На правах рукописи

Убшаева Юлия Борисовна

КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ УРОВНЯ СЫВОРОТОЧНЫХ

ЦИТОКИНОВ И ПОЛИМОРФИЗМА ИХ ГЕНОВ

В ПРОГНОЗЕ ТЕЧЕНИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ

РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

14.01.22 Ревматология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии»

Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Коненков Владимир Иосифович.

Научный консультант: кандидат медицинских наук Королев Максим Александрович.

Официальные оппоненты:

Зборовская Ирина Александровна, доктор медицинских наук, профессор; ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России;

кафедра госпитальной терапии, ВПТ с курсом клинической ревматологии ФУВ;

профессор кафедры.

Дубиков Александр Иванович, доктор медицинских наук, доцент; ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России;

кафедра факультетской терапии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ярославская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «30» октября 2013 г. в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 208.008.08 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов,1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России по адресу: 400131, г.

Волгоград, пл. Павших борцов,1.

Автореферат разослан «_» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Магницкая Ольга Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы и степень ее разработанности Высокая социальная значимость ревматоидного артрита (РА) определяется преимущественным поражением лиц трудоспособного возраста, неуклонным прогрессированием болезни, ранней инвалидизацией и сокращением продолжительности жизни (Насонов Е.Л., 2013). Широкая распространённость РА (частота в популяции 1%), зачастую упорное течение заболевания, связанное с недостаточной эффективностью и трудностями при подборе адекватной терапии, обеспечивают необходимость внедрения в практику новых высокотехнологичных, индивидуализированных методов диагностики и терапии пациентов с РА.

Исследования последних лет показали, что иммунокомпетентные клетки и продуцируемые ими цитокины определяют полиморфизм аутоиммунных воспалительных заболеваний, в том числе и РА (Александрова Е.Н., Насонов Е.Л., 2013;

McInnes I.B. и соавт., 2007). TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF осуществляют активацию фибробластов и экспрессию молекул адгезии, что рассматривается как основной механизм поддержания воспаления и прогрессии РА, формирования системных проявлений и осложнений. В то же время реализация аутоиммунного воспаления связана с продукцией IL-4, IL-10, ингибирующих деятельность провоспалительных цитокинов (Новиков А.А. и соавт., 2010). Уровень продукции самих цитокинов определяется структурой регуляторных участков генов цитокинов, сосредоточенных, как правило, в промоторных или интронных участках генов.

В последние десятилетия произошли существенные изменения в подходах к лечению ревматологических больных, включая внедрение концепции раннего агрессивного лечения и комбинированной базисной противовоспалительной терапии, широкое применение генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП) (Каратеев Д.Е, 2012; Балабанова Р.М., 2012). В настоящее время выбор терапии РА осуществляется эмпирически, не предусматривая чувствительность пациентов к лечению, что ограничивает возможности лечебного воздействия в будущем и способствует неконтролируемой прогрессии заболевания.

Проводятся работы по выявлению лабораторных, инструментальных, иммунологических и иммуногенетических маркеров прогностически неблагоприятных форм РА и эффективности терапии, однако результаты различных исследований зачастую противоречивы (Breedveld F. C., Combe B., 2011; Romao V. C. и соавт., 2013), и поиск указанных биомаркеров остается актуальной проблемой медицины.

провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, исследован полиморфизм генов цитокинов у пациентов РА на фоне различных схем терапии. Уровень цитокинов обуславливает развитие и поддержание воспаления при РА, в связи с чем проанализирован совместно с распределением основных медиаторов воспаления.

Результаты исследования направлены на разработку критериев использования сывороточного уровня провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, полиморфизма их генов в комплексе с лабораторными показателями в качестве маркеров прогрессирующих форм РА, прогноза эффективности и нечувствительности к терапии.

Оптимизация терапии ревматоидного артрита путем применения прогностической стратегии на основе оценки клинической значимости сывороточного уровня и полиморфизма генов цитокинов.

Провести комплексный анализ соотношения циркулирующих провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (TNF-, IFN-, IL-2, IL-12 (p70), GM-CSF, IL-4, ILIL-13, IL-5) у пациентов с ревматоидным артритом при различной активности воспалительного процесса.

