На правах рукописи

ЧУРОВА

Мария Викторовна

АКТИВНОСТЬ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ НЕКОТОРЫХ

ФЕРМЕНТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И УГЛЕВОДНОГО

ОБМЕНА И РАЗМЕРНО-ВЕСОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

РЫБ СЕМЕЙСТВ ЛОСОСЕВЫЕ (SALMONIDAE) И

СИГОВЫЕ (COREGONIDAE)

Специальность 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Петрозаводск 2012

Работа выполнена в лаборатории экологической биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии Карельского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Немова Нина Николаевна

Официальные оппоненты:

Шпаков Александр Олегович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии Андреева Алла Михайловна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, заведующая Центром коллективного пользования «Молекулярные технологии» ИБВВ РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится 15 марта 2012 года в 15.00 на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.087.02 при Карельской государственной педагогической академии по адресу: 185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельской государственной педагогической академии (185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17).

Автореферат разослан " " февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н., доцент А.И. Малкиель

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Важнейшим метаболическим фактором, определяющим функциональную активность клеток различных органов и, соответственно, процессы роста и развития рыб, является уровень энергетического обмена. Достаточный уровень образования АТФ определяет активный рост и развитие организма рыб, особенно в период раннего онтогенеза, когда требуются большие энергетические затраты на синтез структурных, функциональных и запасных соединений. Поэтому в исследованиях взаимосвязи биохимических параметров с размерными характеристиками рыб и темпами их роста большое внимание уделяется изучению активности и экспрессии генов ферментов энергетического обмена, участвующих в процессах аэробного и анаэробного синтеза АТФ. Исследование биохимических и молекулярно-генетических параметров энергетического метаболизма проводится главным образом в белых мышцах рыб, т.к. они составляют значительную часть тела (около 60% веса) и, таким образом, во многом определяют особенности метаболизма всего организма и отражают темпы роста рыб (Goolish, Adelman 1987; Houlihan et al., 1993; Burness et al., 1999; Davies, Moyes, 2007; Savoie et al., 2008). Кроме того, активность ферментов гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи митохондрий, наряду с молекулярно-генетическими показателями – индексом РНК/ДНК и уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина, могут использоваться как индикаторы темпов роста и состояния рыб в исследованиях по изучению влияния различных условий на рост рыб. Например, эти показатели применяются при изучении влияния на рыб загрязнения окружающей среды, температуры, качества и количества пищи, паразитарной инвазии (Buckley et al., 1999; Overturf and Hardy, 2001; Imsland et al., 2006;

Caldarone, 2006; Dhillon R. et al., 2008; Vinagre еt al., 2008). Ряд работ в этом направлении посвящен также изучению механизмов регуляции активности ферментов у рыб разного размера, а именно исследованию взаимосвязи уровня экспрессии генов ферментов с активностью этих ферментов и массой тела (Yang, Somero, 1996; Burness et al., 1999; Davies, Moyes, 2007).

Рост рыб представляет собой сложный многофакторный процесс, определяющийся взаимодействием организма с абиотическими и биотическими факторами среды в процессе онтогенеза (Дгебуадзе, 1993, 2001; Павлов, 2010; Huss, 2009). В отличие от млекопитающих, рыбы растут в течение всей жизни. При этом особи одной когорты могут значительно отличаться размерами в зависимости от соотношения генетической и негенетической составляющих процесса их роста и влияния различных факторов среды. В связи с этим, линейные и весовые показатели, характеризующие размер особи, являются одними из наиболее изменчивых характеристик организма рыб. Изучение биохимических и молекулярно-генетических закономерностей и механизмов формирования изменчивости и дифференциации рыб по размерам позволит значительно расширить представления об особенностях процесса роста у рыб и способов его регуляции в различные периоды онтогенеза, на разных стадиях жизненного цикла и при влиянии экологических условий. Несмотря на значительное число работ в этой области, ряд вопросов остается неизученным. Так, недостаточно данных по оценке взаимосвязи процессов энергетического и пластического обмена в мышцах и печени с размерами (длиной и массой рыб). Не исследован характер взаимосвязи показателей друг с другом, возрастные и половые особенности этой зависимости, влияние антропогенного фактора. Таким образом, исследование особенностей и механизмов роста рыб и формирования размерной изменчивости на биохимическом уровне является одним из важных вопросов биохимии и физиологии рыб, популяционной биологии, экологии.

