Главная >> Диссертации - все темы

Pages: |

| 2 |

«КОМПЛЕКС МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ NK-КЛЕТОК В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА РОССИИ»

На правах рукописи

Муругин

Владимир Владимирович

КОМПЛЕКС МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

NK-КЛЕТОК В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.03.03 - иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Пащенков М.В.

МОСКВА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЗКЦТ – антителозависимая клеточная цитотоксичность;

БСА – бычий сывороточный альбумин;

ВПГ – вирус простого герпеса;

ГФС – гемофагоцитарный синдром;

ДАГ – диацилглицерол;

ИЛ – интерлейкин;

ИОН – иономицин;

ИС – иммунологический синапс;

ИФН – интерферон;

ЛЕ20 – литическая единица-20 (количество эффекторных клеток, необходимое для киллинга 20% мишеней);

МАТ – моноклональное антитело;

МНК – мононуклеарные клетки;

НАДФ – никотинамидадениндинуклеотид фосфат;

НАДФН – никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный;

ПКС – полная культуральная среда;

ПТС – параллельные тубулярные структуры (parallel tubular arrays);

СВО – синдром Вискотта-Олдрича;

СГЛ – семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз;

СИФ – средняя интенсивность флуоресценции;

СЧХ – синдром Чедиака-Хигаси;

ФАТ – фактор активации тромбоцитов ФМА – форбол-12-миристат-13-ацетат;

ФНО – фактор некроза опухолей;

ФСБ – фосфатно-солевой буфер;

ФСБ-Д – фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко;

ХГБ – хроническая гранулематозная болезнь;

ЦБ – цитохалазин Б;

ЦГ – циклогексимид;

ЦОМТ – центр организации микротрубочек;

ЦТЛ – цитотоксический лимфоцит;

ЧРГ – часто рецидивирующий герпес;

Э:М – соотношение эффектор:мишень;

CCR – C-chemokine receptor (рецептор C-хемокинов);

CD – cluster of differentiation (кластер дифференцировки);

CFSE – 5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (5-,6карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловый эфир);

cSMAC – central supramolecular activation complex (центральный супрамолекулярный активационный комплекс);

DNAM-1 – DNAX accessory molecule-1 (вспомогательная молекула, открытая в FasL – Fas ligand (лиганд антигена Fas);

FITC – fluorescein isothiocyanate (флюоресцеина изотиоцианат) HLA – human leukocyte antigens (антигены лейкоцитов человека; название главного комплекса гистосовместимости у человека);

ICAM – intercellular adhesion molecule (межклеточная молекула адгезии);

Ig – immunoglobulin (иммуноглобулин);

ITAM – immunoreceptor tyrosin-based activation motif (иммунорецепторный активационный мотив, основанный на тирозине);

ITIM – immunoreceptor tyrosin-based inhibition motif (иммунорецепторный ингибиторный мотив, основанный на тирозине);

KIR – killer cell immunoglobulin-like receptor (иммуноглобулиноподобный рецептор киллерных клеток);

KLR – killer cell lectin-like receptor (лектиноподобный рецептор киллерных LAD – leukocyte adhesion deficiency;

LAMP – lysosome-associated membrane protein (мембранный белок, ассоциированный с лизосомами);

LFA – lymphocyte function-associated antigen 1 (антиген, ассоциированный с функцией лимфоцитов; мембранный белок семейства интегринов);

MHC – major histocompatibility complex (главный комплекс гистосовместимости);

MIC – MHC-I homologs (молекулы, гомологичные MHC I класса);

NCR – natural cytotoxicity receptor (рецептор естественной цитотоксичности);

NKG – natural killer group protein 2 (белок естественной киллерной группы) ;

NK-клетки – natural killer cells, натуральные (естественные) киллерные клетки;

PC5, PC7, ECD – коммерческие названия флюоресцентных красителей;

PE – phycoerythrine (фикоэритрин) PI – propidium iodide (пропидий йодид);

pSMAC – peripheral supramolecular activation complex (периферический супрамолекулярный активационный комплекс);

RANTES – regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (хемокин, регулируемый активацией, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками) SNARE – soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor accessory-protein receptor (рецептор белка, вспомогательного для растворимого N-этилмалеимидчувствительного фактора);

Syk – spleen tyrosine kinase (селезеночная тирозинкиназа);

TRAIL – tumor necrosis factor receptor-related apoptosis inducing ligand (апоптозиндуцирующий лиганд для рецептора из семейства рецепторов фактора некроза опухолей);

ULBP – UL-16 binding protein (белок, связывающий антиген UL- цитомегаловируса;

VAV1 – протоонкоген VAV1;

VCA-домен – verproline-central-acidic domain (верпролин-центральный-кислый домен; один из доменов белка WASP);

WASP – Wiskott-Aldrich syndrome protein (белок синдрома Вискотта—Олдрича);

ZAP-70 – zeta-chain-associated protein kinase of 70 kDa (протеинкиназа массой кДа, ассоциированная с зета-цепью Т-клеточного рецептора).

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы противоопухолевом иммунитете. Определение их функциональной активности важно при диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов, ассоциированных с часто рецидивирующими или хроническими вирусными инфекциями, а также с онкологическими заболеваниями.

В настоящее время в лабораторной практике широко применяется только один метод оценки функциональной активности NK-клеток, а именно тест на NK-активность мононуклеарных клеток (МНК). Под NK-активностью понимают способность МНК, выделенных из крови обследуемого, без какой-либо предварительной активации убивать опухолевые клетки-мишени, лишенные экспрессии MHC I класса. Эта активность МНК опосредуется практически только NK-клетками. Исследование NK-активности МНК позволяет оценить киллерную функцию NK-клеток, но не дает возможности более точно охарактеризовать дефект в системе NK-клеток, если таковой имеется. Очевидно, что на NK-активность может влиять целый ряд параметров, в частности процентное содержание NK-клеток в образце МНК, содержание биологически активных перфорина и гранзимов в литических гранулах NK-клеток, способность NK-клеток дегранулировать (т.е. выбрасывать перфорин и гранзимы из литических гранул на поверхность инфицированных или опухолевых клетокмишеней), способность NK-клеток убивать мишени с помощью механизмов, не связанных с дегрануляцией. С развитием иммунотерапии и генотерапии возрастают возможности избирательно воздействовать на нарушения в каждом из перечисленных аспектов функционирования NK-клеток. Следовательно, необходим комплекс методов оценки NK-клеток, который позволил бы — у лиц с нарушением NK-активности — более точно установить уровень локализации функционального дефекта, с тем чтобы более целенаправленно проводить дальнейшую диагностику и терапию.

Сравнительно недавно был предложен новый способ оценки киллерной активности NK-клеток — тест на дегрануляцию. На внутренней стороне мембраны литических гранул находится антиген CD107a, который в результате дегрануляции оказывается на поверхности NK-клетки, где может быть выявлен с помощью иммунофлюоресцентной окраски. Хотя этот тест получил широкое распространение как вспомогательный метод исследования NK-клеток, специфичность CD107a как маркера именно дегрануляции, а не активации NKклеток не была достаточно хорошо обоснована. Неизвестно, существуют ли более информативные маркеры дегрануляции NK-клеток, чем CD107a.

Основной функциональный параметр NK-клеток — NK-активность — обычно оценивают с помощью радиоизотопного метода. Клетки-мишени линии K562, лишенные экспрессии MHC I класса, метят радиоизотопами (51Cr, 3H) и инкубируют с выделенными МНК пациента, после чего оценивают либо выход изотопа в супернатант, либо остаточную радиоактивность клеток-мишеней после периода инкубации. Однако этот подход требует специального оборудования (гамма- или бета-счетчик), а также разрешения на работу с радиоизотопами и особо осторожного обращения с ними. В то же время большинство крупных лабораторий клинической иммунологии в настоящее время располагают лазерными проточными цитометрами. Проточная цитометрия позволяет оценивать NK-активность без применения радиоактивных меток и, кроме того, дает возможность исследовать более тонкие параметры системы NK-клеток, в частности их процентное содержание, субпопуляционный состав, дегрануляцию, экспрессию цитотоксических белков и цитокинов.

Таким образом, разработка комплексного подхода к исследованию NKклеток и применение этого подхода для исследования пациентов с первичными иммунодефицитами и инфекционными заболеваниями является актуальной задачей. Актуальным является также использование проточной цитометрии в качестве методологической основы для исследования NK-клеток.

Цель работы Разработка и применение комплекса методов исследования NK-клеток у здоровых лиц, при вирусных инфекциях и первичных иммунодефицитах.

Задачи исследования Отработать методики оценки NK-активности, процентного содержания внутриклеточного перфорина в NK-клетках, дегрануляции NK-клеток по экстернализации CD107a с помощью проточной цитометрии.

Уточнить значимость CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток.

Оценить применимость маркера CD63 для оценки дегрануляции NKклеток.

Применить комплекс методов, перечисленных в п.1, для исследования функций NK-клеток у здоровых лиц. Получить нормативные показатели.

Проанализировать корреляционные связи между отдельными параметрами системы NK-клеток.

Используя разработанный комплекс методов, оценить состояние системы Олдрича, хроническая гранулематозная болезнь), часто рецидивирующем герпесе, а также у лиц пожилого возраста.

Провести фенотипический анализ дегранулирующей субпопуляции NKклеток.

Научная новизна Впервые показано, что CD107a является более специфичным маркером дегрануляции NK-клеток у детей с синдромом Вискотта—Олдрича и отсутствие значимых нарушений дегрануляции у детей с хронической гранулематозной болезнью. Впервые обнаружен дефект дегрануляции NK-клеток у больных с часто рецидивирующим герпесом. Впервые обнаружено снижение дегрануляции NK-клеток у лиц пожилого возраста, которое не сопровождается снижением NKактивности.

Практическая значимость применяться в лабораториях клинической иммунологии для выявления функциональных дефектов в системе NK-клеток при первичных и вторичных иммунодефицитах. При первичных иммунодефицитах результаты такого обследования позволят установить уровень локализации генетического дефекта и, таким образом, определить направление генотипирования. При вторичных иммунодефицитах результаты обследования могут учитываться при выборе терапии. Методологическая база, примененная в данной работе, может служить основой для дальнейшего расширения комплекса методов исследования NKклеток, в который может быть включено исследование экспрессии цитокинов при активации NK-клеток, а также исследование более широкого спектра цитотоксических белков.

1.1. Общая характеристика NK-клеток лимфоциты, экспрессирующие маркер NKp46, маркеры CD56 и/или CD16, не экспрессирующие линейные маркеры Т- и B-клеток (CD3 и CD19) и способные без предварительной активации убивать инфицированные или злокачественно измененные клетки организма [9, 218].

NK-клетки относят к системе врождённого иммунитета, поскольку они развиваются без перестройки генов рецепторного аппарата. Однако в отличие от большинства других клеток врожденной иммунной системы, распознающих полностью чужеродные для организма молекулярные структуры микробного происхождения, NK-клетки узнают и уничтожают измененные собственные клетки организма. Мишенями NK-клеток являются такие клетки организма, которые частично или полностью утратили поверхностную экспрессию молекул MHC I класса, но при этом экспрессируют нормальные или повышенные уровни поверхностных молекул, индуцируемых клеточным стрессом [10]. Такие молекулярные изменения характерны для клеток, инфицированных вирусами и другими цитозольными паразитами, а также для опухолевых клеток. NK-клетки способны уничтожать клетки-мишени без какой-либо предварительной активации (иммунизации). Это их свойство носит название естественной цитотоксичности (или NK-активности) и лежит в основе термина «естественные киллеры». Описаны также случаи прямого распознавания вирусных белков NKклетками: так, рецептор экспрессирующийся на небольшой цитомегаловируса [17]. Кроме того, благодаря экспрессии Fc-рецепторов, NKклетки могут участвовать в реакциях антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ), т.е. уничтожать мишени, опсонизированные IgG [102].

NK-клетки играют одну из ключевых ролей в защите организма от вирусных инфекций и рака. NK-клетки обладают широким набором рецепторов, позволяющих им распознавать клетки-мишени и отличать здоровые клетки от пораженных (см. 1.3). Кроме того, NK-клетки экспрессируют рецепторы для цитокинов, гормонов и нейромедиаторов. Благодаря такому набору рецепторов, NK-клетки одними из первых получают сигналы о нарушении генетически обусловленного постоянства внутренней среды организма («сигналы опасности»). NK-клетки участвуют в ранней фазе иммунного ответа на вирусную инфекцию [102], а также вовлекают в элиминацию возбудителя целый арсенал защитных средств как иммунной, так и нейроэндокринной систем. Кроме того, NK-клетки трансформации [210].

