«ЕФРЕМЕНКО Дмитрий Витальевич Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза 03.00.23 – биотехнология 03.00.07 - микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук ...»

До 1978 г. в России отмечалось снижение заболеваемости туберкулёзом за счёт улучшений социальных условий и внедрения комплекса лечебнопрофилактических мероприятий. Последующие годы (до 1991) характеризовались дальнейшим снижением заболеваемости до порога эпидемического благополучия, определённого ВОЗ - 30 случаев на 100 тыс. населения. Особенно быстро показатели снижались среди детей и подростков. Начиная с 1992 г., эпидемическая ситуация по туберкулёзу резко ухудшилась во всём мире, наблюдается рост заболеваемости как среди взрослых, так и среди детей (Журавлёв М.В., Арсенина Л.В., Виноградова И.Л. с соавт.,2002; Русакова Е.В., Иваненко Г.П., Иванова И.Н. с соавт., 2002). В период с 1997 по гг. в России заболеваемость, вызываемая МТБ, возросла. В 2000 г. этот показатель увеличился по сравнению с уровнем 1991 г. в 2,7 раза (Шешуков П.Ф., Готовский Ю.В., 2002) и лишь в 2000-2002 гг. стабилизировался на высоком уровне. В последние годы резко возрос показатель инфицированности детей, который в 2000 г. составил 2,5 %, тогда как при благополучной ситуации он не превышал 0,1-0,3 % (Онищенко Г.Г., 2003). Наблюдаемое в настоящее время в РФ прогрессирование заболеваемости туберкулёзом связано с очевидным снижением уровня жизни человека и сопутствующим дисбалансом в питании; многочисленными стрессами и наплывом беженцев из других республик бывшего СССР (их заболеваемость туберкулёзом достигает 700 случаев на 100 000 населения), особенно чеченских беженцев (Jakubowiak W., Komourzaeyev B., Dara M. et. al. 2003); увеличением количества эмигрантов (A. G. Miranda, 2003); ростом алкоголизма и наркомании; неудовлетворительным условием содержания заключённых (хотя, несмотря на напряженную эпидситуацию в местах лишения свободы, мероприятия, направленные на предупреждение и раннюю детекцию ТБ, включающие туберкулинодиагностику, флюорографию 2 раза в год, химиотерапию, позволили уменьшить случаи выявления ТБ среди юношей в 6,5 раз (Rakisheva A., Erkenova G., Kassenova L., 2003); скученностью населения в следственных изоляторах, лагерях беженцев; увеличением числа лиц “без определённого места жительства”; прекращением в 90 –х годах предоставления больным с открытой формой туберкулёза изолированной жилой площади (заболеваемость контактных в очаге достигает 700 на 100 000 населения); недостаточным количеством современных препаратов для больных; низкой материально- технической базой многих противотуберкулёзных учреждений (Онищенко Г.Г., 2003). С другой стороны, усиливается “активность” возбудителя, обусловленная, очевидно, вытеснением естественных конкурентов в результате применения антимикробных средств.

Во всех странах ежегодно регистрируют 8-10 млн. случаев инфицирования. Не меньшее значение имеет увеличение количества лиц с хроническими заболеваниями, сопровождающимися нарушениями иммунитета (Покровский В.И., Позднеева О.И. М.,1998).

Эпидемический процесс при туберкулёзе характеризуется наличием двух форм – антропонозной и зоонозной. В первом случае источником инфекции служит человек, заболевание вызывается Mycobacterium tuberculosis, во втором случае – животные (крупный рогатый скот), птицы, заболевания которых вызываются Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium. В отличие от других зоонозных инфекций, при туберкулёзе человек не является эпидемическим тупиком, от него возможно дальнейшее распространение инфекции антропонозным путём (Коротченко С.И., 1999; Фролова Ф.Н., Кулаков И.М., Зайнутдинова Н.Г., Фатыхова Р.Х., 2002). Особенностью при туберкулёзе является убиквитарное распространение и широкая циркуляция возбудителя среди населения, многообразие механизмов, путей и факторов передачи: при антропонозном - ведущий аспирационный механизм с воздушнокапельным и воздушно-пылевым путями передачи, возможен и контактный механизм с контактно-бытовым путём передачи; при зоонозном туберкулёзе преобладают алиментарный и контактно-бытовой пути заражения. Эпидемиологический процесс при туберкулёзе характеризуется высокой заболеваемостью у определённых групп населения, особенно среди лиц с вторичными иммунодефицитами, в том числе ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, в закрытых коллективах детей и взрослых. Повышается уровень заболеваемости среди медицинских работников, особенно противотуберкулёзных учреждений, среди работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих и птицеводческих хозяйств, среди лиц, имеющих профессиональные вредности (шахтёры, работники предприятий с повышенным пылеобразованием и др.).

Зависимость заболевания туберкулёзом от социальных факторов обусловлена усилением миграции с территорий, неблагополучных по туберкулёзу, снижением уровня жизни и ухудшением питания населения (в основном неработающей части населения), демографическими сдвигами в сторону старения населения (Покровский В.И., Позднеев О.И. М.,1998; Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Дергачёв А.В. с соавт., 2003).

Для возбудителя туберкулёза характерны относительно быстрое формирование лекарственной устойчивости, появление лекарственно-зависимых форм, способность к трансформации в L-формы, фильтрующиеся и оскольчатые формы, персистирующие внутри макрофагов, а также некультивируемые формы с возможностью реверсии всех этих образований микобактерий в исходное состояние.

Клинические проявления туберкулёза имеют ряд особенностей, заключающихся в множественной локализации патологического процесса (лёгочные и внелёгочные формы) с преимущественным поражением дыхательной системы (до 90 % и более), невозможности определения точных сроков инкубационного периода (минимальным сроком инкубации считается 2 нед. до появления в лёгких специфических Т-лимфоцитов). Установить же максимальный срок инкубации при инфекции, развивающейся медленно и клинические признаки при которой возникают постепенно, достаточно сложно.

Для туберкулёза характерны хронический характер инфекционного процесса при отсутствии ранней диагностики и лечения, преобладание клинически выраженных форм у подростков и лиц молодого возраста, первичное инфицирование преимущественно в детском возрасте, трудность раннего выявления заболевания у людей всех возрастов из-за полиморфности клинической симптоматики, отсутствия настороженности медицинских работников, а также нарушения регулярности профилактических осмотров.

В патогенезе туберкулёза возможны эндогенный и экзогенный механизмы развития инфекционного процесса. Экзогенный механизм проявляется чаще у взрослых при повторном инфицировании (суперинфекции), как правило, лекарственно-устойчивыми микобактериями. При эндогенном механизме развитие туберкулёза происходит в результате реактивации (реверсии) изменённых форм микобактерий, сохранившихся в остаточных очагах первичной туберкулёзной инфекции. Активация туберкулёзного процесса может происходить в разные сроки, иногда через длительное время от момента первичного заражения.

Восприимчивость человека к туберкулёзу всеобщая, хотя и неабсолютная. Из контактировавших с бациллярными больными инфицируются в течение года 40-50 чел., из которых заболевают 20-40 %. При этом отмечается неодинаковая восприимчивость к данной инфекции в разных возрастных группах: низкая- у детей 1-2 лет, 10-11 лет и у взрослых 30-50 лет (зрелый возраст); высокая- у детей раннего возраста, в препубертатный и пубертатный периоды (12-16 лет), у лиц молодого возраста и пожилых людей. Формирование противотуберкулёзного иммунитета происходит, как правило, на фоне инфицирования («нестерильный иммунитет») (Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В., 2003).

В структуре клинических форм туберкулёза стало больше пациентов, страдающих распространенными, запущенными и осложнёнными формами, а также больных, выделяющих лекарственно-устойчивые микобактерии туберкулёза, снизилась также эффективность лечения больных туберкулёзом (Шевченко Ю.Л. Приказ МЗ РФ № 109 от 21.03.2003).

Появление остро прогрессирующих форм туберкулёза способствует высокому уровню инфицирования туберкулёзом детского населения и увеличению числа заболевших детей, отмечаемому с 1990 г. (1989 г. – 7,4 на 100000 детского населения, 1990 г. - 7,8; 1997 г. - 14,7; 2001 г. - 18,6). Особую тревогу вызывают постоянно сохраняющиеся в течение ряда лет высокие показатели заболеваемости детей туберкулёзом в Чеченской, Ингушской, Северо-Осетинской республиках, а также в республиках Алтай, Дагестан, Тыва и Бурятия.

