«СПЕЦИФИЧЕСКАЯ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ НЕКОТОРЫХ КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ...»

Корреляция отражает меру согласованности одного признака с другим, и корреляционная связь признаков указывает на причинно-следственную связь изменений изучаемых параметров. Проведение корреляционного анализа по Спирмену позволило выявить взаимосвязи аллергологических показателей, что дало возможность определить значимые критерии в диагностике бактериальной сенсибилизации. Значения уровня общего IgЕ статистически значимо коррелировали с интенсивностью кожных проб на 3 «+», 4 «+» на бактериальные аллергены (r = 0,657, р = 0,0002) и немедленным типом кожного реагирования (r = 0,441, р = 0,0003) (рисунок 6). Кожно-аллергические реакции на 3 «+» и 4 «+» на аллергены Neisseria perflava и Staphylococcus aureus чаще наблюдались у больных с феноменом гиперчувствительности немедленного типа. У больных с феноменом ГНТ выявлена значимая корреляционная связь с интенсивностью кожных проб на инфекционные аллергены (r = 0,544, р = 0,0001) в целом и по видам аллергенов (рисунок 7).

интенсивность кожных проб Рисунок 6 – Корреляция уровня общего IgЕ с интенсивностью кожных проб к бактериальным perflava, так и к Staphylococcus aureus показало их значимость у больных с выраженными кожными пробами от 3 «+» и 4 «+» с феноменом ГНТ (рисунок 8, 9, таблица 11). Вышеизложенное подтверждает участие специфических (иммунологических) механизмов в патогенезе БА и формирование сенсибилизации к Neisseria perflava и Staphylococcus aureus.

интенсивность кожных проб Рисунок 8 – Корреляция специфических IgЕ антител к аллергену Staphylococcus aureus с интенсивностью кожных проб (а) Рисунок 9 – Корреляция специфических IgЕ антител к аллергену Neisseria perflava с интенсивностью кожных проб (а) Таблица 11 – Результаты корреляционного анализа по Спирмену специфических IgЕ антител к бактериальным аллергенам Таким образом, результаты кожных проб выраженной интенсивности по ГНТ, выявление специфических IgЕ антител к бактериальным аллергенам и повышение уровня общего IgЕ, являются значимыми критериями, подтверждающими бактериальную сенсибилизацию у больных с БА. Эти данные подтверждают, что в общей когорте больных с клиническим фенотипом БА, осложненной сопутствующими заболеваниями, определяется вариант БА с сенсибилизацией к бактериальным аллергенам. Полученные результаты могут служить основанием к проведению АСИТ.

2.3 Характеристика иммунологических параметров у больных с бронхиальной астмой, осложненной коморбидной патологией БА представляет собой хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в основе которого, лежат иммунопатологические изменения. Особенность БА, осложненной коморбидной патологией, характеризуется наличием аллергического процесса, т.е. собственно сенсибилизации к бактериальным аллергенам разных типов гиперчувствительности, сочетанием с сопутствующими заболеваниями респираторного и желудочно-кишечного тракта, сочетанием с неспецифическими механизмами, наличием очагов хронической инфекции и клинически диагностированным ВИДС.

Характер нарушений иммунной системы у больных БА зависит от ведущего патогенетического механизма, вклада специфических и неспецифических факторов в формирование данного фенотипа БА, выраженности сенсибилизации, типа гиперчувствительности на бактериальные аллергены.

Поэтому изучение показателей нейтрофильного фагоцитоза, гуморального и Тклеточного звеньев иммунитета у данной категории больных имеет важное значение для изучения механизмов патогенеза и оценки эффективности проводимого лечения.

Результаты иммунологического обследования больных БА представлены в таблице 12. Оценка показателей нейтрофильного фагоцитоза, гуморального, Тклеточного звеньев иммунитета и некоторых цитокинов крови проводилась в целом у больных БА, включенных в исследование и отдельно по группам до и после ИТ. При частотном анализе изменений изучаемых данных было выявлено отклонение от нормы тех или иных показателей нейтрофильного фагоцитоза, Тклеточного и/или гуморального иммунитета у 250 (92,2%) больных. Только (7,7%) пациентов не имели отклонений в параметрах иммунной системы. Величины изучаемых иммунологических параметров имели нормальное распределение, данные представлены в виде M±m.

