«КОМПЛЕКС МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ NK-КЛЕТОК В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ ...»

меченные флюоресцеина изотиоцианатом (FITC) МАТ к CD107a (клон H4A3, BD Bioscience, США, каталожный номер 555800), перфорину (клон G9, Abcam, Великобритания, каталожный номер ab18385) и CD94 (eBioscience, США) меченные фикоэритрином (PE) МАТ к CD8, CD56, CD63, СD94, CD159a (NKG2A), CD314 (NKG2D), CD335 (NKp46) (все Beckman Coulter, США) и к CD16 (Сорбент, Россия);

меченные ECD МАТ к CD3 (Beckman Coulter);

меченные фикоэритрином-Cy5 (РС5) МАТ к CD3 (Beckman Coulter) и меченные фикоэритрином-Cy7 (РС7) МАТ к CD56 (Beckman Coulter);

изотипические контроли: мышиные IgG1 и IgG2b с меткой FITC (Caltag-Invitrogen, Великобритания), IgG1 и IgG2a с меткой PE 2.2.4. Флюоресцентные красители Probes, США). Маточный раствор (5 мМ на ДМСО) хранили в течение длительного времени при –20°С в посуде из темного стекла.

Для определения погибших клеток К562 использовали пропидий-йодид (PI, Sigma). Маточный раствор (1 мг/мл на ФСБ) хранили при +4°С в посуде из темного стекла в течение длительного времени.

2.2.5. Прочие реактивы для иммунофлюоресцентной окраски клеток Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) — 1 таблетку ФСБ («ПанЭко») растворяли в 100 мл дистиллированной воды, при необходимости доводили рН до 7,2—7,4. Хранили не более 1 месяца при +4°С.

Раствор для фиксации клеток — 4% раствор параформальдегида (Sigma) в ФСБ. Хранили не более 1 месяца при +4°С.

Раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) — 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (РАА, Австрия) в ФСБ. Хранили не более недели при +4°С.

Раствор для пермеабилизации клеток — 0,5% раствор БСА и 0,1% раствор сапонина (Sigma) в ФСБ. Раствор не хранили, готовили непосредственно перед использованием.

ФСБ с азидом натр ия и ЭДТА — 0,02% раствор азида натрия (Sigma) и 0,02% раствор ЭДТА (Лаверна, Россия) в ФСБ. Раствор хранится длительно при +4°С.

2.2.6. Расходные материалы Планшеты 96-луночные круглодонные полистироловые (Ленинградский завод медицинских полимеров), пробирки однократного применения объемом мл, 1,5 мл и 0,5 мл типа Эппендорф (все Corning, США) и цитометрические пробирки (Beckman Coulter).

2.2.7. Оборудование Лазерный проточный цитометр Cytomics FC500 фирмы Beckman Coulter с возможностью одновременной детекции малоуглового (переднего) светорассеивания (канал FSC), бокового светорассеивания (канал SSC) и пяти параметров флюоресценции (каналы FL1 — FL5), из которых канал FL предназначен для детекции FITC и CFSE, FL2 — PE, FL3 — ECD или PE-Texas Red, FL4 — PC5 и PI, FL5 — PC7. Запись и анализ данных производили с помощью программного обеспечения CXP (Beckman Coulter).

Ламинарный бокс (Flow, США), создающий непрерывный ламинарный поток воздуха для обеспечения стерильных условий работы.

Прочее оборудование: мультифункциональные программируемые и термостатируемые центрифуги Allegra 25R (Beckman Coulter) и Heraeus Sepatech (Германия); морозильная камера с поддежанием температуры –70°С (Sanyo, Япония) и –20°С (Минск-17, Беларусь); холодильник «Саратов 1615-М»

(Россия); микроскоп Laborlux D (Leitz, Германия); инкубатор с поддержанием температуры +37°С и концентрации СО2 5% (Jouan, Франция); аналитические электронные весы (Ohaus Analytical Plus, Швейцария), рН-метр (Mettler Toledo, переменным объемом «Ленпипет» (Россия); камера Горяева, модель (Ленинградское производственное объединение «Красногвардеец»).

2.3. Забор крови и выделение мононуклеарных клеток Забор крови (15 мл, у детей — 5—10 мл) осуществляли из периферической вены в стерильные пробирки фирмы Sarstedt (Германия), содержащие литий-гепарин. Кровь разводили средой 199 в 2 раза, и по 10 мл разведенной крови наслаивали на 3 мл фиколл-верографина. Пробирки центрифугировали при 400g в течение 25 минут при +15°С, после чего отбирали слой мононуклеарных клеток (МНК) с границы между фиколл-верографином и плазмой. Клетки трижды отмывали средой 199, ресуспендировали в ПКС, считали в камере Горяева и доводили до концентрации 12,5 млн/мл (для определения дегрануляции), 5 млн/мл (для определения NK-активности) или млн/мл для внутриклеточной окраски клеток. Жизнеспособность МНК после окраски трипановым синим составляла не менее 98%.

2.4. Культивирование клеток K Клетки K562 вели в ПКС, пассировали каждые 2—3 сут. Для опыта использовали клетки на вторые сутки после пересева.

2.5. Определение дегрануляции NK-клеток по экстернализации Дегрануляцию NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии по появлению на поверхности NK-клеток (экстернализации) маркера CD107a после стимуляции in vitro. Использовали методику Alter и соавт. [13], с небольшими модификациями. В качестве индукторов дегрануляции NK-клеток использовали клеточный стимул — клетки эритромиелоидной HLA-I-негативной линии K562, а также нерецепторный стимул — ФМА в сочетании с иономицином (ФМА+ИОН). Клетки К562 в требуемом для опыта количестве отбирали из культурального флакона, осаждали, отмывали средой RPMI-1640 (300g; 10 мин), считали в камере Горяева с красителем трипановым синим и доводили до концентрации 12,5 млн/мл. Жизнеспособность клеток К562 после окраски трипановым синим составляла не менее 95%.

В лунки 96-луночных круглодонных планшетов вносили в указанном порядке: 1) 40 мкл 40-мкМ раствора моненсина на ПКС; 2) 40 мкл FITCмеченных МАТ к CD107a, разведенных на ПКС 1/50; 3) 40 мкл суспензии МНК с дегрануляции: 40 мкл клеток К562 (510 5 клеток / 40 мкл, соотношение МНК:

К562 = 1:1) или 40 мкл ФМА+ИОН с концентрациями 400 нг/мл и 2 мкг/мл соответственно. Конечные концентрации реагентов в лунках составляли:

моненсин — 10 мкМ, ФМА — 100 нг/мл, ИОН — 0,5 мкг/мл; конечное разведение МАТ к CD107a — 1/200. В качестве положительного контроля дегрануляции использовали ФМА+ИОН в комбинации с цитохалазином Б (ЦБ).

Последний добавляли вместе с ФМА+ИОН до конечной концентрации 5 мкг/мл, исходя из литературы по дегрануляции нейтрофилов [166]. В лунку отрицательного контроля вместо индукторов дегрануляции добавляли равный объем ПКС. Для контроля окраски на CD107a в еще одну контрольную лунку не добавляли антитела к CD107a.

При оценке эффекта циклогексимида (ЦГ) готовили по 2 лунки на каждый индуктор дегрануляции. ЦГ добавляли в одну из лунок до конечной концентрации 10 мкг/мл, перед добавлением индукторов, после чего МНК инкубировали 15 мин при 37°C. Затем к МНК добавляли индукторы дегрануляции как описано выше.

После добавления всех ингредиентов содержимое лунок однократно перемешивали пипеткой, после чего планшет центрифугировали при 200 g ( мин) для осаждения клеток и инкубировали 4 ч в СО2-инкубаторе (5% СО2, 37°С). (Указаны окончательные условия реакции, определенные в предварительных опытах, где варьировали время инкубации, концентрации реагентов, количество клеток на лунку.) По окончании инкубации планшет еще раз центрифугировали (450 g, 2 мин), отбирали супернатант и ресуспендировали клетки в 150 мкл ФСБ с 0,02% азидом натрия и 0,02% ЭДТА для диссоциации клеточных агрегатов в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем клетки отмывали в ФСБ с 0,5% БСА, ресуспендировали в том же буфере и докрашивали PC5-меченными МАТ к CD3 и PE-меченными МАТ к CD56 для идентификации NK-клеток (4°С, 20 мин, разведения антител 1/100). Окрашенные клетки анализировали на 5-канальном проточном цитометре Cytomics FC500 с использованием программного обеспечения CXP. NK-клетки идентифицировали представляли как процент CD107a+ NK-клеток по отно шению ко всем NKклеткам и как процент CD107a+ NK-клеток по отношению к МНК. Также оценивали среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) CD107a на CD107a+ NK-клетках.

При исследовании фенотипа дегранулирующих NK-клеток докрашивание клеток после инкубации проводили PC5-меченными МАТ к CD3, PC7меченными МАТ к CD56 и одним из следующих МАТ, меченных PE: CD8, CD57, CD94, CD159a, CD335.

В некоторых опытах, чтобы получить нужное сочетание маркеров и меток, вместо FITC-меченных МАТ к CD107a использовали PC5-меченные, а после инкубации с индукторами дегрануляции клетки докрашивали FITC-меченными МАТ к CD94, PE-меченными МАТ к CD335, ECD-меченными МАТ к CD3 и PC7-меченными МАТ к CD56.

При оценке CD63 в качестве маркера дегрануляции использовали PEмеченные МАТ к CD63, которые добавляли в культуры в разведении 1/ вместе с FITC-меченными МАТ к CD107a. После инкубации клетки докрашивали PC5-меченными МАТ к CD3 и PC7-меченными МАТ к CD56.

2.6. Определение NK-активности МНК NK-активность МНК исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней K562, меченных флуоресцентной меткой CFSE [6].

Для мечения клетки К562 дважды отмывали в ФСБ-Д (1200 об/мин; 10 мин), ресуспендировали в ФСБ-Д, подсчитывали в камере Горяева и доводили до конечной концентрации 20x106/мл. Добавляли равный с объемом клеток объем CFSE с концентрацией 1,2 мкМ (конечная концентрация — 0,6 мкМ) и инкубировали клетки в течение 10 мин в темноте при 37°C. Мечение останавливали путем добавления 10-кратного объема холодного ФСБ-Д с 20% ФТС, после чего клетки осаждали, отмывали 1 раз ФСБ-Д и 1 раз ПКС ( об/мин; 10 мин). Затем клетки K562 ресуспендировали в ПКС, еще раз считали в камере Горяева и доводили до рабочей концентрации 0,1x106/мл.

Жизнеспособность клеток К562 по окраске трипановым синим была >95%.

В лунки 96-луночных круглодонных планшетов вносили по 80 мкл суспензии меченных K562 (8103 клеток на лунку). Выделенные МНК добавляли к клеткам-мишеням в объеме 80 мкл таким образом, чтобы соотношение эффектор (МНК):мишень (К562) составило 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1 и 3,125:1. В предварительных опытах на здоровых донорах было обнаружено, что повышение Э:М до 100:1 не приводит к значимому повышению киллинга, в связи с чем это соотношение не использовали. Для контроля спонтанной гибели клеток-мишеней использовали лунки, в которые вместо МНК добавляли ПКС.

Планшет центрифугировали при 200 g в течение 1 мин и инкубировали в СО2инкубаторе в течение 4 часов. Время инкубации, соотношения эффектор:мишень и количество клеток-мишеней в лунке были подобраны после предварительных опытов. По истечении времени инкубации клетки ресуспендировали, переносили в цитометрические пробирки и окрашивали пропидий-йодидом (PI, конечная концентрация 1 мкг/мл; инкубация в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте). Пробы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500;

определяли процент погибших мишеней (PIbrightCFSE+ событий) по отношению ко всем CFSE+ событиям. Процент киллинга рассчитывали по формуле:

% погибших мишеней в опыте – % спонтанной гибели % киллинга = —————————————————————————100%.