Показатель заболеваемости туберкулёзом детского населения свидетельствует о сохранении неблагополучной общей эпидемической ситуации по туберкулёзу в стране. При этом структура впервые выявленного туберкулёза у детей подтверждает в целом удовлетворительное качество работы общей лечебной и противотуберкулёзной служб по активному выявлению и профилактике заболевания. Несмотря на ухудшение общей эпидемиологической ситуации в стране, структура фтизиопедиатрической службы была сохранена в прежнем объёме в большинстве регионов России. Охват специфической вакцинацией БЦЖ детей ежегодно составляет до 95 %, туберкулинодиагностикой-85 %. Доля впервые выявленных профилактическими методами больных детей составляет более 70 %. Эти подходы обеспечивают диагностику форм заболеваний, требующих проведения коротких курсов химиотерапии, позволяющих достичь быстрого излечения без остаточных изменений. При росте уровня общей заболеваемости детей в России в течение 10 лет встречаются единичные случаи фиброзно-кавернозного туберкулёза. Из заболевших детей 4003 ребёнка имели поражения органов дыхания. Уменьшается число случаев туберкулёзного менингита, его доля в структуре заболеваемости туберкулёзом составила 0,9 % в 2001 г. Показатель смертности детей от туберкулёза в России колеблется в последние два десятилетия от 0, до 0,11 % на 100 000 детей. Наиболее высока смертность у детей первых лет жизни, она в 10 раз превышает общий показатель (Аксёнова В.А., 2003).

С 1996 г. наблюдался умеренный рост туберкулёза среди больных ВИЧ-инфекцией. Диагностировали эту сочетанную патологию главным образом на ранних стадиях ВИЧ – инфекции более чем в 50 % случаев в противотуберкулёзных учреждениях. В настоящее время ситуация начала изменяться. Это связано с тем, что у заразившихся ВИЧ 5 лет назад уже начинают развиваться поздние стадии ВИЧ - инфекции и, соответственно, иммунодефицит. Если проецировать такое развитие ситуации и дальше, то к 2007 г.

число больных ВИЧ-инфекцией и туберкулёзом составит более 30 тыс. (Фролова О.П., 2003).

Государственная система мониторинга туберкулёза действует в России с 1997 г. на основе приказа Минздрава России № 193 от 13.07.97. Базы данных и программное обеспечение, установленные в более чем 40 административных территориях РФ, обеспечивают в настоящее время эффективный эпидемиологический мониторинг и контроль деятельности фтизиатрической службы (Белиловский Е.М., 2003).

В настоящее время НИИ туберкулёза и фтизиопульмонологии сотрудничает с зарубежными учреждениями по прикладным и фундаментальным исследованиям, по изучению механизмов возникновения лекарственной устойчивости и путей распространения туберкулёза, разработке методов ускоренного определения чувствительности МТБ к химиопрепаратам, иммуногенетике туберкулёза с целью изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности макроорганизма туберкулёзной инфекции (Ерохин В.В.,2003).

В связи со своеобразием эпидемиологии, клиники и диагностики туберкулёза, эпидемиологический надзор должен осуществляться с учётом его особенностей (Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В., 2003). ВОЗ принимает участие во внедрении программы по контролю над туберкулезом на территории РФ с 1994 г. Сегодня 27 субъектов РФ используют рекомендации ВОЗ (Kluge H., Jakubowiak W., Pashkevich D. et.al., 2003).

1.2. Анализ современного состояния конструирования диагностических препаратов и индикации возбудителя туберкулеза.

На приоритетном месте медицинской биотехнологии стоят вопросы разработки и совершенствования технологий изготовления биопрепаратов с целью повышения их активности, чувствительности, специфичности, экспрессности при диагностике туберкулёза у больных людей и выявлении возбудителя в объектах внешней среды.

Для конструирования высокоактивных диагностических препаратов необходимо получить качественный антигенный и антительный материал.

При изолировании антигенного материала микобактерий, представляющего собой сложные комплексы, содержащие протеины, полисахариды, липиды, фосфатиды, необходимо более полное извлечение интересующих специфических компонентов с сохранением их биологических и антигенных свойств.

Для перевода антигенов в растворимое состояние применяют экстракцию трихлоруксусной кислотой, солевыми растворами, фенолом, эфиром, хлороформом, ацетоном и т.д. Получаемые при этом экстракты имеют различные физико-химические, иммунохимические свойства и спектр антигенов. При анализе литературных данных по методам выделения антигенных комплексов из микробных клеток привлекли внимание сообщения Н.А.Бельской с соавт. (1972), В.И.Вейнблата с соавт. (1972), в которых показано, что наиболее сложным макромолекулярным составом обладали водно-солевые экстракты. Многими исследователями для извлечения антигенных компонентов из микробной клетки использовались различные методы её разрушения:

физический, химический, механический и др. Эффективными методами разрушения микробной клетки является ультразвуковая и механическая дезинтеграция (Фихте Б.А., 1972; Афанасьев Е.Н., 1986), так как под их воздействием наступает, прежде всего, разрушение структуры клеток микробов, а изменения химических веществ, находящихся в них, происходят гораздо медленнее, что обеспечивает возможность получения различных нативных антигенных комплексов (Благовещенский В.А.с соавт., 1961).

Специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимости от активности и специфичности антитела, используемого для приготовления диагностического препарата (Скачек Д.В., 1984; Алексеев В.В. с соавт. 1987). Для получения сывороток описаны различные схемы иммунизации животных (Шаханина К.Л., 1977; Чибисова В.А., 1975; Тюменцева И.С.

с соавт., 1994 г; Rowe D.S., 1970; Lachman P.J., 1970 и др.). Антисыворотки, приготовляемые к различным антигенам, испытывают на активность и специфичность методами кольцепреципитации, электрофореза и иммуноэлектрофореза, преципитацией в агаре по Оухтерлони, реакциями агглютинации (РА), непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного анализа (ИФА) и т.д.. При наличии перекрестных реакций антисыворотки истощают (Шаханина К.Л., 1981; Смирнов В.В., 1980; Кузовлева А.А., Шаханина К.Л., 1982; Beuntner E.H. et al., 1970; Ansari A.A. et al.,1981). Лучшие результаты получают при удалении нежелательных антител нерастворимыми иммуносорбентами. Применяют иммуносорбенты, полученные путем присоединения специфического антигена к носителю (целлюлозе, агарозе, сефарозе и др.), либо "сшивкой" специфического антигена. Такие иммуносорбенты обладают прочной ковалентной связью антигена с матрицей и получаются при взаимодействии реакционноспособных функциональных групп биополимеров со специально подобранными бифункциональными соединениями.

Попытки истощения сывороток при использовании в качестве адсорбентов микробных клеток, широко применяемых в сывороточном производстве (Карпов С.П. с соавт.,1976; Смирнов В.В. с соавт., 1980; Пекшев А.В., Елагин Г.Д., Пятков В.А., 1998), приводят к существенной потере специфической активности нативных сывороток, при их частичном насыщении антигенным материалом. При этом процесс адсорбции иммунной сыворотки корпускулярными антигенами очень трудоемок и требует приготовления большого количества биомассы. Значительные преимущества перед названными сорбентами имеют твердофазные иммуносорбенты. При их приготовлении отпадает необходимость получения большого количества биомассы микроорганизмов штаммов-адсорбентов, существует возможность длительного их использования после проведения регенерации и, что самое главное, в процессе адсорбции происходит незначительное снижение специфической активности сывороток при упрощении манипуляций (Лопаткин О.Н. с соавт., 1983).

Тем не менее, метод иммуносорбции имеет и недостатки, связанные со сложностью подготовки иммуносорбентов, с использованием канцерогенных, дорогостоящих импортных реактивов, с недостаточной сорбционной емкостью сорбентов.

Чувствительность иммунометодов зависит, прежде всего, от активности антител, на основе которых они изготовлены. Чаще всего используют иммуноглобулины класса G, для выделения которых из сыворотки существует много способов: аффинная хроматография, высаливание сернокислым аммонием (Таран И.Ф., Лопаткин О.Н., 1985;.O,Berry P.A., 1964; Lenis V.J. с соавт., 1964), осаждение каприловой кислотой (Steibuch, Andran, 1969), полиэтиленгликолем (Polson A. с соавт., 1964), риванолом (по Корн, 1977), этиловым спиртом (Табаков П.К с соавт., 1962; Носков Ф.С., 1969) и т.д. Освобождение иммуноглобулинов от основного количества балластных белков (главным образом от альбумина) позволяет снизить неспецифические реакции.

Каждый из методов выделения иммуноглобулинов имеет свои преимущества и недостатки. Удаление солей, используемых при фракционировании белков, необходимо проводить полностью, так как загрязнения выделенных глобулинов даже небольшим количеством сульфата аммония мешают точному определению количества белка и дальнейшей его конъюгации с красителем или ферментом. Сульфатно-риваноловый метод обеспечивает эффективное удаление балластных веществ при очистке иммуноглобулинов (Водолазова А.М., Никитина Л.Н., 1981). Метод их выделения с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) является эффективным, так как ПЭГ хорошо осаждает белки, обладает селективностью, более специфичен при осаждении белков различной природы, чем сульфат аммония. При фракционировании иммуноглобулинов каприловой кислотой выделяется наиболее чистая фракция иммуноглобулинов класса G.