Таблица 12 – Оценка показателей нейтрофильного фагоцитоза, Т-клеточного и гуморального звеньев иммунной системы у больных с бронхиальной астмой и здоровых доноров CD3+, % CD4+,абс.

CD4+, % CD8+, % CD4+/CD8+ Примечание :* – статистически значимое различие показателей у больных с БА и здоровых доноров (тест Mann-Whitney, р 0,05).

Анализируя данные, полученные при сравнении больных с БА со здоровыми донорами (контрольная группа), выявлены статистически значимые различия со стороны лейкоцитов в абсолютных значениях (Mann-Whitney тест, р = 0,009), нейтрофилов в абсолютных значениях (Mann-Whitney тест, р = 0,0001). Эти данные свидетельствовали о наличие очагов хронической инфекции в организме и бактериальном воспалении у больных с БА.

Важным было оценить состояние системы нейтрофильного фагоцитоза, участвующей в противоинфекционной защите организма. Несмотря на повышение количества нейтрофилов, их активность по данным спонтанного НСТ-теста не отличалась от таковых у здоровых лиц. Однако показатели индуцированного НСТ-теста были снижены в целом у больных с БА, осложненной хронической патологией и составили 52,63±0,41% по сравнению со здоровыми (Mann-Whitney тест, р = 0,0001). Снижение индуцированного НСТ-теста отмечено у 92,3% больных. Это свидетельствовало о снижении функциональной активности нейтрофилов, в частности О2-зависимого метаболизма и ассоциировалось с хроническим течением бактериальной инфекции у данной категории больных.

Оценивая уровень содержания субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+ обнаружена следующая тенденция: снижение CD8+ в абсолютных и относительных значениях (Mann-Whitney тест, р = 0,0002, р = 0,0002) и повышение CD4+ в абсолютных значениях (Mann-Whitney тест, р = 0,004) по сравнению с контрольной группой (таблица 13). Полученные результаты свидетельствуют о нарушении соотношения Т-клеток. Увеличение CD4+ – лимфоцитов характерно для больных с аллергическими заболеваниями [186, 221, 233]. Повышение CD4+ – лимфоцитов и снижение CD8+ – лимфоцитов привело к сдвигу иммунорегуляторного индекса. Так иммунорегуляторный индекс был в 1,2 раза выше в группе больных с БА: отмечено повышение CD4+/CD8+ до 2,13±0,02 по сравнению со значениями у здоровых 1,71±0,02 (Mann-Whitney тест, р = 0,0001) (таблица 12). При частотном анализе данный факт отмечен у 93,0% больных. Статистически значимо были снижены показатели РБТЛ с ФГА, результаты которого составили 56,01±0,38% в сравнении с контрольной группой (Mann-Whitney тест, р = 0,0001). Значение РБТЛ с ФГА были снижены у 95,2% больных. Это свидетельствовало о снижении функциональной (пролиферативной) активности лимфоцитов у больных с БА, осложненной очагами хронической инфекцией.

Показатели гуморального звена иммунной системы у наблюдаемых больных были изменены неравнозначно (таблица 12). Значения иммуноглобулинов класса IgА достоверно не изменялись. Статистически значимые изменения были выявлены в отношении классов иммуноглобулинов IgМ (Mann-Whitney тест, р = 0,0001), IgG (Mann-Whitney тест, р = 0,002) и общего IgЕ (Mann-Whitney тест, р = 0,0001). Снижение уровня IgМ отмечено у 90,4%, повышение у 5,5% больных с БА. Статистически значимо уровень IgМ в 1,6 раз был ниже в сравнении со здоровыми, что вероятно, связано с очагами бактериальной инфекции в организме, в том числе патологии со стороны желудочно-кишечного тракта. Отмечено повышение уровня IgG в среднем до 11,78±0,13 г/л по сравнению с контрольной группой (Mann-Whitney тест, р = 0,002). Однако, при частотном анализе, помимо повышения уровня IgG у 62,0% пациентов, отмечены сниженные показатели у 30,3% больных с БА. Интересным было проанализировать уровень общего IgЕ у изучаемых пациентов. При частотном анализе выявлено повышение уровня общего IgЕ у 95,5% пациентов, нормальные значения отмечены только у 12 (4,4%) пациентов с БА. Значения общего IgЕ колебались от 26,00 до 411,30 МЕ/мл и в среднем составили 161,80±5,71 МЕ/мл по сравнению со значениями 44,80±5,00 МЕ/мл у здоровых доноров (Mann-Whitney тест, р = 0,0001). Повышение уровня общего IgЕ отражает участие аллергических реакций в патогенезе изучаемого фенотипа БА.