опухолевых клеток является основной функцией NK-клеток. Лизис клетокмишеней преимущественно обеспечивается перфорином и гранзимами — белками, которые хранятся в так называемых литических гранулах NK-клетки, а при взаимодействии NK-клетки с клеткой-мишенью выбрасываются на поверхность последней в результате процесса, носящего название дегрануляции.

Гранзимы, попав при помощи перфорина в цитозоль клетки-мишени, индуцируют ее апоптоз [64]. Меньший вклад в киллерную функцию NK-клеток вносят поверхностные молекулы семейства фактора некроза опухолей (ФНО), такие как FasL/CD178 и TRAIL/CD253, которые вызывают рецептор-зависимый апоптоз мишеней [188, 225]. В редких случаях NK-клетки могут распознавать и убивать непосредственно клетки возбудителя; NK-чувствительные микроорганизмы, как правило, относятся к эукариотам [134].

Второй важнейшей функцией NK-клеток является продукция цитокинов и хемокинов. NK-клетки вырабатывают в первую очередь провоспалительные цитокины (ИФН-, ФНО-), а также воспалительные хемокины MIP-1/ и RANTES, тем самым вовлекая в иммунный ответ другие клетки иммунной системы [59, 73, 105]; однако описаны и так называемые регуляторные NKклетки, вырабатывающие преимущественно интерлейкин-10 (ИЛ-10) и способствующие подавлению иммунного ответа [66].

NK-клетки обладают рядом свойств, которые отличают их от миелоидных клеток (составляющих основу врожденного иммунитета) и сближают с клетками адаптивного иммунитета, в особенности CD8+ Т-клетками : 1) NK-клетки, как и Т-клетки, образуются из общего лимфоидного предшественника и зависят от одних и тех же ростовых факторов (ИЛ-15, ИЛ-7, ИЛ-2); 2) NK-клетки и Тклетки экспрессируют много общих поверхностных маркеров; 3) NK-клетки проходят процесс «обучения», функционально сходный с селекцией Т-клеток в тимусе; 4) NK-клетки и CD8+ Т-клетки вырабатывают сходные цитокины (в первую очередь ИФН-) и обладают сходными механизмами цитотоксичности;

5) наконец, по крайней мере NK-клетки, прямо распознающие вирусные белки, после распознавания антигена могут подвергаться клональной экспансии, а в последущем ускоренно и усиленно реагируют на повторный контакт с вирусным белком, т.е. ведут себя как клетки памяти [197, 198]. Неудивительно, что при первичных иммунодефицитах функции NK-клеток и CD8+ Т-клеток, как правило, страдают одновременно [77].

1.2. Литические гранулы азурофильных литических гранул диаметром порядка 500 нм, в которых хранятся цитотоксические белки — перфорин, гранзимы и ряд других.

«Классические» литические гранулы являются секреторными лизосомами (т. е.

лизосомами, способными к экзоцитозу содержимого) [173]. При электронной микроскопии в таких гранулах выделяется светлая периферическая часть, в которой могут содержаться множественные везикулы, и электронноплотная центральная часть, которая может быть отграничена от периферии гранулы преимущественно в электронноплотной части, однако выявляются также и в периферических везикулах [173]. Гранулы, являясь производными лизосом, имеют многочисленные сходства с последними, в частности: 1) кислый pH (около 5—5,5); 2) присутствие лизосомальных гидролаз, в частности катепсинов;

3) присутствие протеазоустойчивых протеогликанов (серглицин); 4) присутствие мембранных лизосомальных белков (в частности, белков CD107a, CD107b и CD63 из семейства LAMP — lysosome-associated membrane proteins) на лимитирующей мембране гранул [30, 117, 118, 173].

Перфорин (порообразующий белок) синтезируется в виде неактивного предшественника массой около 70 кДа, активность которого ингибируется кальретикулином (который, вероятно, связывается с перфорином еще в эндоплазматическом ретикулуме), а также аутоингибируется собственным Cконцевым фрагментом, содержащим крупный остаток гликана [176, 208].

Гранзимы — это сериновые протеазы, способные индуцировать апоптоз клетки-мишени. В настоящее время открыто более 10 видов гранзимов, из которых у человека экспрессируются гранзимы A, B, K и M; из них гранзим В обладает наиболее значимыми эффекторными свойствами [64, 192]. Как и перфорин, синтезируются в виде неактивных предшественников.

Незрелые перфорин и гранзимы, пройдя через аппарат Гольджи, вероятно, вначале поступают в так называемые гранулы с параллельными тубулярными структурами (ПТС или parallel tubular arrays). Гранулы с ПТС выявляются примерно в 30% свежевыделенных NK-клеток [117]. ПТС напоминают соты со квазикристаллического состояния упакованные перфорин и гранзимы. Маркеры лизосом в ПТС-гранулах отсутствуют. При культивировании NK-клеток ПТС исчезают, и гранулы приобретают черты секреторных лизосом, что, вероятно, происходит в результате слияния ПТС-гранул с обычными лизосомами [117].

В кислой среде «классических» гранул C-концевой фрагмент отщепляется от предшественника перфорина, в результате чего образуется зрелый перфорин массой около 60 кДа, способный выполнять свою биологическую функцию [208]. Тем не менее, внутри гранул зрелый перфорин остается неактивным вследствие: 1) кислого pH; 2) отсутствия свободного Ca2+ (ионы Ca2+ связываются кальретикулином); 3) образования комплекса с протеогликаном серглицином, что создает стерическое препятствие для мультимеризации перфорина [176]. Предшественники гранзимов тоже подвергаются протеолитическому процессингу с участием лизосомальной протеазы катепсина C [174] и в гранулах тоже остаются в неактивном состоянии вследствие связи с серглицином и другими протеогликанами [108].

Следует отметить, что морфологически гранулы NK-клеток довольно разнородны; в частности, они могут иметь морфологию мультивезикулярных телец (в которых имеется только светлая часть со множественными везикулами, а электронноплотный центр отсутствует), а также поздних эндосом [161].

1.3. Рецепторы NK-клеток В конце 80-х годов ХХ в. H.-G. Ljunggren и K. Krre сформулировали гипотезу «отсутствия своего» (missing self) [129, 130]. Cогласно этой гипотезе, NK-клетки распознают и убивают собственные клетки организма, у которых нарушена или отсутствует экспрессия антигенов MHC I класса, что может быть обусловлено, в частности, отсутствием или изменением структуры данное явление наблюдается при злокачественной трансформации клеток или при инфицировании их микроорганизмами. Было показано, что молекулы MHC I класса распознаются т.н. ингибиторными рецепторами NK-клеток, блокирующими активацию [121]. Позднее стало ясно, что для запуска NKопосредованной литической атаки недостаточно лишь отсутствия молекул MHCI на поверхности мишени: так, эритроциты не экспрессируют MHC, но не лизируются NK-клетками. Было установлено, что NK-клетки обладают также активационными рецепторами, которые взаимодействуют со стрессиндуцированными молекулами на поверхности клеток-мишеней (присутствие таких молекул характерно для инфицированных и опухолевых клеток), либо непосредственно с вирусными белками, экспонированными на поверхности зараженной клетки [17, 122, 155]. Таким образом, NK-клетка распознает потенциальную мишень с помощью двух типов рецепторов — ингибиторных и активационных; окончательное решение «убивать или не убивать» определяется суммой сигналов, поступающих от этих рецепторов. Активационные рецепторы либо сами содержат активационные ITAM-мотивы (immunoreceptor tyrosineлибо взаимодействуют с адаптерами. ITAM-мотивы, фосфорилированные по остаткам тирозина, служат сайтами прикрепления киназ, передающих сигнал в ядро и на «исполнительные механизмы» дегрануляции. Ингибиторные рецепторы содержат ITIM-мотивы (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs), служащие сайтами связывания фосфатаз, которые дефосфорилируют сигнальные белки, участвующие в активации клетки [169].

Рисунок 1. Схема формирования комплекса KIR2D/HLA-C с различиями в структуре цитоплазматической части молекулы KIR (из книги Р.И.Сепиашвили, И.П.Балмасовой «Физиология естественных киллеров», 2005). 2m — 2микроглобулин; АГ — антигенный пептид, представляемый молекулой HLA-C.

Ниже дана характеристика основных групп рецепторов NK-клеток, классифицированных по строению внеклеточного домена; каждая группа может включать как активационные, так и ингибиторные рецепторы.

Наиболее хорошо изучена группа киллерных иммуноглобулиноподобных рецепторов (killer cell immunoglobulin-like receptors, или KIR; по CDноменклатуре — группа CD158). На сегодня открыто 17 генов KIR-рецепторов, из которых 15 кодируют функционирующие рецепторы [151, 167]. KIRрецепторы представляют собой трансмембранные гликопротеины, внеклеточная порция которых может включать два или три иммуноглобулиноподобных домена (соответствующие подгруппы KIR-рецепторов называются KIR2D и KIR3D). Цитоплазматические домены KIR-рецепторов могут быть длинными (L) или короткими (S), причем L-цепи содержат ITIM-мотивы, а S-цепи ассоциированы с адаптером DAP-12, содержащим активационный ITAM-мотив ингибиторные, так и активационные сигналы (рис. 1). Лигандами для KIRрецепторов служат как классические молекулы MHC I класса с нагруженными на них пептидами (HLA-A и HLA-B распознаются KIR3D-рецепторами; HLA-C — KIR2D) [69, 169], так и неклассические молекулы МНС I класса, например HLAG. Последний находится на клетках трофобласта во время беременности, стабилизирует другую неклассическую MHC-молекулу — HLA-E и ингибирует активацию NK-клеток [112, 147, 153, 182]; распознается рецептором KIR2DL [151].

KIR — одна из наиболее сложных систем иммунорецепторов. Гены KIR располагаются друг за другом на 19-й хромосоме (локус 19q13.4) и наследуются сцепленно, что позволяет говорить о KIR-гаплотипах [151]. Количество генов в гаплотипе может варьировать от 8 до 13, у индивидуума — от 8 до 15. Кроме того, многие гены KIR являются полиморфными, причем степень полиморфизма сопоставима с таковой у HLA [151]. Гены KIR экспрессируются кодоминантно, однако их экспрессия в отдельно взятых NK-клетках регулируется стохастически (известна лишь вероятность экспрессии данного гена KIR в клетке) [14]. Таким образом, разные NK-клетки того же индивидуума экспрессируют различное число KIR-рецепторов (0 до 4, чаще всего — 0 или 1), причем возможны любые сочетания рецепторов [14]. Поскольку экспрессия KIR носит вероятностный характер, а также поскольку гены KIR и MHC/HLA наследуются независимо, то возможно появление NK-клеток, у которых ни один из KIR-рецепторов не будет распознавать собственные молекулы MHC. Эти свойства генов KIR имеют важнейшее значение для процесса обучения NK-клеток (см. 1.4).

KIR-рецепторы не являются специфичными для NK-клеток, поскольку экспрессируются также на субпопуляциях Т-клеток [22].

К группе KLR-рецепторов (killer cell lectin-like receptor) относятся NKG2D человека и грызунов, гетеродимерные рецепторы CD94/NKG2 человека и грызунов, рецепторы KLRG1 и KLRF1 (NKp80), а также группа мышиных рецепторов Ly49 [158, 169]. Эти рецепторы имеют структурное сходство с лектинами C-типа и могут быть как активационными, так и ингибирующими.

Молекула CD94 образует гетеродимерные комплексы с NKG2A, NKG2C или NKG2E. Изоформа NKG2A (CD159a) имеет длинный цитоплазматический домен, изоформы NKG2С (CD159c) и NKG2Е — короткие. По аналогии с KIRрецепторами, длинные и короткие изоформы NKG2 выполняют, соответственно, ингибирующие и активирующие функции [123]. Изоформа NKG2A у здоровых лиц экспрессируется на значительной части NK-клеток, изоформы NKG2C и NKG2E — на незначительных субпопуляциях [88]. Лигандами для CD94/NKG2рецепторов служат молекулы HLA-E (неклассические молекулы MHC I класса) в комплексе со встроенными в них пептидами [179]. Пептиды, представляемые молекулами HLA-E, — это лидерные пептиды классических молекул MHC, отщепляемые в эндоплазматическом ретикулуме. Поэтому высокий уровень пептид-нагруженных молекул HLA-E на поверхности потенциальной мишени является индикатором сохранного синтеза молекул MHC, что сигнализирует о «нормальности» клетки и через комплекс CD94/NKG2A ингибирует литическую атаку NK-клеток. CD94/NKG2A дополняет функцию KIR, являясь основным ингибиторным рецептором на тех NK-клетках, которые не экспрессируют собственные молекулы MHC [29].