Оценить зависимость эффективности базисной противовоспалительной терапии от уровня сывороточных цитокинов до начала лечения и динамику их концентраций в процессе терапии.

Изучить характер ассоциированности генотипов в промоторных участках генов цитокинов (TNFA в позициях С-863А, G-308A, G-238A, IL-1B T-31C, IL6 G-174C, IL4 CT, IL10 C-592A) с клиническим течением РА и эффективностью различных схем его лечения среди европеоидного населения Западной Сибири.

Провести клинический анализ прогностической значимости исследованных лабораторных признаков течения ревматоидного артрита.

иммунологических и иммуногенетических факторов в формировании и развитии РА среди европеоидного населения Западной Сибири, имеющего определенные отличия в характере распространения некоторых аллелей различных генов от населения европейской части России.

Впервые для этой группы пациентов установлена динамичная взаимосвязь сывороточных концентраций провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (TNF-, IFN-, IL-2, IL-12 (p70), GM-CSF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-5) с активностью воспалительного процесса, характером течения РА, с эффективностью базисной противовоспалительной терапии (БПВТ).

Впервые для этой группы показано, что полиморфизмы генов TNFA С-863А, GA, G-238A, IL-1B T-31C, IL6 G-174C, IL4 C-590T, IL10 C-592A ассоциированы с вариантами клинического течения РА, эффективностью БПВТ и анти-TNF-терапии.

Впервые установлено, что пациенты с РА, имеющие хороший ответ при назначении БПВТ, кардинальным образом различаются по комбинациям генотипов цитокинов от больных, у которых этот ответ отсутствовал.

Впервые представлены данные по информативности комплекса лабораторных, иммунологических и иммуногенетических признаков в оценке возможности прогнозирования течения и эффективности терапии РА.

В результате проведенного исследования пациентов с РА в Сибирском регионе продемонстрирована динамика изменения уровня провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови в ходе иммуносупрессивной терапии и возможность использования комплексного анализа их уровня в качестве маркера эффективности проводимой терапии.

провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, участвующих в патогенезе ревматоидного артрита, позволяет прогнозировать эффективность БПВТ и терапии ингибиторами TNF-.

На основании выделения информативных признаков разработан комплексный подход прогноза варианта течения и эффективности терапии РА. Внедрение в клиническую практику ведения пациентов с РА выявленных иммунологических и иммуногенетических признаков позволит значительно снизить вероятность использования заведомо неэффективных лекарственных средств, проводить индивидуализированное назначение препаратов пациентам с прогнозируемой высокой эффективностью данного вида терапии, производить своевременную коррекцию лечения.

1. Дополнительными критериями активности процесса и эффективности терапии при противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови.

2. Клиническое течение РА и ответ пациентов на базисную противовоспалительную терапию ассоциированы с генотипами в промоторных участках генов ряда цитокинов.

концентраций цитокинов и полиморфизма генов цитокинов позволяет выявлять неблагоприятные варианты течения РА и проводить персонализированный выбор терапии.

консультативного отделений ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН, терапевтических отделений ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН, используются для выявления неблагоприятных вариантов течения РА, прогноза эффективности базисной терапии и мониторирования проводимого лечения.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии»

(Новосибирск, 2008, 2011 гг.), V съезде ревматологов России (Москва, 2009), Евразийском симпозиуме (Чолпон-Ата, 2009), выездной научной сессии «Актуальные вопросы клинической лимфологии» (Андижан, 2009), Городской научноIII практической конференции врачей «Актуальные проблемы профилактики, диагностики и лечения болезней внутренних органов» (Новосибирск, 2009), I Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, декабрь 2012), ученых советах и семинарах ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН (Новосибирск, 2010-2013).

По материалам работы в 2009 г. получена именная стипендия администрации Новосибирской области в сфере научной деятельности. Работа заняла второе место среди лучших научных работ молодого ученого по терапии на I Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, декабрь 2012 г.).

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ для публикаций основных результатов диссертационных работ, 3 тезиса в иностранной печати. 2 соавторства в монографии.

