфа, а также фиксации для последующего анализа методом FISH и экстракции ДНК для молекулярных исследований.

4.2. Определение активности окисления метана образцами торфа. Навески по г сырого торфа измельчали до фрагментов размера 10-15 мм, помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 160 мл, герметично закрывали флаконы и вводили метан до концентрации около 1000 ppm. Флаконы инкубировали при комнатной температуре. В периодически отбираемых из газовой фазы флаконов пробах (0.5 мл) определяли концентрацию метана на хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматек», Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Измерения проводили до полного исчезновения метана во флаконах. На основании полученных данных рассчитывали скорость окисления метана исследуемыми образцами торфа.

4.3. Оценка численности метанотрофных бактерий с помощью метода FISH.

4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа. Перед фиксацией образцы торфа подвергали процедуре экстракции клеток микроорганизмов, которую проводили с использованием гомогенизатора BagMixer 100 “MiniMix” (Interscience, Франция) и прилегающих к нему стерильных пакетов BagFilter®. Каждый пакет имеет две части, Таблица 4. Болотные экосистемы, исследованные в настоящей работе.

отбора образцов Архангельская обл., Архангельская обл., Архангельская обл., N 56°42’, E 36°52’ в районе горелого silvestris, B.pendula, Eq. fluviatile, A.

Тарлаковский мох, N 56°37’, E 36°52’ 3.9 Олиготрофное Ярославская обл., Владимирская обл., разделенные внутренней фильтрующей вставкой. Последняя позволяет отделить торфяную суспензию от крупных частиц неразложившегося растительного материала ( мм). 2 г сырого торфа помещали в одно из отделений пакета, добавляли 10-20 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали в гомогенизаторе в течение минут. 0.5 мл суспензии, обогащенной микробными клетками отбирали из другого отделения и центрифугировали для осаждения клеток при 8000 об/мин в течении 5 минут.

Осадок ресуспендировали в 0.5 мл фосфатного буфера (NaCl – 8.0 г, KCl – 0.2 г, Na2HPO – 1.44 г, NaH2PO4 – 0.2 г, H2O – 1 л, pH 7.0). К полученной суспензии добавляли 1.5 мл раствора 4%-ого раствора формальдегида в фосфатном буфере и инкубировали в течение 1.5 часов. Образец осаждали центрифугированием (8000 об/мин в течение 5 минут) и дважды промывали фосфатным буфером. Фиксированные образцы ресуспендировали в смеси 100% этанола и фосфатного буфера (1:1, об:об) и до анализа хранили при -20С.

4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами. 1-5 мкм суспензии фиксированных образцов наносили на обработанные в 0.1% растворе желатина предметные стекла с окошками, разделенными тефлоновым покрытием. Препараты выдерживали 24 часа при комнатной температуре для лучшего связывания клеток со стеклом. Стекла с нанесенными образцами последовательно проводили через серию растворов этанола (50%, 80%, 100%), оставляя по 3 мин в каждом. Для гибридизации использовали как предложенные ранее, так и разработанные в настоящем исследовании рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды (Табл. 5). Гибридизацию препаратов с зондами проводили в соответствии с методикой Stahl и Amann (1991) при температуре 46С. После завершения процедуры гибридизации препараты в течении 10 минут докрашивали 1 мкМ раствором универсального, ДНК-специфичного флуресцентного красителя – ДАФИ (4’,6’-диамидино-2-фенилиндол), промывали дистиллированной водой и высушивали.

4.3.3. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов для детекции метанотрофов. Учет численности клеток метанотрофов I типа осуществляли путем гибридизации с эквимолярной смесью Су3-меченых зондов М705+М84, а метанотрофов II типа – с зондом М450. Общую численность клеток бактерий определяли гибридизацией с эквимолярной смесью зондов Eub338-mix.