Биологический смысл существования активационных рецепторов, распознающих HLA-E (NKG2C, NKG2E), не до конца ясен. Интересно, что у лиц, инфицированных цитомегаловирусом наблюдается увеличение процентного содержания NKG2C+ NK-клеток в крови [88].

Рецептор NKG2D (CD314), несмотря на название, имеет лишь отдаленное сходство с NKG2A/C/E и не образует гетеродимеров с CD94. NKG2D является классическим активационным рецептором NK-клеток. Лигандами NKG2D служат структурные гомологи HLA-A и HLA-B — молекулы MICA и MICB (находятся на поверхности многих опухолевых клеток) [86, 87], а также UL- cвязывающие белки (ULBP), которые являются рецептором для антигена UL- цитомегаловируса [61]. Молекулы MICA, MICB и ULBP не имеют в своем составе 2-микроглобулина и не несут антигена, но состоят из трех (MICA, MICB) или двух (ULBP) доменов, гомологичных NKG2D играет важнейшую роль в защите от многих опухолей и инфекций [169, 210].

Цитоплазматический конец NKG2D ассоциирован с адаптером DAP10, содержащим активационный YXXM-мотив. При стимуляции NKG2D YXXMмотив фосфорилируется по остатку тирозина и служит сайтом прикрепления фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3-киназы), что ведет к запуску активационного сигнального пути [10].

кадгерина, в частности E-кадгерин — поверхностный белок нормальных эпителиальных клеток, который утрачивается при эпителиально-мезенхимальной трансформации раковых клеток [100, 203]. Стратегия распознавания кадгеринов через KLRG1 увеличивает шансы детекции опухолевого роста NK-клетками.

Как и KIR, KLR-рецепторы экспрессируются также на небольших субпопуляциях - и -Т-лимфоцитов [101].

Еще одну группу активационных рецепторов составляют рецепторы естественной цитотоксичности (natural cytotoxicity receptors, NCR). В эту группу входят три рецептора, обозначаемых, в соответствии с молекулярной массой, NKp46, NKp44 и NKp30 (по CD-номенклатуре — соответственно CD335, CD и CD337). NCR-рецепторы принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов [154]. NKp46 и NKp30 экспрессируются практически всеми NK-клетками, хотя уровень экспрессии может варьировать [171]. NKp46 и NKp30, вероятно, экспрессируются на других популяциях лейкоцитов [218]. NKp44 постоянно не присутствует на NK-клетках, а появляется только после активации ИЛ-2 [193].

Лиганды NCR охарактеризованы слабо. Сравнительно недавно было показано, что NKp30 может распознавать молекулу B7-H6 на поверхности опухолевых клеток [36], а также белок pp65 цитомегаловируса, хотя последний не активирует NKp30, а препятствует активации [19]. Лигандами для NKp46 могут служить вирусные гемагглютинины и гепарансульфат [136, 169]. NCR ассоциированы с адаптерами CD3 и FcR, содержащими активационные ITAM-мотивы [9].

Рецептор 2В4 (CD244) относится к суперсемейству иммуноглобулинов и взаимодействует с антигеном CD48, который присутствует на поверхности всех лейкоцитов. Цитоплазматический домен 2B4 содержит т. н. ITSM-мотив (immunoreceptor tyrosine switch motif), который привлекает адапторы SAP и ERT [169]. Рецептор 2B4 является активирующим, однако у больных X-сцепленным лимфопролиферативным синдромом 1 типа, у которых мутирован белок SAP, 2B4 оказывает ингибирующее действие [72]. Вероятно, 2B4 участвует в отторжении MHC-несовместимых лейкоцитов и костного мозга, а также в элиминации вирус-инфицированных лейкоцитов и лейкозных клеток.

Одним из наиболее мощных активационных рецепторов NK-клеток является молекула СD16, которая представляет собой трансмембранный белок суперсемейства иммуноглобулинов. Антиген CD16 является низкоаффинным рецептором для Fc-фрагментов антител субклассов IgG1 и IgG3 (у человека) [89, 102]. Различают две изоформы этого антигена — CD16a (FcIIIA) и CD16b (FcIIIB); NK-клетки экспрессируют только первую из них. Антитела субклассов IgG1 и IgG3 играют роль опсонинов, своими Fab-фрагментами взаимодействуя с поверхностными антигенами клеток-мишеней, а Fc-фрагментами — с CD16, что антителами (АЗКЦТ). Активационный сигнал от CD16 передается через Srcкиназы, которые фосфорилируют ITAM-мотивы адапторных белков CD3 и FcR, которые, в свою очередь, привлекают и активируют тирозинкиназы Syk и ZAP-70 [102].

1.3.6. Прочие рецепторы Среди других рецепторов, регулирующих активацию NK-клеток, следует упомянуть активационный рецептор DNAM-1 (CD226, взаимодействует с CD и CD155), семейство NKR-P1 (CD161) и ингибиторные рецепторы LILR [169].

На поверхности NK-клеток присутствуют также молекулы адгезии, которые участвуют в активации NK-клеток постольку, поскольку необходимы для образования иммунологического синапса (ИС) с клеткой-мишенью. Это рецепторы CD2 (LFA-2), CD54 (ICAM-1), CD58 (LFA-3), входящие в суперсемейство иммуноглобулинов [215], а также CD11a, CD11b и CD11c, относящиеся к интегринам и образующие димеры с CD18 — соответственно, LFA-1, MAC-1 и gp150 [194].

NK-клетки экспрессируют также рецепторы для различных цитокинов, в частности для ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-12, ИЛ-18, ИФН I типа. Цитокины не запускают киллерную атаку, однако индуцируют экспрессию различных генов в NKклетках, что приводит к индукции пролиферации (ИЛ-2, ИЛ-15), синтеза ИФНИЛ-15, ИЛ-18), усилению цитотоксической активности при (ИЛ-12, последующем контакте с клетками-мишенями (ИФН I типа, ИЛ-2, ИЛ-12) [10].

Последнее явление носит название прайминга.

1.4. Дифференцировка и обучение NK-клеток Маркером зрелых NK-клеток человека служит молекула адгезии CD56. По степени экспрессии CD56 NK-клетки крови взрослого человека разделяются на две субпопуляции: слабосветящие CD56dim (около 90% NK-клеток крови) и яркосветящие CD56bright (около 10%). Между этими субпопуляциями имеются существенные различия [58, 74, 223]. CD56bright NK-клетки, по сравнению с CD56dim, характеризуются: 1) низкой или отсутствующей экспрессией CD16 и KIR; 2) высокой экспрессией NCR, NKG2D и CD94/NKG2A; 3) низкой цитотоксичностью в реакциях естественной цитотоксичности и АЗКЦТ, что обсуловлено низкой экспрессией перфорина и гранзимов; 4) более высокой продукцией ИФН- и ряда других цитокинов при активации цитокинами ИЛ-12 и ИЛ-15; 5) более высокими уровнями рецепторов к ИЛ-2 и ИЛ-7 и гораздо более энергичным пролиферативным ответом на ИЛ-2; 6) наличием экспрессии хемокинового рецептора CCR7, который дает возможность CD56bright NKклеткам мигрировать в Т-клеточные зоны вторичных лимфоидных органов преимушественно в нелимфоидные ткани) [57, 74, 223]. Две субпопуляции NKклеток первоначально рассматривались как независимые: CD56dim субпопуляция — как «эффекторная», CD56bright — как «регуляторная». Однако в последующем было показано, что CD56bright и CD56dim NK-клетки представляют собой последовательные стадии дифференцировки. На это указывает, в частности, возможность получения CD56dim NK-клеток из CD56bright in vitro, а также меньшая длина теломер в циркулирующих CD56dim NK-клетках по сравнению с CD56bright [49, 99, 185].

Созревание и дифференцировка NK-клеток начинается в костном мозге и продолжается во вторичных лимфоидных органах [79]. Дифференцировка NKклеток контролируется факторами транскрипции Ets1 и Id2 [10]. Основным дифференцировочным и антиапоптотическим фактором NK-клеток является ИЛНаиболее ранним маркером NK-клеток, развивающихся in vitro и во вторичных лимфоидных органах in vivo, является CD161 (NKR-P1A) [24, 79].

Клетки с фенотипом CD3–CD56–CD161+ способны продуцировать цитокины, в частности ФНО- [24], но не обладают перфорин-зависимой цитотоксичностью [225]. С появлением маркеров CD56, CD94, NKG2D и NKp46 NK-клетки вторичных лимфоидных органов приобретают способность к выработке ИФН- и перфорин-зависимому киллингу [79, 225].

лимфоидных органов фенотипически сходна с CD56bright субпопуляцией NKклеток крови, однако CD56bright NK-клетки крови экспрессируют гораздо более низкие уровни перфорина. Связь между этими двумя субпопуляциями NKклеток пока не ясна. CD56bright NK-клетки крови приобретают цитотоксические свойства в ходе дальнейшей дифференцировки, которая сопровождается нарастанием экспрессии цитотоксических белков, а также снижением экспрессии CD56 и появлением CD16, в результате чего NK-клетки приобретают фенотип CD56dimCD16+ (основная субпопуляция NK-клеток крови). Скорее всего, этот процесс идет через промежуточную стадию CD56brightCD16+ клеток [27].

Превращение CD56bright NK-клеток в CD56dimCD16+, видимо, сопровождается несколькими клеточными делениями, что ведет к укорочению теломер [49, 185].

С приобретением фенотипа CD56dimCD16+ дифференцировка NK-клеток не заканчивается. CD56dim NK-клетки постепенно утрачивают экспрессию CD94/NKG2A, приобретают экспрессию одного или нескольких ингибиторных KIR-рецепторов, а также CD57 — маркера терминальной дифференцировки NKклеток и Т-клеток [29, 133, 223]. Это сопровождается снижением способности пролиферировать и вырабатывать ИФН-. Естественная цитотоксичность NKклеток в ходе терминальной дифференцировки существенно не меняется, однако CD57+ NK-клетки являются более мощными эффекторами АЗКЦТ [133].

конституционально экспрессируют цитотоксические белки (перфорин, гранзимы), то должны существовать жесткие механизмы, препятствующие случайной активации NK-клеток. Поэтому параллельно с дифференцировкой, но в определенной степени независимо от нее [29], происходит «обучение» NKклеток (NK-cell education). Суть обучения состоит в том, что цитотоксический потенциал приобретают только те NK-клетки, которые могут распознать собственные молекулы MHC организма хотя бы через один ингибиторный рецептор (как правило, CD94/NKG2A и/или KIR) [96, 164]. NK-клетки, не отвечающие этим условиям, являются гипореактивными (неспособны перфорина/гранзимов, а также способность секретировать цитокины [16].

Описанный механизм позволяет предотвратить случайное повреждение здоровых клеток организма NK-клетками, ингибиторные рецепторы которых не распознают MHC-лигандов. Обучение NK-клеток функционально эквивалентно селекции Т-клеток в тимусе, однако имеет ряд важных отличий: 1) обучение не сопровождается перестройкой генов мишень-распознающих рецепторов; 2) NKклетки, не распознавшие MHC-лиганд, не погибают, а циркулируют в крови в составе CD56dimCD16+ субпопуляции; 3) литическая функция «необученных»

NK-клеток вырабатываемых, например, при острых вирусных инфекциях [196].

Молекулярные основы обучения NK-клеток по большей части неясны.

Предлагается минимум три модели обучения:

Модель «вооружения», согласно которой NK-клетки исходно функционально неполноценны, и только после взаимодействия через ингибиторные рецепторы с молекулами МНС I класса «приобретают лицензию»

на выполнение киллерных функций [115].

Модель «разоружения», противоположная первой: изначально NKклетки функционально полноценны, но при потере ингибиторных рецепторов для взаимодействия с молекулами MHC I класса становятся функционально неполноценными [82].

Реостатная модель постулирует, что приобретение NK-клетками киллерной способности не подчиняется закону «все или ничего», а зависит от числа и аффиннности экспрессирующихся на них ингибиторных рецепторов [37, 107]. NK-клетки, экспрессирующие два и более рецептора к собственным молекулам MHC I класса, обладают более выраженными цитотоксическими свойствами, чем NK-клетки с экспрессией одного ингибиторного рецептора [37].

Однако NK-клетка не должна экспрессировать слишком много ингибиторных рецепторов, поскольку это снижает ее чувствительность при обнаружении инфицированных и трансформированных клеток.

1.5. Активация NK-клеток и иммунологический синапс (ИС) Пройдя процесс обучения, NK-клетки приобретают «лицензию» на использование цитотоксического арсенала. Поскольку NK-клетки убивают мишени путем секреции цитотоксичных медиаторов, то должны существовать механизмы, направляющие действие этих медиаторов именно на патологически измененные клетки-мишени, но не на здоровые соседние клетки. Такая направленность достигается путем образования ИС между NK-клеткой и клеткой-мишенью. ИС — это упорядоченная реорганизация молекул в иммунной клетке в месте ее контакта с другой клеткой [161]. В активационном ИС, образуемом NK-клетками, происходит несколько взаимосвязанных процессов, в частности: 1) распознавание лигандов; 2) усиление и интеграция активационного сигнала, что достигается благодаря сближению и микрокластеризации рецепторов и внутриклеточных молекул, участвующих в сигналинге; 3) направленная секреция растворимых цитотоксических медиаторов на поверхность клетки-мишени, взаимодействие «рецепторов смерти» NK-клеток с их лигандами на поверхности мишени; 4) направленная секреция цитокинов и накопление молекул костимуляции (важно при взаимодействии, например, CD56bright NK-клеток с дендритными клетками, приводящем к активации последних); 5) по окончании литической атаки — терминация взаимодействия между NK-клеткой и клеткой-мишенью [161].

В формировании ИС между NK-клеткой и чувствительной клеткоймишенью выделяют 3 стадии [161]: 1) стадию инициации; 2) эффекторную стадию; 3) стадию терминации и восстановления литического потенциала.

1.5.1. Стадия инициации Стадия инициации начинается со сближения и непрочного контакта NKклетки с потенциальной клеткой-мишенью, которое, вероятно, обеспечивается хемокинами и селектинами [161]. Сближение дает возможность NK-клеткам «просканировать» поверхность мишени на предмет активационных и ингибиторных лигандов. Распознавание лигандов активационными рецепторами ведет к фосфорилированию ITAM-мотивов этих рецепторов или связанных с ними адаптеров. С фосфорилированными ITAM-мотивами связываются киназы Syk и ZAP-70, которые в результате также активируются и фосфорилируют GEFбелок VAV1 (GEF = guanine nucleotide exchange factor) [93, 102]. Активный VAV1 индуцирует переход молекулы адгезии LFA-1 из закрытой в открытую (активную) конформацию [38]. Изменение конформации внеклеточной порции LFA-1, вызванное событиями внутри клетки, называется сигналингом «изнутри наружу» (inside-out signalling), в отличие от более традиционного сигналинга «снаружи внутрь». Активный LFA-1 взаимодействует с лигандами на поверхности клетки-мишени (CD54, CD50), что приводит к формированию прочного межклеточного контакта [38].

Если на поверхности мишени присутствует достаточное количество лигандов, распознаваемых ингибиторными рецепторами NK-клеток, то вместо активационного синапса происходит образование ингибиторного синапса.

Стимуляция ингибиторных рецепторов активирует фосфатазы SHP-1, SHP-2 и SHIP, которые дефосфорилируют VAV1 и ряд других ключевых сигнальных молекул [38]. В результате LFA-1 остается в неактивной конформации, не происходит перестройка цитоскелета и блокируется эффекторная стадия образования активационного синапса; NK-клетка отделяется от мишени.

Bryceson и соавт. показали, что переход LFA-1 в активную конформацию можно вызвать изолированной стимуляцией самых различных рецепторов NKклеток, в том числе NKG2D, DNAM-1, 2B4, CD2, CD16 [39]. Однако ни один из этих рецепторов в одиночку не способен вызвать дегрануляцию NK-клеток.

Исключение составляет рецептор CD16, стимуляция которого вызывает ненаправленную дегрануляцию по всей поверхности NK-клетки [40]. В остальных случаях индукция ненаправленной дегрануляции возможна только при стимуляции сочетаний рецепторов, например NKG2D + 2B4 [39]. Поэтому все активационные рецепторы NK-клеток (кроме CD16) правильнее называть коактивационными. Ненаправленная дегрануляция, однако, не обеспечивает эффективный киллинг мишеней. Дегрануляция приобретает направленность на клетку-мишень в том случае, если мишень экспрессирует лиганды для LFA- [40]; это ведет к эффективному киллингу. Таким образом, одновременная стимуляция LFA-1 и двух активационных рецепторов (не CD16) — это минимальное условие индукции естественной цитотоксичности, а одновременная стимуляция LFA-1 и CD16 — минимальное условие АЗКЦТ [39].

1.5.2. Эффекторная стадия (стадия «программирования лизиса») События, приводящие к направленной дегрануляции NK-клеток, и собственно дегрануляция составляют суть второй — эффекторной — стадии формирования ИС. Эта стадия характеризуется перестройкой ИС, в котором образуются центральный и периферический супрамолекулярные активационные концентрируются активационные рецепторы, а в pSMAC, который кольцом окружает cSMAC — молекулы адгезии (CD2, CD11a/CD18, CD11b/CD18), которые связываются со своими лигандами на поверхности клетки-мишени.

Перестройка синапса обеспечивается реорганизацией актинового цитоскелета.

Ключевую роль в передаче активационного сигнала с мембранных рецепторов на сеть актиновых микрофиламентов играет белок синдрома Вискотта—Олдрича (Wiskott-Aldrich syndrome protein или WASP) [135], который регулирует переход актина из глобулярной формы в полимерную фибриллярную — f-актин (подробнее см. 1.7.3). Латеральные перемещения белков в ИС происходят при участии эзрина, радиксина и моэзина [161, 181]. Перестройка синапса способствует усилению активационной сигнализации (благодаря кластеризации рецепторов в cSMAC), а также отграничивает полость ИС от окружающей среды (благодаря pSMAC).

активационного сигнала в NK-клетке. ITAM-ассоциированные киназы ZAP-70 и Syk активируют фосфолипазу C, которая расщепляет фосфатидилинозитолбисфосфат (PIP2) на диацилглицерол (ДАГ) и инозитолтрифосфат (IP3); ДАГ активирует протеинкиназу C, тогда как инозитолтрифосфат индуцирует вход ионов Ca2+ в цитозоль [102]. Эти события важны как для индукции дегрануляции, так и для передачи активационного сигнала в ядро NK-клетки.

Следующее важнейшее событие эффекторной стадии — движение литических гранул в зону ИС (поляризация). Перемещения гранул внутри клетки (микротрубочками). Вначале гранулы с помощью молекулярного двигателя динеина движутся по микротрубочкам от их (+) конца к (–) концу в сторону центра организации микротрубочек (ЦОМТ). Затем ЦОМТ вместе с гранулами сам начинает двигаться в сторону ИС, что ведет к скоплению (поляризации) гранул в цитоплазме непосредственно под синапсом [38]. Поляризация гранул — результат сигналинга через LFA-1 по типу «снаружи внутрь»; направление поляризации определяется местонахождением активированного LFA-1 [38]. В передаче сигнала с LFA-1 на тубулиновый цитоскелет участвуют белки талин, WASP и CIP-4, устанавливающий связь между WASP и ЦОМТ [21]. Для индукции поляризации гранул необходимо также участие митогенактивированных протеинкиназ [38].

С помощью пока не известного механизма образуются «проходы» в слое субмембранного (кортикального) f-актина, благодаря чему поляризованные гранулы приближаются к поверхностной мембране NK-клетки [180]. Возможно, в окончательном движении гранул от ЦОМТ к мембране участвуют актиновые филаменты и миозин II [15]. Во взаимодействии гранул с поверхностной мембраной выделяют несколько этапов: прикрепление (docking), подготовку к слиянию (priming) и слияние (fusion). Прикрепление обеспечивается малой ГТФазой Rab27, которая ассоциирована с наружной поверхностью гранул, тогда как в подготовке к слиянию ключевую роль играет белок Munc13-4 [77].

Интересно, что в покоящихся клетках Rab27 и Munc13-4 связаны не с гранулами, а, соответственно, с поздними и с рециклизирующимися эндосомами. Слияние Rab27+ и Munc13-4+ везикул с гранулами происходит непосредственно перед прикреплением гранул к мембране и, вероятно, представляет собой еще один механизм, препятствующий случайной дегрануляции [145]. Слияние мембраны гранул с поверхностной мембраной NK-клетки обеспечивается взаимодействием белков v-SNARE (со стороны гранулы) и t-SNARE (со стороны поверхностной мембраны) [77, 161]. В результате слияния мембран происходит собственно дегрануляция, т.е. выход содержимого цитотоксических гранул в щель ИС — полость глубиной около 50 нм [143], отграниченную от межклеточной среды барьером из молекул адгезии (pSMAC). Гранула при этом запустевает, а ее мембрана встраивается в наружную мембрану NK-клетки. Однако возможна и неполная дегрануляция, когда содержимое гранулы секретируется лишь частично, после чего сообщение полости гранулы с внеклеточной средой закрывается и гранула отходит от мембраны в глубь цитоплазмы [127]; значение и механизмы этого явления неясны.

Помимо собственно эффекторного ответа, стимуляция активационных рецепторов в ходе эффекторной стадии приводит к активации митогениндуцируемых протеинкиназ и протеинкиназы активации факторов транскрипции NF-B и AP-1 [54, 97] и индукции экспрессии генов, в частности цитокинов и хемокинов [73]. Одним из инициаторов МАП-киназного каскада является упоминавшийся выше белок VAV1 [102].

1.5.3. Стадия терминации После дегрануляции наступает период относительной неактивности длительностью около 1 ч, в ходе которого NK-клетка остается конъюгированной с клеткой-мишенью. Это время, вероятно, необходимо для поглощения цитотоксических медиаторов из полости ИС клеткой-мишенью и индукции ее апоптоза. Затем NK-клетка отделяется от мишени. Этому способствует, в частности, интернализация активационных рецепторов NK-клеток, что ведет к прекращению активирующей сигнализации Поскольку являются «серийными убийцами», то после уничтожения мишени они способны довольно быстро восстанавливать литический потенциал, что может быть обусловлено следующими факторами: 1) неполным выбросом цитотоксических медиаторов в ходе однократной литической атаки; 2) активацией экспрессии генов перфорина и гранзимов; 3) возможен также эндоцитоз и повторное использование цитотоксических белков частности, гранзима выделившихся в полость ИС, но не поглощенных клеткой-мишенью [125].

1.6. Механизмы цитолитического действия NK-клеток Основным механизмом цитолитического действия NK-клеток является перфорин-гранзим-зависимый, в основе которого лежит дегрануляция.

1.6.1. Механизм действия перфорина и гранзимов Перфорин секретируется в едином комплексе с серглицином и гранзимом B [149], однако, попав в слабощелочную или нейтральную межклеточную среду, вероятно, освобождается от серглицина [118]. Молекула зрелого перфорина состоит из двух доменов: регуляторного кальций-связывающего C2-домена и домена встраивания в мембрану, гомологичного компоненту комплемента C [176]. Свободный Ca2+, взаимодействуя с C2-доменом, переводит перфорин в активную конформацию. Согласно «классической» модели, выведенной из опытов на искусственных фосфолипидных мембранах, в присутствии ионов Ca2+ молекулы перфорина с помощью C9-гомологичного домена встраиваются в поверхностную мембрану клетки-мишени, где мультимеризуются и образуют каналы диаметром 5—20, через которые в цитозоль клетки-мишени проникают образовавшиеся поры мишень теряет ионы, что ведет к осмотическому лизису.

Эти события объединяют термином «летальный удар».

Однако реальный механизм действия перфорина и гранзимов, вероятно, сложнее. Показано, что гранзим B в комплексе с серглицином связывается с поверхностью клетки-мишени путем электростатического взаимодействия, после чего эндоцитируется, причем этот процесс не зависит от перфорина [80, 149];

Добавление сублитических (не вызывающих осмотический лизис) концентраций перфорина к клеткам, поглотившим гранзим B, приводит к переносу гранзима B из эндосом в цитозоль и апоптозу клеток-мишеней [80]. Эти находки можно объяснить двояко: 1) перфориновые поры образуются не на поверхности клетки, эндоцитированных гранзимов [202]; 2) перфорин, повреждая поверхностную мембрану, вызывает попытку клетки закрыть дефект путем привлечения эндосом (уже содержащих гранзимы), что ведет временному нарушению целостности их мембраны и высвобождению гранзимов в цитозоль [176]. Lieberman и соавт.

предложили «объединительную» модель, согласно которой перфорин вначале вызывает небольшой дефект поверхностной мембраны, через который в клеткумишень входят ионы Ca2+, что вызывает репаративный ответ со стороны клетки.

В результате этого ответа перфорин и гранзимы эндоцитируются в гигантские эндосомы, которые эти авторы назвали «гигантосомами» [202]. Перфорин затем образует каналы в мембране гигантосом, через которые гранзимы проникают в цитозоль клетки-мишени. Через некоторое время гигантосомы разрываются, выделяя остатки перфорина и гранзимов в цитозоль.

По данным Berthou и соавт., активность перфорина усиливается в присутствии фактора активации тромбоцитов (ФАТ), который секретируется NK-клетками и связывается одновременно и с перфорином, и с ФАТрецепторами клеток-мишеней, что облегчает внедрение перфорина в мембрану [25]. ИФН- усиливает экспрессию ФАТ-рецепторов и сенсибилизирует клеткимишени к действию перфорина.

ограниченного протеолиза активирует две основных группы белков: 1) проапоптотический белок BID, который запускает митохондриальный путь апоптоза; 2) прокаспазу-3 и ряд других прокаспаз, которые после превращения в активные каспазы запускают каспазный апоптотический каскад [64]. Эти процессы завершаются активацией эндонуклеаз, фрагментацией ДНК, гибелью клетки и ее фрагментацией на апоптотические тельца, которые поглощаются фагоцитами. Гранзим B расщепляет многие другие белки, в частности белки цитоскелета и ядерного матрикса, ферменты, связанные c репарацией ДНК, и т. д. [64]. Мишенями гранзима A являются различные нуклеопротеины [64].

Кроме того, гранзимы A и B могут активировать интерлейкин-1-конвертазу (каспазу-1), вследствие чего атака NK-клеток или ЦТЛ против моноцитов или макрофагов, содержащих про-ИЛ-1, вызывает секрецию активного ИЛ-1, что способствует индукции воспалительного ответа [148]. Перфорин-гранзимзависимый механизм клеточной гибели может быть заблокирован, в результате чего клетка-мишень приобретает устойчивость к действию NK-клеток. Данное явление может быть обусловлено, в частности, экспрессией у клеток-мишеней костномозгового происхождения [199], а также у клеток, пораженных вирусом Эпштейна—Барр [222].

1.6.2. «Рецепторы смерти»

Помимо основного перфорин-гранзим-зависимого механизма, NK-клетки располагают другими средствами киллинга, из которых наиболее заметную роль играют поверхностные молекулы семейства ФНО, в частности Fas-лиганд (FasL, CD178) [188]. В покоящихся цитотоксических лимфоцитах FasL находится на внутренней поверхности мембраны литических гранул и в результате дегрануляции экспонируется на поверхности NK-клетки [33, 229]. Однако эффективность этого механизма киллинга невысока, т. к. FasL быстро «срезается» с поверхности клетки металлопротеазами [152]. В гранулах, поверхности внутренних везикул, которые отшнуровываются от лимитирующей мембраны гранулы в ее просвет. При дегрануляции эти везикулы секретируются в виде экзосом, что является очень эффективным средством доставки FasL к мембране клетки-мишени [103]. Хотя перфорин/гранзимы и FasL хранятся в одних и тех же органеллах, условия, необходимые для их мобилизации на поверхность цитотоксического лимфоцита могут различаться [109]. FasL связывается с молекулами Fas (CD95) на поверхности клетки-мишени (при условии, что мишень экспрессирует Fas) [186]; в результате в клетке-мишени индуцируется рецептор-зависимый путь апоптоза с участием адаптора FADD и каспаз-8 и -10. В роли индуктора апоптоза может выступать другая поверхностная молекула семейства ФНО — TRAIL, взаимодействующая с рецепторами TRAILR1 и TRAILR2. TRAIL экспрессируется в основном незрелыми CD56–CD161+ NK-клетками [225]. ФНО-, секретируемый NKклетками, тоже может вызывать апоптоз некоторых мишеней через рецептор TNFR1 (CD120a, p55).

Гранулы NK-клеток содержат ряд других цитотоксических молекул, в частности небольшой сапозинподобный белок гранулизин и полипептид LL- [12, 119]. Их роль в цитотоксичности NK-клеток окончательно не установлена.

1.7. Первичные иммунодефициты, сопровождающиеся нарушением активации и дегрануляции NK-клеток Поскольку молекулярные механизмы активации NK-клеток и CD8+ ЦТЛ в значительной степени сходны, а механизмы дегрануляции и цитолиза практически идентичны, то первичные иммунодефициты, поражающие ту или иную функцию NK-клеток, поражают аналогичную функцию и у CD8+ ЦТЛ.

Поэтому сложно оценить, нарушение функций каких клеток — NK-клеток или ЦТЛ — вносит больший вклад в патогенез таких иммунодефицитов. Более того, значительная часть данных по этим иммунодефицитам получена именно на ЦТЛ и экстраполирована на NK-клетки.

Первичные иммунодефициты, поражающие функции NK-клеток, можно условно разделить на три группы: 1) с нарушением цитотоксичности при сохранной активации; 2) с полным отсутствием активации NK-клеток; 3) с частичным нарушением активации и цитотоксичности [161].

1.7.1. Иммунодефициты с избирательным нарушением цитотоксичности Иммунодефициты, при которых нарушена цитотоксичность NK-клеток и ЦТЛ при сохранной активации, довольно многочисленны и могут протекать как с избирательным поражением цитотоксических лимфоцитов (семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз [СГЛ]), так и с поражением нейтрофилов, меланоцитов и других типов клеток, содержащих секреторные лизосомы (синдром Чедиака—Хигаcи [СЧХ], синдром Германски—Пудлак II типа, синдром Гришелли II типа). У больных снижена резистентность к различным инфекциям (спектр инфекций определяется наличием функциональных дефектов в других клетках иммунной системы, помимо цитотоксических лимфоцитов).

Возможно поражение всех компонентов цитолитического аппарата NKклеток. Так, СГЛ 2 типа вызван нонсенс- и миссенс-мутациями в гене PRF1, кодирующем перфорин, при сохранной дегрануляции [195]. При СЧХ, вызванном мутациями в гене LYST, формируются гигантские литические гранулы, неспособные к поляризации и экзоцитозу [98]. Синдром Германски— Пудлак II типа возникает вследствие мутаций в гене AP3B1, регулирующем сортировку белков в лизосомах; литические гранулы этих больных также неспособны к поляризации [98]. При синдроме Гришелли II типа, вызванном мутациями в гене RAB27A, гранулы поляризуются, но не прикрепляются к мембране NK-клеток [83, 146]. Наконец, СГЛ 3, 4 и 5 типов обусловлен нарушениями дегрануляции в результате мутаций генов, соответственно, UNC13D (белок — Munc13-4), STX11 (белок — синтаксин-11) и STXBP2 (белок — Munc18-2); эти синдромы характеризуются нарушениями слияния мембраны гранул с поверхностной мембраной [62, 76, 230].

гемофагоцитарного синдрома (ГФС) на том или ином этапе заболевания.

Синдром провоцируется инфекцией, как правило вирусной, и характеризуется гепато- и спленомегалией, лихорадкой и тяжелой анемией [77, 83]. ЦТЛ и NKклетки распознают вирус-инфицированные клетки, образуют ИС и активируются (что выражается, в частности, в продукции ими ИФН-), но вследствие нарушения цитотоксичности не могут элиминировать патоген. В результате вирусная нагрузка нарастает, что ведет к гиперстимуляции цитотоксических лимфоцитов, гиперпродукции ими ИФН- и системной гиперактивации макрофагов. Это приводит к развитию системного воспаления, фагоцитозу эритроцитов и других форменных элементов крови гистиоцитами (тканевыми макрофагами) и панцитопении [77]; прогноз неблагоприятен.

При СЧХ, помимо гранул NK-клеток и ЦТЛ, страдают также гранулы меланоцитов и нейтрофилов. Последнее является причиной тяжелых бактериальных инфекций, которые выходят на первый план в клинике; однако на поздней стадии СЧХ развивается лимфомоподобный синдром, который гемофагоцитарным синдромом [77, 161].

Такие заболевания, как синдром Германски—Пудлак II типа и синдром Гришелли II типа, протекают с сочетанным поражением цитотоксических лимфоцитов, нейтрофилов и меланоцитов и тоже осложняются гемофагоцитарным синдромом [77, 161].

1.7.2. Иммунодефициты с нарушением активации Первичные иммунодефициты, при которых отсутствует собственно синдромом, т.к. у этих больных не индуцируется не только цитотоксическая функция (хотя все компоненты ее сохранны), но и выработка цитокинов, в том числе ИФН-. Один из примеров — LAD-синдром 1 типа (leukocyte adhesion deficiency syndrome, type 1), который вызывают мутации в гене ITGB2, кодирующем CD18-субъединицу молекул адгезии LFA-1 (CD11a/CD18), Mac- (CD11b/CD18) и CD11c/CD18 [116]. NK-клетки таких больных не образуют ИС, что делает невозможным их активацию [161]. Поскольку при LAD-синдроме нарушена функция всех лейкоцитов, в первую очередь нейтрофилов, то на первый план в клинике выходят тяжелые гнойные инфекции.

1.7.3. Синдром Вискотта—Олдрича Промежуточное положение занимают иммунодефициты, при которых активация NK-клеток и ЦТЛ нарушена частично (сохранена стадия инициации ИС). Одним из таких иммунодефицитов является синдром Вискотта—Олдрича (СВО) — первичный иммунодефицит, возникающий вследствие мутаций в гене WAS (Wiskott-Aldrich syndrome), который находится на X-хромосоме, в локусе Xp11.22-23. Частота встречаемости СВО — 1—10 случаев на 1 новорожденных; болеют мальчики [160].

Белок WASP, кодируемый геном WAS, участвует в формировании актинового цитоскелета клетки, а также в передаче сигналов с рецепторов клеточной мембраны на актиновый цитоскелет [201]. WASP состоит из аминокислотных остатков и экспрессируется только в гематопоэтических клетках. На С-конце WASP находится верпролин-гомологичный домен VCA, способный связывать актин-взаимодействующий комплекс Arp2/3, который инициирует образование новых актиновых филаментов (f-актина). На N-конце присутствуют регуляторные домены: EVH1 (для связывания с белком WIP — взаимодействие, важное для стабилизации WASP), основной регион (важен для аутоингибирования функции WASP и для связывания фосфатидилинозитол-4,5Полимеризация актина Рисунок 2. Схема строения и функционирования белка WASP. А — в неактивированной клетке белок WASP в аутоингибированном состоянии (структура «шпильки»). В — при активации клетки ГТФаза Cdc42 связывается с WASP, а также происходит фосфорилирование тирозина-291 (P); это приводит к разворачиванию молекулы WASP и ее связыванию с комплексом Arp2/3, что индуцирует полимеризацию актина (Bouma et al, 2009).

дифосфата), GBD-домен (для связывания ГТФазы Cdc42) и домен, богатый пролином (для связывания с белками, содержащими SH3-домены) [34]. Такое обилие регуляторных доменов указывает, что WASP является точкой схождения многочисленных сигнальных путей.

В неактивированной клетке WASP находится в аутоингибированном состоянии, при котором VCA-домен ассоциирован с ГТФазо-связывающим GBD-доменом (рис. 2А) [34, 114]. При активации клетки (например, после стимуляции Т-клеточного рецептора у Т-клеток, IgE-рецептора у тучных клеток или коллагенового рецептора у тромбоцитов), ГТФаза Cdc42 при участии белка Toca-1 связывается с GBD-доменом, что приводит WASP в активное состояние.

В этом состоянии VCA-домен отделяется от GBD-домена и связывается с Arp2/3, в результате чего инициируется полимеризация актина (рис. 2В) [42, 95].

Активное состояние WASP поддерживается фосфорилированием тирозина в положении, которое происходит при активации клетки в результате активности Src-киназ, причем это фосфорилирование происходит независимо от активации WASP через Cdc42 [60, 206].

При СВО в результате мутаций белок WASP либо полностью отсутствует, либо синтезируется его усеченная, нефункционирующая форма, что приводит к нарушению внутриклеточной передачи сигнала, изменению формы клеток и их движения [43].