Цитокины являются важными медиаторами иммунной системы, участвующими в патогенезе различных аллергических заболеваний, в том числе и БА. Спектр цитокинов определяет различный тип (Тh1- или Тh2) иммунного реагирования и формирует различные клинические варианты БА. Были изучены уровни следующих цитокинов сыворотки крови: ИЛ-4, ИЛ-10 и IFN-, основных медиаторов, влияющих на уровень общего IgЕ и определяющих тип иммунного ответа.

Различия в показателях изучаемых цитокинов в целом в группе в сравнении со здоровыми были статистически значимые только по уровню ИЛ-4 (Mann-Whitney тест, р = 0,0001) (таблица 13, рисунок 10). Проведенный частотный анализ показал, что уровень ИЛ-4 был выше нормальных значений у 93,6% больных. Значения ИЛ- колебались от 1,10 до 16,00 пг/мл, в среднем составили 4,05±0,18 пг/мл (Ме – 3,80) по сравнению с 2,29±0,30 пг/мл (Ме – 2,30) у здоровых доноров. Значительно различались и интерквартильные размахи [Р25%;Р75%] у больных с БА и здоровых лиц: 2,90;4,70 и 1,40;2,90, соответственно. Это подтверждает участие Тh2-механизма в патогенезе БА с сопутствующей коморбидной патологией. Цитокины Тh2-пути участвуют в формировании IgЕ-опосредованных реакций с последующим синтезом общего и специфических IgЕ антител к этиотропным аллергенам.

Таблица 13 – Оценка уровня цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, IFN- у больных с бронхиальной астмой и здоровых доноров Примечание :* – статистически значимое различие показателей у больных с БА и здоровых доноров (Mann-Whitney тест, р 0,05).

Оценка уровня ИЛ-10 в группе больных с БА в сравнении со здоровыми донорами статистически значимых различий не выявила (Mann-Whitney тест, р > 0,05).

Однако при частотном анализе значений ИЛ-10 у 81,2% больных с БА отмечено повышение данного показателя по сравнению со здоровыми. IFN- – является антагонистическим медиатором Тh2-пути и антагонистом ИЛ-4, участвует в развитии патогенетических механизмов по Тh1-пути, препятствуя формированию специфических атопических механизмов у больных с аллергическими заболеваниями. У пациентов с изучаемой формой БА наблюдался значительный разброс значений IFN- у разных пациентов от 0,00 до 365,80 пг/мл. Высокие значения IFN- отмечены у 28,6% больных с БА. Высокие значения ИНФ- могут свидетельствовать о высокой антигенной нагрузки на организм и определять выраженность и активность инфекционного процесса. Это подтверждает, что у наблюдаемых больных имеется сочетание аллергического и хронического инфекционного процесса, что необходимо учитывать при выборе метода терапии. Кроме того, участие IFN- в развитии БА показывают возможность формирование очагов хронической инфекции и формирование двух типов иммунного ответа как по Тh2 так и по Th1-иммунному реагированию.

Однако в сравнении со здоровыми значения IFN- не были достоверными и составили 45,63±20,23 пг/мл (Ме – 8,90 [6,80;11,30]) (Mann-Whitney тест, р = 0,814) (таблица 13). Тем не менее, определяя значения IFN- у больных с БА, осложненной хронической патологией можно индивидуально подходить к выбору противоинфекционной терапии (доз АБП, ИГКС) для подготовки пациентов к следующему этапу терапии – выбору иммунотропного препарата.