Цель работы - исследовать взаимосвязь между активностью ферментов энергетического и углеводного обмена белых мышц и печени, уровнем экспрессии ряда генов в белых мышцах и размерно-весовыми характеристиками рыб некоторых видов семейств Лососевые Salmonidae и Сиговые Coregonidae.

Задачи исследования:

1. Изучить взаимосвязь между активностью ферментов цитохром с оксидазы (ЦО), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), глюкозофосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), 1-глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ), альдолазы в мышцах и печени, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина (МyHC), показателем РНК/ДНК в мышцах и размерно-весовыми характеристиками особей различных видов лососевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращиваемой радужной форели.

2. Изучить возрастные и половые особенности взаимосвязи данных показателей с размерно-весовыми характеристиками рыб.

3. Сравнить характер взаимосвязи исследуемых показателей с размерно-весовыми характеристиками сигов, обитающих в водоемах с различной антропогенной нагрузкой.

4. Изучить взаимосвязь между уровнем экспрессии генов лактатдегидрогеназы субъединицы А (LDH-A), цитохром с оксидазы субъединиц I и IV (COX1 и СOX4) и активностью этих ферментов в мышцах у рыб разных размеров.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активность исследуемых ферментов энергетического и углеводного обмена, уровень экспрессии генов ферментов и тяжелой цепи миозина в белых мышцах и печени рыб изучаемых видов положительно коррелируют с длиной и массой их тела.

2. Изменение уровня экспрессии генов цитохром с оксидазы и лактатдегидрогеназы является одним из возможных механизмов регуляции активности этих ферментов при формировании размерного разнообразия рыб.

Научная новизна. Получены новые данные о взаимосвязи активности некоторых ферментов углеводного и энергетического обмена мышц и печени, уровня экспрессии генов MyHC, CОХ1, COX4, LDH-А и показателя РНК/ДНК мышц и печени с длиной и массой особей различных видов лососевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращиваемой форели, с учетом возраста и пола. Впервые проведено комплексное исследование взаимосвязи изучаемых показателей с массой и длиной сигов и при влиянии антропогенного фактора. Впервые определена взаимосвязь между уровнем экспрессии генов двух субъединиц цитохром с оксидазы и активностью этого фермента у рыб разных по размеру.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты и сделанные на их основании выводы расширяют существующие представления о биохимических и молекулярных механизмах и закономерностях процесса роста у рыб с учетом видового, возрастного, полового и экологического аспектов. Знание особенностей процесса роста рыб может служить основой для разработки точных, удобных физиолого-биохимических индикаторов роста рыб и оценки состояния их здоровья, что может быть использовано в мониторинговых исследованиях, определении ресурсного потенциала водоемов и развитии новых технологий аквакультуры. Результаты исследования могут быть использованы для разработки лекционных курсов по физиологии и биохимии рыб, экологической биохимии и энзимологии для студентов биологических факультетов ВУЗов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены в виде устных и стендовых докладов на российских и зарубежных конференциях: Всероссийской конференции с международным участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008); Международной научной конференции Arctic Frontiers 2009 “Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change” (Tromso, Norway, 2009); Международном симпозиуме 15th International Symposium on Pollutant Responses in Marine Organisms (Bordeaux, France, 2009); XXVIII Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера» (Петрозаводск, 2009); III Международной конференции с элементами школы для молодых учёных, аспирантов и студентов «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010);

Международной школе-семинаре для молодых ученых «Биологические ресурсы Арктики и Субарктики – потенциал для биотехнологии: исследования и инновации» (Петрозаводск, 2010); I научно-практической конференции молодых ученых ФГУП «ВНИРО» «Современные проблемы и перспективы изучения мирового океана» (Москва, 2011); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), Научной конференции и школе молодых ученых, посвященных 65-летию КарНЦ РАН «Фундаментальная и прикладная наука в Республике Карелия: современное состояние и перспективы развития» (Петрозаводск, 2011); Молодежном инновационном конкурсе "МИК - 2011" (Петрозаводск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 9 статей в других изданиях и 8 тезисов докладов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы, 62 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 235 источников, в том числе 186 работ зарубежных авторов.