тромбоцитопения, экзема и иммунодефицитное состояние, которое проявляется пневмококковыми) и вирусными инфекциями (в частности, герпесвирусными) [160]. Вследствие низкого содержания тромбоцитов в крови возникают петехии и кровотечения из слизистых оболочек, в том числе желудочно-кишечного тракта. У 40% больных СВО развиваются аутоиммунные заболевания:

гемолитическая анемия, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная нейтропения, артриты, васкулиты малых и крупных кровеносных сосудов, аутоиммунное поражение почек и печени. У больных СВО, особенно инфицированных вирусом Эпштейна—Барр, повышен риск лимфом головного гемофагоцитарного синдрома. Диагноз СВО ставят по результатам Вестернблоттинга или проточно-цитометрического анализа, при которых выявляют снижение или полное отсутствие экспрессии белка WASP.

Иммунологические нарушения при СВО разнообразны и могут быть объединены в следующие группы [43]: 1) нарушение образования ИС Т- и NKклетками, что ведет к дефектам их активации и неспособности элиминировать вирус-инфицированные клетки; 2) нарушение продукции Т-клеток в тимусе; 3) нарушение дифференцировки и/или функций B-клеток, в частности снижение продукции антител к полисахаридным антигенам, что ведет к снижению резистентности к капсулообразующим бактериям, например к пневмококку; 4) нарушения фагоцитоза; 5) нарушения хемотаксиса различных клеток иммунной системы.

инфекциям и повышенная частота лимфом косвенно указывает на дефект функции NK-клеток при СВО. Имеется небольшое число работ, посвященных этой теме. Так, при СВО показано снижение естественной и антитело-зависимой цитотоксичности NK-клеток [85], что, вероятно, обусловлено нарушением реорганизации актина и отсутствием поляризации литических гранул в зону ИС [163]. Эти дефекты обусловлены критической ролью WASP и регулируемой им реорганизации актина во второй стадии образования ИС (см. 1.5.2). Однако первая стадия формирования ИС при СВО, вероятно, не нарушена, поэтому индукция ИФН- частично сохранена. В условиях вирусной инфекции это может вести к развитию гемофагоцитарного синдрома вследствие гиперпродукции ИФН- Т- и NK-клетками [161]. Интересно, что цитотоксическая активность NKклеток больных СВО может быть восстановлена in vitro путем культивирования с ИЛ-2, что указывает на существование альтернативных механизмов регуляции актинового цитоскелета, не связанных с WASP [85].

Лечение СВО сводится к пересадке костного мозга от HLA-совместимых доноров; для симптоматического лечения экземы назначают стероиды и антибиотики, при аутоиммунных заболеваниях — иммуносупрессанты [226].

Прорывом в этой области следует считать опубликованное в 2010 г. сообщение пересаживали аутологичные стволовые кроветворные клетки, в которые с помощью ретровирусного вектора был введен нормальный ген WAS. После пересадки наблюдалась экспрессия белка WASP в значительной части лимфоидных клеток, миелоидных клеток и тромбоцитов, отмечалось восстановление функциональной активности Т-, B-, NK-клеток и моноцитов, а аутоиммунной симптоматики, резкое уменьшение частоты инфекций). Эффект терапии сохранялся минимум 2 года после пересадки стволовых клеток. Успех этой работы позволяет надеяться на успешное применение генотерапии и при других первичных иммунодефицитах.

1.8. Хроническая гранулематозная болезнь иммунодефицит, возникающий вследствие отсутствия или дисфункции фермента НАДФН-оксидазы в фагоцитах. Нарушения экспрессии и/или функции НАДФHоксидазы могут быть вызваны мутациями в любом из генов, кодирующих компоненты этого ферментного комплекса [126], а также дефицитом субстрата НАДФН в результате генетического дефекта глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы или нарушением активации НАДФН-оксидазы [94]. Частота встречаемости ХГБ — 1 случай на 250 тыс.; мальчики болеют чаще девочек. Заболевание чаще всего проявляется уже в раннем детстве [67].

НАДФH-оксидазный комплекс катализирует самую первую реакцию кислородного взрыва, приводящую к образованию супероксид-аниона:

В отсутствие продукции О2–, являющегося первым в цепи образования кислородные радикалы (гидроксильные радикалы, перекись водорода, гипохлорит и др.). Более того, НАДФH-оксидаза поддерживает в фагоцитарных антимикробных пептидов и ферментов [189]. В отсутствие функционирующей НАДФH-оксидазы нейтрофилы неспособны разрушать фагоцитированные микроорганизмы. Незавершенный фагоцитоз приводит к укрыванию микробов фагоцитарных вакуолях. Попадая в другие ткани с кровью, они могут давать начало новому воспалительному очагу. Формирующиеся гранулемы направлены на локализацию инфекции, однако, возникая во многих жизненно важных органах, они могут стать причиной серьезных осложнений [159].

В конце 70-х — начале 80-х гг. XX в., когда механизм цитотоксического действия NK-клеток не был известен, делались попытки связать его с продукцией активных форм кислорода NK-клетками, однако нормальная NKактивность у больных ХГБ стала одним из доказательств против этой гипотезы [111]. В настоящей работе группа детей с ХГБ служит в качестве возрастной иммунодефицитами.

1.9. Инфекция, вызываемая вирусами простого герпеса 1.9.1. Краткая клинико-эпидемиологическая характеристика Герпесвирусы (от греч. herpes — ползучая болезнь) являются одними из наиболее распространенных патогенов в человеческой популяции. Объединены в семейство Herpesviridae, которое включает три подсемейства: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae и Gammaherpesvirinae. Вирусы простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1 и ВПГ-2), вызывающие лабиальный и генитальный герпес, относятся к альфа-герпесвирусам. Вирусы этого подсемейства характеризуются коротким циклом репродукции в клеточных культурах, высокой тропностью к клеткам эпителиоидного ряда и выраженным цитопатическим действием. Альфагерпесвирусы обычно персистируют в нервной системе, поддерживая латентную инфекцию, которая может периодически реактивироваться. В большинстве случаев альфа-герпесвирусы вызывают поражение кожи и слизистых. Помимо ВПГ, к альфа-герпесвирусам относится вирус варицелла зостер.

Подавляющее большинство людей (до 90%) становятся пожизненными носителями ВПГ [178], хотя возраст инфицирования зависит от географической локализации, расовой принадлежности и социального статуса [220]. В возрасте 50 лет и старше антитела к ВПГ-1 и/или ВПГ-2 типа выявляются у 90% населения. Наиболее часто ВПГ-инфекция проявляется в виде пузырьковых высыпаний на слизистой губ и ротовой полости (лабиальный герпес) и наружных половых органов (генитальный герпес). ВПГ-1 преимущественно вызывает лабиальный герпес, тогда как ВПГ-2 — генитальный. Однако в последнее время наблюдается рост частоты генитального герпеса, вызванного ВПГ-1, и лабиального — вызванного ВПГ-2 [220]. Инфекции, вызванные ВПГ-1 и ВПГ-2, клинически неразличимы, однако частота последующих реактиваций инфекции зависит от анатомической локализации поражения и типа вируса [209].

Рецидивирующее течение заболевания отмечается у 20—40% инфицированных [219]. ВПГ-2-инфекция протекает тяжелее и более склонна к рецидивированию;

средняя частота симптоматических рецидивов составляет 2,9 в 100 дней у мужчин и 1,7 в 100 дней у женщин [220].

Существенную социально-экономическую проблему представляет глазной герпес (герпетический кератоконъюнктивит): в США в 1990-е гг.

регистрировалось до 300 000 случаев заболевания в год [220]. Глазной герпес нередко имеет рецидивирующее течение и со временем приводит к помутнению роговицы. К тяжелым, угрожающим жизни формам ВПГ-инфекции относится распространенное герпетическое поражение эпителия желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, внутренних половых органов, а также герпетический энцефалит. Эти формы инфекции, как правило, развиваются на фоне иммунодефицитов. Особняком стоит герпес новорожденных, который, как правило, развивается вследствие прохождения плода через родовые пути ВПГ-2инфицированной матери и нередко оканчивается летальным исходом [220].

1.9.2. Свойства и жизненный цикл ВПГ ВПГ впервые был выделен W. Gruter в 1912 г. из жидкости герпетического пузырька у человека. ВПГ термолабилен, инактивируется при температуре в течение 30 минут, однако весьма устойчив к воздействию низких температур и повторному замораживанию [2, 5]. ВПГ инактивируется ультрафиолетовым и рентгеновским излучением, очень чувствителен к спиртам и другим органическим растворителям [2, 3].

ВПГ, как и другие герпесвирусы, обладают довольно большим геномом, образованным двуспиральной ДНК. Геном ВПГ содержит не менее 100 генов, которые кодируют не менее 84 известных полипептидов [184]. В геноме ВПГ кодируется большая часть ферментов, необходимых для репликации вирусной ДНК, что важно для репликации ВПГ в нейронах [8].

Передача ВПГ (первичное инфицирование) происходит контактным путем через поверхностно поврежденный эпидермис или неповрежденные слизистые.

Вирус заражает эпителиоциты и реплицируется в них, приводя к их разрушению и формированию первичного очага. Вирусные частицы, высвобождающиеся из эпителиоцитов, проникают в афферентные нервные волокна C-типа [23], по которым транспортируются в тригеминальные или сакральные ганглии. Кроме этого (нейрогенного) пути распространения ВПГ, существует гематогенный путь, обусловленный способностью гликопротеинов ВПГ связываться с гепарансульфатом эритроцитов [207] и имеющий значение, вероятно, только при генерализованных формах ВПГ-инфекции. ВПГ может также обнаруживаться в лимфатической системе в свободном или связанном с лимфоцитами состоянии [5].

Попав в чувствительные нейроны ганглиев, ВПГ формирует в них латентную инфекцию. При латентной инфекции в клетке присутствует вирусная ДНК и особые РНК-транскрипты, ассоциированные с латентностью (latencyassociated transcripts или LATs), однако экспрессия других вирусных генов и продуктивная инфекция отсутствует [184]. Переход инфекции в латентную стадию может быть объяснен двумя моделями: 1) в ядрах нейронов в норме отсутствует транскрипционный фактор HCF-1, необходимый для транскрипции немедленно-ранних генов ВПГ; 2) ДНК ВПГ все же проходит несколько циклов репликации в нейронах, однако это — в силу биохимических особенностей нейронов — приводит не к продуктивной инфекции, а к установлению приписывается LAT-транскриптам и вирусным микроРНК (miRNA), которые экспрессию отдельных вирусных генов по механизму РНК-интерференции [184].

Кроме того, в ганглиях с латентной ВПГ-инфекцией присутствуют CD8+ Тклетки, специфичные к поверхностным антигенам ВПГ [113, 128]; возможно, эти Т-клетки препятствуют репликации ВПГ в нейронах с помощью механизма, не связанного с лизисом, например путем продукции ИФН- [65].

Тем не менее, со временем в нейронах может начаться экспрессия вирусных генов и репликация вируса. Это явление назвается реактивацией. Как правило, реактивация индуцируется стрессом, ультрафиолетовым облучением, способствовать развитию стрессового состояния в ВПГ-инфицированных нейронах, при котором транскрипционный фактор HCF-1 перемещается в ядро, эпителиоцитов ведет к их гибели и служит морфологической основой обострения заболевания.

Характерной чертой ВПГ-инфекций является бессимптомное вирусовыделение, т.е. реактивация без клинически явного повреждения эпителия. Wald и соавт. проводили ежедневную ПЦР-детекцию ДНК вирусного гликопротеина gB в мазках из влагалища ВПГ-2-серопозитивных женщин и выявили бессимптомное выделение ВПГ-2 в 28% дней, а у некоторых женщин — практически постоянное вирусовыделение; при этом клинически явные рецидивы генитального герпеса наблюдались в несколько раз реже [216]. Те же авторы позже обнаружили бессимптомное выделение ВПГ-2 у лиц, никогда не страдавших рецидивирующим генитальным герпесом [217]. Kaufman и соавт.

показали, что у 98% лиц, инфицированных ВПГ-1, хотя бы 1 раз в месяц происходит бессимптомное выделение ВПГ-1 со слюной и/или слезной жидкостью [110]. Источник бессимптомно выделяемого ВПГ достоверно не известен: им могут быть как эпителиоциты (например, если вирус реплицируется в небольшом количестве эпителиоцитов, потеря которых может быть быстро восполнена), так и непосредственно чувствительные нервные окончания [204]. В последнем случае приходится предположить, что реактивация инфекции в нейронах лишь в относительно небольшом проценте случаев приводит к продуктивной инфекции в эпителиоцитах (т.е. к симптоматическому рецидиву).

Одним из факторов, препятствующих поражению эпителиоцитов, вероятно, является состояние иммунной системы хозяина.

1.9.3. Иммунный ответ на ВПГ В защите от ВПГ играют роль факторы врожденного иммунитета (эпителиальные барьеры, комплемент, система интерферонов I типа, NK-клетки, макрофаги, нейтрофилы) и адаптивного иммунитета (CD4+ и СD8+ Тлимфоциты, B-клетки и вырабатываемые ими антитела). Для краткости здесь будут рассмотрены только два взаимосвязанных компонента защиты от ВПГ:

система интерферонов I типа и NK-клетки.

Ранняя фаза иммунного ответа на первичное инфицирование или рецидив ВПГ-инфекции возникает в первые 6—12 ч развития инфекционного процесса и обеспечивается в основном выработкой ИФН I типа [213]. ВПГ — мощный индуктор ИФН; этот эффект опосредуется распознаванием вирусных нуклеиновых кислот паттерн-распознающими рецепторами TLR3, TLR9 и DAI [47, 200, 227]. Продуцентами ИФН I типа могут быть как инфицированные эпителиоциты, так и лейкоциты, среди которых основной вклад вносят плазмацитоидные дендритные клетки [190]. Ранняя продукция ИФН-/ коррелирует с устойчивостью к ВПГ; ИФН-/ препятствуют экспрессии немедленно-ранних генов ВПГ как в ганглиях, так и в эпителиоцитах [70]. Кроме того, интерфероны I типа активируют протеинкиназу R, которая фосфорилирует фактор элонгации трансляции eIF2, что ведет к остановке трансляции в клетке.

Другой мишенью ИФН-/ является РНКаза L, которая неизбирательно разрезает клеточную РНК. Наконец, интерфероны I типа обладают мощным иммунорегуляторным действием, в частности индуцируют экспрессию хемокинов, активируют макрофаги, дендритные клетки и NK-клетки.

Врожденные дефекты индукции интерферонового ответа проявляются именно тяжелой ВПГ-инфекцией в форме энцефалита [47, 172, 227].

Однако ингибирующее влияние ИФН-/ на ВПГ-инфекцию сравнительно невелико по сравнению с другими вирусными инфекциями [70], что обусловлено способностью ВПГ «обходить» или блокировать противовирусные эффекты интерферонов I типа: 1) белок ICP34.5 ВПГ вызывает дефосфорилирование eIF2, что приводит к возобновлению трансляции в клетке [70]; 2) белок ICP0, кодируемый одним из немедленно-ранних генов ВПГ, вызывает деградацию белка PML (promyelocytic leukemia protein), чем отменяет ингибирующее действие интерферонов I типа на репликацию ВПГ [92, 156, 184]; 3) ВПГ вызывает деградацию компонентов сигнального пути от рецептора ИФН-/ [50, 144]; 4) белок ICP27 ВПГ вызывает секрецию термостабильного антагониста интерферонов I типа, блокирующего ИФН-/ рецептор и/или передачу сигнала от него в ядро [106]; 5) ВПГ вызывает синтез неактивных аналогов 2’,5’олигоаденилатов, которые конкурируют с активными формами 2’,5’олигоаденилатов и препятствуют активации РНКазы L [1].

NK-клетки вступают в действие на более позднем этапе ответа на ВПГинфекцию [213], и их активность во многом регулируется интерферонами, продуцируемыми на ранней стадии. Стимуляция цитотоксической активности NK-клеток является одним из основных эффектов интерферонов I типа [68];

кроме того, ИФН-индуцибельные цитокины (RANTES, IP-10) привлекают NKклетки в очаг инфекции [183]. Основная функция NK-клеток при ВПГ-инфекции — лизис вирус-инфицированных клеток. NK-клетки ингибируют репликацию ВПГ-1 in vitro [78] и in vivo [213]. В отсутствие Т-клеток NK-клетки достаточны для предотвращения летального исхода ВПГ-энцефалита у мышей [11]. В то же время пациенты с дефицитом NK-клеток [28] или их киллерной функции [162] страдают именно от тяжелых форм ВПГ-инфекции. NK-клетки способны инфекции, причем для распознавания инфицированной мишени и ее киллинга по механизму естественной цитотоксичности достаточно экспрессии немедленнораннего гена ICP0 в клетке-мишени [53]. Кроме того, NK-клетки распознают и убивают мишени, покрытые антителами к ВПГ [55]. Помимо киллинга мишеней, NK-клетки продуцируют цитокины, наиболее важными из которых являются ИФН- и ФНО-. ИФН-, наряду с интерферонами I типа, препятствует репликации вируса [65], сенсибилизирует клетки-мишени к цитотоксическому иммунорегуляторными эффектами, в частности активирует противовирусную функцию макрофагов, способствует развитию Т-хелперного ответа 1 типа и противовирусное действие интерферонов I типа, способствует развитию воспалительной реакции, может оказывать прямое цитотоксическое действие на клетки-мишени.

противодействия NK-клеткам. Контакт с ВПГ-инфицированными клеткамимишенями приводит к «разоружению» т.е. потере ими цитотоксических свойств [56]; механизм этого эффекта до сих пор не ясен [224].

ВПГ ингибирует экспрессию лигандов NKG2D инфицированными клетками, препятствуя их распознаванию NK-клетками [187]. ВПГ-инфицированные интерферонов I типа [106], который может блокировать активирующее действие ИФН-/ на NK-клетки.

1.9.4. Часто рецидивирующий герпес Несмотря на многолетние исследования, до сих пор не ясно, почему у одних ВПГ-инфицированных лиц рецидивы инфекции редки, а у других развивается часто рецидивирующий герпес (ЧРГ). Способствовать частому рецидивированию могут генетические особенности хозяина, особенности штамма ВПГ, а также текущее состояние иммунной системы. В частности, мононуклеарные клетки крови больных с ЧРГ вырабатывают пониженные уровни ИФН-, ИФН- и ИЛ-2, особенно непосредственно перед обострением [120, 150, 175].

При ЧРГ, как правило, описывают снижение NK-активности [7, 48, 51, 124, 191], однако детали этих работ разнятся. По данным С.Б.Чекнева и соавт., снижение NK-активности при рецидивирующем генитальном герпесе более выражено в стадию ремиссии заболевания [51]. Cauda и соавт., напротив, сообщают о снижении NK-активности и содержания NK-клеток (определяемых как CD16+ лимфоциты) преимущественно в ходе обострения генитального герпеса, с нормализацией во время ремиссии [48]. Leszczyszyn-Pynka приводит сходные данные для рецидивирующего лабиального герпеса [124]. Наконец, по данным Sirianni и соавт., NK-активность при рецидивирующем генитальном герпесе снижена независимо от стадии заболевания, причем это снижение обратно коррелирует с повышенным процентным содержанием NK-клеток, которые определяли как HNK-1+ (CD57+) лимфоциты [191]. Трактовка данных Sirianni и соавт. затруднена, поскольку CD57 не является специфичным маркером NK-клеток. В целом, данные по состоянию NK-клеток при ЧРГ противоречивы.

Таким образом, характер течения ВПГ-инфекции является результатом взаимодействия разнообразных факторов, важнейшими из которых являются:

биологические свойства штамма ВПГ, особенности функционирования иммунной системы хозяина, наличие или отсутствие иммунодефицита, а также внешние факторы, воздействующие на макроорганизм. Поэтому для ВПГинфекции характерен широчайший диапазон клинических форм — от латентной инфекции до манифестной, протекающей с ограниченными или распространенными поражениями кожи и слизистых оболочек или с вовлечением в патологический процесс различных органов и систем.

1.10. Методы исследования дегрануляции NK-клеток Дегрануляция — главный механизм, с помощью которого NK-клетки осуществляют киллерную функцию, поэтому ее исследование необходимо для оценки состояния NK-клеток. Наиболее очевидный способ оценки дегрануляции — измерение уровней содержимого гранул в культуральном супернатанте NKклеток (например, с помощью Вестерн-блоттинга, иммуноферментного анализа или путем измерения активности гранзимов) [149]. Кроме того, количество клеток, секретирующих перфорин, можно оценить методом ELISPOT (enzymelinked immunospot) [228]. Недостаток данного подхода — необходимость использовать очищенные NK-клетки, т.к. иначе нельзя точно судить об источнике перфорина/гранзимов. Кроме того, поскольку значительная часть перфорина и гранзимов поглощается клетками-мишенями, то измерение их свободных уровней в супернатанте ведет к недооценке их реальной секреции.

Другой подход — измерение убыли секретируемых белков внутри клетки, например с помощью иммунофлюоресцентной окраски и проточной цитометрии.

Чувствительность этого подхода невысока, т. к. при однократной литической атаке NK-клетка выбрасывает лишь небольшую часть цитотоксических белков, потери которых к тому же восполняются за счет повторного использования или синтеза de novo.

Наконец, еще один подход основан на том факте, что при дегрануляции NK-клетки происходит слияние мембраны литических гранул с поверхностной мембраной, в результате чего мембранные белки, располагающиеся на внутренней поверхности гранул, оказываются на поверхности NK-клетки иммунофлюоресцентной окраски. К числу таких белков относятся CD107a (LAMP-1 или lysosome-associated membrane protein-1) и родственный ему CD107b (LAMP-2) [173]. Эти два высокогликозилированных белка составляют около 50% мембранных белков лизосом и их производных [81]. Вероятно, они защищают мембрану гранул, а после дегрануляции — также и поверхностную мембрану цитотоксического лимфоцита от повреждения цитотоксическими белками. Экстернализация CD107a была предложена в качестве маркера дегрануляции вначале для CD8+ Т-клеток [26], а затем для NK-клеток [13] и кратковременной (2—4 ч) стимуляции клеток in vitro. В качестве стимуляторов NK-клеток обычно используют клетки K562 (MHC-I-негативная клеточная линия, полученная от больного эритромиелоидным лейкозом и являющаяся классической мишенью NK-клеток), другие NK-чувствительные клеточные линии, моноклональные антитела к активационным рецепторам NK-клеток, а также нерецепторные стимулы (форбол-12-миристат-13-ацетат в сочетании с иономицином) [13]. Результаты теста на экстернализацию CD107a обычно оценивают с помощью проточной цитометрии [13, 41]. Тест получил широкое распространение, что обусловлено следующими его преимуществами: 1) относительная простота; 2) высокая чувствительность; 3) возможность визуализировать и подсчитывать «настоящие» эффекторные лимфоциты, т.е.

клетки, отвечающие на ту или иную стимуляцию выбросом цитотоксических белков; 4) возможность определять фенотип дегранулирующих клеток; 5) возможность одновременно исследовать другие функции дегранулирующих и недегранулирующих клеток, в частности продукцию ими цитокинов.

Хотя роль CD107a как маркера дегрануляции была всесторонне доказана для CD8+ Т-клеток [26], для NK-клеток аналогичная работа не была проведена [13]. Более того, по данным Tomescu и соавторов, CD107a+ и CD107a– NKклетки, полученные после 3-часовой коинкубации с клетками K562, не различаются по внутриклеточному содержанию перфорина и гранзимов [205], что ставит под сомнение роль CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток.

Кроме того, неизвестно, существуют ли более чувствительные маркеры дегрануляции, чем CD107a/b.

1.11. Резюме по обзору литературы Развитие генотерапии позволяет целенаправленно корригировать врожденные дефекты генов, отвечающих за иммунный ответ, в том числе генов, необходимых для функционирования NK-клеток [35]. Поэтому наряду с оценкой NK-активности (интегральный показатель функции NK-клеток), необходим комплекс диагностических методов, позволяющих более детально оценить основные параметры NK-клеток: 1) их процентное содержание в крови; 2) экспрессию ими маркеров литических гранул; 3) экспрессию цитотоксических белков, в частности перфорина; 4) способность дегранулировать. Проведение подозрением на первичный иммунодефицит позволит более точно диагностировать поломку в системе NK-клеток [138] и, следовательно, более целенаправленно искать поврежденный ген с целью восполнения его функции.

После генотерапии те же исследования могут использоваться для мониторинга восстановления функций NK-клеток. Указанный комплекс исследований в лабораториях клинической иммунологии в Российской Федерации в настоящее время не проводится, что обусловлено в первую очередь отсутствием необходимой методологической базы.

Помимо первичных иммунодефицитов, оценка функций NK-клеток имеет существенное значение при вирусных инфекциях, особенно хронических. Часто рецидивирующий герпес (ЧРГ) — один из наиболее типичных примеров таких инфекций. Роль NK-клеток в защите от вирусов простого герпеса показана достаточно убедительно на экспериментальных моделях; имеются данные о снижении NK-активности у пациентов с ЧРГ. Комплексная оценка функций NKклеток позволила бы точнее охарактеризовать дефект в системе NK-клеток у пациентов с ЧРГ. Опубликованные данные по состоянию NK-клеток при ЧРГ противоречивы; имеет смысл вернуться к этому вопросу на современном методологическом уровне.