Только при чётко подобранном антигенном материале, эффективной схеме иммунизации, отработанном для каждого конкретного случая методе выделения иммуноглобулинов, возможно получение высокоактивных диагностических препаратов.

В настоящее время диагностика ТБ недостаточно эффективна. Так, например, основными методами диагностики ТБ медиастинальных лимфоузлов, сопровождающегося интоксикационным синдромом в сочетании с кальцинацией лимфоузлов и продуктивным кашлем, являются рентгенологический и бронхоскопический (Nikolayeva O., Shpak O., 2003).

При диагностике туберкулёза до сих пор на приоритетном месте находятся бактериоскопия и культуральный метод. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Бактериоскопия позволяет быстро получить результаты анализа, однако недостаточно чувствительна, а результаты культурального метода из-за длительности сроков культивирования микобактерий не отражают настоящую ситуацию по бактериовыделению (Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Васильева И.А. с соавт., 2004). Идентификация комплекса МТБ биохимическими тестами требует большого количества времени и наличия достаточного количества выросших колоний. На основании наличия внутривидовых различий результаты тестов могут разниться, поэтому необходимо проводить их в комплексе. Например, для идентификации МТБ необходимы, по меньшей мере, 4 биохимических теста - аккумулирование ниацина, редукция нитратов, каталазы и толерантность к парааминобензойной кислоте (Kent P.T., Kubica G.P., 1985). Стоимость этих анализов выше стоимости ПЦР в два раза, а время, необходимое для их проведения, составляет около 28 дней.

Газо-жидкостная хроматография является быстрым и действенным методом идентификации МТБ, для которого необходима чистая культура и определённое количество бактерий, формирующихся при трёх неделях роста (Butler W.R., Jost K.C., Kilburn J.O., 1991; Thibert L., Lapierre S., 1993; Duffey P.S., Guthertz L.S., Evans G.C., 1996; Zerbini E., Cardoso M.M., Sequeira M.D. et al., 1999).

Стремительное развитие биотехнологии в последние годы привело к появлению многочисленных новых методов исследования, однако, продолжает широко применяться хорошо известная реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА), заключающаяся в том, что эритроциты, связавшие серологически активный компонент, приобретают свойства агглютинироваться гомологичным серологически активным анти-компонентом. Такой метод выявления первичного взаимодействия антиген-антитело обладает весьма высокой чувствительностью. Эти реакции находят все большее применение в диагностике различных заболеваний, изучении иммунологической прослойки населения, исследовании антигенной структуры различных микроорганизмов и т.д. Эритроцитарные диагностикумы до сих пор привлекательны по себестоимости, доступности сырья, простоте производства и применения.

В качестве антигена для РНГА применяют экстракт туберкулиновых микобактерий или очищенный туберкулин, которыми сенсибилизируют эритроциты. Диагностическое значение имеет положительная реакция с сыворотками больных 1:8 и выше. Положительные результаты регистрируются у 70-90 % больных туберкулёзом (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2003).

Суспензии - распространённые микрогетерогенные системы, которые могут быть получены различными способами, например, конденсационными, дисперсными и т.д. (Хмельницкий Р.А., 1988). Адсорбция лигандов на данных системах зависит от химического строения сорбентов и соотношения фракций лиганда (Адамов А.К., 1965; Адамов А.К., Агафонов В.И., 1969).

При изучении закономерностей адсорбции иммунных антител установлено, что они адсорбируются органическими соединениями, содержащими гидроксильные, хинонные, карбоксильные, альдегидо -, сульфо - и нитро-группы, органическими веществами, в состав которых входят атомы металлов, а также пористыми образованиями - активированным углём, каолином и т.д.

(Адамов А.К, Бердиков В.Т., 1964). Иммуносорбенты могут быть получены из любых частиц, на которых фиксированные антитела сохраняют иммунологическую активность и специфичность. Суспензионные диагностикумы применяют в реакции суспензионной агглютинации (РСА), которую осуществляют на стекле или в U-образных иммунологических планшетах (Ramadass P., Samuel B.,Nachimuthu K., 1999; Maruyama S., Boonmar S., Morita Y., 2000), обнаруживая невооруженным глазом склеивание или выпадение в осадок микробных тел при взаимодействии их со специфическими антителами, сорбированными на суспензии. Благодаря специфичности и простоте, реакция получила широкое распространение в микробиологической практике.

Среди матриц для суспензионных диагностикумов хорошо себя зарекомендовали латексы - полистирол, полиакролеин и др. (Лукин Ю.В. с соавт, 1985; Ерохин Е.П. 1991; Дячина М.Н. с соавт., 1995; Лазовская А.Л., Воробьва З.Г., 2002). Латексы – водные эмульсии каучукоподобных полимеров, получаемые полимеризацией или сополимеризацией различных органических непредельных соединений (Бусеев А.И., Ефимов И.П., 1971). Реакции с использованием в качестве твёрдой основы латекса называются реакцией агглютинации латекса (РАЛ). Слининой С.А. (2001) выявлены микобактериальные антигены в моче больных с помощью РАЛ и показана перспективность использования данной реакции.

Особое распространение получили методы, основанные на применении антител, меченных специальными маркерами-флуорохромами, которые позволяют с помощью люминесцентного микроскопа проводить высокочувствительные определения исследуемого вещества в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) (Coons A.H. et al., 1942.). При диагностике туберкулёза широко используется люминесцентная микроскопия, основанная на том, что объекты (клетки), окрашенные специальными красителями (флуорохромами), дают излучение в видимом спектре света под действием облучения их ультрафиолетом. При обработке микобактерий флуоресцентными красителями (аурамин, родамин и др.) они связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. По чувствительности люминесцентная микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала, незначительно уступает методу посева. Этим методом можно исследовать любой материал кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ СССР № 558, 1978).

Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по Цилю-Нильсену (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001).

При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что может привести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранжевого свечения. Микроскопические исследования с использованием окрасок по Цилю-Нильсену и аурамином не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mуcobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) - возбудителей микобактериозов. На основе этих методов можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003).

В связи с этим, желательно использовать более специфические методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, в частности - метод иммунофлуоресценции. Он достаточно прост, экономичен, может использоваться в экспресс - диагностике инфекционных заболеваний и вместе с тем удобен для работы (Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В., 1982; Greenlee M.T. et al., 1994; Gall D. еt al., 2000; Nielsen K. еt al., 2000).

Данный метод основан на использовании специфичности иммунологических реакций и чувствительности флуоресцентной микроскопии. Один из компонентов иммунной реакции (специфические иммуноглобулины) коньюгируется с флуоресцирующим красителем (меткой). После возбуждения флуоресцирующего агента ультрафиолетовым излучением визуализация антигена становится возможной непосредственно наблюдателю вследствие развития флуоресценции. В качестве флуорохрома применяют изоцианаты, изотиоцианаты и сульфохлорид флуоресцеинов, которые связываются с белковыми молекулами. Метка белка ФИТЦ проводится в щелочной среде. Интенсивность свечения уменьшается в 2-3 раза после присоединения ФИТЦ к белку, но остается достаточно высокой при просмотре в люминесцентном микроскопе. В реакции конъюгации в основном участвуют аминогруппы лизина и N-концевые аминогруппы белковой молекулы. Известно, что конъюгация белка с ФИТЦ является химической реакцией, зависящей от ряда факторов: чистоты и активности красителя, его количества при метке, концентрации белка, взятого в конъюгацию, количества и степени его очистки, состава буфера, величины рН, времени конъюгации и температуры реакции.

В настоящее время разработаны методы экспресс-диагностики туберкулёза, основанные на использовании РИФ с моноклональными видоспецифическими флуоресцирующими сыворотками (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2003).

Большое внимание уделяется развитию методов флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением, что значительно повышает чувствительность анализа (Жердева В.В., Чудинов А.В., Савицкий А.П., 2002). В диссационно-усиленном лантаноидном флуоресцентном иммуноанализе используются ионы европия, тяжелого металла группы лантаноидов. Для образования прочной связи белка с ионом лантоноида применяют бифункциональные производные карбоновых кислот. На стадии детекции ионы европия диссоциируют из меченого антитела с поверхности твердой фазы в специальный раствор, образуя новый флуоресцирующий комплекс (Иванов Ю.В., Коровкин С.А., 1997).

Анализ данных литературы (Шаханина К.Л., Манько М.И., 1969; Шаханина К.Л., Походзей И.В., 1978; Стоев К.Г. с соавт., 1981; Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., 1986; Ефременко В.И. с соавт, 1989; Moldey R.S., Jen S.P.S., Rembaum A., 1977) свидетельствует о перспективности разработки твёрдофазного иммуноанализа на основе РИФ с использованием иммуносорбентов, позволяющих выявлять не только корпускулярные, но и водорастворимые антигены.

Для избирательной сорбции некоторых бактерий и риккетсий с целью последующего выявления микроорганизмов в РИФ К.Л.Шаханина с соавт. (1969) применяли иммуносорбенты на основе целлюлозного носителя, при этом повышалась чувствительность метода в 10-15 раз, хотя он и не позволял проводить количественный учет свечения гранул.

Некоторые авторы работ считают, что синтетические диагностикумы на основе сефарозы, агарозы выгодно отличаются от эритроцитарных и латексных тем, что их качество не зависит от типа носителя, к которому присоединение антитела или антигена происходит ковалентно. Результаты исследований сыворотки больных хроническим бронхитом позволили сделать вывод, что приготовленные сефарозные антительные и антигенные диагностикумы достаточно специфичны и более чувствительны, чем РСК (Шаханина К.Л., Походзей И.В., 1978).

К.Г. Стоевым с соавт.(1981) разработан количественный метод РИФ с использованием специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа (DASS-система), что позволяет измерить концентрацию Ig Е человека в пределах 5-2500 м.е./мл. Метод обладает рядом преимуществ, отличается малой затратой времени, доступен практическим лабораториям.

В настоящее время появились сведения об усовершенствовании РИФ с использованием иммуносорбентов, обладающих магнитными свойствами.

Описано использование магнитных полиакриламидных сорбентов (Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., 1986; Ефременко В.И. с соавт., 1989; Подзолкова Г.Г. с соавт., 1989); магнитных органокремнезёмных сорбентов (Жарникова И.В., 1995; Афанасьев Е.Н., 2000, Базиков И.А., 2000); магнитных железоокиснодекстрановых частиц (Molday R.S.et al., 1977). К недостаткам последнего метода следует отнести необходимость применения мощных магнитных полей для сепарации этих частиц.

На основе твердофазных иммуносорбентов различной природы Г.Г.

Подзолковой с соавт. (1989) предложен метод количественной иммунофлуоресценции, позволяющий выявлять с высокой чувствительностью различные антигены. Таким образом, РИФ с использованием иммуносорбентов может успешно применяться для выявления возбудителей инфекций. Однако совершенствование метода иммунофлуоресценции на твердой матрице во многом определяется качеством сорбентов, лиганда, техникой постановки реакции.

На основании того, что диагностика МТБ с помощью традиционных методов требует длительного времени и в условиях широкого применения разнообразных противотуберкулёзных препаратов изменилась биология возбудителя туберкулёза (морфология, ферментативная активность и биологические свойства) (Приказ МЗ РФ № 558., 1978), в микобактериологии на протяжении последних лет используются молекулярные технологии - методы генодиагностики, а именно полимеразная цепная реакция (ПЦР), что позволило разработать методы генотипирования и дифференцирования штаммов микобактерий туберкулёза на уровне хромосомной ДНК (Goto M., Oka S., Okuzumi K. еt al., 1991; Lebrun L., Espinasse F., Povenda J. еt al., 1992; Badak F.Z., Goksel S., Sertoz B. et al., 1999). В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфической для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности. Реакция осуществляется при помощи термостабильной ДНК-полимеразы и комплиментарных ДНК – мишени олигонуклеотидных праймеров. Образование в результате реакции фрагментов ДНК определённого размера оценивается как факт наличия в пробе клеток искомого микроба и позволяет идентифицировать исследуемую ДНК.

Визуализация результатов ПЦР достигается различными способами в зависимости от используемого формата реакции. При использовании электрофоретического разделения продуктов амплификации для обнаружения ампликонов используется окрашивание ДНК. Самый распространенный способ – окраска бромистым этидием с последующим просвечиванием геля на ультрафиолетовом трансиллюминаторе. Этот метод высокочувствителен, но бромистый этидий является мутагеном и требует осторожного обращения.

Еще один подход основан на использовании флуорохромов, которые излучают свет разных цветов. Deng Shaoli, Yang Yuan (2002) провели детекцию Муcobacterium tuberculosis в образцах слизи туберкулёзных и нетуберкулёзных больных с помощью культурального метода, рутинной ПЦР и новой техники ПЦР с использованием гибридизации с Tagman флуоресцентным зондом. Было установлено, что «Tagman – техника» является высоко чувствительной, специфичной и может использоваться для диагностики туберкулёза.

Известны различные варианты гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР. После амплификации ампликоны с включенными биотинилированными праймерами вносят в лунки микропланшета с иммобилизированными одноцепочечными зондами к этим фрагментам, проводят гибридизацию и после отмывки добавляют авидин с конъюгированной пероксидазой или с фосфатазой, субстрат для фермента и выявляют окрашенный продукт с помощью фотометра.

Открытие генетических механизмов развития лекарственной устойчивости к противотуберкулёзным препаратам позволило разработать и внедрить в практику методы ПЦР, позволяющие определять вид мутаций, которые обуславливают снижение чувствительности к противотуберкулёзным препаратам (Рекомендации для национальных программ ВОЗ, 1978; Севастьянова Э.В., Ларионова Е.Е., 1999; Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Денисова Т.С. с соавт., 2000; Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., 2001; Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О., 2003; Small P., van Embden J.D.A., 1994;WHO Geneva, 1998).

Использование ПЦР позволяет быстро (за 8-27 часов) выявить МТБ как при туберкулёзе органов дыхания, так и при внелёгочных формах (туберкулёзный менингит, туберкулёз кожи, кишечника и др.), в том числе у больных СПИДом. При высокой чувствительности метода (10-1000 клеток в пробе) имеется возможность выявлять штаммы M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. Методом ПЦР можно также контролировать эффективность лечения больных туберкулёзом. При использовании нескольких образцов исследуемого материала от каждого пациента специфичность ПЦР достигает – 99,8-100 % при высокой чувствительности (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2003). Быстрота выполнения, возможность прямой детекции атипичных и некультивируемых форм микробов, высокая чувствительность метода указывают на перспективность ПЦР для детекции различных микроорганизмов (Куличенко А.Н. с соавт., 1996; Гинзбург А.Л., 1998; Вишневская Е.Б. с соавт., 2001; Самсонова С.А. с соавт.

2002; Ruiz-Bravo A., Jimemez- Valera M.,, 1996; Burt F.J. et al, 1998; Eremenko E.I. et al., 1999; Tcherneva E. et al., 2000; Bricker B.J. et al., 2000). Генетические методы позволили повысить оперативность и информативность исследований (Бударина Н.А. с соавт., 2002; Drosten C., Gottig S., Schilling S. et al.

2002). W.Tan, N.Xia, Y. Cong (1998) для выявления низкой концентрации патогена разработали гнездовую ПЦР в одной пробирке, тем самым, исключая контаминацию исследуемой пробы.

И.В. Раковская с соавт. (2002) использовали оригинальную схему ПЦР-анализа, которая даёт возможность обнаружить персистирующие микоплазмозы, не выявляемые рутинными методами, что весьма актуально для эффективной диагностики хронических форм инфекции.

Чувствительность ПЦР составляет величину порядка 100-1000 м.к./мл.

(Куличенко А.Н., Попов Ю.А., Наумов А.В., 1995) и имеет преимущества над другими реакциями (Кулаков Ю. К. с соавт, 1992), но стоимость этого анализа пробы на порядок выше, чем при применении серологических методов, что существенно при проведении массовых анализов, в том числе мониторинговых. Недостатками ПЦР, кроме дорогостоящего оборудования и реагентов, являются ложноположительные результаты, выявляемые при обнаружении некоторых микобактерий из-за содержащихся в пробах веществ, ингибирующих реакции и обуславливающих ложные результаты (Ford E.G., Snead S.J., Todd J., 1993; Butler W.R., O`Connor S.P., Yakrus M.A. et al., 1994;

Somoskоvi A., Hotaling J.E., Fitzgerrald M., 2000). Хотя определение последовательности ДНК микроорганизмов– один из самых точных молекулярных методов, но он очень трудоёмок для клинических лабораторий.

Применение магноиммуносорбентов на предварительном этапе подготовки проб к проведению ПЦР позволило осуществить концентрирование антигена в пробах с низкой концентрацией микробов, очистить пробы от посторонней микрофлоры и других агентов, мешающих постановке ПЦР, использовать метод кипячения для выделения ДНК, исключив метод лизиса бактерий гуанидин-тиоцианатом с нуклеосорбцией, одновременно достигая стерилизации исследуемого материала, что упрощает анализ и сокращает время обнаружения возбудителя (Жилченко Е.Б., ЕфременкоВ.И., 2002).

Изучение возможности создания оптимального алгоритма для диагностики туберкулёза по методу вегетативного резонансного теста (ВРТ) “ИМЕДИС-ТЕСТ” с использованием аппарата “МИНИ-ЭКСПЕРТ-ПК” и специально разработанных кассет для тестирования в экспериментальной работе, в клинической и практической медицине представлено в работе П.Ф.

Шешукова, Ю.В. Готовского (2002). Метод основан на записи нозодов в потенциях D3-D200 лиофилизированных штаммов микобактерий туберкулёза и 12 основных антибактериальных препаратов, применяемых в фтизиатрии. Из 107 обследованных методом ВРТ у 90 были выявлены типичные и у 17 пациентов атипичные микобактерии, а также проведено определение поражённых органов, стадии процесса, устойчивости МБТ к антибактериальным препаратам. В работе П.Ф. Шешукова, Ю.В. Готовского (2002) представлена сравнительная характеристика различных методов диагностики туберкулёза по чувствительности, специфичности, времени детекции и установлено, что ВРТ превосходит остальные методы по всем показателям.

Для обнаружения возбудителей различных инфекционных заболеваний широко применяются методы с использованием антител (антигенов), меченных ферментами - иммуноферментный анализ (ИФА), принципы и особенности которого описаны во многих работах: (Нго Т. Т., Ленхофф Г. М, 1988;

Яковлев А.Т., 1992; Подоляко М.П. с соавт., 1995; Engvall E., Perlmann P., 1971; Van Weemen B.K., Schuurs A.N., 1972; Guesdon J.L., Avrameas S., 1981;

Sting R., Ortmann G., 2000 и т.д.).

Метод ИФА заключается в том, что на нерастворимую основу иммобилизуют антитела (антигены), вносят испытуемый материал, и образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью конъюгата антител (антигена) с ферментом, активность которого регистрируют по изменению цвета субстрата фотометрически (Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.В., Егоров А.М., 1980; Ficapal A. et al., 1995).

Ферментами - маркерами, используемыми в ИФА, могут быть щелочная фосфатаза, галактозидаза, глюкооксидаза, глюкоамилаза, пенициллиназа, но чаще применяют пероксидазу (Harding N., 1982).

Для приготовления иммуноферментных коньюгатов обычно используют перйодатный, глутаральдегидный методы (Умнова Н.С. с соавт., 1986;

Nakane P.K., Kawaoi A., 1974; O'Sullivan M.J., Marks V., 1981), иногда применяют малеимидный метод (Kato K. et al., 1975; Weston P.D., Devries G.A., Wriggleworth R., 1980), но наиболее перспективным считается перйодатный метод конъюгации иммуноглобулина с ферментом (Anaokar S., Garry P.J., Standefer J.C., 1979).

Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунохимические свойства и стабильность фиксированных веществ, обладать минимальной способностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз (Щедрин В.И., Сбойчинов В.Б., Волков В.И, 1994; Дмитриев Г.А., Киселёва Т.А., 1997). В качестве твердой фазы используется поливинил, дакрил и другие синтетические полимеры, из которых изготавливают пробирки (Bushway R.J. et al., 1992) и микропланшеты из оптически прозрачного полистирола (Voller A. еt al., 1976). Микропланшеты обладают не одинаковыми сорбционными свойствами, что существенно влияет на достоверность и воспроизводимость полученных результатов (Сухоруков А.М., Пономарёва А.М., 1987; Шаханина К.Л., Соколенко А.А., Павлова И.П., 1987). Количество антител (антигенов), используемое для образования иммунного комплекса, ограничено возможностями твёрдой фазы (Ометов В.К. с соавт., 1997). Недостаточная концентрация антител (антигенов) ограничивает чувствительность ИФА. Качество адсорбции фиксируемых на твёрдой фазе веществ зависит от температуры, рН, ионной силы, времени инкубации. Процесс сорбции обратим и, следовательно, сенсибилизированные планшеты, полученные сорбционным путём, не подлежат длительному хранению (срок хранения 20 дней на холоде при герметизации) (Калинина О.А., Емельянова И.В., Локтионова М.А., 1997).

Е.В.Гучетль, Л.П.Пономарёва (2002) представили опыт определения противотуберкулёзных антител у больных урогинекологического отделения в иммуноферментном анализе и показали, что применение указанного теста в комплексе с клинико-лабораторным обследованием больных позволяет с высокой степенью достоверности диагностировать туберкулёз гениталий у женщин (88,5 %).

Известно применение магнитных частиц (Ефременко В.И., Климова И.М., Трофимов Е.Н., 1989; Тюменцева И.С., 1996), магнитных бус (Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E., 1984.) в качестве твёрдой фазы при постановке различных иммунобиологических реакций.

В ряде работ (Климова И.М. с соавт., 1986; Ефременко В.И., Тюменцева И.С., 1995; Ефременко В.И. с соавт., 1996; Жарникова И.В., 2005) представлены данные об использовании магнитных сорбентов (МС) в тестсистеме ИФА. Установлены оптимальные параметры анализа: зависимость адсорбирующей способности МС от его содержания в пробе, динамика адсорбции антигена при инкубации его с твёрдофазным носителем. Результаты исследований показали, что чувствительность метода в случае обнаружения бактериальных клеток составляла 10 2-10 4 м.к./мл.

Известны работы О.В. Борисенко с соавт. (2001) по разработке и применению магнитоуправляемых диагностикумов в иммуноферментном анализе при выявлении возбудителя туберкулёза. Данные разработки актуальны, но имеют недостатки, связанные с использованием в качестве лигандов неадсорбированных сывороток, что приводит к неспецифической реакции.

Таким образом, ИФА является экспрессным, чувствительным, перспективным методом для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний.

Учитывая недостатки ИФА, необходимо вести поиск новых методов сохранения активности сорбированных лигандов и инертных носителей, на поверхности которых протекают все процессы реакции ИФА.

Анализ достоинств и недостатков методов экспресс-диагностики позволил приступить к разработке эффективных диагностических препаратов, выявляющих возбудителя туберкулёза у больных и в объектах внешней среды, обладающих надёжностью, информативностью при высокой их специфической активности.

1.3.Носители иммобилизованных систем твёрдофазного иммуноанализа Развитие и использование твёрдофазных методов анализа предъявляет высокие требования к качеству иммуносорбентов. Согласно гипотезе В.Б.Алесковского (1976), любое твердое тело имеет остов и облегающие его атомы и группы атомов. С химической точки зрения, остов- ненасыщенное высокомолекулярное образование, представляющее собой макрорадикал, вокруг которого расположены функциональные группы высокомолекулярного соединения. Именно наличие этих групп определяет возможность использования поверхностных реакций для синтеза новых твердых веществ.

Иммобилизация на твёрдых носителях различных биомолекул приводит к значительному повышению их термической устойчивости и стабильности (Абелян В.А., Африкян Э.Г., 1992; Масько А.А. c cоавт., 1992).

В качестве сорбентов широко используются агарозные матрицы, активированные BrCN (Lowe C.R., Dean D.G., 1974.). Однако, наряду со всеми положительными сторонами данной матрицы, следует отметить недостаточную стабильность связи между лигандом и BrCN- активированной агарозой (Turkova J., 1978), низкую механическую стабильность сорбентов, что ограничивает возможности их практического использования.

В качестве природных твёрдофазных носителей используют целлюлозу, крахмал, агарозу (Аленкина Т.В., Данилина И.В., 2002) и т.д. Известны исследования по использованию в качестве матрицы сорбентов полисахарида - хитина (Бендекене В.Г. с соавт., 1981); биосорбентов, состоящих из фракции молочных белков - казеина, который обладает термостабильностью, способностью связывать воду, коагулировать, желировать; микрокристаллической целлюлозы, являющейся неионогенным, гидрофильным полисахаридом (Кунижев С.М. c cоавт., 2002); полиакриламидного геля, обладающего химической стабильностью и инертностью, прозрачностью, лабильностью структуры, устойчивостью к изменениям рН и температуры, нерастворимостью в большинстве растворителей (Гавенский С. Д. с соавт., 1990, 1991; Гавенский С.Д., Пушкарь В.Г., 1995; Подзолкова Г.Г. с соавт., 1988). Но данные препараты имеют недостатки, связанные с длительностью, многостадийностью их получения и использованием дорогостоящих импортных реактивов (Тюменцева И.С., 1996). В настоящее время широко применяются сорбенты на основе кремнезёма (Киселёв А.В., Кустова Т.Л., 1976; Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С., 1991; Брыкалов А.В., 1991; Темишевская Л.Я., 1995; Taylor D., 1972; Marshall K., Ridgewee N., Simpson J.,1974; Snyder L.R., Kirkland J.J., 1979). Это связано с тем, что их матрица по своей геометрической структуре и химическим свойствам хорошо подходит для адсорбции биополимеров.

В настоящее время созданы различные иммобилизованные структуры:

биоаффинные адсорбенты (Гайда А.В., Староверов С.М., 1989; Лисичкин Г.В., 1989; Гонтарь И.П. с соавт., 1996); иммобилизованные ферменты (Брыкалов А.В. с соавт, 1982; Брыкалов А.В.,1993; Коваленко Г.А. с соавт., 2002);

иммобилизованные лекарственные средства (Брыкалов А.В., Кобанкова А.Н., 2002; Герстунбергер М.Р. с соавт, 2002; Кунижев С.М., Аполохова С.Ф., 2002). В практической деятельности человека находят применение иммобилизованные клетки и антитела (Кузовлева А.А., Шаханина К.Л., 1982; Гавенский С. Д. с соавт., 1991; Ефременко В.И., 1997; Лавриненко И.А., Костровский В.Г., 1997; Кислицын Ю.В., Мешандин А.Г., 2001; Lea T. et al., 1985;

Cunliffe D. et al., 2000). При постановке иммуноанализов (Kriz K., Gerhrke J., Kriz D., 1998; Yu H., 1998; Tanaka T., Matsunaga T., 2001; Richardson J. et al., 2001); культивировании микроорганизмов (Владимцева И.В., 2002; Hornung M., Ludwic M, Schmauder H.P., 2002) в ряде случаев также применяют различные иммобилизованные системы.

В качестве твёрдофазных носителей широкое распространение получили кремнезёмы. Реакционную способность их можно существенно повысить, обрабатывая поверхность различными неорганическими и металлоорганическими соединениями (Рогожина С.В., Варламов В.П., Вальковский Д.Г., 1975; Алесковский В.В., Юффа А.Я., 1989; Ходж Ф., 1989; Ходж Ф., 1989;

Березин В.Б., Лахтин В.М., Ямсков И.А., 1995; Chim C., Wold F., 1974;

Weetall H.H., Detor C.C., 1975), путём молекулярного наслаивания (Алесковский В.В., Юффа А.Я., 1989), либо подвергая механическому воздействию (растирание, дробление в среде модификатора) или облучению ( и УФ). Метод химического модифицирования кремнезёмов с целью получения функциональных органокремнезёмов хорошо изучен и позволяет получать сорбенты с требуемыми свойствами. Им присущи гидрофильность, жесткость остова, химическая (Постнова А.М., Пак В.Н., Кольцов С.И., 1981) и микробиологическая устойчивость, каталитическая активность (Кольцов С.И., Алесковский В.Б., 1973), ненабухаемость в растворах, значительная адсорбционная емкость, отсутствие токсичности. Поверхность кремнеземных сорбентов содержит большое число силанольных (SiOH) и силоксановых групп (Si-OSi) (Черкасов А.Н., Пасечник В.А., 1991).

Носители, обладающие магнитными свойствами и предназначенные для фиксации на них биополимеров, имеют значительные преимущества по сравнению с немагнитными. При их использовании не требуется предварительного концентрирования исследуемых проб с отделением выявляемых микроорганизмов от контаминирующей микрофлоры и других примесей, возможность проведения индикации на качественно более высоком уровне. В результате использования магносорбентов, способных осуществлять на себе селективное концентрирование микроорганизмов, появляется возможность исследования проб с высокой степенью загрязненности, неограниченных объемов, с низкой концентрацией микроорганизмов при высокой чувствительности и специфичности метода исследования (Ефременко В.И., 1997;

Weimer B.C. et al., 2001).

В качестве магнитных материалов в МС обычно используются окислы металлов Fe, Ni, Co (Пушкарь В.Г. с соавт., 1984), порошки этих окислов заключаются в микросферы, плёнки полимеров, гранулы. А.М. Тишин, Ю.И.

Спичкин (2004) предлагают использовать магнитный сорбент, состоящий из гидрофобного полимерного связывающего компонента, состоящего из мочевино-формальдегидной смеси с порофором и отвердителем, алюмосиликатного магнитного наполнителя и минерального масла. Г.Д. Елистратов, М.И.

Волчанова, И.В. Малыгин с соавт. (2004) предлагают способ получения сорбента из измельчённого углеродсодержащего сырья, представляющего собой древесные частицы или отходы переработки однолетних растений.

Специалисты Литовского института химии и химической технологии установили возможность иммобилизации трипсина на магнитном хитине.

Сравнительное изучение свойств нативного и магнитного производных хитина показало, что "намагничивание" матрицы способствовало уменьшению набухаемости, сохранению адсорбционных свойств и упрощению процесса выделения и регенерации иммобилизованных препаратов трипсина в результате применения внешнего магнитного поля (Бендикене В.Г. с соавт., 1995).

В связи с этим, МИС находят все большее применение в диагностике и обнаружении возбудителей различных заболеваний (Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н. с соавт., 1995; Ефременко В.И., 1997; Жарникова И.В., 2004), а также при конструировании специфических сорбентов, используемых при лечении некоторых заболеваний (Гонтарь И.П. с соавт., 1998; Базиков И.А., 2000).

Расширение областей применения магнитных носителей, с одной стороны, способствует более детальному их изучению, с другой - предопределяет увеличение числа всевозможных методов их получения и конструирование на их основе новых диагностических препаратов для детекции возбудителей инфекционных заболеваний, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью.

Способность отдельных фосфолипидов формировать в водной среде при встряхивании «пузырьки жира», представляющие собой жидкокристаллическую мембрану, в полости которой и снаружи находится водная фаза, впервые была описана в 1965 году А.Бенхемом с соавторами. Эти «пузырьки», напоминающие под электронным микроскопом клетки, получили в дальнейшем название липосомы (бислойные липидные везикулы).

К настоящему времени разработаны несколько десятков методов получения липосом с включением в их внутренний объем или структуру мембраны различных по природе и физико-химическим параметрам веществ, обеспечивающих при необходимости высокий процент их иммобилизации, а также эффективные способы отделения липосом от несвязавшихся компонентов, методы их стерилизации и стабилизации, позволяющие сохранять целостность мембран липидных везикул относительно длительное время в различных реакционных средах и биологических системах. При этом, гидрофильные вещества фиксируются во внутренний объем липидных везикул, а гидрофобные – в их мембрану.

Возрастающий интерес к липосомам обусловлен совокупностью их физико-химических и биологических свойств. Их химическая инертность, универсальность, отсутствие токсичных, антигенных свойств, доступность сырья, простота включения лигандов и т.д. открывают возможности получения диагностических препаратов нового поколения с сохранением физикохимических и иммунологических свойств включаемых в липосомы веществ.

В качестве маркера, включаемого во внутренний объём бислойных липидных везикул, используют красители, флуорохромы, ферменты, радиоактивные вещества, углеводы и т.д., которые регистрируют соответствующим методом по мере появления их в анализируемой смеси после выхода из липосом (Власова Г.С., Салов В.Ф., Торчилин В.П. с соавт., 1982; Закревский В.И., Подзолков В.В., Мельников В.А., 1983; Закревский В.И., 1985; Остро М.Д., 1987; Сюнамото Дзюдзо, Акиёси Кадзунари, Сато Тосинори, 1989;

Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И. с соавт., 1990; Ревенко Л.

Г., Ротов К.А., Васильев В.П. с соавт., 1990; Ротов К.А., Климова И.М., Васильев В.П. с соавт., 1992; Литчфилд У.Д., Фрейтаг Д.У., 1998; Ефременко В.И.,1999; McDougall I.R., Dunnick J.K., McNamee M.G. et al., 1974; Leserman L.D.et al., 1984; Sunamato J. et al., 1987; Flechtner M.D. et al., 1990).

Иммобилизованный в липосомы материал оказывается защищённым липидной мембранной от действия неблагоприятных факторов внешней среды, благодаря чему увеличивается срок его годности (Mарголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Mарголис Л.Б., 1987; Liposomes, 1980; Liposomes, 1988).

При этом в липосомы возможно включение маркёров, которые в своей молекуле не содержат функциональные группы, необходимые для ковалентного присоединения к различным биополимерам, что зачастую является обязательным при использовании других диагностических методов исследования. Благодаря этому чрезвычайно расширяется круг используемых маркёров, включаемых в липосомальные диагностические препараты. Высокая же чувствительность липосомальных диагностических систем достигается тем, что в липидные везикулы удаётся фиксировать значительное количество маркёра.

Способность липосом с иммобилизованным на их поверхности одним из фрагментов реакции «антиген-антитело» специфически фиксировать недостающий компонент и в присутствии сывороточного комплемента, подобно некоторым клеткам микроорганизма, нарушать целостность своей мембраны с высвобождением заключённого во внутренний объём везикул маркёра используется при разработке высокочувствительных диагностических методов комплемент-зависимого иммунного лизиса липосом. Данная реакция позволяет обнаруживать в исследуемых объектах специфические гаптены, антигены, антитела или комплемент.