Исходя из результатов исследования параметров иммунной системы у больных с БА, осложненной коморбидной патологией, можно заключить, что воспалительный процесс, обусловлен иммунологическими изменениями. У больных с диагнозом БА имеются характерные нарушения, проявляющиеся функциональной недостаточностью нейтрофильного фагоцитоза, пролиферативной активности Тклеток, дисбалансом показателей Т-клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Значимые изменения уровня общего IgЕ, ИЛ-4 свидетельствуют, что у пациентов имеется преобладание Th2-иммунного ответа.

Клинические признаки вторичного иммунодефицитного состояния и наличие изменений в иммунологических параметрах у больных БА с сопутствующими заболеваниями необходимо учитывать при выборе метода терапии. Наиболее рациональным является включение в комплексную терапию БА бактериальных иммунокорректоров, влияющих на факторы врожденного и адаптивного иммунитета.

Алгоритм диагностики и дифференциально-диагностические критерии 2. различных клинико-патогенетических вариантов бронхиальной астмы, Аллергическая гиперчувствительность развивается через включение иммунных механизмов, которые могут быть IgE-опосредованными, так и не-IgEопосредованными. Кроме того, в патогенезе БА играют значительную роль неспецифические, не иммунные (неатопические) механизмы [177, 178, 179, 215].

Это приводит к выделению как минимум двух групп больных, которые различаются между собой по своей реактивности, клиническим и аллергологическим проявлениям: с преобладанием иммунных (специфических) и с преобладанием неиммунных (неспецифических) механизмов.

Наиболее значимыми диагностическими критериями аллергического процесса и степени сенсибилизации являются данные аллергоанамнеза, результаты кожного тестирования с аллергенами, тип кожного раегирования на аллергены, выявление специфических IgЕ антител к причинно-значимым аллергенам, повышение уровня общего IgЕ.

Что подтверждается полученными результатамии. Эти же критерии и определяют отбор больных с аллергическими заболеваниями для проведения АСИТ.

Критериями участия неспецифических механизмов в патогенезе БА являются: отрицательный аллергоанамнез, отрицательные и/или слабоположительные кожные пробы с этиотропными аллергенами, отсутствие специфических IgЕ-антител к причинно-значимым аллергенам, низкий уровень общего IgЕ, триггерные неспецифические факторы бронхиальной гиперреактивности (холодный воздух, физическая нагрузка, непереносимость НПВП, инфекция), заболевания пищеварения [178, 179, 188, 215], полипоз носа.

Учитывая, что данные клинических и аллергологических показателей значительно отличались у разных больных с БА, был проведен комплексный анализ показателей для определения вариантов БА с учетом ведущег патогенетического механизма. Для оценки диагностической значимости данных критериев с целью определения ведущих патогенетических механизмов у больных с БА ьыл применен непараметрический статистический метод А. Вальда. Доля участия изучаемых факторов в патогенез иммунных и неиммунных механизмов определен по данным литературы [177, 178, 179, 215]. Для каждого диагностического признака был определен свой диагностический коэффициэнт (ДК) (таблица 14).

По суммарной совокупности вклада различных критериев разброс диагностического коэффициента составил от плюс 22,60 баллов и выше до минус 22, баллов и ниже. С вероятностью 95% можно говорить, что у пациента с суммой баллов плюс 22,60 и выше аллергический вариант (фенотип) БА (АБА), с суммой минус 22,60 и ниже – неаллергический вариант (фенотип) БА (НАБА).

В соответствии с концепцией В.И. Пыцкого была проведена оценка соотношения специфических (иммунных) и неспецифических (неиммунных) механизмов у каждого больного.

Таблица 14 – Бальная шкала оценки клинических и аллергологических показателей для дифференциальной диагностики различных клинико-патогенетических фенотипов бронхиальной астмы (по Федосовой Л.Б., Пыцкому В.И. [215] в модификации Костиной Е.М., Молотилова Б.А.)