Для оценки дегрануляции NK-клеток и ЦТЛ все чаще применяют тест на экстернализацию лизосомального антигена CD107a после стимуляции NKклеток или ЦТЛ in vitro. Однако формальная валидация этого теста именно для NK-клеток не была проведена. Более того, опубликованы данные, ставящие под сомнение значимость этого теста именно как теста на дегрануляцию. Не исследована возможность использования других лизосомальных антигенов, в частности CD63, для оценки дегрануляции NK-клеток.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика обследованных групп исследованных групп ниже представлен как медиана [10—90 процентили].

2.1.1. Пациенты с синдромом Вискотта-Олдрича ( СВО) Исследовано 15 мальчиков, страдающих СВО (возраст 4 [1-14] лет).

Больные наблюдались в отделении иммунопатологии Детской городской клинической больницы №9 им. Сперанского г. Москвы (заведующий отделением — профессор, д.м.н. А.П.Продеус). Диагноз СВО был подтвержден с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания (отсутствие белка WASP в лейкоцитах).

8 пациентов на момент исследования получали иммуносупрессивную терапию (глюкокортикостероиды либо цитостатики, либо их сочетание).

2.1.2. Пациенты с хронической гранулематозной болезнью (ХГБ) Группу составили 9 мальчиков (возраст 9 [4-14] лет), наблюдавшихся в отделении клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы (заведующая отделением — профессор, д.м.н. И.В.Кондратенко).

Диагноз был подтвержден с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции (отсутствие кислородного взрыва при стимуляции зимозаном). Семеро больных на момент исследования получали массивную антимикробную терапию.

2.1.3. Пациенты с часто рецидивирующим герпесом (ЧРГ) Исследовано 34 пациента с ЧРГ (возраст 33 [24-50] лет), из них 11 мужчин и 23 женщины, наблюдавшихся в отделении аллергологии и иммунотерапии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России» (заведующий отделением — профессор, д.м.н. А.Е.Шульженко). Критериями включения в группу были: 1) наличие двух и более обострений заболевания в год; 2) отсутствие других активных воспалительных или инфекционных заболеваний на момент исследования. Диагноз ЧРГ был подтвержден опытным иммунодерматологом (к.м.н. И.Н.Зуйкова). У 30 пациентов отмечалась генитальная локализация высыпаний, у двоих — лабиальная и еще у двоих — смешанная. Частота обострений у 25 пациентов составила от 2 до 6 в год, у 9 пациентов — более 6 в год.

Подгруппа из 24 пациентов была исследована в динамике: однократно в ходе обострения (в течение 48 ч после появления первых симптомов) и однократно во время ремиссии (спустя примерно 1 мес. после начала обострения). Остальные 10 человек были исследованы только в обострении. Во время обострения все пациенты получали ацикловир (400 мг 3 раза в день в течение 10 дней).

2.1.4. Здоровые доноры Для целей исследования были сформированы три группы здоровых доноров, давших добровольное согласие на участие в исследовании:

группу ср авнения для детей с СВО и ХГБ составили 28 здоровых доноров молодого возраста — не старше 30 лет (возраст 25 [23—28] группу сравнения для пациентов с ЧРГ составили 56 здоровых доноров (возраст 27 [23—35] лет), из них 21 мужчина и 35 женщин.

Эта группа включала в себя всех доноров первой группы. По возрастному и половому составу эта группа не отличалась от группу пожилых доноров крови составили 15 человек (возраст Критерием включения в донорские группы было отсутствие хронических инфекционных и воспалительных заболеваний, отсутствие онкологических заболеваний, а также отсутствие острых инфекционных заболеваний на момент исследования либо разрешившихся менее чем за 2 нед. до исследования.

2.1.5. Прочие пациенты и доноры Кровь здоровых доноров использовалась для отработки и валидации методик исследования, а также для определения фенотипа дегранулирующих NK-клеток. Эти доноры не включены в вышеперечисленные группы, а их количество указано для каждого эксперимента в главе Результаты.

Исследован также мальчик 5 лет с СЧХ, двое мальчиков с подозрением на СГЛ (возраст — 2,5 года и 2 года), а также сестра первого мальчика с подозрением на СГЛ (возраст — 1 год).

2.2. Реактивы, расходные материалы и оборудование 2.2.1. Реактивы для культуральных работ Полная культуральная среда (ПКС) — среда RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (РАА, Австрия) и 2 мМ глутамина (Sigma). Готовили в стерильных условиях, хранили не более 1 недели при +4°С.

Краситель трипановый синий — 0,4% раствор трипанового синего (Sigma, США) в ФСБ.

Прочие реактивы — фиколл-верографин с плотностью 1,077 г/см (ПанЭко); среда 199 (ПанЭко); фосфатно-солевой буфер в модификации Дюльбекко (ФСБ-Д; ПанЭко).

2.2.2. Стимуляторы и ингибиторы Форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА, Sigma) — готовили маточный раствор с концентрацией 1 мг/мл на ДМСО.

Иономицин (ИОН, Sigma) — готовили 1 мМ маточный раствор на ДМСО.

Моненсин (Sigma) — готовили 10 мМ маточный раствор в 96% этиловом спирте.

Цитохалазин Б (ЦБ, Sigma) — маточный раствор 1 мг/мл на ДМСО.

Циклогексимид (ЦГ, Sigma) — маточный раствор 10 мг/мл на ДМСО.

Все растворы хранили при –20°C.

2.2.3. Моноклональные антитела (МАТ) Использовали следующие МАТ с флюоресцентными метками:

Pages: |

| 2 |

Главная >> Диссертации - все темы

[ СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА .pdf ]

Похожие работы:

«Панфилова Ольга Витальевна ОЦЕНКА АДАПТИВНОСТИ КРАСНОЙ СМОРОДИНЫ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ СЕВЕРО-ЗАПАДА ЦЕНТРАЛЬНО-ЧЕРНОЗЕМНОГО РЕГИОНА 06.01.05- селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель : кандидат с. - х. наук О.Д....»

«vy vy из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Лучанкин, Александр Иванович 1. Социальные представления и социальная работа (Проблемы философского обоснования) 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2002 Лучанкин, Александр Иванович Социальные представления и социальная работа (Проблемы философского обоснования) [Электронный ресурс]: Дис.. д-ра филос. наук : 09.00.11 - М.: РГБ, 2002 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Социальная философия Полный текст:...»

«ЕРЕМИНА АННА АЛЕКСЕЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ УРАНОВАНАДАТОВ ЩЕЛОЧНЫХ, ЩЕЛОЧНОЗЕМЕЛЬНЫХ, d-ПЕРЕХОДНЫХ И РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ Специальность 02.00.01 – неорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Н. Г....»

«Землянухин Юрий Петрович ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КОМПОЗИЦИОННЫХ РАДИОМАТЕРИАЛОВ, АКТИВНО ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ МИЛЛИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА 01.04.03 – Радиофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель кандидат физ.мат. наук,...»

«РАЗУМОВ ПАВЕЛ ВЛАДИМИРОВИЧ КРИМИНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕРОНТОЛОГИЧЕСКОЙ ПРЕСТУПНОСТИ И МЕРЫ ЕЕ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ 12.00.08 – уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель : Кандидат юридических наук, доцент Ю.Е. Пудовочкин Ставрополь, ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.. Глава I. Криминологическая характеристика геронтологической преступности...»

«Князькин Сергей Игоревич ЭКСТРАОРДИНАРНЫЙ ХАРАКТЕР ДЕЯТЕЛЬНОСТИ НАДЗОРНОЙ СУДЕБНОЙ ИНСТАНЦИИ В ГРАЖДАНСКОМ И АРБИТРАЖНОМ ПРОЦЕССЕ 12.00.15 – гражданский процесс; арбитражный процесс Диссертация на соискание учной степени кандидата юридических наук Научный руководитель : Доктор юридических наук, профессор Фурсов Дмитрий Александрович Москва,...»

«МАРТЫНЮК КСЕНИЯ АНДРЕЕВНА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ ЦЕЛЕВЫХ ПРОГРАММ РАЗВИТИЯ СОЦИАЛЬНОЙ ИНФРАСТРУКТУРЫ НА ОСНОВЕ МЕТОДА РЕЗУЛЬТАТИВНОГО УПРАВЛЕНИЯ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и...»

«ДЖАБОРОВ МЕХРУБОН МАХМАДКУЛОВИЧ ПОВЫШЕНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЗОННЫХ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЕЙ ДЛЯ ЭЛЕКТРОВОЗОВ НА ПЕРЕМЕННОМ ТОКЕ Специальность: 05.09.03 – Электротехнические комплексы и системы Диссертация на соискание ученой степени Кандидат технических наук Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Н....»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Шмойлов, Дмитрий Анатольевич 1. Эффективность производства и реализации тепличный овощей 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 U мой л об, Дмитрий Анатольевич f Эффективность производства и реализации тепличный овощей [Электронный ресурс]: Дис. канд. экон. наук : 08.00.05.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Экономика — Российская Федерация — Сельское козяйство — Растениеводство — Тепличное...»

«Степанова Наталия Валентиновна АНГЛОЯЗЫЧНЫЕ ЭКОНОМИЧЕСКИЕ МЕДИАТЕКСТЫ КРИЗИСНОГО ПЕРИОДА: КОГНИТИВНО-ДИСКУРСИВНЫЙ АНАЛИЗ Специальность 10.02.04 –германские языки ДИССЕРТАЦИЯ...»

«Коротеев Михаил Юрьевич Вихретоковый контроль качества паяных соединений стержней статорных обмоток турбогенераторов Специальность 05.11.13 – Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«vy vy из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Гурин, Валерий Петрович 1. Естественная монополия как субъект региональной экономики 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2003 Гурин, Валерий Петрович Естественная монополия как субъект региональной экономики [Электронный ресурс]: Стратегия и экономические механизмы развития на примере ОАО Газпром : Дис.. канд. экон. наук : 08.00.04.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной библиотеки) Региональная экономика...»

«ЕФРЕМЕНКО Дмитрий Витальевич Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза 03.00.23 – биотехнология 03.00.07 - микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель :...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Конев, Федор Федорович 1. Федерализм: теоретико-правовые аспекты и опыт России 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Конев, Федор Федорович Федерализм: теоретико-правовые аспекты и опыт России [Электронный ресурс]: Дис.. канд. юрид. наук : 12.00.01.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Государство и право. Юридические науки — Государственное (конституционное) право — Российская Федерация —...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Шеманаева Татьяна Викторовна ЭХОГРАФИЧЕСКАЯ И КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕНЕЗА 14.01.13 - Лучевая диагностика, лучевая терапия 14.01.01 – Акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: д.м.н. Воеводин С. М. д.м.н. Макаров И.О. Москва - 2014...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Абызгильдина, Сакина Шагадатовна База знаний экспертной системы в области промышленной безопасности Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Абызгильдина, Сакина Шагадатовна. База знаний экспертной системы в области промышленной безопасности [Электронный ресурс] : Дис.. канд. техн. наук : 05.26.03. Уфа: РГБ, 2006. (Из фондов Российской Государственной Библиотеки). Пожарная безопасность Полный текст:...»

«Владыкин Сергей Николаевич ПОРТФЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ И КРАТКОСРОЧНЫЕ ИНВЕСТИЦИОННЫЕ СТРАТЕГИИ НА ФРАКТАЛЬНОМ ФОНДОВОМ РЫНКЕ РФ специальность 08.00.13 – Математические и инструментальные методы экономики Диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель доктор экономических наук, профессор Яновский Леонид Петрович; Воронеж – Диссертация добавлена на сайт Финансовая электронная библиотека...»

«Дидигов Мурат Тамерланович ОРГАНОСОХРАНЯЮЩИЕ ХИРУРГИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ ДЕКОМПЕНСИРОВАННЫМ РУБЦОВО-ЯЗВЕННЫМ СТЕНОЗОМ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ Хирургия – 14.01.17 Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант : Заслуженный врач РФ...»

«Дагаев Эдуард Хамзатович МЕТОДИКА ПАРАМЕТРИЧЕСКОГО СИНТЕЗА СИСТЕМ СПУТНИКОВОЙ СВЯЗИ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ПОНИЖЕННЫЕ ЧАСТОТЫ И СДВОЕННЫЙ ПРИЕМ СИГНАЛОВ 05.13.01 Системный анализ, управление и обработка информации (в технике и технологиях) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени...»

наверх

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА (Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)