Таблица 5. 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды, использованные

CTGGTGTTCCTTCAGATC

EUB338Amann et EUB338 III)

CCGGCGGGAGGTCTTGCG

GCTGCGCCACTGACAGCT

– концентрация формамида в гибридизационном буфере, 4.3.4. Разработка новых зондов и проверка их специфичности. Поиск уникальных последовательностей в 16S рРНК представителей нового рода метанотрофов-спирилл Candidatus Methylospira palustris и создание олигонуклеотидных зондов для специфической детекции этих бактерий осуществляли с использованием функции “Probe Design” пакета ARB. Специфичность полученных зондов проверяли путем тестирования в базе данных Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu). Синтез зондов, меченных флуоресцентным красителем Cy3, осуществлялся компанией “Синтол” (Москва, Россия). Оптимизацию условий гибридизации проводили в диапазоне рабочих концентраций формамида в гибризационом буфере от 0 до 40%.

4.3.5. Микроскопический анализ. Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Йена, Германия) со светофильтрами Zeiss 20 для Cy3-меченных зондов и Zeiss 02 для окраски ДАФИ.

4.3.6. Детекция и учет клеток микроорганизмов в образцах торфа. Определение численности целевых групп бактерий в образцах торфа осуществляли путем подсчета количества гибридизованных с зондами клеток в 100 (метанотрофы II типа и эубактерии) и 400 (метанотрофы I типа) полях зрения, с последующих расчетом численности популяций на 1 грамм влажного торфа по следующей формуле:

численность клеток в 1 г торфа = (среднее число целевых клеток в поле зрения микроскопа площадь анализируемого окошка общий объем фиксированного образца общий объем торфяного экстракта разведение) / (площадь поля зрения микроскопа объем нанесенного на окошко фиксированного образца объем торфяного экстракта, использованный для фиксации масса образца торфа).

Общую численность бактерий в образцах определяли путем учета клеток, выявленных смесью зондов EUB338-mix (Табл. 5).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием таблиц MS Excel 2010.

4.4. Молекулярная идентификация болотных метанотрофов с помощью ПЦРанализа.

4.4.1. Экстракция тотальной ДНК из образцов торфа. Для анализа использовали г свежеотобранного торфа. Выделение тотальной ДНК из торфа производили с использованием набора «FastDNA SPIN kit for soil» (Biol 101, США) в соответствии с рекомендацией производителя. Концентрацию ДНК в полученных экстрактах определяли с помощью флуориметра Qibit®2.0 (Invitrogen, США). Экстракты ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

4.4.2. Экстракция ДНК из микробных клеток. Для выделения ДНК из клеток изолятов и смешанных культур использовали модификацию ранее описанного метода (Zhou et al., 1995; Dedysh et al., 1998), основанного на применении додецил сульфата натрия (SDS) в качестве лизирующего агента. Клетки культуры осаждали центрифугированием при 8000 об/мин 5 минут. Осадок ресуспендировали в 400 мкм буфера S (100мМ Трис-НСl (pH 8.0), 100 мМ Na2-ЭДТА (рН 8.0), 1.5 М NaCl, 1% СТАВ).

Добавляли 5 мкл свежеприготовленного раствора протеиназы К (10мкг/мкл) и тщательно перемешивали образец на вортексе. В полученную суспензию добавляли 80 мкл 10% раствора додецил сульфатат натрия и инкубировали на водяной бане при +70°С и об/мин в течении 2 часов. Далее образцы охлаждали до комнатной температуры и добавляли 350 мкл фенола и 350 мкл смеси хлороформа и изопропанола (24:1, по объему). Полученную смесь встряхивали в течение 5 минут и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Верхнюю, водную фазу отбирали в чистую пробирку Эппендорф. К ней добавляли 700 мкл смеси хлороформа и изопропанола (24:1, по объему). Полученную смесь также встряхивали в течение 5 минут и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Верхнюю фазу также переносили в чистую пробирку Эппендорф и добавляли 0.6 – 1 объема изопропанола для осаждения ДНК.

Смесь аккуратно перемешивали и оставляли при -20°С от 2 до 12 часов. Затем смесь центрифугировали при 14000 об/мин 30 мин при +4 °С. Супернатант отбрасывали, а осадок промывали 1 мл 70% этанола, охлажденного до +4°С. Осадок растворяли в стерильной дистиллированной воде и полученные растворы ДНК хранили при -20°С.