АБА НАБА

1) с преобладанием специфических механизмов, аллергическая БА (АБА) – 71 (26,2%) пациент;

2) сочетание специфических и неспецифических механизмов, смешанный фенотип БА (СмБА) –73 (26,9%) человека;

3) преобладание неспецифических механизмов, неаллергическая БА (НАБА) – 127 (46,9%) пациентов.

Рисунок 11 – Частота встречаемости различных клинико-патогенетических вариантов бронхиальной астмы, осложненной коморбидной патологией Для пациентов 1 группы пациентов с аллергическим фенотипом (АБА) было характерно: положительные результаты кожного тестирования с аллергеном Neisseria perflava и Staphylococcus aureus значительной интенсивности в пределах 3-4 «+», по гиперчувствительности немедленного типа; выявление повышенного уровня общего IgE, наличие специфических IgE антител к аллергенам Neisseria perflava и Staphylococcus aureus высокого уровня. При этом пациенты этой группы имели минимальные проявления неспецифической гиперреактивности бронхов, из сопутствующей патологии преобладали инфекционно-аллергических заболеваний респираторного тракта. Суммарный средний ДК по А. Вальду у пациентов этой группы составил плюс 21,53±0,13 балла (Ме – плюс 22,20 [плюс 20,50; плюс 22,60]) (таблица 15, рисунок 12).

Таблица 15 – Результаты диагностического коэффициента по методу А. Вальда у больных с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмы Примечание:

* – различие ДК между 1 и 2 группами статистически значимо (Mann-Whitney тест, р 0,05);

** – различие ДК между 2 и 3 группами статистически значимо (Mann-Whitney тест, р 0,05);

*** – различие ДК между 1 и 3 группами статистически значимо (Mann-Whitney тест, р 0,05).

Рисунок 12 – Результаты ДК по А. Вальду у больных различными клинико-патогенетическими Примечание:

* – различие ДК между 1 и 2 группами статистически значимо (Mann-Whitney тест, р 0,05);

** – различие ДК между 2 и 3 группами статистически значимо (Mann-Whitney тест, р 0,05);

*** – различие ДК между 1 и 3 группами статистически значимо (Mann-Whitney тест, р 0,05).

Во 2 группу были включены пациенты со смешанным вариантом БА (СмБА) для которых было характерно: положительные результаты кожного тестирования с аллергеном Neisseria perflava и Staphylococcus aureus меньшей интенсивности в пределах 1-2 «+» по ГНТ и сочетании ГНТ и ГЗТ, уровня общего IgE в пределах нормальных значений, выявление специфических IgE-антител к аллергену Neisseria perflava и Staphylococcus aureus низкого уровня. Вместе с тем более чем у 2/3 пациентов наблюдались умеренно выраженные неспецифические реакции в виде бронхиальной и назальной гипереактивности на физические, химические факторы и холодный воздух и сочетание сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта и респираторного тракта, из которых преобладал полипоз носа. Суммарный средний ДК по А. Вальду у пациентов этой группы составил минус 5,30±1,37 баллов (Ме – минус 11,00 [минус 16,40;9,00]) (таблица 15, рисунок 12).

В З группу с неаллергическим (НАБА) были включены пациенты с отрицательными и слабыми кожными реакциями на аллерген Neisseria perflava и Staphylococcus aureus 1 «+» по типу ГНТ и/или ГЗТ, значениями общего IgE в пределах нормального диагностического уровня. У всех пациентов выявлено отсутствие специфических IgE-антител к аллергену Neisseria perflava и Staphylococcus aureus в сыворотке крови. При этом у всех больных наблюдались выраженные неспецифические реакции, у всех больных отмечено наличие очагов хронической инфекции желудочно-кишечного тракта. Суммарный средний ДК по А. Вальду у пациентов этой группы составил минус 18,38±0,29 баллов (Ме – минус 18,90 [минус 20,50; минус 16,90]) (таблица 15, рисунок 12).

Полученные результаты показывают, что проведение комплексного анализа клинических и аллергологических критериев по методу А. Вальда позволяет достоверно определить патогенетический механизм и диагностировать различные варианты БА. Суммарный ДК статистически значимо различался при сравнении групп между собой (Mann-Whitney тест, р = 0,0001, р = 0,0001, р = 0,0001).