Реакция на основе иммуноанализа липосом (LILA-liposome immune lysis assay), получившая название липосомальный анализ (ЛИА), может осуществляться как в прямом, так и в конкурентном вариантах. По простоте регистрации и возможности автоматизации она не уступает традиционным методам, а по чувствительности и быстроте ответа превосходит обычные радиоиммунный и иммуноферментный анализы (Ясуда Такудзи, 1986; Литчфилд У.Д., Фрейтаг Д.У., 1998; Сюнамото Дзюдзо, Акиёси Кадзунари, Сато Тосинори, 1989; Ефременко В.И.,1999; Vistnes A.I., 1984; Connor J. et al., 1985;

Monrroe D., 1986 a; 1986 б; Jou Yi-Her et al., 1990).

В ряде случаев маркёры иммобилизируют на поверхности мембраны липосом. Иммобилизация ингредиентов иммунологической реакции (антигенов и антител) с липидной мембранной липосом представляет определённую трудность в связи с её гидрофобной природой. Описаны различные методы ковалентного связывания белковых молекул с наружной поверхностью липосомальной мембраны: посредством глутарового альдегида, перйодата натрия, галактозидазы (Chua M.M. et al., 1987; Yu B.S. et al., 1987). Образующиеся альдегидные группы связывали с поверхностью липосом посредством предварительно введённых гидразидных групп. Такой способ позволяет связывать до 60 % добавленного в реакцию модифицированного белка (Владимцева И.В., 2002).

Иммобилизация рецепторных молекул гидрофобной природы, например, ганглиозидов, не представляется методически трудной, поскольку включение осуществляется путём совместного озвучивания в процессе приготовления липосом (Moss J., Fishman P.H.,Richards R.L. et al.,1976 Masserini M., Sonnino S., Giuliani A., Tettamanti G. et al., 1984; Umeda M., Kanda S., Nojina S. et al., 1984).

В качестве твёрдой фазы при проведении липосомального иммуноанализа используют наносимые на твёрдую поверхность мазки из зева, содержащие -гемолитический стрептококк группы А (Gerber M.A. et al., 1990), а также пластиковые пробирки, полимерные микроплаты, диски нитроцеллюлозной бумаги, стеклянные бусы, покрытые различными специфическими иммуноглобулинами.

Дополнительные преимущества данный метод приобретает при использовании твёрдофазных магнитных сорбентов, позволяющих легко сепарировать компоненты реакционной системы в магнитном поле и эффективно регистрировать анализируемые вещества. С помощью данного метода выявляют различные микроорганизмы и их антигены. В этом случае на магнитные сорбенты вначале фиксируют исследуемый материал за счёт специфической реакции «антиген-антитело», а затем липосомы. Освобождение маркёра, включённого в бислойные липидные везикулы, с последующей его количественной регистрацией осуществляют в присутствии органических растворителей, поверхностно-активных и других веществ, воздействием повышенной температуры, приводящих к лизису липидных мембран, после того, как несвязавшиеся с твёрдой фазой компоненты реакции удаляются, а липосомы за счёт специфических реакций остаются фиксированными на твёрдой поверхности (Ефременко В.И., 1999).

К.А. Ротовым с соавт. (1992) продемонстрирован метод обнаружения чумного микроба с использованием магнитных полиакриламидных гранул и радиоактивной метки, включённой в липосомы, на поверхности которых фиксировали иммуноглобулины. Метод позволил выявлять возбудитель чумы в концентрации 10 3 м.к./мл и 10 пг/мл фракции I чумного микроба.

И.В. Владимцевой (2002) разработаны биотехнологические аспекты конструирования диагностических тест-систем на основе МИС и люминесцируюших липосом, позволяющих выявлять 0,6+0,014 мкг чумных иммуноглобулинов и 15 нг/мл холерного энтеротоксина.

Из проведённого анализа литературных данных следует, что в настоящее время используется небольшое количество экспресс-методов, позволяющих выявлять микобактерии туберкулёза. Для достоверной диагностики туберкулёза рекомендовано проводить комплексное обследование больных с использованием нескольких методов, так как ни один из существующих анализов не может подтвердить диагноз во всех случаях болезни. Многие реакции громоздкие и сложные, а методы их постановки малорезультативны. В связи с этим продолжается поиск универсальных методов выявления туберкулезных антигенов и антител, замена существующих рутинных тестов на современные, высокоэффективные способы.

2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу В работе использованы штаммы микроорганизмов, характеристики которых представлены в таблице 1.

2.2. Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов Выращивание туберкулёзных и близкородственных микобактерий M. tuberculosis humanus, M. вovis, M. аvium, M. кansasii, М. intracellulare проводили при температуре 37 С в течение 30 дней на яичной среде ЛёвенштайнаЙенсена. Выращивание гетерологичных культур Nocardia brasiliensis проводили при температуре 37 0С в течение 3 дней на мясопептонном агаре; Brucella melitensis, Brucella abortus и Brucella suis - при температуре 37 0С в течение дней на печёночном агаре, Salmonella typhi - при температуре 37 0С в течение 2 дней на среде Эндо; Streptococcus, Staphylococcus - на кровяном агаре при температуре 37 0С в течение 2 дней; Listeria monocytogenes - при температуре 37 0С в течение 3 дней на глюко-глицериновой среде.

Штаммы микобактерий туберкулёза, полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, засевали на среду Лёвенштайна-Йенсена и выращивали при температуре 37 0С в течение 1 месяца, контролируя посевы каждые 10 дней (визуальный контроль и микроскопия c окраской по методу Циля-Нильсена и флуорохромом - аурамином). Из биохимических тестов применяли ниациновую пробу Конно (по методике, описанной в работе Воробьёва А.А., Кривошеина Ю.С., Широбокова В.П., (2003), основанную на способности МТБ в отличие от других микобактерий индуцировать ниацин). Для посева в широкие пробирки использовали культуру, смытую 0,9 % раствором хлорида натрия, которую инкубировали в течение 1 месяца при температуре 37 0С, смывали 0,9 % раствором натрия хлорида и обеззараживали холодным (минус 20 0 С) ацетоном.

У МТБ отсутствует наружная мембрана, как у Грам «+» бактерий.

Таблица 1. Характеристика штаммов микроорганизмов, использованных в работе пп ганизмов и обозначение морфологические и культуральные свойства Биохимические свойства изогнутые, лежащие пышный рост колоний, чем M. Пиразимидазу и ниацин не аккупод углом друг к другу tuberculosis humanus. Через 10- мулируют.

Продолжение таблицы ные палочки, более поверхностью среды "лепёшечек", или в Способны к образованию длинные и полиморф- виде "бубликов". Рост появляется к концу эстеразы, пиразимидазы. Не обные в мазках- 1-го месяца, иногда позднее; при пересе- разуют кислую фосфотазу, отпечатках из органов вах - к концу 7-10 дня. В субкультурах уреазу. Ниацин не аккумулизаражённых кур, мы- растут гладким, влажным налётом. В руют.

шей или кроликов. жидкой среде дают помутнение. Культуры лучше растут при 43-450С. ПассироНеподвижны, спор не M. кansasii Yoss М. intracellulare # Продолжение таблицы Nocardia brasiliensis ветвлением. Диаметр твёрдых средах на 2-3 сут образуют мел- Белки ферментируют с образонитей – 0,3-1,3 мкм. кие гладкие влажные колонии тестоватой ванием сероводорода. РазлагаГрамположительные в консистенции, через 72 ч их поверхность ют казеин, тестостерон, эскупатологическом мате- становится исчерченной и петлистой. На лин. Способны к образованию 7-9 Brucella melitensis 565, Мелкие коккобакте- Строгие аэробы. Наилучшая питательная Не разжижают желатину, не 16-М, Rev-1 (вакцинный) рии, величиной 0,3-0,5 среда –печёночный бульон или агар. Для расщепляют белков, не образумкм. Неподвижны, не бруцелл характерен медленный рост пер- ют сероводород. Тионин и особразуют спор. Кра- вых генераций от 20 до 30-35 дней. Лабо- новной фуксин 1:25 000 не окасятся всеми анилино- раторные культуры вырастают через 2 зывают бактериостатического 10-12 Brucella abortus 544, 345, Мелкие коккобакте- Первые генерации требуют повышенного Не разжижают желатину, не 19-BA (вакцинный) рии, величиной 0,3-0,5 содержания в атмосфере СО2. При после- образуют индола, не свертывамкм. Неподвижны, не дующих пересевах СО2 –зависимость те- ют молоко, не расщепляют угобразуют спор. Кра- ряется. В остальном культуральные свой- леводов, ферментируют белки с Продолжение таблицы 13-15 Brucella suis 1330, 508, 6 Мелкие коккобакте- Строгие аэробы. На агаре и бульоне на Биохимическая активность нерии, величиной 0,3-0,5 2-3 сут дают типичный для бруцелл значительна. Не образуют инмкм. Неподвижны, не рост. Не лизируются бактериофагом дола, не разжижают желатину, Salmonella typhi 818, цательные палочки. растут на средах с мясным экстрактом не образуют, продуцируют сепри температуре 37 0С (рН 7,2). На среПодвижны, имеют пе- роводород. Молоко не свёртыритрихиальные жгу- дах Плоскирева, Левина и Эндо – коло- вают. Ферментируют с образотики. Кислотолабиль- нии прозрачные, бесцветные или голу- ванием кислоты глюкозу, манные. Спор и капсул не боватые; на висмут-сульфитной среде- нит, мальтозу, левулезу, галакобразуют. колонии чёрные или чёрные со светлым тозу, раффинозу, декстрин, Продолжение таблицы 19-20 Staphylococcus epidermidis, Грамположительные Факультативные анаэробы, лучше раз- Ферментируют углеводы с обaureus кокки. При размноже- виваются в аэробных условиях. На по- разованием кислоты. РасщепStaphylococcus 21-27 Listeria monocytogenes 1 – Небольшие грампо- Аэробы. Растут при температурах от 4 до Желатину, казеин и молоко не Основными структурными компонентами клеточной стенки туберкулёзных микобактерий являются пептидогликан, полимер N-ацетилглюкозамин и N –ацетилмурамовая кислота. ЛПС представлены арабиногалактаном. Миколовая кислота играет важную роль в кислотоустойчивости бактерий, определяя первую линию защиты от неблагоприятных условий (Heifets L.B, Jenkins P.A.

1998).

2.3. Объекты исследования Для работы использовался материал (моча и мокрота) от больных туберкулёзом лёгких, почек, мужских половых органов, глаз, предоставленный сотрудниками Краевого клинического противотуберкулёзного диспансера (ККПТД).

2.4. Получение антигенных комплексов микроорганизмов Водорастворимые антигены изолировали комплексным методом: водносолевой экстракцией и дезинтеграцией микроорганизмов (Афанасьев Е.Н., Таран И.Ф., Тюменцева И.С., 1986; Василенко Н.Ф. с соавт., 1988). Экстракцию проводили 2,5 % раствором NaCl. Дезинтегрирование осуществляли разрушением под высоким давлением в Х-прессе (Швеция) и ультразвуковым методом на аппарате УЗДН - 2Т (Россия) при частоте колебаний 22 и 44 кГц в течение мин при температуре 0-4 0С. О степени разрушения микробных клеток судили по изменению оптической плотности, которую регистрировали фотоэлектроколориметрически (ФЭК-4, зеленый светофильтр) по количеству белка в надосадочных жидкостях, полученных центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, и микроскопически.

2.5. Лабораторные животные, использованные в экспериментах В опытах были использованы:

1. 34 кролика обоего пола породы «Шиншилла», массой 3-3,5 кг;

2. 30 беспородных белых мышей, массой 18-20 г;

3. 15 морских свинок, массой 250-300 г;

Кроликов, мышей получали из питомника Ставропольского научноисследовательского противочумного института и после карантинизации использовали в опытах. В процессе содержания животных поддерживали рекомендуемый режим питания согласно приказу МЗ РФ № 1179 (М.,1983).

Все процедуры на экспериментальных животных проводили согласно рекомендациям В.В. Карпенко, В.И. Сачков (1985).

2.6. Методы иммунизации животных Иммунизацию проводили по схеме, разработанной И.С.Тюменцевой (1994) и Е.Н.Афанасьева (2000). В качестве иммуномодуляторов использовали феракрил, тималин, циклофосфан.

2.7. Методы контроля антигенов и сывороток Постановку реакции радиальной иммунодиффузии проводили по О.Оухтерлони (1949) на предметных стёклах или в чашках Петри в 1% агаровом геле.

Анализ антигенного состава туберкулёзного микроба проводили согласно методикам, описанным в книге Г.Фримеля (1987).

Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в НРИФ по T.H.Weller, A.H.Coons (1954). Микроскопию препаратов осуществляли в падающем отраженном свете в люминесцентном микроскопе серии "Люмам", используя соответствующие фильтры согласно инструкции по эксплуатации прибора. За положительный результат принимали яркую (4+,3+) флуоресценцию периферии микробных клеток.

2.8. Выделение иммуноглобулинов Для осаждения иммуноглобулинов применяли сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980), метод фракционирования белковых смесей с использованием высоко-молекулярного, незаряженного, линейного полимера полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) по A.Polson и др. (1964), а также каприловой кислоты (Steibuch G., Andran R., 1969).

2.9. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969), с ФИТЦ (C21H11NO5S) фирмы «Sigma» проводили по X.Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по A.H.Coons, M.H. Kaplan (1950).

2.10. Получение и контроль липосом Фосфолипиды, из которых конструировали липосомы, выделяли из мозга к.р.с. и свиней путём экстракции смесью хлороформ-этанол в соотношении 2:1.

После фильтрации раствора фосфолипиды осаждали добавлением 1,5-2,0 объёмов ацетона. Состав липидов определяли по методике, описанной в книге М.

Кейтс (1975) с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол». Формирование липосом и определение их размеров контролировали на электронном микроскопе Hol (Япония) JEM – 100SX.

2.11. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К.Nakane, А.Kawaоi (1974) в модификации Е.А.Ткаченко с соавт.

(1982).

Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M.Clark и A. Adams (1977) в “сэндвич”-варианте ИФА.

2.12. Физико-химические методы Количественное определение белка проводили по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравнением спектра поглощения белков при длине волн и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Спектр поглощения микробных антигенов определяли на спектрофотометре «Specord» (ГДР) при длине волн 210-300 нм.

Очистку конъюгатов от непрореагировавшего флуорохрома осуществляли методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985).

Определение растворимости, цветности, прозрачности проводили визуально в соответствии с методикой, описанной в ГФ СССР, ХI изд.,т.1,стр.194,195 и МУК 4.4/1.2.588-96,с.118.

Контроль потери в массе при высушивании проводили в соответствии с методикой, описанной в МУК 4.1/4.2.588-96, с.116.

Микроструктуру поверхности магносорбентов (МС) определяли по методу, описанному в работе Д.Фрайфелдера (1980). Удельная поверхность МС определялась по методу А.А.Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и радиус пор МС определен по методу Н.В.Кельцева (1984).

2.13. Иммунохимические методы анализа Анализ антигенного состава микроорганизмов и качества полученных иммунных сывороток проводили в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по O. Ouchterlony (1949).

Очистку иммунопероксидазных конъюгатов от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100.

Для иммуноэлектрофореза использовали 1 % агар Дифко на вероналмединаловом буфере, рН 8,6, ионная сила 0,05. Для проведения электрофореза использовали комплектную систему для горизонтального электрофореза «Мультифор» LKB. Электрофорез проводили в течение 100-120 мин и напряженности электрического поля 6 вт/см2.

2.14. Лиофилизация биологического материала Лиофилизацию препаратов проводили в камере LZ-9c (Чехословакия).

Готовые препараты разливали в ампулы, замораживали в низкотемпературном столе LZ-28О/75 при температуре минус (45 ± 5) 0С не менее 18 ч и высушивали в сушильной камере под вакуумом.

2.15. Характеристика реагентов, используемых для получения магноиммуносорбентов В качестве основной матрицы при конструировании МС использовали алюмосиликат (ТУ 6-09-01-356-76), представляющий собой тонкодисперсный продукт, содержащий в своем составе двуокись кремния, алюминия (насыпная плотность – 320 кг/м3; влажность при температуре 110 0С (массовая доля) – 3, %; содержание SiO2 - 85-90 %; содержание Cl в пересчёте на NaСl- 0,2 %, содержание SO3 –0,6 %).

Модификаторами сорбентов являлись декстран (полиглюкин)полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, соединенных 1,6-гликозидгликозными связями. Молекулярная масса декстрана 0,5х10 9. В работе использован препарат декстрана, выпускаемый комбинатом медпрепаратов "Красноярск"; магнитный порошок-III окись железа ГОСТ 4173-77 ч.д.а. с содержанием основного вещества 98,7 %; натрий перхлорат- ТУ 6-09-3582-74 с содержанием основного вещества 98,0 %, вторичный алкилсульфат натрия ТУ 38-10719-77.

2.16. Методы математической и статистической обработки материалов Для подтверждения воспроизводимости и достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д., Уэст Д., 1979).

Математическую обработку результатов экспериментов проводили на компьютере (программа EXCEL). Расчет значения средней квадратичной ошибки отдельного измерения (S), выборочной дисперсии (S2), вероятного квадратичного среднеарифметического отклонения (Е 0,95), проводили по формулам:

Ci – измерение опыта; (Ci - C) – разность между измерениями;

t - 4,3 при двух степенях свободы с доверительной вероятностью 0,95.