На правах рукописи

ГЛУШКОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНЫХ

БИОПРОТЕЗОВ ДЛЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ

(экспериментальное исследование)

14.01.24 – Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Журавлева Ирина Юрьевна

Официальные оппоненты:

Семеновский Моисей Львович – доктор медицинских наук, профессор, заведующий кардиохирургическим отделением № 1 ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ Муратов Равиль Муратович – доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения неотложной хирургии приобретенных пороков сердца ФГБУ «Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева» РАМН

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «» _ 2012 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д.208.055.01 при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова»

Минздравсоцразвития РФ (123182, г. Москва, ул. Щукинская, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова»

Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан «_» октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.055. доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна Актуальность работы.

Для коррекции врожденных и приобретенных пороков сердца используют различные биологические протезы, изготовленные из аортального клапана свиньи и перикарда крупного рогатого скота. Наиболее распространенным консервантом для стабилизации биологической ткани остается раствор глутарового альдегида (ГА). Одной из основных причин дисфункций ГА-обработанных биопротезов является первичная тканевая несостоятельность, связанная с кальцификацией (Carrel T, 2004). Научная гипотеза, согласно которой структурные трансформации коллагеновой матрицы под действием ГА определяют способность биоматериала к накоплению кальциевых солей, привела к замене ГА на диглицидиловый эфир этиленгликоля (ДЭЭ), что, в свою очередь, способствовало снижению риска кальцификации биопротезов клапанов сердца у взрослых пациентов. Однако у детей частота развития кальцификации остается высокой, даже при использовании эпоксидной консервации (Латыпов А.К., 2005). Данная проблема требует поиска новых путей решения. В мировой практике известен клинический опыт применения соединений из класса дифосфонатов для антикальциевой обработки биоматериала, консервированного ГА (Webb C.L., 1988, Эльгудин Я.Л., 1992). Дифосфонаты являются аналогами пирофосфата – природного ингибитора кальция, и в иммобилизованном состоянии в значительной степени препятствуют кальцификации биоматериала (Connolly J.M., 2004). Применение дифосфонатов может оказаться перспективным для дополнительной обработки ДЭЭконсервированного биоматериала с целью максимального подавления его кальцийсвязывающей активности.

По результатам клинического применения биологических протезов была отмечена различная интенсивность кальцификации биоматериалов, в зависимости от тканевой принадлежности. При реоперациях по поводу дисфункций клапансодержащих кондуитов, имеющих в своем составе перикард, створки аортального клапана (АК) и стенку аорты, кальциевые депозиты отмечены в основном в стенке аорты, реже – в створках АК, перикардиальная часть практически всегда остается интактной (Акатов В.С., 2002). Данный факт послужил предпосылкой для изучения возможности использования ксеноперикарда в качестве основного биоматериала при изготовлении эпоксиобработанных биопротезов клапанов сердца и клапансодержащих кондуитов.

Использование ксеноперикарда при моделировании кардиоваскулярных биопротезов ставит перед производителями проблему точности воспроизведения каждого элемента при раскрое. Использование как стандартных режущих инструментов (скальпеля, ножниц), так и вырубных матриц приводит к отклонению от формы лекал, что усложняет процесс моделирования биопротеза. Кроме этого, возможны краевые надсечки, являющиеся негативным фактором для клапана, функционирующего в условиях длительной циклической нагрузки. В настоящее время для высокоточного раскроя различных материалов небиологического происхождения используют лазерные технологии (Вейко В.П., 2001). В связи с этим представляется перспективным применить лазерные технологии для раскроя биологического материала.

Потенциальная устойчивость ксеноперикарда к кальцификации, выявленная в клинической практике, нуждается во всестороннем экспериментальном подтверждении. Представляется целесообразным создание клапанных биопротезов из эпоксиобработанного ксеноперикарда. Кальций-связывающая активность данного биоматериала может быть дополнительно снижена модификацией 3-амино-1-оксипропилидендифосфоновой кислотой. Использование лазерных технологий может явиться перспективным подходом в разработке методов высокоточного раскроя ксеноперикарда при создании кардиоваскулярных биопротезов.

Цель исследования: обосновать в эксперименте применение новой технологии антикальциевой обработки и лазерного раскроя при изготовлении ксеноперикардиальных эпоксиобработанных биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии.

Задачи исследования:

1. Выполнить сравнительную оценку кальций-связывающей активности перикарда крупного рогатого скота, стенки аорты и створок аортального клапана свиньи, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля;

2. Оценить влияние иммобилизованной 3-амино-1-оксипропилидендифосфоновой кислоты на кальций-связывающую активность эпоксиобработанных биоматериалов различной видовой и тканевой принадлежности;

3. Изучить влияние антикальциевой обработки на структуру, физикомеханические свойства и гемосовместимость биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля;

4. Оценить воздействие излучения различных лазеров на структуру биоматериала в области среза. Выбрать оптимальные параметры лазерного излучения для создания промышленной установки картирования и раскроя биоматериала.

Новизна исследования:

Впервые проведена оценка сшивающей активности диглицидилового эфира этиленгликоля в отношении стенки аорты.

Впервые проанализирована в сравнительном аспекте кальций-связывающая активность перикарда крупного рогатого скота, створок аортального клапана и стенки аорты свиньи, консервированных глутаровым альдегидом и диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые исследован антикальциевый эффект 3-амино-1-оксипропилидендифосфоновой кислоты, иммобилизованной на биоматериале, консервированном диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые изучено воздействие 3-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновой кислоты на структуру, физико-механические свойства и гемосовместимость биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Впервые изучена возможность использования лазерных технологий для раскроя эпоксиобработанного биоматериала.

Впервые в мировой практике лазерное излучение применено для раскроя ксеноперикарда при изготовлении кардиоваскулярных биопротезов.

Практическая значимость работы. Экспериментально обоснован выбор биоматериала для изготовления кардиоваскулярных биопротезов с низкой кальцийсвязывающей активностью. Разработан способ антикальциевой модификации биоматериала, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Определены оптимальные режимы лазерного излучения для раскроя биоматериала при моделировании кардиоваскулярных биопротезов из ксеноперикарда. На основе полученных результатов совместно с Институтом лазерной физики Сибирского отделения РАН созданы установки «МЕЛАЗ» и «МЕЛАЗ-1» для раскроя биоматериала.

Разработанные технологи антикальциевой модификации и лазерного раскроя биоматериала внедрены ЗАО «НеоКор» (Россия) в серийное производство ксеноперикардиальных биопротезов клапанов сердца с 2008 г (Протез клапана сердца ксеноперикардиальный биологический консервированный монтированный на гибком опорном каркасе «ЮниЛайн» по ТУ 9444-010-57628698-2008).

Положения, выносимые на защиту:

1. Перикард крупного рогатого скота и створки аортального клапана свиньи, консервированные диглицидиловым эфиром этиленгликоля, обладают более низкой кальций-связывающей активностью, по сравнению с эпоксиобработанной стенкой аорты свиньи.

2. 3-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновая кислота в иммобилизованном состоянии достоверно снижает кальций-связывающую активность перикарда крупного рогатого скота и створок аортального клапана свиньи, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

3. Использование лазерного раскроя ксеноперикарда делает процесс изготовления кардиоваскулярных биопротезов более технологичным. В качестве активной среды лазера для раскроя ксеноперикарда могут быть использованы алюмоиттриевый гранат, легированный эрбием, и углекислый газ.

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 19 работ в журналах, материалах научных съездов и конференций (из них 2 статьи в журналах, рецензируемых ВАК), а также получен патент РФ на изобретение. Список прилагается.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Региональной научно-практической конференции с Международным участием «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой хирургии» (Кемерово, 2006 г), где автор заняла I место на конкурсе молодых ученых с работой «Обоснование новой модели ксеноперикардиального клапансодержащего кондуита», на XIII и XVI Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007, 2010 гг.), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010 г), Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» совместно с V Международным симпозиумом по эхокардиографии и сосудистому ультразвуку, XVII ежегодной научно-практической конференцией «Актуальные вопросы кардиологии» (Тюмень, 2010 г). Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой патологии» (Кемерово, 2010 г).

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и практических рекомендаций; содержит 3 таблицы, рисунок. Указатель литературы включает 189 работ, в том числе 102 зарубежные.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В настоящем исследовании был использован биоматериал, применяемый в производстве кардиоваскулярных биопротезов: перикард крупного рогатого скота (КРС), створки АК и стенка аорты свиньи. Базовую консервацию исследуемых образцов осуществляли: 0,625% раствором глутарового альдегида (Барбараш Л.С., 1995) (контрольная серия) и 5% раствором диглицидилового эфира этиленгликоля (патент РФ № 2008767).

Аминокислотный состав биоматериала, консервированного ДЭЭ (n=30) исследовали на автоматическом аминокислотном анализаторе «Hitachi-835» (Япония).

Данный раздел работы выполнен в ГУ НИИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ г. Москва (зав. отделом хроматографии, д.х.н. Л.А.Баратова).

Для антикальциевой модификации биоматериала, консервированного ДЭЭ, использовали 3-амино-1-оксипропилиден-дифосфоновую кислоту (АОПДФК). Дифосфонат синтезирован в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН (г. Новосибирск). Модификацию образцов проводили в одну и четыре стадии 0,15% раствором АОПДФК, приготовленным на 0,9% растворе хлорида натрия при комнатной температуре. При одностадийной обработке образцы помещали в раствор АОПДФК на 4 ч с последующей отмывкой от несвязанного дифосфоната и помещением в консервант.

При четырехстадийной модификации образцы помещали в раствор АОПДФК на 3 ч, после чего переносили в консервирующий раствор на 12 ч. Данный процесс повторяли 4 раза, перед последним помещением в консервант образцы биоматериала отмывали от несвязанного дифосфоната.

Количество дифосфоната, иммобилизованного на биоматериале в процессе модификации в 1 и 4 стадии, оценивали микрометодом Бартлета по количеству дифосфонатного фосфора. Для контроля использовали образцы с базовой консервацией (n=60). Оптическую плотность проб измеряли на кинетическом спектрофотометре UV/VIS Ultraspek Plus (LKB-Pharmacia) (=830 нм). Концентрацию фосфора в пробе определяли по калибровочному графику, построенному в интервале 1-10 мкг.

Кальций-связывающую активность биоматериала, в зависимости от базовой консервации и дополнительной модификации, изучали на стандартной модели ускоренной кальцификации, путем подкожной имплантации исследуемого материала крысам-самцам субпопуляции Wistar. Для сравнительного анализа антикальциевой эффективности при обработке в 1 и 4 стадии количество кальция определяли на 60 и 90 сутки после имплантации. Для оценки пролонгированного действия АОПДФК обработку биологического материала осуществляли в одну стадию. Срок имплантации биоматериала составил 60, 120 и 180 суток. Количество кальция определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра «Perkin Elmer»-5100 (USA), расчет производили на 1г сухой ткани (n=920). Количество накопленного кальция оценивали относительно уровня неимплантированного биоматериала.

Исследования физико-механических свойств биоматериала в сравнительном аспекте после базовой консервации и антикальциевой модификации (n=200) выполнены совместно с лабораторией химии и технологии материалов для сердечнососудистой хирургии НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (г. Москва) (руководитель лаборатории – профессор С. П. Новикова). В качестве второго контроля использовали нативный биоматериал. Испытания проведены на универсальной испытательной машине «Zwick/roell»-2.5Н (Германия), в условиях одноосного растяжения образцов, в соответствии с ГОСТ 270-75. При оценке физико-механических свойств биоматериала учитывали показатели прочности и упруго-деформативных свойств.

Влияние модификации АОПДФК на гемосовместимость эпоксиобработанного биоматериала оценивали in vitro в сравнительном аспекте с ксеноперикардом, консервированным ГА, ДЭЭ и с эпоксиобработанным ксеноперикардом, модифицированным нефракционированным гепарином (НФГ), выбранным в качестве материала с доказанной высокой гемосовместимостью (Кудрявцева Ю.А., 2010).

Агрегацию тромбоцитов оценивали после контакта образцов с кровью в течение 3 мин. Агрегацию индуцировали раствором АДФ с концентрацией 1,25 мкг/мл.

Скорость (%/мин) и максимум (%) агрегации тромбоцитов измеряли на полуавтоматическом анализаторе АРАСТ 4004 (LABiTec, Германия). В качестве контроля использовали показатели агрегации тромбоцитов, не имевших контакта с поверхностью биоматериала (n=60).

Тромбогенность биоматериала оценивали по динамике пристеночного тромбообразования, используя экспресс-метод, разработанный С.П. Новиковой с соавторами 1991г., модифицированный для плоских объектов (Кудрявцева Ю.А., 1997). Время контакта образцов с кровью составило 20, 40 и 60 мин (n=180).

Цитотоксичность оценивали по величине гемолиза, индуцированного биоматериалом. Исследуемые образцы (n=60) инкубировали в растворе 0,9% NaCl при 370С в течение 120 мин, затем добавляли 200 мкл свежей цитратной крови, и повторно инкубировали 60 мин. После этого раствор центрифугировали и измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре.

Структуру биоматериала исследовали методом световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизон (n=75).

Гистологические препараты исследовали с помощью микроскопа МИКМЕД- («ЛОМО», Санкт-Петербург), при увеличении х100 и х400.

Методом световой микроскопии было изучено влияние модификации АОПДФК на структуру эпоксиобработанного перикарда КРС и створок АК. Также методом световой микроскопии исследовали влияние способа раскроя на структуру биоматериала в зоне среза.

Для раскроя использовали перикард КРС, консервированный ДЭЭ. Раскрой производили стандартными хирургическими инструментами – ножницами и скальпелем, а также вырубной матрицей и лазерами с различными параметрами излучения.

Использовали лазеры на алюмоиттриевом гранате, легированные неодимом (Nd:YAG) и эрбием (Er:YAG), генерирующие излучение на длинах волн 1,06 и 2, мкм, соответственно, и газовый углекислотный лазер (СО2-лазер) с длиной волны генерации 10,6 мкм.

Обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами статистики при помощи пакета прикладных программ для обработки медицинской и биологической информации «STATISTICA 6.0» (StatSoft,Inc., USA). Все данные представлены как средние значения (М) и стандартная ошибка среднего (±m). Характер распределения определяли при помощи критерия Колмогорова – Смирнова. При нормальном распределении переменных для определения различий между двумя независимыми группами использовался t-критерий Стьюдента, а при неправильном распределении – непараметрический критерий Манна-Уитни. В случае множественных сравнений проводили попарно сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни, применяя поправку Бонферрони при оценке значения р. Достоверными считали различия при уровне значимости р стенка аорты (92%). В связи с этим можно предполагать, что прочностные характеристики стенки аорты будут ниже, чем у створок АК и ксеноперикарда.

Известно, что поперечные связи с OH-Lys и Lys являются основным субстратом для образования интра- и интермолекулярной сшивки коллагена при консервации, предотвращая ферментативный лизис биоматериала после имплантации и сохраняя удовлетворительные физико-механические свойства (Барбараш Л.С. с соавт., 1995; Журавлева И.Ю. 1995).

Количественные показатели сшивки стенки аорты по His более чем в 1,4 раза уступают, а по Tyr в 1,2 раза превосходят показатели сшивки по данным аминокислотам для створок АК и ксеноперикарда. Сшивка по Met характерна только для перикарда КРС.

По-видимому, качественные и количественные различия сшивки коллагена эпоксиобработанной стенки аорты, створок АК и ксеноперикарда обусловлены различным количественным соотношением коллагеновых и эластиновых волокон в составе данных видов биоматериала. Это может, в свою очередь, отражаться на трансформациях, протекающих в стенке аорты после имплантации в организм реципиента.

Сравнительная оценка физико-механических свойств биоматериала, консервированного ДЭЭ По результатам исследования были выявлены отличия физико-механических свойств нативной стенки аорты от створок АК и ксеноперикарда, обусловленные различиями состава данных видов биоматериала (рис. 1). Прочность стенки аорты достоверно ниже, а относительное удлинение выше (р0,05). Все виды биоматериала различались между собой по модулю Юнга (р перикард КРС > стенка аорты.

Рис. 1. Физико-механические свойства биоматериала: нативного и консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля (ДЭЭ). * – р0,05), однако оказала влияние на упруго-деформативные свойства. Относительное