Клинический пример №1. Больная А., 45 лет (таблица 16). Длительность заболевания 10 лет, начало БА связывает с перенесенной пневмонией. Обострения БА на фоне ОРЗ/ОРВИ, обострении бронхита, холодного воздуха. Результаты кожного тестирования с аллергеном Neisseria perflava «++++» по ГНТ. Сопутствующие заболевания: хронический бронхит, инфекционно-аллергический риносинусит. Специфические IgЕ антитела к Neisseria perflava высокого уровня. Уровень общего IgЕ – 302 МЕ/мл. Цитологический мазок со слизистой носовой полости – 5%. ДК по А.

Вальду: плюс 33,3 балла (диагностирован аллергический фенотип БА).

Таблица 16 – Клинический пример больных с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмой по методу А. Вальда аллергеном, «+, мм»

аллерген (ГНТ, ГЗТ, ГНТ+ГЗТ) аллергену Содержание эозинофилов в мазке из полости носа, % 9,54 9,54 -9, Клинический пример №2. Больная С., 51 год. Длительность БА 23 года, начало связывает с частыми простудными заболеваниями, ОРЗ, частым обострением бронхита. Хронический риносинусит более 30 лет. Обострения БА на фоне ОРЗ/ОРВИ, при воздействии резких запахов, физической нагрузке. Результаты кожного тестирования с аллергеном Staphylococcus aureus «++» по ГЗТ. Специфические IgЕ антитела к Staphylococcus aureus отрицательные. Уровень общего IgЕ – 151 МЕ/мл. Цитологический мазок со слизистой носовой полости – 7%. ДК по А. Вальду: плюс 6,02 балла (диагностирован «смешанный» вариант БА).

Клинический пример №3. Больной К., 53 г. Длительность БА 25 лет. Хронический гнойный бронхит, полисинусит более 30 лет, хроничекий холецистит, хронический гастрит, в анамнезе язвенная болезнь 12 п.к. В течение 10 лет полипоз носа, полипэктомия 5 раз. Обострения БА на фоне ОРЗ/ОРВИ, обострении бронхита, холодного воздуха, резких запахах, при физической нагрузке. Результаты кожного тестирования с инфекционными аллергенами отрицательные. Специфические IgЕ антитела в сыворотке крови отсутствуют. Уровень общего IgЕ – 55 МЕ/мл. Цитологический мазок со слизистой носовой полости – 25%. ДК по А. Вальду: минус 28,46 балла (диагностирован неаллергический вариант БА).

Был проведен РОС анализ для определения пороговых значений ДК между различными вариантами БА. Это позволило определить методологический подход к диагностике вариантов БА, осложненной хронической инфекцией.

Для дифференциации групп больных по величине комплексного показателя – суммарному ДK было принято решение провести ROC-анализ данного показателя. Данный анализ позволяет определить пороговое значение интервальной переменной-предиктора, на основании которого можно распределять наблюдения в две альтернативные группы с заданным уровнем чувствительности и специфичности теста. Как известно, чувствительность отражает долю положительных результатов, полученных с помощью теста у пациентов, которые имеют заболевание. В свою очередь, специфичность показывает процент отрицательных результатов теста у пациентов, которые не больны. Таким образом, если чувствительность и специфичность теста равны 100%, то проблем с интерпретацией теста нет, но фактически ни один тест не является совершенным, поэтому появляется необходимость выбрать такое сочетание чувствительности и специфичности для каждого теста, чтобы в общей сумме они дали наиболее точный результат.

Первым этапом определения порогового значения стал ROC-анализ групп больных с вариантами АБА и НАБА изучаемой формой БА по показателю суммарного ДK. Как видно из рисунка 13, кривые распределения не имеют общих точек пересечения и в группе с АБА значения суммарного ДK значительно выше. В связи с чем, была поставлена задача определить пороговое значение суммарного ДK, выше которого располагаются значения, характерные только для группы с АБА.