Благодарности. Автор искренне благодарна научному руководителю член.-корр. РАН Н.Н. Немовой и научному консультанту к.б.н. О.В. Мещеряковой, сотрудникам лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации, а также О.П. Стерлиговой, Н.В. Ильмасту и сотрудникам лаборатории экологии рыб ИБ КарНЦ РАН за помощь при получении биологического материала и консультации. Автор выражает огромную благодарность сотрудникам группы молекулярной биологии ИБ КарНЦ РАН Л.В. Топчиевой и лаборатории популяционной биологии ФГУП «ВНИРО» Н.С. Мюге за консультации по методам молекулярно-генетических исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 08-04а, 11-04-00167-а), программы Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-306.2008.4, НШ-3731.2010.4, НШ-1642.2012.4, проекта программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга», 2009-2011 г. (рег. № 01200955241), гранта Правительства РФ (Постановление 220, ГК №11.634.31.0052, лаборатория молекулярной генетики врожденного иммунитета ПетрГУ, зав. лабораторией А.Н. Полторак).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы рассматривается роль аэробного и анаэробного энергетического обмена в процессах роста и развития рыб. Обобщены данные по взаимосвязи активности ферментов энергетического и углеводного обмена в органах рыб с темпами роста и размерами особей. Приведены сведения о регуляции активности ферментов на уровне транскрипции их генов при формировании размерного разнообразия. Представлены данные о молекулярно-генетических показателях, использующихся в оценке темпов роста рыб. Рассмотрены особенности роста рыб и механизмы формирования размерной изменчивости.

Материал исследования. В качестве объектов исследования были выбраны рыбы разных возрастных групп четырёх видов двух семейств Сиговые (Coregonidae) и Лососёвые (Salmonidae): естественных популяций, атлантический лосось Salmo salar L., обыкновенный сиг Coregonus lavareus L., ряпушка Coregonus albula L., а также искусственно выращиваемая радужная форель Parasalmo mykiss Walb. В зависимости от задач количество экземпляров в одной возрастной группе составило от 7 до 30.

Определение активности исследуемых ферментов. Активность ферментов определяли в белых мышцах и печени рыб. Ткань гомогенизировали в 0,01 М трис-HCl буферном растворе (рН 7,5). Общую активность ферментов лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27), малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49), 1-глицерофосфат-дегидрогеназы (КФ 1.1.1.8) определяли по общепринятым методам (Кочетов, 1980).

Активность альдолазы (КФ 4.1.2.13) определяли по методике Beck в модификации Ананьева и Обуховой (Колб, Камышников, 1976). Активность указанных ферментов выражали в мкмоль субстрата/мин/г ткани. Активность цитохром с оксидазы (КФ 1.9.З.1.) в мышцах и печени определяли по методу Смита (Smith, 1955). Активность ЦО выражали в k/г ткани, где k – константа реакции 1-го порядка. Содержание белка в тканях определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта БСА.

Определение концентрации нуклеиновых кислот. Тотальную РНК выделяли из белых мышц по Хомчински и Саччи (Chomczynski, Sacchi, 1987) с помощью набора «для выделения тотальной РНК Yellow Solve»

(Клоноген, С.-Петербург). ДНК белых мышц выделяли по методу Альанаби и Мартинеса (Aljanabi, Martinez, 1997). Концентрации РНК и ДНК определяли спектрофотометрически (спектрофотометр “SmartSpec Plus”, BioRad, США) (Маниатис и др, 1984).

Проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) (Силекс, Россия). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из препарата тотальной РНК с использованием MMLV-обратной транскриптазы и случайных гексонуклеотидов (набор «Синтез первой цепи ДНК», Силекс). Амплификацию проводили на приборе i-Cycler с оптической приставкой IQ5 (BioRad) с использованием реакционной смеси 2.5 х для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Синтол, Россия).