Для более точной оценки NK-активности расcчитывали количество литических единиц-20 (ЛЕ20) на 105 МНК. ЛЕ20 — это количество МНК, необходимое для киллинга 20% мишеней K562. Расчет количества ЛЕ20 на МНК производили по формуле:

ЛЕ20 на 10 МНК = —————————, где 810 3 — количество мишеней на лунку; Э:М20 — соотношение эффектор:мишень, при котором киллинг составил бы 20%. Если 20%-ный киллинг не достигался даже при Э:М=50:1, то содержание ЛЕ20 на 105 МНК приравнивали к 0.

2.7. Внутриклеточная окраска на CD107a и перфорин Для определения внутриклеточного содержания CD107a и перфорина в NK-клетках сначала проводили поверхностную окраску МНК на CD3 и CD56, а затем, после фиксации и пермеабилизации клеток, внутриклеточную окраску.

Свежевыделенные МНК отмывали от ПКС и ресуспендировали в ФСБ c 0,5% БСА в концентрации 10x106/мл. По 50 мкл (5x105 клеток) помещали в цитометрические пробирки и добавляли к ним PC5-меченные МАТ к CD3 (1/50) и PE-меченные МАТ к CD56 (1/50). Клетки инкубировали с антителами при 4С в течение 20 мин, после чего отмывали 1 раз в 0,5% БСА/ФСБ и 1 раз в ФСБ.

После этого клетки ресуспендировали в 300 мкл 4% параформальдегида и инкубировали 20 мин. при 4°C. Фиксацию останавливали добавлением 900 мкл ФСБ, клетки осаждали и отмывали 1 раз в пермеабилизирующем буфере (0,1% сапонин и 0,5% БСА на ФСБ; 5 мин при 800 g). После осаждения пермеабилизирующего буфера и добавляли FITC-меченные МАТ к CD107a или перфорину (оба 1/100). В контрольный образец (изотип-контроль) от каждого исследуемого добавляли контрольный мышиный FITC-меченный IgG1 (1/100).

Клетки инкубировали с антителами в течение 25 мин. при комнатной температуре в темноте. После окончания инкубации клетки отмывали 1 раз в пермеабилизирующем буфере и 1 раз в ФСБ с 0,5% БСА, ресуспендировали в ФСБ с 0,5% БСА и анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 с использованием программного обеспечения CXP. Популяцию NK-клеток идентифицировали как описано в 2.5. Экспрессию внутриклеточных молекул NK-клетками представляли как среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) клеток при окраске специфическими антителами минус СИФ при окраске изотип-контролем.

2.8. Сочетанный анализ дегрануляции и внутриклеточной экспрессии перфорина и гранзима A Чтобы оценить остаточные уровни перфорина и гранзима A в NK-клетках после дегрануляции, реакцию дегрануляции ставили с FITC-меченными МАТ к CD107a как описано в разделе 2.5, докрашивали клетки PC5-меченными МАТ к пермеабилизировали, как описано в разделе 2.7. Внутриклеточную окраску проводили с помощью PE-меченных МАТ к гранзиму A и перфорину (оба 1/50).

Клетки отмывали и анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 как описано выше.

2.9. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов производили с помощью программ Microsoft Excel 2003, GraphPad Instat 3.06 и Statsoft Statistica 6.0. Все данные представляли как медиана (10-й — 90-й процентиль). Если в группе было менее 10 измерений, то вместо 10-го и 90-го процентилей указывали минимум и максимум группы. Две группы сравнивали при помощи непараметрического Uтеста Манна—Уитни. Три группы сравнивали с помощью теста Крускала—