Наблюдения На рисунке 14 изображена ROC-кривая для параметра «суммарный ДK» в группах больных с АБА и НАБА. Как видно из рисунка, полученная ROC-кривая проходит через верхний левый угол и имеет идеальную форму, что позволяет построить качественный классификатор по величине суммарного ДK с высокой чувствительностью и специфичностью.

Как видно из таблицы Б.1 (Приложение Б) площадь под кривой для переменной «суммарный DK» равна 1,000, что высокозначимо отличается от 0, (р = 0,0001) и свидетельствовало о высокоточной классификации на основании данной переменной. Можно сделать вывод, что пороговым значением суммарного ДK является 4,45 с чувствительностью и специфичностью теста 100%, причем для этого значения выполняются требования максимальной чувствительности и специфичности теста (max (Sensitivity+Specificity) = 2,000), а также требования баланса чувствительности и специфичности (min |Sensitivity-Specificity| = 0,0001).

Рисунок 14 – ROC-кривая для суммарного ДK в группах с аллергическим и неаллергическим (а), с аллергическим и смешанным (б), со смешанным и неаллергическими (в) вариантами В связи с тем, что существует еще смешанный вариант БА, было принято решение определить пороговые значения для дифференциации больных на аллергический и смешанный варианты БА, а также пороговое значение для дифференциации на смешанный и неаллергический варианты БА. Как видно из рисунка 13, кривые распределения имеют некоторую площадь пересечения, причем в группе с АБА значения суммарного ДK очевидно выше. В связи с чем, была поставлена задача определить пороговое значение суммарного ДK, выше которого располагаются значения, характерные только для группы с АБА. На рисунке 14 изображена ROC-кривая для параметра «суммарный ДK» в группах больных с АБА и СмБА. Как видно из рисунка 14, полученная ROC-кривая проходит через верхний левый угол и имеет идеальную форму, что позволяет построить качественный классификатор по величине суммарного ДK с высокой чувствительностью и специфичностью.

Как видно из таблицы Б.1 (Приложение Б) площадь под кривой для переменной «суммарный ДK» равна 1,000, что высокозначимо отличается от 0, (р = 0,0001) и свидетельствовало о высокоточной классификации на основании данной переменной. Можно сделать вывод, что пороговым значением суммарного ДK является 18,70 с чувствительностью и специфичностью теста 100%, причем для этого значения выполняются требования максимальной чувствительности и специфичности теста (max (Sensitivity+Specificity) = 2,000), а также требования баланса чувствительности и специфичности (min |Sensitivity-Specificity| = 0,000). Как видно из рисунка 13, кривые распределения имеют достаточную площадь пересечения, причем в группе со СмБА значения суммарного ДK очевидно выше. В связи с чем, была поставлена задача определить пороговое значение суммарного ДK, выше которого располагаются значения, характерные только для группы со СмБА. На рисунке 14 изображена ROC-кривая для параметра «суммарный ДK» в группах больных со СмБА и НАБА. Как видно из рисунка, полученная ROCкривая не проходит через верхний левый угол и не имеет идеальной форму, но находится сравнительно близко к ней, что позволяет построить достаточно качественный классификатор по величине суммарного ДK с высокой чувствительностью и специфичностью. Как видно из таблицы Б.1 (Приложение Б) площадь под кривой для переменной «суммарный ДK» равна 0,843, что достоверно отличается от 0,5 (р = 0,0001) и свидетельствует о достаточно точной классификации на основании данной переменной.

Если исходить из требований максимальной чувствительности и специфичности теста (max (Sensitivity+Specificity) = 1,622), то пороговым значением суммарного ДK следует признать минус 12,70 баллов. При этом чувствительность теста равна 68,7%, его специфичность 93,5%, иначе говоря, 6,5% наблюдений среди больных с НАБА могут быть ложноположительными. Если исходить из требований баланса чувствительности и специфичности (min |Sensitivity-Specificity| = 0,026), то пороговым значением будет считаться минус 16,50 с чувствительностью 75,9% и специфичностью 78,5%. Следует отметить, что с той же чувствительностью (75,9%) по результатам ROC-анализа есть значение суммарного ДK минус 16,55 баллов со специфичностью 81,3%. Таким образом, для проведения дифференциальной диагностики больных по величине суммарного ДK (группа со СмБА и НАБА) было принято решение использовать пороговое значение суммарного ДK минус 12,70 баллов и выше.