Праймеры к нуклеотидным последовательностям генов тяжелой цепи миозина (MyHC), цитохром с оксидазы субъединицы IV (COX4) и субъединицы I (COX1), лактатдегидрогеназы субъединицы А (LDH-A) и референсных генов фактора элонгации (EF-1) и -actin подбирали с помощью программы Beacon Designer 5.01 («Premier Biosoft», США). Концентрацию матричной РНК в виде кДНК определяли по стандартной кривой (Gahr et al., 2008). Данные выражались как отношение концентрации мРНК исследуемого гена к концентрации мРНК референсного гена.

Секвенирование. Для подтверждения того, что продукты амплификации кДНК являются фрагментами исследуемых генов, проводили секвенирование.

Реакцию секвенирования ПЦР-продуктов выполняли с использованием наборов реагентов GenomLabTM DTCS-Quick Start Kit (Beckman Coulter, Inc., США) и BigDye version 1.1 (Applied Biosystems, США). Продукты реакции секвенирования очищали от невключенных нуклеотидов с флуорофорами путем осаждения 96% этанолом. Разделение синтезированных фрагментов проводили методом автоматического капиллярного электрофореза в генетическом анализаторе Beckman Coulter CEQTM 8000 (Beckman Coulter, Inc, США) и ABI 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США) на базе ИБ КарНЦ РАН и ВНИРО. Для редактирования полученных последовательностей использовали программу ChromasPro (http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html). Полученные последовательности нуклеотидов сравнивали с базой данных NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Гомология полученных фрагментов с последовательностью генов из генетического банка была не ниже 96%.

Статистическая обработка данных. В работе использовали общепринятые методы статистической обработки данных с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics 2.5 for Windows. Сравнение выборок проводили с применением непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Cтепень влияния исследуемых факторов оценивали при помощи многофакторного дисперсионного анализа МANOVA.

Взаимосвязь исследуемых показателей с размерами особей и между собой оценивали при помощи линейной регрессии и корреляционного анализа (Коросов, Горбач, 2007).

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 1. Общие закономерности взаимосвязи исследуемых биохимических и молекулярно-генетических показателей с длиной и массой особей изучаемых видов рыб По результатам анализа взаимосвязи между исследуемыми показателями мышц и печени и размерно-весовыми характеристиками особей рыб разного возраста, выловленных в летний нагульный период, были установлены некоторые общие тенденции. Установлена положительная корреляция активности ферментов мышц аэробного обмена - ЦО и анаэробного обмена - ЛДГ с длиной и массой особей внутри одновозрастных групп рыб из естественных водоемов: молоди лосося, сига и ряпушки (табл. 1). Аналогичная закономерность была показана и для искусственно выращиваемой форели. Положительная связь активности этих ферментов с размерами рыб объясняется необходимостью поддержания высокого уровня аэробного и анаэробного энергетического обмена для обеспечения необходимым количеством АТФ основных процессов жизнедеятельности, в том числе процессов синтеза структурных, функциональных и запасных соединений в мышцах, которые интенсивно протекают у активно растущих особей, особенно в раннем онтогенезе (Houlihan et al., 1995; Savoie et al., 2008;

Gauthier et al., 2008). Установлена положительная корреляция массы рыб с активностью МДГ - фермента цикла трикарбоновых кислот, а также активностью альдолазы, характеризующей степень использования углеводов в гликолизе. Полученные результаты указывают на то, что более крупные особи имеют более высокие уровень аэробного и анаэробного обмена и степень использования углеводов в процессах энергетического метаболизма в мышцах рыб.

Корреляция активности ЦО (k/г) и ЛДГ (мкмоль субстрата/мин/г) мышц с длиной (AC) и массой особей у разных возрастных групп рыб Форель * - достоверные значения коэффициента корреляции при p < 0, ** - различия между возрастными группами достоверны при p < 0, белков в мышце и составляет 50% от количества всех мышечных белков (Watabe, Ikeda, 2006). Согласно ряду исследовательских работ уровень экспрессии гена MyHC коррелирует с темпами роста В печени значения коэффициенРис. 1. Зависимость уровня экспрессии гена MyHC в белых мышцах от тов корреляции активности ЦО с масмассы тела у лосося (А), сига (Б), сой одновозрастных рыб составили