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 рисунками, содержит 27 таблиц, приложения (4 таблицы). Библиографический указатель включает 185 источников, из них отечественных и 153 зарубежных.

Работа выполнена в рамках темы НИР ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН №005, госрегистрационный №01.2.00951656 «Разработка новых лимфотропных технологий диагностики, лечения и профилактики заболеваний соединительной ткани на основе идентификации транскрипционных генов и установление их связи с чувствительностью к заболеваниям, особенностям клинического течения и эффективности проводимой терапии».

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

В исследование включено 148 больных РА, средний возраст 53,75±13,11 лет, из них 135 женщин (91,2%). Средняя продолжительность заболевания 8,59±8,53 лет. Дебют суставного синдрома в основном приходится на средний возраст. К моменту включения в исследование преобладала поздняя стадия РА (71%). Серопозитивными по ревматоидному фактору (РФ) были 84,5%, при этом средняя концентрация РФ в сыворотке всех пациентов составила 206,22±202,01 Ед/мл. Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) определялись в сыворотке 82,4% пациентов. По степени активности воспаления распределение пациентов составило: низкая (DAS285,1) – 99 пациентов (66,9%), при этом средний индекс DAS28 составил 5,6±1,22 балла. Пациенты в состоянии ремиссии в исследование не включались. У 38, % больных рентгенологически определялась третья стадия. 85,8% больных были ограничены в выполнении профессиональных и непрофессиональных обязанностей (II и III ФК). Среднее значение индекса HAQ составило 1,63±0,71. Системные проявления РА имели 87 пациентов.

К моменту включения в исследование 61 пациент (41,2%) не получал базисной противовоспалительной терапии, из них 26 больных принимали пероральные глюкокортикоиды (17,6%). На неделе 0 всем пациентам была начата БПВТ в случае ее отсутствия, произведена смена, усилена или подобрана комбинированная при неэффективности предыдущего подхода лечения. 25 пациентам была назначена ГИБТ инфликсимабом 3 мг/кг массы тела по установленной схеме.

Динамическое наблюдение с исследованием сывороточного уровня цитокинов произведено у 92 пациентов. В исследование полиморфизма генов цитокинов с оценкой эффективности БПВТ (метотрексат или сульфасалазин) включено 104 пациента.

Характеристики выделенных групп сопоставимы с общей группой.

В качестве контроля содержания цитокинов и иммунологического контроля использованы группы практически здоровых жителей Сибирского региона европеоидного происхождения (39 и 297 человек соответственно).

Клиническая оценка интенсивности суставного синдрома включала стандартные методы подсчета числа болезненных и припухших суставов, оценку продолжительности утренней скованности в минутах, уровень боли по ВАШ. Для количественной оценки активности РА использовался модифицированный индекс DAS28 (Prevoo M. и соавт., 1995). Функциональный статус оценивался по Стэнфордскому опроснику состояния здоровья HAQ (Fries J. и соавт., 2003). Оценка эффективности терапии проводилась по критериям EULAR (Prevoo M., 1995; Fransen J., 2004).

Количественное определение С-реактивного белка в сыворотке крови, Еселектина, РФ, АЦЦП осуществлялось методом твердофазного ИФА – ELISA.

Содержание в сыворотке 9 цитокинов TNF-, IFN-, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL- (p70), IL-13, GM-CSF оценивали методом проточной флюориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-PlexTM 2000 System (Bio-Rad, США).

Измерения проводились в 25 мкл сыворотки. Диапазон измерений составлял 0,1- пг/мл. При статистической обработке значения цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимали за 0,02 пг/мл.

Исследование 7 полиморфизмов, локализованных в промоторных регионах генов интерлейкинов, проведено с использованием метода рестрикционного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ): TNFA С-863А - Bst BAI, TNFA G-308A Bsp19 I, TNFA G-238A - Msp I, IL1B T-31C - Alu I, IL6 G-174C - SfaN I, IL4 C-590T - Bme 18 I, IL10 C-592A – RsaI («СибЭнзим», Новосибирск).

Для математической обработки полученных данных использовали статистические компьютерные программы «STATISTICA 6.0», включая методы параметрического и непараметрического анализа. Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена.