«Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях Москва-Звенигород 5-10 дек~ 0бря 2011 а~ Учреждение российской академии наук институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН ...»

Вопрос о том, как генетический материал разных видов и родов взаимодействует, находясь в одном полиплоидном ядре, волнует уже не первое поколение исследователей. На сегодняшний день известно, что в основе коадаптации разных геномов в одном ядре лежат значительные генетические и эпигенетические изменения. У аллополиплоидов часто наблюдается элиминация, а в более редких случаях, наоборот, появление новых фрагментов генома. Помимо структурных изменений у аллополиплоидов наблюдается изменение экспрессии генов вплоть до полной супрессии одного из гомеологов. У искусственно созданных аллотетраплоидов и аллогексаплоидов широко распространено явление транскрипционного доминирования. В основе изменения экспрессии генов у аллополиплоидов могут лежать следующие причины: необходимость нормализации уровня экспрессии, дисбаланс энхансеров и видоспецифичность транскрипционных факторов. Особенности структурно-функциональной организации генов растений в аллополиплоидном геноме требуют модификации подходов, разработанных для анализа генома диплоидных видов растений. Такой комплексный модифицированный поход, примененный для исследования молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе формирования признаков окраски у аллогексаплоидной пшеницы, позволил установить, что гомеологичные копии структурных генов (кодирующих ферменты биосинтеза флавоноидных пигментов) характеризуются более схожими между собой паттернами экспрессии по сравнению с гомеологичными копиями регуляторных генов (кодирующих транскрипционные факторы). В отличие от диплоидных видов растений, у которых к изменению фенотипа по признакам окраски могут приводить мутации не только в регуляторных, но и структурных генах биосинтеза флавоноидных пигментов, у аллогексаплоидной пшеницы фенотип по признакам окраски определяют именно регуляторные гены, эволюционирующие быстрее структурных генов. У аллогексаплоидной пшеницы при возникновении функциональной мутации в одной из копий структурного гена биосинтеза флавоноидов окрашенный фенотип сохраняется, благодаря компенсирующей роли гомеологичных копий мутантного гена.

Образование химерных побегов при получении генетически трансформированных Хоанг Тхи Жанг1, Ралдугина Г.Н.2, Калашникова Е.А. Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева, ул.

Тимирязевская, 49, Москва, Россия, 127550.

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Ботаническая ул., д.35, 127276, Москва, Россия email: [email protected] В настоящее время трансформация растений является главным направлением исследований в биологии растений и является ключевым практическим методом для улучшения культур. Она позволяет решать коренные задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции. Однако при трансформации растений возникают огромные трудности, в том числе связанные с повышением частоты получения трансформантов, среди которых часто возникают химеры.

Это явление очень затрудняет дальнейшую работу с полученными трансформированными растениями. Поэтому для создания генетически однородных растений-трансформантов очень важно знать, в каких случаях образуются химерные растения, чтобы исключить причины их образования. Целью нашей работы было выяснение зависимости образования химерных растений-трансформантов от типа первичного экспланта и исследуемого генотипа. Трансформацию проводили на семядольных и листовых эксплантах двух сортов рапса (Вестар и Подмосковный) с помощью Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0, содержащую генетическую конструкцию с маркерным геном gfp. Флуоресценцию GFP наблюдали в флюресцентном микроскопе или лупе при освещении его синим светом (440нм). При проведении ПЦР-анализа семенного поколения растений-трансформантов установлено, что у 70 % линий наблюдается значительное отклонение расщепления от ожидаемого расщепления по менделевской наследственности для единого признака. Кроме того, для некоторых линий формирование трансгенных потомков не было получено, хотя у растений Т0 после проверки микроскопическим анализом и ПЦР было показано наличие и экспрессия гена gfp. Особенно сильно это проявлялось на семенах растенийтрансформантов, полученных из листовых эксплантов. Мы предполагаем, что такие трансгенные растения с неменделевским наследованием гена были химерными, т.е. их ткани содержали как трансформированные, так и нетрансформированные клетки. Этот феномен может быть результатом происхождения растений не из одной клетки, а из группы клеток первичного экспланта рапса и последствием защиты нетрансформированных клеток от действия селективного фактора трансформированными клетками.

Работа частично поддержана грантом РФФИ 09-08- Высокоэффективная экспрессия рекомбинантных белков в растениях: проблемы и Шелудько Ю.В.1, Герасименко И.М.1, Голденкова-Павлова И.В. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Украина, 03680, Киев, ул. Заболотного 148, e-mail: [email protected] Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, ул. Губкина 3, г. Москва, 119991, Россия По сравнению с другими экспрессионными системами, растения имеют ряд преимуществ, касающихся, прежде всего, белков эукариотического происхождения:

обеспечивают большинство посттрансляционных модификаций, необходимых для нормальной биологической активности белка; растительные системы экономичны и могут гарантировать фактически неограниченный источник материала; риск загрязнения бактериальными токсинами или потенциальными патогенами человека минимален, поэтому стадия очистки продукта может быть исключена (съедобные вакцины);

аккумулирование белков в различных тканях растений или направление продуктов экспрессии во внутриклеточные компартменты повышает их стабильность.

Основным препятствием при использовании генетически- модифицированных растений для биотехнологического производства является часто низкий уровень накопления целевого белка, что может объясняться влиянием внутриклеточных систем регуляции на разные стадии экспрессии трансгена, а также действием протеиназ на конечный продукт. Поэтому селекция стабильно высокопродуктивной линии представляет сложный и трудоёмкий процесс, основанный на долгосрочном анализе множества событий трансформации. Для улучшения экспрессии трансгена были разработаны подходы, оптимизирующие процесс на каждой из стадий: трансформации и интеграции, транскрипции, трансляции и аккумуляции конечного продукта. Они включают в себя выбор экспрессионного вектора, растения-хозяина и метода переноса трансгена, адаптацию трансгена для эффективной транскрипции и трансляции в данном биохимическом окружении, создание селекционно-репортерной схемы анализа трансформантов, защиту конечного продукта от действия протеаз и блокирование сайленсинга. Учёт всех вышеперечисленных факторов позволяет добиться кумулятивного эффекта.

Среди множества современных стратегий получения рекомбинантных белков можно отметить разработку протоколов для транзиентной экспрессии, которая происходит без интеграции чужеродной ДНК в геном растения. Преимуществом этого метода является возможность быстрого получения значительных количеств продукта в отдельных органах или тканях без необходимости регенерации трансгенного растения.

Другой подход - создание экспрессионно-селекционной системы, которая включает гибридный ген целевого и репортерного белка, такого как термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum. В ряде случаев показано отсутствие влияния репортера на физиологическую активность слитого с ним целевого белка, а определение его собственной активности проводится после температурной денатурации ферментов растения. Это позволяет одновременно с накоплением целевого продукта проводить мониторинг его количества, а также может увеличивать стабильность конечного продукта.

Работа выполняется при поддержке гранта НАНУ УкрИНТЭИ № 0110U006062 и № 0110U006062, а также ГФФИ Украины-РФФИ, грант F40.4/021.

Экспериментальные модели для создания растений устойчивых к стрессовым Шимшилашвили Х.Р.1, Юрьева Н.О.2, Шаяхметова Д.М.1, Голденкова-Павлова И.В. УРАН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991, Россия, Москва, Губкина УРАН Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева,127276, Россия, Москва, ботаническая Для создания устойчивых форм растений используют стратегию, которая включает несколько этапов. Первоначально проводят поиск и отбор организмов, которые способны к росту и развитию в экстремальных условиях действия стрессовых факторов. Далее, идентифицируют и клонируют гены, продукты которых обеспечивают такую устойчивость, с последующей экспрессией клонированных генов в модельных организмов и проверкой их на устойчивость к стрессам.. Положительные результаты дают основание использовать эти гены для получения устойчивых к стрессам хозяйственно-важных культур. Основные трудности при использовании этой стратегии, в большинстве случаев, связаны с определением белкового продукта исследуемого гена или его функциональной активности, поскольку большинство продуктов клонированных генов либо не имеют ферментативной активности либо их ферментативную активность можно определять, используя сложные методы исследования. Цель работы – разработать новый подход для конструирования экспериментальных моделей с целью дальнейшего создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам. Этот подход основан на конструировании гибридных генов, в которых целевой ген имеет трансляционное слияние с последовательностью репортерного гена, кодирующего термостабильную лихеназу.

В работе в качестве целевого гена выбран ген desA цианобактерий, кодирующий 12десатуразу. Этот белок участвует в образовании двойных связей в молекулах жирных кислот мембранных липидов. За счет этого может изменяться текучесть мембран клетки.

В ходе исследований сконструированы нативный desA и гибридный desA-licBM3.

Продемонстрировано, что в составе гибридного белка DesA-LicBМ3 десатураза сохраняет способность катализировать введение двойной связи в жирные кислоты как в про- (E.coli), так и в эукариотах (растения картофеля)..

Показано, что гетерологичная ацил-липидная десатураза эффективно экспрессируется в трансформантах растений, стимулирует биосинтез мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенных ЖК, что коррелирует с увеличением устойчивости трансформантов к пониженным температурам и фитопатогенам..

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ (10-04-90054-Бел_а) Новый подход к изучению эффективности арбускулярной микоризы: применение мутантов Medicago lupulina с нарушениями в развитии симбиоза Юрков А.П.1,2, Якоби Л.М. Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, 196608, Россия, Санкт-Петербург, Пушкин, ш. Подбельского, 3, [email protected] Российский государственный гидрометеорологический университет, 195112, Россия, СанктПетербург, Малоохтинский пр., Арбускулярная микориза (АМ) – наиболее широко распространенная в природе и экологически значимая микробно-растительная ассоциация. В ее образовании участвуют Гломеромицеты и более 80% всех наземных растений. АМ оказывает существенное положительное влияние на рост и минеральное (особенно фосфорное) питание растений.

Для решения практических задач, связанных с повышением продуктивности растений за счет симбиотической активности АМ необходимо знание основ тех процессов, которые управляют ее становлением и функционированием. Основные исследования в области симбиогенетики АМ были сконцентрированы на выявлении растительных генов, контролирующих образование АМ на разных этапах онтогенеза: получены индуцированные мутанты бобовых культур, таких как горох посевной, бобы конские, лядвенец японский, люцерна стволовидная и спонтанные мутанты небобовых культур, таких как томат и кукуруза. С их помощью установлены основные этапы становления АМ.

Мутанты бобовых растений по АМ-симбиозу были отобраны путем скрининга коллекции мутантов по ризобиальному симбиозу. Однако этот способ получения мутантов по АМсимбиозу не дает полного представления о генетическом контроле растений за образованием АМ, т.к. исключает выявление генов растений, специфичных для АМсимбиоза. Полученные линии оказались хорошо адаптированными к условиям низкого уровня доступного для питания растений фосфора (Рд) в почве и при этом слабо микотрофными. По этой причине они не подходят для изучения механизмов симбиотической эффективности АМ. Для решения проблемы коллективом авторов впервые в качестве объекта для получения мутантов с дефектами по АМ-симбиозу выбрано сильно микотрофное растение люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L.) и разработаны методические подходы для отбора симбиотических мутантов из популяции мутагенизированных растений М2 (Юрков, Якоби, 2003-2011). Модельный объект – линия MlS-1 (от Medicago lupulina Spring) сортопопуляции ВИК32. Проведен отбор мутантов на селекционной среде – стерилизованной почве с низким Рд в условиях инокуляции АМгрибом Glomus intraradices. Получены четыре мутанта с признаками “карликовость” и “неспособность к образованию микоризы” (III-8-20-23-2-2-3 с Myc–-фенотипом АМ и XIIXII-32-5-50-2-3-5, XII-32-6-45-2-2-7 с Pen–-фенотипом), а также мутант с признаками “извилистый стебель” и “аморфные арбускулы” (XII-2-18-4-5-9-1 с Rmd–фенотипом АМ). Результаты фенотипического анализа растений в ряду 2-7 поколений показали стабильность наследования признаков у полученных мутантов (100% наследование).

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки, ГК №16.740.11.0344.

Эффективность использования радиационного излучения зоны отчуждения Чернобыльской АЭС при создании селекционно-ценного материала Якимчук Р.А.

Уманский государственный педагогический университет им. Павла Тычины, 20300, Украина, г. Умань, ул. Садовая, 2, [email protected] К нашему времени накоплен довольно значительный экспериментальный материал, который позволяет выделить для каждой культуры наиболее эффективные мутагены.

Однако многие из них обладают высокой токсичностью, индуцируют хозяйственнополезные мутации с очень низкой частотой. В связи с этим актуальным является поиск новых высокоактивных мутагенов, что позволяет повысить эффективность мутационного процесса и расширить его возможности. Поэтому важно изучать частоту и спектр селекционно-ценных признаков у растений, что произрастали в радиоактивно загрязненной зоне отчуждения ЧАЭС, подвергаясь уникальным и неповторимым условиям облучения. Именно благодаря таким условиям облучения проявился очень сильный эффект индуцированного формообразования.

Выращивая озимую пшеницу разных сортов в год аварии на ЧАЭС и через 9, 13 и 20 лет после нее на радионуклидно загрязненной территории 30-км зоны отчуждения, было установлено, что среди типов мутаций, выявленных в М2 и М3, часто встречаются изменения по генам карликовости (карликовые и низкорослые формы). Такие мутации исключительно редко наблюдаются при спонтанной изменчивости и с низкой частотой – при индуцированном мутагенезе. Анализ частоты и спектра мутаций свидетельствует о влиянии радионуклидных загрязнений на изменчивость не только качественных, но и количественных признаков, включая признаки по элементам продуктивности, а также признаки, связанные с изменением физиологического состояния роста и развития растений – сроками созревания, устойчивостью к стрессовым условиям среды и др.

С целью детального изучения количественных изменений, что сопровождают мутации по генам карликовости, был проведен структурный анализ растений выделенных форм по показателям продуктивности. Установлено, что большинство показателей структуры урожая мутантных семей существенно ниже, чем у исходной формы. Однако такие показатели, как продуктивная кустистость и масса 1000 зерен, находятся на уровне контроля. Это свидетельствует о том, что данные мутантные формы вследствие наследственных изменений не утратили продуктивного потенциала и заслуживают на дальнейшее изучение.

Такой тип мутаций, как карликовость, может быть эффективно использован в селекционной практике как во время отбора отдельных мутантных линий, так и в гибридизации как донор данного генетически ценного признака.

В результате многолетних опытов создана чернобыльская коллекция озимой мягкой пшеницы (T. aestivum L.), растения которой являются ценным генетическим материалом для создания современных сортов. Отдельные линии с данной коллекции могут быть использованы в агрономических опытах как доноры генов белковости, зимоустойчивости, карликовости, устойчивости к засухе и разным патогенам.

Работа выполнена в отделе генетического улучшения растений Института физиологии растений и генетики НАН Украины.

Разработка программного обеспечения для анализа кариотипа после дифференциального окрашивания и флуоресцентной in situ гибридизации Яковин Н.А.

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А.

Тимирязева», 127550, Россия, Москва, Тимирязевская ул., д. 49, [email protected] Разработано универсальное программное обеспечение «NickMesuare» для анализа фотографий хромосом живых организмов. В программе реализован механизм ручного выделения контуров хромосом и разноокрашенных участков на них, с последующим автоматической сортировкой хромосом по длине, центромерному индексу и содержанию разноокрашенных областей и автоматической разбивкой на пары (рис. 1). Ручное выделение контуров обеспечивает возможность анализа препаратов любого качества, что особенно важно при научно-исследовательской работе.

Рис. 1. Интерфейс программы NickMesure.

Количество типов разноокрашенных областей не ограничено. Автоматическая сортировка может корректироваться вручную. Программа автоматически строит идиограммы, на которых отображаются дифференциально окрашенный области, а также таблицы с подробными статистическими данными как в относительных, так и в абсолютных величинах: длины хромосом и их плеч, центромерного индекса, типа хромосомы по центромерному индексу. Кроме того программа строит таблицу длины и положения относительно центромеры всех участков разноокрашенных областей.

Программа создана в среде программирования Delfi 7 (Borland Software Corporation), с использованием стандартных компонентов. Она имеет классический интерфейс приложений для Windows, который сделан максимально простым и интуитивно понятным и не требует специального обучения пользования программой, являясь таким образом, универсальным и простым в использовании инструментом для анализа кариотипов как после классического, так и после дифференциального окрашивания, флуоресцентной и геномной in situ гибридизации.

2-я Международная школа-конференция молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях»

Х.Р. Шимшилашвили, Н.А. Боголюбова, И.Н. Бердичевец ~ 81 ~