«Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях Москва-Звенигород 5-10 дек~ 0бря 2011 а~ Учреждение российской академии наук институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН ...»

Нами получены две линии мягкой пшеницы, сочетающие транслокацию 1BL.1RS с пшенично-ржаным замещением хромосом. Для этого две пшенично-ржаные замещенные линии 5R(5A) и 5R(5D) сорта Саратовская 29 (С29) были скрещены с линией Л2075, несущей транслокацию 1BL.1RS, любезно предоставленной С.Н. Сибикеевым (Саратов). В полевых условиях 2004-2010гг. проводили отбор растений F2-6 на устойчивость к патогенам и фенотипирование растений на присутствие чужеродного замещения хромосом по наличию опушения колосоножки, характерной для хромосомы 5R ржи. В каждом поколении высевали не менее 100 зерен от двух-четырех исходных. Среди гибридных популяций в F6 Л2075ЧС295R(5A) и F6 Л2075ЧС295R(5D) были выделены несколько гомозиготных популяций с комплексной устойчивость к болезням и наличием опушения под колосом. Эти формы характеризуются высокой устойчивостью к бурой ржавчине и мучнистой росе по сравнению с линиями С295R(5A) и С295R(5D). На основе геномной in situ гибридизации (GISH) у растений F6 Л2075ЧС295R(5A) выявлено присутствие ожидаемой транслокации 1BL.1RS, при этом вместо целой хромосомы 5R ржи, заместившей хромосому 5A пшеницы, обнаружена 5RL-5AL.5RS транслокация.

Транслоцированная хромосома 5R ржи имеет в теломерной области длинного плеча фрагмент хромосомы 5А пшеницы. Показано, что сорта и линии с 1B/1R замещением или транслокацией имеют большую частоту хромосомных аберраций, кроме того, присутствие дополнительного генетического материала ржи стимулирует образование новых транслокаций у гибридных форм.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 10-04- Изучение коллекции исходного материала растений рода Brassica как источника генов устойчивости к вирусу мозаики турнепса (TuMV) Зубарева И.А., Грибова Т.Н., Игнатов А.Н.

Центр «Биоинженерия» РАН, 117312, г. Москва, проспект 60-летия Октября, дом 7/1, [email protected] Вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus - TuMV) относится к крупнейшей группе растительных вирусов семейства Потивирусы (Potyviridae). Вирус поражает все растения семейства Капустные (Brassicaceae), в том числе такие важные сельскохозяйственные культуры как масличный рапс (B. napus), капуста белокочанная (B.

oleracea), репа, турнепс (B. rapa), горчица. Эффективных мер борьбы с вирусными заболеваниями в настоящее время не существует. Естественная устойчивость растений является наиболее эффективным и экологически безопасным способом борьбы с вирусом.

Независимо от штамма вируса, при поражении растений происходит задержка в росте, ранняя дефолиация листьев, снижение товарного вида кочанных и салатных форм, что приводит к заметному снижению урожайности и экономическим потерям, поэтому необходимость в создании устойчивых форм представляется крайне актуальной задачей.

Целью нашей работы был поиск доноров генов устойчивости к вирусу мозаики турнепса в коллекции растений рода Brassica и изучение генетики устойчивости к вирусу TuMV.

Была сформирована коллекция растений семейства Brassicaceae из 64 образцов (хозяйственно-ценных и диких видов), включающая несколько видов: Brassica napus, Brassica rapa, Brassica oleracea, Brassica juncea. В качестве инфекционного фона использовали нескольких штаммов вируса мозаики турнепса, выделенных из зараженных растении Brassica rapa и Brassica oleracea. На базе ЭУИК (экспериментальная установка искусственного климата) было проведено заражение более 300 растений (64 образца в 4- кратной повторности).

Коллекцию растений механически инокулировали в фазе 3-4 настоящих листьев.

Для оптимального процесса инфицирования и развития (распространения) вирусной инфекции в растениях, в боксе ЭУИК поддерживали температуру +23-25 оС. Симптомы заболевания определяли визуально и оценивали по 10-ти бальной шкале с 7 дневным интервалом в течение 4 недель после инокуляции. Для подтверждения заражения растений искомым вирусом был проведен ИФА-анализ с использованием тест-системы.

По результатам оценки коллекции растений рода Brassica по устойчивости к вирусу TuMV нами было выделено 15 образцов, обладающих полной устойчивостью (на уровне 0баллов) ко всем четырем штаммам вируса. Устойчивость к трем штаммам вируса показали еще 8 образцов.

Отобранные образцы планируется использовать для изучения генетики устойчивости растений к потивирусам, а также для создания линий-дифференциаторов генов устойчивости к TuMV.

Работа выполнена при поддержке Государственного Контракта № 16.518.11.7036.

Изучение пшенично-ржаных замещенных линий по хромосомам ржи 1R в качестве доноров хозяйственно-ценных признаков в селекции мягкой пшеницы Кабаненко1 Ю.Н., Красилова2 Н.М., Силкова2 О.Г.

Новосибирский Государственный Аграрный Университет, 630039, Россия, г. Новосибирск, ул. Добролюбова, 160, [email protected] Государственное учреждение Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Россия, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, Пшенично-ржаные замещенные линии и линии с транслоцированными хромосомами являются потенциальным источником для передачи полезных агрономических качеств мягкой пшенице (Triticum aestivum L.) (Friebe et al., 1996; Rabinovich, 1998). Целью нашей работы являлось изучение пшенично-ржаных замещенных линий 1Ron(1A) и 1Rv(1A) в качестве доноров хозяйственно-ценных признаков, включая анализ характера передачи 1R при бэккроссировании. Ранее проведенная оценка Омским НИИСХ у линий качества зерна показала высокое содержание белка, клейковины, хорошие хлебопекарные качества, а также линии были устойчивы к заболеваниям. Нами проведена оценка растений на устойчивость к заболеваниям на инфекционном фоне, изучена их продуктивность и мейотическая стабильность. Линии 1Rv(1A), 1Ron(1A) и сорт Саратовская 29 (С29) (контроль) оказались восприимчивыми к бурой ржавчине (4 балла), к стеблевой ржавчине линия 1Ron(1A) была умеренно устойчива (MR), а сорт С29 и линия 1Rv(1A) чувствительны к данному патогену (S). Линия 1Ron(1A) превосходила сорт С29 по устойчивости к мучнистой росе (8 баллов), который проявлял среднюю устойчивость так же, как и линия 1Rv(1A) (6 баллов). По продуктивности линии не уступали сорту С29.

Изучение мейоза у линий показало их высокую цитологическую стабильность. Количество бивалентно спаренных хромосом на клетку составило 19,16, а открытых бивалентов и унивалентов на клетку - 1,7 и 0,13, соответственно.

Изучение характера передачи хромосомы 1R включало два этапа: анализ мейоза двойных моносомиков 1Rv-1A (1Rv(1A)xС29) и кариотипирование F2 поколения 1Rv-1A. Анализ поведения унивалентных хромосом в мейозе показал, что количество унивалентов на клетку составило 1,66. Унивалентные хромосомы 1Rv и 1A делились на хроматиды в АI (0.75 хромосом на клетку), а в AII разрывалась на плечи или оставались в цитоплазме. На стадии тетрад образовывалось 0,75 микроядер на клетку. Изучение кариотипов F поколения выявило, что такой тип поведения в мейозе приводит к элиминации хромосомы ржи и образованию различных трансформаций этой хромосомы. Обнаружено 44.44% растений с хромосомой 1Rv, 11.11% растений в своем кариотипе имели короткое плечо 1RS и 2.8% - транслокацию T1RS.1A. Полученные данные могут быть интересны для разработки более эффективных подходов в передаче чужеродного материала в геном мягкой пшеницы.

Работа выполнена при поддержке гранта «Фундаментальные исследования, выполненные совместно со сторонними научными организациями» интеграционный проект №129.

Использование рекомбинантной системы Cre-loxP для создания безмаркерных Кабардаева К. В., Камионская А. М.

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН, 117312 Россия, Москва, пр-т 60-летия Октября д.7, корп.1, [email protected] При создании трансгенных растений в качестве селективных генов чаще всего используются гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Несмотря на научнообоснованные доказательства их безопасности, выращивание растений с наличием таких генов связано с определенными рисками, связанными с горизонтальным переносом генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам к другим организмам. Таким образом, создание безмаркерных трансгенных растений является актуальной задачей.

Для достижения данной задачи наиболее часто применяется механизм «удаления»

маркерного гена, основанный на системе рекомбинации Cre-loxP бактериофага Р1. CreloxP система состоит из фермента рекомбиназы Cre и loxP сайтов, которые представляют собой два инвертированных повтора, разделенных ассиметричной последовательностью спейсера.

В лаборатории систем молекулярного клонирования Центра «Биоинженерия» РАН была сконструирована плазмида pGUS_CRE2 содержащая три кассеты экспрессии: NosPnptII-35ST, Ppr1a-Cre-NosT, фланкированные loxP сайтами в прямой ориентации, и 35SuidA-NosT. В качестве маркерного гена использовали ген устойчивости к канамицину nptII.

На следующем этапе изучали эффективность работы конструкции pGUS_CRE2 в трансгенных растениях. Конструкция pGUS_CRE2 была использована для агробактериальной трансформации Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum. В результате на селективной питательной среде, содержащей канамицин, было отобрано 6 трансформантов A. thaliana, 12 - N. tabacum и 8 растений S. tuberosum.

Трансгенный статус полученных растений был подтвержден методом полимеразно-цепной реакции. На следующем этапе трансгенные растения были микроклонально размножены и высажены на питательные среды, содержащие салициловую кислоту для индукции промотора Ppr1a. В дальнейшем планируется провести анализ эффективности элиминации маркерного гена nptII.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ГК № 16.518.11.7036.

Создание генетических конструкций для тканеспецифической экспрессии Казанцев А.А., Герасименко И.М., Кищенко Е.М., Мазур М.Г., Шелудько Ю.В.

Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, 03680, Украина, Киев, ул. Заболотного 148, e-mail: [email protected] Методы генетической инженерии позволяют вводить в геном растений гетерологическую генетическую информацию как с целью изменения природных характеристик растенияхозяина, так и для получения белков, представляющих интерес для человека.

Использование регуляторных элементов, обеспечивающих тканеспецифическую экспрессию трансгенов, позволяет, с одной стороны, ограничить накопление чужеродных белков отдельными органами растения, что снижает риск нежелательного воздействия этих белков на человека и окружающую среду. С другой стороны, экспрессия трансгенов в некоторых органах растений (например, в семенах) может привести к увеличению стабильности и, как следствие, содержания целевых белков. В ходе представленной работы планируется создание серии генетических конструкций для Agrobacteriumопосредованной трансформации растений, которые содержат промоторы и 5'нетранслируемые области, позволяющие проводить экспрессию целевых генов в семенах и тканях цветков. Эффективность и специфичность данных промоторов будет протестирована в различных видах растений.

Промоторная область гена развития цветов группы B apеtala3, который экспрессируется в цветочных меристемах, была амплифицирована методом ПЦР из генома A. thaliana. В этих тканях планируется проводить экспрессию генов ацил-липидных десатураз цианобактерий с целью защиты этих органов растений от повреждений при понижении температуры.

Поскольку при заморозках страдают также молодые корни, ген десатуразы desA (12) цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, слитый с репортерным геном термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum для облегчения селекции, был помещен под контроль корнеспецифического промотора гена mll, полученного методом ПЦР из генома сахарной свеклы.

Для проведения семяспецифической экспрессии были выбраны регуляторные области генов -кетоацил-CoA-синтазы и напина рапса (Brassica napus) и олеозина и напина Arabidopsis thaliana. Промотор гена напина арабидопсиса был синтезирован (GenScript, США), три других семяспецифических промотора были амплифицированы из геномов соответствующих видов методом ПЦР. Под контролем промотора гена напина рапса был помещен ген репортерного зеленого флуоресцентного белка (GFP) в генетической конструкции для Agrobacterium-опосредованной трансформации растений, созданной на основе pBIN19. Полученный вектор будет использован для изучения особенностей работы промотора гена напина рапса в разных видах растений. В дальнейшем под контроль семяспецифических промоторов будут помещены гены фармацевтически ценных белков для повышения уровня их накопления.

Работа выполнялась при поддержке гранта НАНУ УкрИНТЭИ № 0110U006062 и ГФФИ Украины-РФФИ, грант F40.4/021.

Получение гербицидустойчивых растений цикория Cichorium intybus L.

Кваско Е., Матвеева Н.

Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины 03680, Украина, Киев, ул Заболотного, 148, [email protected] Создание растений, устойчивых к гербицидам, является одним из ведущих направлений современной селекции. Такие растения могут быть получены с использованием биотехнологий. Разработаны способы создания гербицидустойчивых сельскохозяйственных растений методами генетической инженерии, в том числе с использованием бактерий Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes.

Целью данной работы было получение устойчивых к гербициду Баста растений цикория методом Agrobacterium-опосредованной трансформации.

Для определения селективной концентрации гербицида Баста семядольные экспланты растений цикория с предварительно сделанными насечками культивировали на среде МС с -нафтилуксусной кислоты и добавлением 1, 2, 4, 6, 8, 10 мг/л гербицида. Для трансформации использовали A. tumefaciens штамм GV3101 с векторной конструкцией рСВ125, Т-ДНК которой содержала гены bar (обеспечивающий устойчивость к гербициду Баста) и ifn– 2b (ген интерферона-2b человека). Семядольные экспланты 12-дневных проростков цикория с предварительно сделанными насечками кокультивировали в суспензии бактерии в течение 30 мин. После этого экспланты помещали на среду для регенерации, содержащей питательные элементы по Мурасиге и Скуга, а также 0,5 мг/л 0,05 мг/л -нафтилуксусной кислоты. После 2 суток культивирования без антибиотиков экспланты переносили на среду для регенерации, но с добавлением 600 мг/л цефотаксима для элиминации агробактерии. На данной среде экспланты культивировали в течение суток, после чего переносили на среду для регенерации с добавлением 600 мг/л цефотаксима и 1 мг/л гербицида Баста. Затем концентрацию гербицида повышали до концентрации 2 мг/л, которая была определена как селективная.

При использовании такой методики были получены устойчивые к гербициду Баста регенеранты цикория. Частота получения трансгенных растений составила 15 %.

Отобранные регенеранты были проанализированы методом ПЦР на наличие перенесенных генов. Показано присутствие этих генов в полученных линиях растений цикория. Кроме этого, для некоторых линий показан синтез мРНК (ОТ-ПЦР).

Изучение тубулинового цитоскелета в материнских клетках пыльцы растений табака (Nicotiana tabacum L.) при увеличении уровня плоидности.

Киняйкин В. И., Сидорчук Ю. В.

Институт цитологии и генетики СО РАН Новосибирск, Россия, пр.ак.Лаврентьева,10, [email protected], sidorch@ bionet.nsc.ru Правильная сегрегация хромосом в мейозе, а значит и фертильность пыльцы у высших растений обеспечивается двумя последовательными делениями при одном цикле репликации ДНК. В каждом из этих последовательных делений происходит смена нескольких цитоскелетных структур: радиальных интерфазных фибрилл, веретена деления и фрагмопласта. Как правило, при несбалансированном увеличении уровня плоидности у растений мейотическое деление нарушено и фертильность пыльцы резко снижена. В лаборатории биоинженерии растений получены триплоидные (3n=72) растения табака, характеризующиеся различными аномалиями мейоза. Такие растения служат ценным источником аномалий мейоза, весьма информативных с точки зрения выявления новых аспектов динамики микротрубочкового цитоскелета, что и являлось целью данной работы.

В работе использовали методы световой и флюоресцентной микроскопии. Визуализацию микротрубочек цитоскелета проводили с использованием антител к -тубулину (SIGMA, T5168).

У проанализированных нами триплоидных растений табака в первом делении мейоза наряду с нормальными биполярными веретенами формировались с низкой частотой (не более 1%) трехполюсные веретена. Установлено, что при построении трехполюсных веретен процессы реорганизации цитоскелета на стадиях от профазы до средней прометафазы не отличались от аналогичных процессов, имевших место при построении биполярных веретен. Вероятно, формирование дополнительного полюса происходит в поздней прометафазе из хаотической фигуры цитоскелета в результате нарушения процессов параллельной коориентации и биполярной ориентации микротрубочковых пучков.

В ходе анализа динамики цитоскелета в мейозе триплоидных растений табака мы наблюдали весьма интересное отклонение в развитии радиальной системы МТ пучков на стадии интеркинеза. Данное отклонение заключалось в формировании мощного радиального МТ пучков вокруг дочерних ядер со стороны полюсных районов клетки.

Наряду с этим отмечалось аномальное сближение дочерних ядер в общей цитоплазме клетки. При этом собственно интерзональная система МТ выглядела в значительной степени редуцированной по сравнению с нормой. Сама по себе данная морфологическая девиация не является нарушением, поскольку, вероятно, не влияет на цитоскелетный цикл.

Тем не менее, известно, что аномальное сближение ядер в МКП двудольных растений с симультанным типом цитокинеза может приводить к формированию общих структур цитоскелета и, в итоге, к реституции.

Кирикович С.С., Левитес Е.В.

Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Россия, Новосибирск, пр-т Лаврентьева, 10, [email protected] Для выяснения причин и закономерностей изменчивости наиболее удобными объектами исследования являются растения в силу того, что они обладают большим разнообразием способов размножения и набором форм разного уровня плоидности. Показано, например, что в агамоспермных потомствах сахарной свеклы с высокой частотой проявляется изменчивость, заключающаяся в несоответствии выявляемых соотношений фенотипов ферментов каким-либо известным теоретическим соотношениям, а также в появлении в таком потомстве фенотипов, не соответствующих генотипу исходного материнского растения. Обнаруженные, например, соотношения фенотипических классов в потомстве мужскостерильных триплоидных растений сахарной свеклы можно объяснить лишь наличием в растительных клетках перед их вступлением на путь эмбриогенеза политенизированных участков хромосом, несущих аллели маркерных ферментных локусов, а также диминуцией избыточных копий хроматид при первых делениях эмбриогенеза. Диминуция избыточных копий хроматид может иметь место при развитии зародыша как из соматической клетки, так и из нередуцированной яйцеклетки. В таком случае соотношение фенотипических классов в агамоспермном потомстве определяется соотношением числа нитей хроматид в районах гомологичных хромосом, несущих аллели гетерозиготного маркерного локуса. Уменьшенная доля какого-либо гомозиготного фенотипического класса может быть следствием того, что у исходного материнского растения в готовящихся к эмбриогенезу клетках соответствующий аллель ферментного локуса присутствовал в меньшем числе хроматид. Для обозначения аллелей, числа хромосом и числа хроматид (числа копий политенизированных участков хроматид), несущих маркерные аллели, нами предложен термин полигенотип локуса. Важным моментом является то, что выявленные экспериментально соотношения фенотипических классов хорошо согласуются с уровнем политении, характеризующемся степенью числа 2, а именно 2, 4, 8 и 16, что отражает физическую природу процесса, лежащего в основе выявленной изменчивости. Вычисленная по соотношению фенотипов степень политении различается в разных локусах, что отражает независимость процесса политенизации в различных частях хромосом и генома в целом. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что кроме общеизвестных лежащих в основе изменчивости комбинаторных процессов, обусловленных случайным расхождением хромосом в мейозе и случайной встречей гамет, существует еще один комбинаторный процесс, обусловленный политенизацией участков хромосом и случайной потерей избыточных копий участков хроматид клеткой, вступившей в эмбриогенез. Данные представления необходимо учитывать не только при рассмотрении результатов сегрегации признаков у селектируемых растений, но и при планировании экспериментов.

Работа финансировалась грантом № 99 по интеграционному проекту СО РАН 2009– Tyramide FISH - ценный инструмент для сравнительной геномики растений Киров И.В., Романов Д.В.

Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева, 127550, Россия, Москва, ул. Лиственничная аллея, д.5 [email protected] На сегодня уже создано большое количество генетических карт для многих растений. Существенным недостатком генетических карт является то, что расстояние между отдельными маркерами, измеряемое в сантиморганах (сМ), не отражает истинного физического расстояния, измеряемого в парах нуклеотидов. В местах супрессии рекомбинации близко расположенные маркеры на генетической карте могут быть удалены друг от друга на расстоянии миллионов пар нуклеотидов, что становиться существенным недостатком при клонировании генов на основе генетических карт. Решением этого недостатка является создание физических карт и их интегрирование с генетическими картами. Традиционно методом физического (цитогенетического) картирования является FISH (флуоресцентная in situ гибридизация), позволяющая визуализировать фрагменты ДНК на хромосоме. Недостатком метода является низкий порог чувствительности – п.н. Однако часто маркеры и гены имеют размер намного меньше порога чувствительности FISH. Альтернативой FISH является сверхчувствительная Tyramide-FISH, позволяющая визуализировать последовательности менее 1000 п.н.

Нами проведена оптимизация протокола Tyramide-FISH для картирования фрагментов генов размером 1000 – 1200 п.н. В работе показана эффективность разных систем детекции для Tyramide-FISH. Получены результаты по картированию генов различных аллиназ (1000 п.н.) и синтазы фактора слезотечения (550 п.н.) на хромосомах луковых (Allium cepa и A. fistulosum). Это позволило провести интегрирование генетической и физической карт и сравнить положение гомеологичных генов на хромосомах двух видов. Оптимизированный протокол позволяет визуализировать короткие последовательности с частотой 70 – 90%, что значительно выше, чем с использованием других методов. Оптимизированный протокол Tyramide-FISH был применен также для картирование гена фенилаланин аммоний лиаза (PAL), участника процессов, приводящих к устойчивости растений к засухе, на хромосомах розы (Rosa wichuraiana), которые характеризуются значительно меньшими размерами по сравнению с хромосомами луковых. Нами впервые проведено Tyramide-FISH картирование фрагмента гена на виде растений с маленькими хромосомами. Наши исследования показывают, что картирование коротких последовательностей на физической хромосоме может быть эффективно проведено с помощью Tyramide-FISH.

Анализ наследования целевых генов у гибридов F1, полученных от скрещивания трансгенных растений томата, экспрессирующих гены SPO11 S. cerevisiae и SPO11- Комахин Р.А., Комахина В.В.1, Милюкова Н.А.1, Криницына А.А.1, Жученко А.А. ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, ул. Тимирязевская 42, Москва 127550, Россия, [email protected] Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, ул. Губкина, д. 3, ГСП 1, г. Москва 119991, Россия Комбинативная селекция остается наиболее простым и действенным способом создания новых сортов растений. Центральным элементом этой схемы селекции является мейотическая рекомбинация у гибридов, которая обеспечивает правильную сегрегацию гомологичных хромосом в профазе I и создает генетическое разнообразие у их потомства.

В мейозе кроссинговер инициируется двухцепочечными разрывами (ДЦР) ДНК с помощью эндонуклеаз Spo11. Механизмы, отвечающие за распределение ДЦР ДНК консервативны, поскольку кроссинговер предпочтительно проходит в «горячих» точках рекомбинации, но до конца не ясны. Сравнение некоторых «горячих» точек из дрожжей S.

cerevisiae и растений A. thaliana не выявило корреляции между их последовательностями.

Это обстоятельство дало нам основание предполагать, что белки Spo11 из различных организмов способны в мейозе инициировать ДЦР в разных участках хромосом. Для проверки этой гипотезы были созданы первичные трансформанты томата, экспрессирующие гены scSPO11 или atSPO11-1 под контролем сильного конститутивного промотора 35S CaMV, соответственно обозначенные 35S-scSPO11 и 35S-atSPO11-1. Эти растения опылялись пыльцой маркерной линии томата Мо938, в результате чего были получены гибриды F1 от восьми растений из группы 35S-scSPO11 и шести 35S-atSPO11-1.

Молекулярно-биологический анализ ДНК и РНК гибридов с трех растений каждой группы 35S-scSPO11 и 35S-atSPO11-1 позволил отобрать формы, экспрессирующие целевые гены, соответственно обозначенные F1-scSPO11 и F1-atSPO11-1, а также их не трансгенные аналоги. Среди потомства трансгенных растений №70 35S-atSPO11-1 и №3 и №5 35SscSPO11 отмечено расщепление по содержанию целевого гена 1:1, что предполагает наличие одной инсерции Т-ДНК в геноме первичных трансформантов и гибридов. В потомстве растения №9 35S-scSPO11 и №37 35S-atSPO11-1 существенно преобладали растения с целевым геном, а в потомстве трансформанта №15 35S-atSPO11-1, наоборот, растения без целевого гена. Отклонения от ожидаемого расщепления, возможно, являются следствием небольшой выборки гибридов F1 или связаны с инсерцией дополнительных копий т-ДНК в геном первичных трансформантов. Окончательные выводы по количеству и локализации Т-ДНК будут сделаны при проведении анализа потомства от самоопыления гибридов F1. Сравнительный анализ всех гибридов показал, что экспрессия генов scSPO или atSPO11-1 не оказывает влияния на фертильность пыльцы и у всех растений она составляла не менее 90%.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 11-04-00873-а.

Индукция мейотической рекомбинации у межсортовых и межвидовых гибридов томатов с использованием гена бактериальной рекомбиназы recA Escherichia coli Комахин Р.А.1, Комахина В.В.1, Милюкова Н.А.1, Левина Т.А.1, Жученко А.А. ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, ул. Тимирязевская 42, Москва 127550, Россия, [email protected] Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, ул. Губкина, д. 3, ГСП 1, г. Москва 119991, Россия Мейотическая рекомбинации ДНК у гибридов, включающая перекомбинацию отдельных хромосом и кроссинговер, является основным источником создания новых форм растений с комплексом хозяйственно-ценных признаков. Однако основная функция кроссинговера, прежде всего, связана с правильной сегрегацией гомологичных хромосом, поэтому этот процесс является генетически детерминированным и проходит вдоль хромосом не случайно, а в определенных локусах - «горячих» точках рекомбинации.

Вследствие этого обмену подвергаются одни и те же участки хромосом, что приводит к преобладанию в потомстве гибридов набора гаплотипов, среди которого трудно обнаружить формы с нетрадиционным сочетанием генов. Эта проблема еще сильнее обостряется при использовании в скрещиваниях дикорастущих видов, являющихся источником новых генов. Отдаленные гибриды часто либо стерильны, либо в своем потомстве формируют ограниченный спектр интрогрессивных форм. Основная причина этого явления заключается в отсутствие необходимого уровня рекомбинации между хромосомами разных видов. С развитием методологии генетической инженерии появилась возможность модифицировать некоторые параметры мейотической рекомбинации у растений с целью повышения эффективности селекционного процесса.

Для этого нами были созданы трансгенные растения культурного томата Solanum lycopersicum L., экспрессирующие ген бактериальной рекомбиназы recA E. coli (Комахин и др., 2010). У межсортовых гибридов томата, экспрессирующих ген recA, частота мейотической рекомбинации (rf) между маркерными генами второй хромосомы была в 1.2раза выше, чем у не трансгенных, что увеличивало гетерогенность в их потомстве (Комахин и др., 2011). Эти результаты позволили предположить, что экспрессия гена recA в клетках межвидовых гибридов томатов может повысить их фертильность и увеличит интрогрессию генетического материала из хромосом дикорастущих видов в хромосомы культурных растений. Для этого были созданы межвидовые трансгенные и не трансгенные гибриды от скрещивания маркерных растений томата S. lycopersicum L., экспрессирующих ген recA, с видами S. lycopersicum var. cerasiforme, S. cheesmaniae и S. pimpinellifolium.

Результаты анализа пыльцы демонстрируют, что у некоторых межвидовых гибридов экспрессия гена recA стабилизирует фертильность на уровне 60-70%, в то время как у не трансгенных гибридов она варьирует от 45 до 84 % в зависимости от условий окружающей среды. Исследования продолжаются.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации МК-244.2011.4.

Выявление нуклеотидных последовательностей гомологичных гену Коротаева А.А., Крупин П.Ю.

Российский Государственный Аграрный Университет – МСХА им. К.А.

Тимирязева, Центр молекулярной биотехнологии, 127550, Москва, Лиственничная аллея, д.5а, [email protected] Листовая бурая ржавчина вызывается факультативным грибом паразитом Puccinia triticina. Это заболевание пшеницы причиняет серьёзный ущерб сельскому хозяйству существенно снижая урожай. На данный момент в мире найдено более 50 генов устойчивости к листовой ржавчине. Многие из этих генов были привнесены в пшеницу из дикорастущих сородичей. Большим потенциалом в качестве источника новых Lr-генов обладает коллекция октоплоидных пшенично-пырейных гибридов (ППГ, 2n=56) (Отдел отдалённой гибридизации ГБС РАН имени Н.В. Цицина). 28 образцов ППГ были изучены на устойчивость к 10 тест-изолятам бурой ржавчины: 16 показали устойчивость ко всем расам, а остальные 12 были восприимчивы к 1-9 расам. С помощью ПЦР-анализа с использованием праймеров рекомендованных для детекции Lr-генов, нами были выявлены амплифицируемые последовательности размером 846 п.н. и около п.н. характерные в основном для устойчивых линий. В дальнейшем данные последовательности были клонированы и просеквенированны. При анализе фрагмента около 1200 п.н. в системе BLAST не обнаружено полных гомологий ни к одной из известных последовательностей, и небольшая степень гомологии к отдельным участкам последовательности гена-кандидата Lr19. Анализ фрагмента 846 п.н. в системе BLAST не показал полной гомологии ни к одной из известных последовательностей, однако выявил относительно высокую гомологию к последовательности гена-кандидата Lr19, который был привнесен в мягкую пшеницу из пырея понтийского, а так же к другим генам устойчивости у различных злаков. С целью локализовать данную последовательность был поставлен ПЦР-анализ на линиях несущих дополненные хромосомы пырея среднего. В результате только на линии Z1 амплифицировался фрагмент размером 846 п.н. Таким образом, полученная нами нуклеотидная последовательность может являться как частью гена пырея среднего обеспечивающего устойчивость к бурой ржавчине, так и частью псевдогена, но при этом тесно сцепленного с истинным геном устойчивости. В обоих случаях используемые в нашей работе молекулярные маркеры могут служить для интрогрессии устойчивости к бурой ржавчине в геном мягкой пшеницы через «мостик» пшенично-пырейных гибридов изученных в нашей работе.

Анализ БАВ межвидового гибрида кедровых сосен в сравнении с родительскими Кукина Т. П. 1, Фролова Т. С. 1 - Новосибирский институт органической химии СО РАН, Россия, Новосибирск, 630090, проспект академика Лаврентьева, 9; [email protected] 2 - Новосибирский государственный университет, Россия, Новосибирск, 630090, ул.

Пирогова, 2; [email protected] Систематика рода Pinus в основном базируется на морфологических признаках. Так, российские виды подрода Strobus – P. sibirica Du Tour, P. pumila (Pall.) Regel и P. koraiensis Sieb. Zucc принадлежат к подсекции Cembrae Loud. В настоящее время между исследователями идет дискуссия о местоположении некоторых видов в системе рода Pinus, т.к. функциональная природа и адаптивное значение молекулярно-генетических и анатомических признаков часто неизвестны. Более перспективным считается изучение зависимости структуры годичного побега от условий произрастания, таксономической принадлежности для выяснения происхождения видов и путей их адаптации к условиям современных ареалов. С совершенствованием инструментальных методов анализа химического состава растительного материала хемотаксономический подход к систематике растений приобретает все большее значение. Хемотаксономические маркеры могут вполне адекватно характеризовать сырьевой материал и его принадлежность к определенному ботаническому виду. Генеративная совместимость видов P. sibirica и P.

pumila представляет большой интерес для сторонников хемосистематического подхода, т.к. хемотаксономические маркеры этих видов практически не совпадают. Дитерпеновые кислоты P. sibirica и P. koraiensis в значительной степени представлены ламбертиановой, сукцинилизокупрессовой, пинусоловой кислотами, отсутствующих в составе P. pumila. В P. pumila преобладают производные антикопаловой и агатовой кислот.

составе Химический состав гибридных растений ранее не изучался. В нашей работе использован материал научного стационара «Кедр» ИМКЭС СО РАН (Томская область), возглавляемого профессором С. Н. Горошкевичем. Образцы кедровых сосен выращены в единых почвенно-климатических условиях. Сезонно-динамические особенности накопления БАВ исключены параллельным отбором образцов в августе 2011 г. Нами проведен сравнительный анализ дитерпеновых и алифатических составляющих пяти образцов хвои трех видов кедровых сосен: P. sibirica двух генотипов, P. koraiensis, P.

pumila и гибрида P. pumila Ч P. sibirica. Сырье высушено при температуре 40-50°С, хвоя отделена от побегов вручную, измельчена до размеров частиц 0.5-2 мм. Экстракция хвои проведена в два этапа: гексаном, а затем метил-трет-бутиловым эфиром. Полученные экстракты разделены на свободные кислоты, связанные кислоты и неомыляемые вещества.

После метилирования кислые компоненты, считающиеся хемотаксономическими маркерами для растительных объектов, анализировали при помощи ХМС. Содержание более 30 соединений сопоставлено для всех пяти образцов сырья. Соотношение БАВ гибридного образца промежуточное между родительскими образцами, не все компоненты P. pumila и P. sibirica обнаруживаются в гибриде. Полученные закономерности предполагается проверить на аналогичных фракциях побегов изучаемых образцов.

Нестабильность экспрессии маркерного гена nptII у трансгенных растений табака:

Логинова Д.Б., Дейнеко Е.В.

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН 630090, Россия, Новосибирск, ул. Лаврентьева 10, [email protected] Трансгенные растения линий Nu 6 и Nu 5 T3 поколения, полученные селекцией на отсутствие мозаицизма из растения Nu 21, контрастно различаются по проявлению маркерного гена nptII. Растения линии Nu 6 характеризуются мозаичной экспрессией маркерного гена, что фенотипически проявляется, как чередование окрашенных (зеленых) и не окрашенных (белых) секторов на листовой пластинке растений, растущих на селективной среде (антибиотик-канамицин). Трансгенные растения линии Nu характеризуются стабильной экспрессией nptII-гена. Растения обеих линий несут сложноорганизованную встройку, состоящую из двух полноразмерных копий Т-ДНК в прямой ориентации и одной усеченной копии в обратной ориентации между ними.

Нестабильность экспрессии перенесенных генов часто связана с метилированием области промотора и инактивацией экспрессии гена на транскрипционном уровне. Целью данной работы было изучение наследования характера проявления маркерного гена nptII у потомков от самоопыления растений линий Nu 6 и Nu 5 и у гибридов от скрещивания с нетрансгенными растениями линии SR1.

По результатам гибридологического анализа установлено, что мозаичная экспрессия маркерного гена nptII на селективной среде сохранялась как у потомков от самоопыления, так и у гибридов от скрещивания с растениями нетрансгенной линии SR1. Установлено, что проявление гена nptII не зависело от гомо- или гемизиготности. Также было показано, что различия в экспрессии гена nptII между Nu 5 и Nu 6 линиями сохранялись как у потомков от самоопыления, так и у гибридов от скрещивания с SR1, однако число мозаиков среди растений Т4 поколения было достоверно выше по сравнению с Т поколением.

По результатам бисульфитного секвенирования образцов ДНК гомозиготных растений линии Nu 5 и Nu 6 было выявлено гиперметилирование области MAS промотора (85% и 94% всех цитозинов Nu 5 и Nu 6 линий) у растений обеих линий. Также показано гиперметилирование 5' области кодирующей части гена nptII у трансгенных растений линии Nu 6 (74.2%) и гипометилирование у растений линии Nu 5 (6.5%). Для гибридов от скрещивания гомозиготных трансгенных растений линий Nu 5 и Nu 6 с растениями дикого типа было показано гиперметилирование (97% у гибрида Nu 5xSR1 и 98.5% у гибрида Nu 6 xSR1) MAS-промотора и значительная степень метилирования (77.4% у гибрида Nu 5xSR1 и 67.7% у гибрида Nu 6 xSR1) 5' области кодирующей части гена nptII, которое было выше, чем аналогичный показатель у трансгенных растений линии Nu 5, и сопоставимо с таковым растений линии Nu 6. Метилирование цитозинов в области MASпромотора и 5' области кодирующей части гена nptII растений линии Nu 5 не имеет существенного влияния на экспрессию nptII-гена, поскольку данные растения на селективной среде имеют стабильную зеленую окраску.

Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие» (направление 4. Эпигенетика и фундаментальные проблемы трансгенеза).

Наследование и экспрессия введенных генов неомицинфосфотрансферазы и человеческого интерферона альфа-2b в поколении Т1 трансгенных растений табака Лучакивская Ю.С. 1, Майстренко А.Н.1,2, Олевинская З.М. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, 03680, г. Киев, ул. Акад. Заболотного 148, тел/факс (044)5221786; e-mail: [email protected], [email protected] Киевский национальный университет им. Т.Г.Шевченка Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины Лейкоцитарный интерферон альфа-2b используют в медицине для лечения гепатитов, ОРВИ и некоторых типов рака. На сегодняшний день рекомбинантный интерферон альфаb получают в культуре бактериальных клеток, культуре дрожжевых клеток и клетках млекопитающих, показана также возможность получения трансгенных растений, способных аккумулировать рекомбинантные интерфероны. Преимущество использования растительных систем состоит в невысокой себестоимости выращивания, отсутствии необходимости осуществления посттрансляционных модификаций, отсутствии бактериальных токсинов и вирусов животного происхождения.

Исходные трансгенные растения Nicotiana tabacum L. cорта Winskonsin и Petite Havana, способные к накоплению белка человеческого интерферона альфа-2b, были получены в результате трансформации с использованием штаммов GV 3101 Agrobacterium tumefaciens и А4 Agrobacterium rhizogenes и плазмидных векторных конструкций, где ген интерферона альфа слитый с растительным кальретикулиновым апопластным сигналом находился под контролем конститутивного 35S промотора ВМЦК (pCB124) или корнеспецифического Mll промотора сахарной свеклы (pCB161), обе конструкции содержали также ген неомицинфосфотрансферазы (устойчивость к антибиотику канамицинсульфату).

В результате искусственного самоопыления были получены жизнеспособные семена, которые были высажены на селективную среду, содержащую канамицинсульфат в качестве селективного агента. Признаки, кодируемые привнесенными генами, наследовались как доминантные (расщепление 3:1). Присутствие трансгенов в отобранных на селективной среде растениях подтверждали с помощью ПЦР-анализа (показано для 95анализируемых растений). Антивирусную активность интерферона измеряли методом микротитрования основанного на способности изучаемых экстрактов защищать клетки клеточной культуры тестикул поросят от цитопатического эффекта вируса везикулярного стоматита. Антивирусную активность наблюдали для всех растений поколения Т1, что свидетельствует о сохранении способности к образованию биологически активного белка у полученных растений. Кроме того, анализ антивирусной активности растительных экстрактов показал сохранение тенденции к проявлению более высокой активности экстрактами растений трансформированных с помощью конструкции, где целевой ген находился под контролем 35S промотора (71-640 MЕ/мг суммарного растворимого белка), по сравнению вариантом с использованием корнеспецифического Mll промотора (26- MЕ/мг суммарного растворимого белка).

Изучение продолжительности вегетационного периода генофонда кукурузы в Мамедова Х.Р., Алиев Э.Б., Талаи Дж.М.

Азербайджанский научно исследовательский институт Земледелия,AZ- 1098, Азербайджан Баку, Пос. Пиршаги, Совхоз № 2, [email protected] В настоящее время в генофонде Института Генетических Ресурсов НАН Азербайджана собрана богатая коллекция, насчитывающая около 500 сортов и гибридов кукурузы разного происхождения. Однако, анализ существующего генетического материала свидетельствует о том, что многие из них не достаточно изучены по самым различным признакам. Особенно слабо исследована продолжительность вегетационного периода.

Учитывая вышеизложенное, нами была поставлена задача, цель которой заключалась в изучении продолжительности вегетационного периода генофонда кукурузы.

В посев был вовлечен генофонд, состоящий из 490 сортов и гибридов кукурузы.

Опыты закладывали в один день 26 мая 2011 года, в 1-ой повторности на экспериментальном участке Аз НИИ Земледелия, близ города Баку. Посев был произведен в ручную на 7–ми ярусах, ширина каждого яруса составляла 2 метра, длина - 49 метров, расстояние между ярусами - 1 м 20 см. Между рядками 70 см, между растениями 20 см.

Глубина заделки семян составляла 4-5 см. В каждый ряд через 20 см. высевали по 2 зерна от каждого сорта или гибрида. После появления всходов, удаляли по одному проростку, и таким образом каждый сорт и гибрид во время вегетации был представлен максимум 10– ти растениями.

Во избежание воздействия высоких температур в период вегетации опыты поливали 5 раз, что позволило обеспечить требования растений к почвенной влаге.

В течение всего вегетационного периода индивидуально у каждого сорта и гибрида отмечали время цветения и восковой спелости початков.

Результаты наблюдения показали, что в условиях естественного короткого дня наиболее раннее цветение наступило у 8–и сортов через 40 дней после всходов (10 июля).

У 7–ми исследованных сортов наступление этой фазы развития оказалось самым поздним и соответствовало8-9 августу. Разница по продолжительности периода всходы-цветения между контрастными сортами составила 29-30 дней.

Анализ данных продолжительности периода всходы-созревания показал, что почти у всех раннецветущих сортов восковая спелость початков и общая продолжительность вегетационного периода завершилось к 25 августу, тогда как поздноцветущих генотипов она завершилась 18 сентября. Остальные сорта и гибриды также как в первом случае оказались промежуточными. Таким образом, результаты исследования позволили, с одной стороны ранжировать сорта по времени цветения и созревания и тем самым паспортизировать генотипы по продолжительности вегетационного периода, а с другой, дали возможность выявить тестерные формы, которые могут быть использованы в генетических исследованиях для определения системы генов, контролирующих изученное свойство кукурузы.

Влияние повышенных концентраций солей CuSO4 и ZnSO4 на трансгенные растения рапса (Brassica napus L.) с геном трансфакторного белка OSMYB Мареай М.М.1, Шумкова Г.А.2, Радионов Н.В.2, Ралдугина Г.Н. Российский университет дружбы народов, ул. Миклухо-Маклая 6, Москва, Россия, Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН; ул. Ботаническая 35, Москва, Россия, 127276.

Быстрыми темпами в настоящее время растет загрязнение почв токсическими тяжёлыми металлами (ТМ), представляя большую проблему для экологии. В связи с очень актуален поиск или создание растений хорошо растущих на загрязненных почвах, которые могли бы накапливать и выводить ТМ из почвы (аккумуляторов и гипераккумуляторов ТМ). В ИФР РАН были получены трансгенные растения рапса сорта Westar (Brassica napus L.), содержащие ген трансфакторного белка Osmyb4. Ранее было показано, что такие трансгенные растения устойчивы к действию низких температур, не погибая при длительном понижении температуры до -7оС. Было сделано предположение, что эти растения будут также устойчивы и к токсическому действию ТМ. Растения первого и второго поколения, экспрессировавшие трансген, были размножены черенкованием и выращены в условиях гидропоники на среде Хоагланда. После образования растениями 4листьев к среде добавляли повышенные концентрации CuSO4 (50-150 мкМ) или ZnSO (1000-3000 мкМ). В качестве контроля использовали нетрансформированные растения, полученные через культуру тканей. Через 15 суток определяли биомассу растений, их оводнённость, аккумуляцию пролина и содержание в них ионов Cu2+ и Zn2+. Результаты исследования показали, что у трансгенных растений рапса накопление сырой биомассы на среде, содержащей повышенные концентрации CuSO4, было в 1,5 - 2 раза выше, чем у контрольных растений, а на среде с повышенным содержанием ZnSO4 ингибирование накопления биомассы было в 1,2-1,4 раза выше, что свидетельствует в пользу их более высокой устойчивости к ТМ. Кроме того, трансгенные растения выживали при таких концентрациях CuSO4, при которых контрольные растения погибали. У трансгенных растений при действии повышенных концентраций солей была также выше и оводнённость тканей надземной части. О более высокой устойчивости трансгенных растений свидетельствует и более интенсивная в них аккумуляция пролина, особенно при повышении в среде содержания CuSO4. Измерение эндогенного содержания Cu2+ и Zn2+ в растениях показало, что оба этих металла накапливались в трансгенных растениях в большей степени, чем в контрольных. Однако аккумуляция как одного, так и другого металла у трансгенных растений была всего в 1,2-1,3 раза выше, чем у нетрансформированных растений, при этом абсолютное накопление в них цинка было выше, чем меди. В связи с тем, что трансгенные растения накапливали значительно больше биомассы при повышенных концентрациях солей ZnSO4 и CuSO4 общее содержание металла в каждом растении было выше. Это свойство делает трансгенные растения лучшими гипераккумуляторами Zn и они могут быть использованы так же, как аккумуляторы Cu.

Трансгенные растения Arabidopsis thaliana с повышенной экспрессией генов пептидил-пролил цис-транс изомераз более устойчивы к фитопатогенам.

Мокрякова М.В., Погорелко Г.В., Брускин С.А.

Институт общей генетики имени Н.И.Вавилова Российской Академии Наук, Россия, Москва, ГСП-1, ул.Губкина,д.3, [email protected] Пептидил-пролил цис-транс изомеразы (PPI-азы) это суперсемейство белков отвечающих за цис/транс-изомеризацию пептидной связи, предшествующей остатку пролина. PPI-азы широко распространены среди про- и эукариот и вовлечены в разнообразные молекулярные процессы. Они играют важную роль в патогенезе, участвуя как в запуске защитного ответа растения, так и в фолдинге белков секретируемых внутрь растительной клетки патогеном. Основной целью работы является исследование функций PPI-аз при взаимодействии растения с патогеном.

В ходе проведенного нами биоинформатического анализа экспрессии иммунофилинов Arabidopsis thaliana были отобраны гены-кандидаты, значительно изменяющие свою экспрессию в ответ на биотический стресс (рис. 1А) и предположительно препятствующие развитию заражения растения фитопатогенами (At2g16600, At4g33060 и At5g48570). В дальнейшем нами были получены трансгенные растения с повышенной экспрессией отобранных генов. И был проведен анализ эффективности заражения бактериальными патогенами (Pseudomonas syringae и Xanthomonas campestris) трансгенных растений, который показал снижение роста титра бактерий в зараженных трансгенных растениях по сравнению с контрольными(рис.1Б).

Рисунок 1. А. Изменение экспрессии генов иммуннофилинов арабидопсиса в ответ на стрессовые воздействия. Б. Рост числа бактерий Pseudomonas syringae в листьях контрольного растения Arabidopsis thaliana и в траснгенных растениях с повышенной экспрессией генов At2g16600, At4g33060 и At5g48570 после их заражения.

Таким образом показано, что пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы At2g16600, At4g33060 и At5g48570 экспрессируются в ответ на бактериальное заражение и являются важным компонентом системы устойчивости растений к атаке фитопатогенов.

Трансгенные растения, экспрессирующие гены At2g16600, At4g33060 и At5g48570 под контролем 35S промотора обладали большей устойчивостью к фитопатогенам Pseudomonas syringae и Xanthomonas campestris, чем контрольные растения.

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Генофонды и генетическое разнообразие» и гранта РФФИ 10-04-01195а.

Изучение методов культивирования in vitro клеток и тканей тритикале Мурлякова Д. А1., Вертикова Е. А1., Акинина В. Н2.

Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова, 410034, Россия, Саратов, Театральная пл.,1,[email protected] ГНУ НИИСХ Юго – Востока, 410010, Россия, Саратов, ул. Тулайкова, 7, [email protected] В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию и обеспечить развитие всего растения.

С целью изучения методов культивирования in vitro клеток и тканей озимой тритикале в 2010 – 2011 годах на базе ГНУ НИИСХ Юго – Востока, в лаборатории клеточной селекции, проводились полевые и лабораторные исследования. Задачи при изучении данного вопроса сводились к следующему: во – первых, к изучению возможности индукции морфогенеза в культуре незрелых колосьев озимой гексаплоидной тритикале; во – вторых, к размножению стерильных гаплоидных и гибридных растений тритикале.

При проведении исследований важным этапом являлся выбор растений – доноров.

Материалом для исследования послужил набор различных генотипов озимой тритикале.

В качестве экспланта использовались незрелые колосья озимой тритикале. Колосья разделяли на сегменты и помещали на питательную среду Мурасиге – Скуга (МС) (Murashige and Skoog, 1962) с содержанием 2,4 – Д в концентрации 2 мг/л. При культивировании эксплантов были получены каллусные культуры с очагами морфогенеза, из которых впоследствии регенерировали растения. Каллус был распассирован в три приема, после чего были получены зеленые растения, которые использовались для дальнейших исследований.

Из введенных в культуру 137 эксплантов получили эмбриогенный каллус.

Наибольший выход его наблюдался у генотипа 718 (100%). В результате первого пассажа у генотипов 687 и 692 зеленых растений получено не было, больший выход наблюдался у генотипа 718. При втором пассаже самый большой выход зеленых растений наблюдался у 775 генотипа, наименьший – у 698. В третьем пассаже зеленые растения получены лишь у 50% генотипов (728, 718, 751, 774, 775). В общей сложности по всем генотипам получено 90 растений, при этом наибольшей морфогенетической активностью характеризуется гаплоид № 775.

В результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Незрелые колосья стерильных растений тритикале могут служить источником получения морфогенетически активных каллусных культур.

2. Методом соматического эмбриогенеза in vitro размножены и сохранены стерильные растения озимой гексаплодной тритикале.

3. В общей сложности по всем генотипам получено 90 растений, при этом наибольшей морфогенетической активностью характеризуется гаплоид № 775.

Изучение особенностей микроспорогенеза трансгенных растений табака Мурсалимов С.Р., Дейнеко Е.В.

Учреждение Российской академии наук Институт Цитологии и Генетики Сибирского Отделения РАН, 630090, Новосибирск, Россия, пр. ак. Лаврентьева,10, [email protected] Преимущество использования трансгенеза в фундаментальных биологических исследованиях заключается, в первую очередь, в возможности внесения целевых изменений в геном растения. В то же время, ценным материалом для исследовательской работы могут служить растения-трансформанты с неожиданными свойствами, которые возникают у них в результате воздействия на геном растений в ходе эксперимента.

Основными причинами появления таких растений является попадание генетической конструкции в область активно функционирующих генов растения, множественная встройка копий переносимой ДНК, сомаклональная изменчивость.

В лаборатории биоинженерии растений (ИЦиГ СО РАН) в ходе работ по агробактериальной трансформации табака (Nicotiana tabacum L.) были выделены растения с удвоенным числом хромосом, несущие множественные встройки Т-ДНК. Эти растения обладали мутантным фенотипом – измененная структура цветка, пониженная фертильность пыльцы и аномально высокая частота цитомиксиса в микроспорогенезе.

Цитомиксис – это явление межклеточной миграции ядер в растительных тканях, которая происходит по прямым цитоплазматическим мостам (цитомиктическим каналам). Впервые это явление было описано более века назад, однако, многие детали, механизмы и последствия этого явления все еще остаются невыясненными. В первую очередь, это связано с отсутствием удобных для исследования этого феномена моделей – растений, постоянно поддерживающих высокий уровень цитомиксиса. В микроспорогенезе линий, полученных из указанных мутантных растений табака, в цитомиксис вовлекается до 50% микроспороцитов, что позволяет использовать их в качестве моделей для детального анализа цитологической картины цитомиксиса.

При электронно-микроскопическом исследовании, было показано, что в микроспорогенезе табака цитомиктические каналы могут образовываться как на основе плазмодесм, так и de novo при помощи специфических органелл, в которых с помощью методов цитохимии было выявлено содержание гидролитичекого фермента каллазы.

Показано, что ядерная оболочка и хроматин не повреждаются при миграции через цитомиктические каналы. Обнаружены случаи прямого контакта через цитомиктические каналы ядер двух клеток со слиянием ядерных оболочек. В настоящий момент на указанных линиях изучается влияние уровня плоидности на частоту цитомиксиса в микроспорогенезе табака.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ: 11-04-01192-а Оценка генетической разнородности томата (Lycopersicon esculentum) для селекции на Никитинская Т.В., Шаптуренко М.Н., Хотылева Л.В.

ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», 220072, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 27, [email protected] Получение гибридных форм хозяйственно важных растений, характеризующихся выраженным гетерозисным эффектом, является основой успеха многих селекционных программ. При отсутствии информации о комбинационной ценности генотипов, когда невозможно предвидеть результат взаимодействий генов и их аллелей в гибридной комбинации, предсказание эффекта гетерозиса основывается на оценке потенциальных аллельных различий путем анализа ДНК-полиморфизма.

Целью настоящей работы явилось изучение молекулярно-генетической гетерогенности селекционных линий томата для идентификации ключевых маркеров, ассоциированных с гибридной силой.

Материалом исследования служили селекционные линии томата Л8165, Л8477, Л8720, Л8397, Л8129, Л8705, Л7264, Л7827, Л8655, Л7614, созданные совместно с РУП «Институт овощеводства», отобранные для испытания в системе тестерных скрещиваний на основе проведенных ранее исследований. Для оценки ДНК-полиморфизма использовали межмикросателлитные маркеры (ISSR-04, ISSR-08, ISSR-09, ISSR-09а, ISSR-10, ISSR-17, ISSR-22, ISSR-23, ISSR-24). Число фрагментов, полученных при амплификации ДНК с каждым из использованных праймеров, варьирует от 6 (ISSR-23) до 14 (ISSR-04).

Основная зона распределения фрагментов находится в диапазоне 120-2000 п.н. Учитывали 94 амплифицированных фрагмента (среднее число локусов на праймер 10,4), из них 8 были полиморфными. Для выявления межлинейного полиморфизма наиболее информативными оказались праймеры ISSR-09, ISSR-09а, ISSR-17, ISSR-22. У генотипа Л8720 был выявлен уникальный фрагмент на уровне 1250 п.н. с помощью праймера ISSR-09а.

На основе полученных ISSR-спектров методом кластерного анализа (TRICON) определены генетические расстояния между анализируемыми образцами и построена дендрограмма.

Исследуемые селекционные линии разделились на два кластера. Первый образовали генотипы: Л8705, Л8720, Л7264, Л8129, Л7614, Л7827. Второй – Л8477, Л8397, Л8165, Л8655. Наиболее дивергентными в анализируемой выборке генотипов оказались линии Л8397 и Л8720 (4,44 ев.ед.) и Л8720 и Л8477 (3,91 ев.ед.), тогда как между генотипами Л7264, Л8129, Л7614 и Л7827 в пределах первого кластера, и Л8165 и Л8655 (во втором кластере) различий выявлено не было.

Дальнейший скрининг полиморфизма исходных селекционных линий в сочетании с анализом варианс общей и специфической комбинационной способности позволит определить ДНК-локусы положительно и отрицательно ассоциированные с продуктивностью гибридов F1.

Портова П., Зимина О., Алхимова Е.

Институт Молекулярной Биологии и Генетики НАНУ, 03680, Украина, Киев, Акад.

Заболотного, 150, [email protected] Cтруктурная адаптация областей хромосом, возникающая для того, чтобы отметить, сигнализировать или сохранить измененные активные участки хроматина, предполагает существование эпигенетических меток. Быстрореагирующая природа эпигенетической системы при нормальных условиях не будет вызывать изменение состояния в определенном локусе, но, скорее всего сразу будет регистрировать изменение, вызванное другими событиями. Такая возможность определять и обозначать изменения в хромосомном состоянии является существенной характеристикой эпигенетической системы.

Тандемно организованная ДНК имеет тенденцию концентрироваться в функционально важных регионах хромосом, центромерах и теломерах. Несмотря на структурную дивергенцию и общее отсутствие консервации последовательностей среди видов, сателлитная ДНК является главной составной частью гетерохроматина, выполняя роль строительного элемента (Ugarkovic, 2005). Исследование экспрессии последовательностей сателлитной ДНК у эукариот свидетельствует о том, что тандемные повторы имеют регуляторную функцию, хотя до сих пор для большинства транскриптов эта роль кажется иллюзорной и гипотетичной.

В составе ДНК терминального субтеломерного гетерохроматина ржи описано несколько семейств тандемно организованных последовательностей. Учитывая исключительное разнообразие последовательностей повторяющейся ДНК и их транскриптов, возможно предположить, что какие-то регуляторные сигналы должны существовать внутри них. В настоящей работе мы исследовали распределение сигнала на хромосомах ржи посевной у различных экотипов и сортов вида методом флуоресцентной гибридизации in situ, используя наиболее распространенные в геноме ржи семейства тадемных повторов pSc и pSc250. Обнаружены огромные вариации числа копий последовательностей повторов, определяемые величиной флуоресцентного сигнала, хромосомные различия в накоплении и локализации каждого из повторов среди популяций вида Secale cereale. Полиморфизм сайтов локализации pSc200 и pSc250 наводит на мысль о существовании общих сердцевинных мотивов последовательностей, поиск которых возможен при тщательном анализе геномного окружения константных и вариабельных областей распространения сателлитной ДНК.

Сравнение поражением вирусом табачной мозайки корней и листьев трансгенных растений цикория Cichorium intubus L с геном inf -2b человека под.

Потрохов.А.А., Кваско Е. Ю,. Матвєєва Н. А.

Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, [email protected] Генетическая трансформация растений это метод, который позволяет создавать растения с новыми не характерными для них свойствами путем встраивания в растительный геном целевых генов интереса. Также из литературных источников известно, что генетическая трансформация может способствовать развитию устойчивости к фитопатогенам. Так было показано что растения табака с геном -интерферона имели стойкость к вирусу табачной мозайки (Смирнов и др 1990). Корнеспецифический промотр Mll интересен в частности точки зрения накопления рекомбенантных белков в корнях и корнеплодах растений.

Целью данной работы было изучить устойчивость трансгенных растений цикория с целевым геном inf -2b человека к вирусу табачной мозаики и сравнить степень заражения подземной и надземной частей растения. Трансгенные растения цикория были получены методом аграбоктериальной трансформации с использованием Agrobacterium rhizogenes. В состав вектора входил корнеспецифический промотор Mll, который обуславлюет синтез целевого продукта в корнях растений.

Растения инфицировали вирусом табачной мозайки (ВТМ), котрый был получен из колекции кафедры вирусологии ННЦ “института биологии” Киевского национального универистета имени Тараса Шевченка. В качестве позитивного контроля использывались нетрансформированые растения цикория зараженые ВТМ А в качестве негативного контроля использывались нетрансформированые растения цикория, которые не были заражены вирусом.

Для опредиления содержания вируса использывали методом имуноферментного анализа (ИФА). Результаты ИФА показали, что в трансформираваных растениях цикория линий pCB161 концентрация вируса привышала концентрацию в контроньных нетрансформированых растениях как в подземных частях растений так и в надземних.

Однако было отмеченно что 1 из линий показала снижение концинтрации вируса относительно контроля. Такой результат может быть причиной повыщеной биологической активности inf -2b человека в данной линии.

Таким образом, большенство линий цикория с геном inf -2b человека не были устойчивы к вирусной инфекции, однако в 1 из линий наблюдалась пониженная концентрация патогенна как в корнях так и в листьях. Также можно говорить о том что синтез интерферона, вероятно, проходит по всему растению, и не обуслолюется наличием в векторной конструкции корнеспецифического промотора Mll. Кроме того у части опытных растений отсутствовала биологическая активность синтизируемого интерферона, про что свидетельствуют результаты тестирования екстрактов листьев трансгенных растений на активность против вирусу везикулярного стоматита.

Данная работа будет продолжена и будет на направлена на поиск устойчивых линий растений относительно фитофирусных инфекций.

Смирнов С. П., Теверовская Є. Х., Крашенинникова Л. В., Пухальский Л. В., Создание экспрессионного интегративного вектора и его использование для введения в растений гена рекомбинантного альфа-интерферона человека // Генетика. – 1990. – Т. 26., № 12. – С. 2111- Отдаленная гибридизация пшеницы с пыреем в Сибири.

Размахнин Е.П.

Институт Цитологии и Генетики СО РАН, 630090, Россия, Новосибирск, пр. академика Лаврентьева 10, [email protected] Проблема получения стабильных урожаев озимой пшеницы до настоящего времени не решена. Для Сибири эта проблема имеет еще большую актуальность. Периодически, в суровые зимы наблюдается вымерзание озимой пшеницы. Генетического потенциала самой озимой пшеницы не достаточно для нужного увеличения морозостойкости. Одним из способов получения высоко-морозостойких сортов озимой пшеницы является отдаленная гибридизация с дикими сородичами, в частности с некоторыми видами пырея, среди которых наиболее перспективен пырей сизый Agropyron glaucum (Desf.).

Селекционеры разных стран проводили гибридизацию пшеницы с пыреем. Наиболее известны работы академика Н.В. Цицина. Существенным недостатком в этих работах являлось небольшое разнообразие используемых в качестве доноров генотипов пырея, отсутствие четкого определения их морозостойкости, а также отсутствие методов выявления генотипов пырея с минимальными нарушениями в геноме.

Для преодоления этих трудностей в Институте Цитологии и Генетики СО РАН были применены следующие подходы:

1. Создана коллекция генотипов пырея сизого из исходного материала, собранного в Восточном Казахстане на возвышенном и малоснежном месте, что обусловливало наличие у растений высокой морозостойкости.

2. Разработан и запатентован метод экспресс-анализа морозостойкости озимой пшеницы, пырея и других злаков.

3. Разработана биотехнология получения чистых андрогенных линий пырея сизого в культуре изолированных пыльников.

4. Разработан метод тестирования генотипов пырея сизого по способности к андрогенному развитию микроспор в культуре пыльников.

5. С помощью усовершенствованной гаплоидной технологии и применения метода андрогенеза, как теста создана многочисленная, не имеющая аналогов в мире генетическая коллекция (растения и семенной материал) гаплоидов, удвоенных гаплоидов и родительских растений пырея сизого.

6. Разработан метод выявления генотипов пшеницы, хорошо скрещивающихся с пыреем по отзывчивости к биостимуляторам.

7. Проведены масштабные скрещивания морозостойких сортов озимой пшеницы с еще более морозостойкими андрогенными линиями пырея сизого. В результате гибридизации и последующего беккроссирования получен обширный материал пшеничнопырейных гибридов, с которым ведется дальнейшая работа по созданию морозостойких сортов озимой пшеницы.

8. Разрабатывается альтернативный метод переноса признака морозостойкости от пырея пшенице методом листовой няньки. С применением этого метода получены морозостойкие линии озимой пшеницы.

Размахнин Е.П. Генофонд пырея сизого как источник расширения биоразнообразия пшеницы. Информационный ВЕСТНИК ВОГиС, 2008, т. 12, №4, С. 701-709.

Рубан А.С.

ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА им.

К.А.Тимирязева, 127550, Россия, Москва, Тимирязевская 49, [email protected] Род Trifolium L. является самым крупным в трибе Trifolieae семейства Бобовые Fabaceae (Leguminosae) и насчитывает около 300 видов. Впервые род был описан Турнефором в 1700 г. (Бобров, 1947; Zohary, Heller, 1984). Систематическое положение клевера подземного Trifolium subterraneum L. в классификации клеверов достаточно долго являлось спорным, как и то, считать ли данный вид комплексным, состоящим из трёх подвидов (subspecies), выделять ли три самостоятельных вида (species), или же относить морфологические вариации к разновидностям (varietas) в пределах одного вида.

Родиной подземного клевера считается средиземноморский регион, в диком виде он распространён в Крыму, на Кавказе, характерен для всей Средиземноморской области (Бобров, 1947). В культуре широко возделывается в Австралии, Канаде, Новой Зеландии, а так же в Польше, Литве и ряде других стран. Является хорошим пастбищным растением, образует способные к самовозобновлению, устойчивые к вытаптыванию травостои. Как представитель семейства Бобовые, обладает высокой кормовой ценностью. В настоящее время получены трансгенные растения подземного клевера, обладающие повышенной устойчивостью, в частности, к гербицидам (Dear et al., 2003), а также растения с измененным аминокислотным составом запасных белков (Khan et al., 1996).

Цитологически клевер подземный исследован слабо, данные о числе хромосом разнятся от 12 до 16. Но большинство авторов свидетельствуют о 2n=16 (Wexelsen, 1928; Zohary, Katznelson, 1958).

Цитологические исследования клевера подземного (T. subterraneum subsp.

subterraneum L.) выполнены на кафедре генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА им. К.А.

Тимирязева. Для приготовления препаратов митотических хромосом использовали корневые меристемы проростков семян. Предфиксационную обработку материала проводили насыщенным раствором -Br-нафталина. Корешки фиксировали в уксусном алкоголе (Пухальский и др., 2007). Анализ проводили на постоянных препаратах хромосом, окрашенных двумя способами: флуоресцентным красителем DAPI и С-методом дифференциального окрашивания (C-Banding protocol of Kansas State University).

Хромосомное число данного вида составляет 2n=16 (х=8). Морфологически все хромосомы имеют большое сходство. По этой причине целесообразным оказалось применение методов дифференциального окрашивания для выделения характерных гетерохроматиновых блоков. По обеим методикам получены идентичные результаты. На каждой хромосоме чётко выделяются крупные блоки прицентромерного гетерохроматина.

Кариотипирование осуществляли в соответствии с положением блоков и с учётом относительных длин хромосом. По относительной длине идентифицируется пара крупных хромосом, имеющих длину около 8% от длины генома. Спутничные хромосомы составляют порядка 5%, спутники – 3%. Таким образом, составлен кариотип клевера подземного.

Оценка устойчивости трансгенных растений картофеля с геном глюкозооксидазы к Савчин Д.В., Панюш А.С., Картель Н.А.

ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», 220072, Беларусь, Минск, ул.

Академическая, 27, [email protected] Глюкозооксидаза (-D-глюкозо: O2-1-оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.4) катализирует реакцию окисления -D-глюкозы до -D-глюконо--лактона и сопряженное восстановление молекулярного кислорода до пероксида водорода. Пероксид водорода обладает бактерицидным действием и потенциально способен активизировать защитные системы растений. Ген gox, кодирующий глюкозооксидазу, клонирован из грибного штамма 46.1 P. funiculosum и использован для создания генетических векторов для трансформации растений. В качестве объекта для трансформации использовался картофель сорта белорусской селекции «Скарб». Отбор трансгенных растений осуществлялся на селективной среде, содержащей канамицин. Наличие встройки трансгена определяли методом ПЦР с праймерами специфичными к последовательности гена gox. Отсутствие рекомбинантных агробактериальных штаммов в растениях, потенциально являющихся источником ложно-положительных результатов при ПЦРанализе трансформантов, проверяли методом ПЦР с праймерами специфичными к агробактериальному гену VirE2. Синтез и активность рекомбинантного белка глюкозооксидазы были проверены методом чашечного теста, основанного на реакции окисления глюкозы глюкозооксидазой и образовании пероксида водорода.

Линии трансгенных растений с наивысшим уровнем экспрессии целевого гена были отобраны для определения уровня устойчивости к фитофторозу и черной ножке.

Оценка устойчивости трансгенных образцов картофеля к фитофторозу по листьям вычислялась по шкале от 1 балла (очень низкая устойчивость) до 9 баллов (очень высокая устойчивость). Среди 87 образцов трансгенных растений был выявлен 1 образец (1,1%) с высокой устойчивостью (8 баллов), 16 образцов (18,4%) с относительно высокой устойчивостью (7 баллов), 28 образцов (32,2%) со средней устойчивостью (5 баллов).

Нетрансгенные растения картофеля сорта «Скарб» характеризуются низкой устойчивостью (3 балла).

Оценку образцов картофеля на устойчивость к черной ножке по ботве проводили по методу Кирай и др. (1974). Выявлен один образец с относительно высокой степенью устойчивости (7 баллов). Остальные образцы проявили среднюю устойчивость (5-6, баллов). Сорт «Скарб» характеризуется как среднеустойчивый в отношении к черной ножке (6 баллов).

Таким образом, можно заключить, что экспрессия гена глюкозооксидазы в растениях приводит к увеличению их устойчивости к неблагоприятному действию патогенов. Однако отобранные растения требуют более детального изучения.

Влияние активности рибонуклеаз на восприимчивость разных сортов гречихи к Синдаровская Я.Р.1*, Лозовая О.Й.2**, Юзвенко Л.В.2, Диденко Л.Ф.2, Спивак Н.Я. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, ул. акад.

Заболотного 148, г. Киев, Украина, 03680, *e-mail: [email protected] Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, ул. акад.

Заболотного 154, г. Киев, Украина, 03143, **e-mail: [email protected] Вирусные болезни являются существенной проблемой для получения высоких урожаев ценных сельскохозяйственных культур. Среди крупяных культур Украины важное место занимает гречиха. Растения гречихи поражаются более чем 30-ю различными патогенами, к числу которых относится и фиторабдовирус - вирус ожога гречихи (ВОГ). ВОГ вызывает существенные повреждения растения и в результате урожайность культуры может падать на 80%. Ранее было показано, что разные сорта гречихи имеют различную чувствительность к ВОГ. Одной из причин может быть различная активность рибонуклеаз (РНКаз). РНКазы - белки гидролизирующие РНК - присутствуют в интактном растении на базовом уровне, но влияние стрессовых факторов биотической и абиотической природы может существенно усиливать активность РНКаз.

Для работы были выбраны два сорта гречихи с различной восприимчивостью к ВОГ:

"Кара-Даг" - средне поражаемый сорт, "Роксолана" - слабо поражаемый сорт. Активность РНКаз в верхних неповрежденных листьях зараженных и незараженных растений измерялась каждые 3 дня в течение трех недель.

В ходе работы показано, что активность РНКаз у сорта "Роксолана" в целом за время эксперимента была выше, чем у сорта "Кара-Даг". Контрольные растения демонстрировали незначительные изменения активности, которая со временем падала. При этом активность РНКаз у сорта "Роксолана" была несколько выше, чем у сорта "Кара-Даг".

Растения, инфицированные ВОГ, демонстрировали значительные различия в активности РНКаз в зависимости от времени истекшего после заражения. Так, растения сорта "Роксолана" имели высокие уровни РНКазной активности в течение двух недель. На 16й день после заражения активность РНКаз значительно падала, но затем снова повышалась (19й день). Временное уменьшение активности РНКаз не способствовало развитию системной вирусной инфекции.

Иные показатели наблюдали у сорта "Кара-Даг". На 7й день активность РНКаз в листьях инфицированных растений значительно падала. В дальнейшем активность РНКаз изменялась скачкообразно: увеличение активности сменялось снижением и наоборот. К концу срока эксперимента растение имело симптомы системной вирусной инфекции.

Падение РНКазной активности на начальных стадиях инфекции могло способствовать успешной репродукции и распространению вируса по растению. А нестабильность РНКазной активности во время эксперимента может быть причиной восприимчивости сорта к ВОГ. В противоположность, высокая активность РНКаз у сорта "Роксолана" на начальных стадиях инфицирования предупреждает распространение вируса по растению, что, вероятно, и обуславливает слабую восприимчивость сорта к ВОГ.

Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что внутренние защитные механизмы растения (в данном случае активность РНКаз) могут быть критерием отбора устойчивых к патогенам сортов растений.

Усик или листочек? Генетический контроль развития листа у гороха посевного Синюшин А.А.

Кафедра генетики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, [email protected] Представители трибы Fabeae (сем. Fabaceae), включающей целый ряд важных в хозяйственном отношении видов, характеризуются достаточно специализированным типом сложного листа. У большинства представителей развивается два типа латеральных структур на оси (рахисе) листа – усики и листочки. У гороха посевного (Pisum sativum L.) определение типа латеральной структуры листа контролирует целый ряд генов – TENDRIL-LESS (TL), TENDRIL-LESS2 (TL2), UNIFOLIATA (UNI) и др.

В рамках представляемой работы охарактеризованы особенности фенотипического проявления мутации tl. Показано, что при развитии листа у мутантов происходит гибридизация программ развития, и формируются листочки аномального строения.

Возникающий у мутантов лист несет только листочки, но отличается по структуре от безусикового листа диких бобовых (Galega, Astragalus и др.). Таким образом, у мутанта tl происходит не простая замена усиков на листочки, как это предполагалось ранее, а комбинирование морфогенетических программ.

Изучены особенности фенотипического проявления и взаимодействия с другими генами ранее не изученной мутации tendrilled acaciaA (tacA). Показано, что ген TACA также регулирует определение границы между усиками и листочками. Описаны особенности действия мутации на уровне морфологии листа и экспрессии ключевых генов.

Также охарактеризован новый делеционный аллель гена COCHLEATA (COCH), контролирующего развитие прилистников. Описано влияние этого гена на форму листочков и характер развития эпидермиса. Сравнение фенотипа известных мутантов coch с дикорастущими представителями подсемейства Caesalpinioideae (Delonix, Peltophorum) позволило сделать вывод о возможной роли этого гена в эволюции семейства.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 10-04-01480).

Мультилокусный анализ полиморфизма сортов перца C. annum.

Снигирь Е.А.

ВНИИССОК,143080,Россия, Московская обл., Одинцовский р-н, пос.ВНИИССОК, ул.

Селекционная, Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, 117312, Россия, Москва, просп.

Шестидесятилетия Октября, 7/ 1, [email protected] Перец (род Capsicum) является одной из наиболее широко распространенных овощных культур. Основная трудность молекулярного маркирования перца (род Capsicum) связана с консервативностью генома и узкой генетической основой особенно культивируемых форм C. annuum. Исследования рода Capsicum показали, что уровень изменчивости среди культивируемых форм перца значительно ниже, чем среди дикорастущих форм. В настоящее время для изучения генетического разнообразия, идентификации генотипов, а так же оценки селекционных ресурсов, в том числе и близкородственных геномов, таких как сорта культивируемых видов, главным образом, используется метод AFLPTM (Amplified Fragment Length Polymorphism).

В данной работе с целью оценки внутривидового генетического потенциала сортов C. annuum, наиболее использующихся в отечественной селекции был проведен мультилокусный AFLP анализ 48 генотипов перца, представленных 45 сортами C.annuum отечественной и зарубежной селекции. В качестве внешней группы использовались образцы родственных видов перца C. frutescens, C. chinense, C. baccatum. AFLP-анализ проводили по стандартной методике (Vos et al., 1995). При этом были использованы комбинация EcoRI/TruI и ранее отобранные 6 праймерных пар. Разделение полученных фрагментов ДНК выполнялось в 6% полиакриламидном геле с использованием высокоразрешающей системы LI-COR 4300 DNA анализатора (www.licor.com).

В результате провеленного маркирования генома для каждого генотипа были получены воспроизводимые полиморфные AFLP спектры. Число полиморфных фрагментов варьировало от 96 (для E35/M61) до 167 (для E41/M61). Всего было получено полиморфных фрагментов генома C. annuum. На основе полученных фрагментов были определены коэффициенты попарных генетических различий (расстояния Nei-Li) и построены дендрограммы с использованием метода объединения соседей (NeighborhoodJoining, NJ) в программе PAUP 4.0b10 (Swofford, 2002), а также Байесовского подхода (Bayesian Inference, далее BI) в программе MrBayes v3.0b3 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). В результате были определены группы генетически схожих и более отдаленных сортов, выявлены сортоспецифические ферменты, которые в последующем могут быть использованы для разработки ДНК маркеров этих сортов. Отобранные наиболее информативные комбинации праймер/фермент могут быть рекомендованы как вспомогательный инструмент для детекции и анализа генетического разнообразия и сходства генотипов при создании новых сортов перца.

Работа была выполнена при поддержке гранта ГК № 16.М04.11.0004.

Генетические основы и роль в стрессоустойчивости признаков антоциановой окраски у изогенных линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) Терещенко О.Ю., Гордеева Е.И., Арбузова В.С., Хлесткина Е.К.

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, 630090, Россия, Новосибирск, пр.ак.Лаврентьева,10, ИЦиГ СО РАН, [email protected] Антоциановые соединения играют важную роль в обеспечении устойчивости растений к различным типам биотических и абиотических стрессов, благодаря их ярко выраженным антиоксидантным свойствам. У пшеницы антоцианами могут быть окрашены различные органы: стебель, листовые пластинки, листовые влагалища, перикарп зерна, колеоптиле и т.д. Гены, контролирующие данные признаки, локализованы в геноме пшеницы (McIntosh et al., 2010), однако молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе их формирования, оставались малоизученными. Также оставалось неясным, способствует ли наличие антоцианового пигмента в данных органах пшеницы устойчивости к стрессорным воздействиям.

В настоящей работе использовались сорт Саратовская 29 (C29) и две изогенные линии, i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P, полученные на основе С29, но имеющие участки интрогрессий генетического материала от сортов-доноров Purple Feed и Purple, соответственно (Arbuzova et al., 1998), которые определяют окраску перикарпа зерна (гены Pp1 и Pp3) и более интенсивную окраску стебля (Pc), колеоптиле (Rс), листовых пластинок (Plb) и листовых влагалищ (Pls) по сравнению с С29. С помощью микросателлитных маркеров определена локализация и установлена протяжённость этих участков в хромосомах 2А (Pp3) и 7D (Pp-D1, Rc-D1, Plb-D1, Pls-D1, Pc-D1). Анализ транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов (Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans) в контрастно окрашенных органах у С29, i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P показал регуляторную роль генов, контролирующих фенотипическое проявление признаков антоциановой окраски различных органов, по отношению к структурным генам биосинтеза антоцианов.

С29 и две изогенные линии i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P использовались также для определения роли антоциановой окраски перикарпа зерна и колеоптиле в стрессоустойчивости проростков мягкой пшеницы. В качестве стрессорных стимулов к однодневным проросткам пшеницы добавлялись соли NaCl (100 и 200 mM), CdCl2 (25 и µM) и 15% PEG6000, моделируя условия засоления, загрязнения среды ионами тяжёлых металлов и засуху, соответственно. Эксперимент проводился в трёх повторностях для каждого генотипа и концентрации. С 3 по 7 день после прорастания зерна оценивалось содержание антоцианов в колеоптиле. Показано, что при действии солевого стресса и засухи происходит увеличении содержания антоцианов в колеоптиле у всех трёх генотипов мягкой пшеницы в 1.2 – 1.8 раз, тогда как при действии CdCl2 усиление биосинтеза в 1.2 раза наблюдалось только у C29. Сравнение морфометрических показателей между линиями показало, что интенсивно окрашенные изогенные линии имеют более высокие морфометрические показатели при действии различных типов стрессов по сравнению со слабоокрашенной С29, что указывает на возможную роль антоциановых соединений в широкой адаптации пшеницы в условиях абиотического стресса.

Неполовые системы размножения растений: генетический контроль и селекционные Тырнов В.С.

Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского, 410012, Россия, Саратов, Астраханская, 83, [email protected] Среди разных систем размножения наибольший интерес привлекают такие как апомиксис, гаплоидия, андрогенез, полиэмбриония. Показано, что на их основе возможно закрепление гетерозиса и других уникальных свойств гибридов, повышение эффективности селекционного процесса за счёт значительного сокращения его сроков и создания условий для проявления в первом поколении всех генов, включая рецессивные.

Андрогенез, кроме того, позволяет создавать «генетически чистые» аллоплазматические линии, что открывает новые возможности для изучения нехромосомного наследования признаков и ускоренного создания линий с ЦМС.

Нами установлено, что в основе всех перечисленных систем размножения может лежать одно явление – партеногенез; разработана его классификация (Тырнов, 2000;

Tyrnov, 2010).Установлено, что партеногенез может быть индуцированным и определяемым ядерными факторами материнской формы. Способность к партеногенезу может при гибридизации передаваться потомству через яйцеклетку и пыльцу. Нами созданы линии кукурузы, у которых частота редуцированного партеногенеза может достигать 100%.

На основе индуцированного и наследуемого партеногенеза разработаны технологии ускоренного создания гомозиготных линий кукурузы. Получены линии-гаплоиндукторы, при использовании которых в качестве отцовских форм, у материнских родителей происходит лишь одинарное оплодотворение ядра центральной клетки и развитие эндосперма. Яйцеклетка остаётся неоплодотворённой и развивается в гаплоидный зародыш. Частота гаплоидии достигала 10 -12 %.

При наследуемом партеногенезе, частоты гаплоидии резко возрастают при задержке опыления ( до 20, 50, 100 % и даже более 100% за счёт полиэмбрионов типов nn, n-2n-n, n-n-n). Такие частоты в производственных посевах были бы вредны. Однако в них опыление идёт по мере появления рылец, т.е. без задержки опыления и гаплоиды возникают с низкой частотой (менее 1%).

Наследуемый партеногенез перспективно использовать для дальнейшего синтеза диплоидных и полиплоидных апомиктов. Это было показано в модельных опытах, при использовании тетраплоидов, предрасположенных к партеногенезу.

С партеногенезом может быть связан и андрогенез. Если яйцеклетка приступила к делению, то ядро спермия не может слиться с её ядром. При этом могут возникать матроклинно-андрогенные двойни, или только андрогенные растения, если яйцеклетка, тем или иным способом была инактивирована. При изучении андрогенного потомства был выявлен ряд цитоплазматических эффектов, том числе, влияющих на структуру урожая.

Работа выполнена при поддержке грантами № 2.1.1/11524 и № 2.2.3.1/11144 Аналитической ведомственной целевой программы Минобрнауки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы».

Тюрин А.А., Бердичевец И.Н.2, Милюкова Н.А.1, Вячеславова А.О. ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА им.

К.А.Тимирязева,127550, Россия, Москва, Тимирязевская 49, [email protected] ІУРАН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991, Россия, Москва, Губкина Ген Lanceolata относится к группе факторов транскрипции TCP и отвечает за развитие сложного листа у томата. Доминантный аллель этого гена появился в результате спонтанной мутации. Доминантные гомозиготы чаще всего нежизнеспособны.

Гетерозиготы жизнеспособны и плодовиты, стебли таких растений тонкие и сильно ветвятся. Рецессивные гомозиготы имеют фенотип дикого типа.

У гена ланцетного листа томата имеется 5 доминантных аллелей. Различия между аллелями (в том числе и диким типом) сводятся к однонуклеотидным заменам (которые в аллелях Lanceolata-2 и Lanceolata-5 приводят ещё и к замене аминокислот в белке) в сайте связывания с микроРНК (miR319).

Регуляция экспрессии гена Lanceolata осуществляется при помощи связывания микроРНК с транскриптом этого гена и с последующим запуском различных процессов, составляющих РНК-интерференцию. В свою очередь продукт гена Lanceolata подавляет активность генов группы KNOXI, отвечающих за закладку новых органов, в частности за развитие рассечённого листа. У доминантных аллелей гена Lanceolata ввиду нарушения в сайте связывания с микроРНК (о которых упоминалось выше) понижается резистентность матричной РНК к микроРНК, что приводит к подавлению активности генов группы KNOXI и, следовательно, блокирует формирование рассечённого листа.

Для выяснения механизмов развития апикальной меристемы и некоторых органов при постоянной экспрессии мутантного (т.е. резистентного к микроРНК) аллеля целевого гена и при полном отсутствии экспрессии данного гена, нами разработана схема эксперимента, включающего:

Ген Lanceolata клонирован при помощи ПЦР в вектора pGEM-T Easy и pRT100.

Для обеспечения стабильной экспрессии целевого гена был выбран промотор 35S РНК CaMV, который обеспечивает высокий уровень экспрессии целевых генов.

Для проверки наличия эффективной экспрессии целевого гена, был сконструирован гибридный ген, в котором ген Lanceolata имеет транскрипционнотрансляционное слияние с последовательностью репортерного гена, кодирующего сконструированный гибридный ген будут использованы для выяснения физиологической роли этого гена на моделях трансгенных растений томатов.

Работа была выполнена при поддержке грантов ГК № 14.740.12.0826 и ГК № 16.512.11. Анализ внутрисортового полиморфизма сортообразцов лука-порея Allium porrum Филюшин М.А.

Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, Москва, 117312;

e-mail: [email protected] Лук-порей Allium porrum в настоящее время становится одной из наиболее перспективных овощных культур в силу своих вкусовых качеств, а также фармакологических свойств. Трудности селекции лука-порея связаны с тем, что A. porrum является перекрестно опыляющейся культурой, а также с аллополиплоидной природой его генома и высокой инбредной депрессией в случае самоопыления. В связи с этим в селекционной работе особое значение приобретает оценка внутрисортового полиморфизма и контроль генетической выравненности индивидуальных растений внутри сорта.

В данной работе впервые с использованием методов RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) анализа генома был исследован внутрисортовой полиморфизм трех сортообразцов лука-порея: два сорта отечественной селекции – Премьер и Сегун, и французский сорт Monstreux de Elbeuf. На ограниченном наборе ДНК генотипов индивидуальных растений сорта Премьер было протестированы RAPD- и ISSR-праймеры, из которых для последующего анализа полиморфизма сортов были отобраны три праймера: 2 RAPD- OPA10 и OPD3, 1 ISSR - M1). Данные праймеры приводили к получению воспроизводимых полиморфных ДНК спектров.

Всего в результате проведенного RAPD- и ISSR- анализа внутрисортового полиморфизма 16 индивидуалов каждого из сортообразцов лука-порея было получено от 18 до 34 RAPD- и ISSR-фрагментов, из них полиморфными были от 8 до 14 фрагментов.

Наибольшее число полиморфных фрагментов детектировалось с использованием праймера OPD3, который может быть предложен для детекции и анализа внутрисортового полиморфизма у A. porrum.

На основе полученных спектров были рассчитаны коэффициенты генетических расстояний (коэффициента Нея-Ли) между индивидуальными генотипами каждого из сортообразцов лука-порея. У индивидуалов сорта Премьер среднее генетическое расстояние между образцами составило 0,028 (минимальное значение 0,009, максимальное значение 0,05), у индивидуалов сорта Monstreux de Elbeuf среднее значение генетического расстояния составило 0,021 (минимальное значение 0,00, максимальное значение 0,05), у индивидуалов сорта Сегун среднее значение составило 0,024 (минимальное значение 0,00, максимальное значение 0,04).

Таким образом, в данной работе впервые был проведен анализ внутрисортового полиморфизма ДНК лука-порея и, опираясь на полученные данные, можно сделать следующие выводы:

- выявленный с использованием RAPD и ISSR анализа внутрисортовой полиморфизм был достаточно низок и не превышал значений 0.05, несмотря на то, что лук-порей является растением с перекрестным опылением.

- ни один из использованных праймеров для RAPD и ISSR анализа не выявил аутоморфных фрагментов у индивидуалов внутри сорта.

Работа была выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие».

Особенности структурно-функциональной организации генов растений в Хлесткина Е.К.

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, e-mail: [email protected] При гибридизации близких видов растений, имеющих похожие, но не идентичные геномы, могут образовываться аллополиплоидные формы. Считается, что через аллополиплоидизацию и последующую диплоидизацию прошли многие виды растений.