По полученным результатам проведенного анализа мы определили пороговые диапазоны между клинико-патогенетическими вариантами БА, осложненной очагами хронической инфекции, позволяющие практическому врачу ориентироваться в интерпретации результатов комплексного обследования и более точно определять вариант течения изучаемой формы БА (таблица 17, рисунок 15).

Таблица 17 – Диапазон диагностического коэффициента (ДК) у больных с различными вариантами бронхиальной астмы по результатам RОС-анализа Рисунок 15 – Диапазон диагностического коэффициента у больных Таким образом, по совокупности клинических и аллергологических показателей при определении суммарного ДК от плюс 22,60 до плюс 18,69 баллов можно диагностировать АБА, в диапазоне баллов от плюс 18,70 до минус 12,69 баллов – смешанный вариант БА и в диапазоне от минус 12,70 до минус 22,60 баллов – НАБА (таблица 17). Данный диагностический метод может быть рекомендован для применения практическим врачам, что позволит оптимизировать подходы к выбору метода иммунотерапии.

Таким образом, на основании данного анализа определено, что:

существуют различные клинико-патогенетические варианты БА, осложненной коморбидной патолгией (аллергический, неаллергический исмешанный);

в основе патогенеза этих вариантов БА лежит разное сочетание специфических (иммунных) и неспецифических (неиммунных) механизмов.

Точность диагностики вариантов БА позволит дифференцированно подойти к выбору метода иммунотерапии в зависимости от ведущего механизма патогенеза и тем самым повысить эффективность лечения. Выбор метода иммунотерапии в зависимости от ведущего механизма патогенеза является наиболее целесообразным.

Вероятно, результаты проводимой АСИТ и ИТ могут значительно отличаться у больных с разными клинико-патогенетическими вариантами БА.

Различия АБА и НАБА являются значительными по совокупности вклада специфических и неспецифических факторов в патогенез этих вариантов БА. В дальнейшем для изучения иммунологических параметров, определения алгоритма диагностики вариантов БА и анализа эффективности различных методов ИТ больные были разделены на 2 группы: с преобладанием иммунных (специфических, аллергических) и с преобладанием неиммунных (неспецифических, неаллергических) механизмов патогенеза.

2.5 Характеристика иммунологических параметров и цитокинов у больных с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмы, осложненной коморбидной патологией В предыдущих главах при анализе клинических и аллергологических параметров было выделено 3 варианта БА с разным участием специфических (иммунных) и неспецифических (неиммунных) механизмов в патогенезе патологии. По результатам, проведенного RОС-анализа между разными вариантами БА очевидно, что АБА и НАБА являются диаметрально противоположными вариантами с четкими границами разделения клинико-аллергологических показателей, а смешанный вариант БА имеет сочетание признаков как первого, так и второго вариантов БА.

Учитывая, что в основе БА лежат иммунопатологические изменения в различных звеньях иммунитета для определения дифференциально-диагностических иммунологических критериев различных вариантов БА в дальнейшем были проанализированы показатели нейтрофильного фагоцитоза, гуморального, Т-клеточного звеньев иммунитета и цитокинов у больных с АБА и НАБА вариантами БА.

Ряд показателей в иммунной системе (таблица 18) имели сходный характер иммунологических изменений в анализируемых группах при сравнении со здоровыми, а именно: повышение числа CD4+ в абсолютных значениях (Mann-Whitney тест, р = 0,046, р = 0,0001), понижение числа CD8+ в относительных значениях (Mann-Whitney тест р = 0,0001, р = 0,0001), повышение знаечний ИРИ (MannWhitney тест, р = 0,0002, р = 0,0001), снижение значений индуцированного НСТтеста (Mann-Whitney тест, р = 0,0001, р = 0,0001) и РБТЛ с ФГА (Mann-Whitney тест, р = 0,0001, р = 0,0002). Эти данные подтверждают общую тенденцию иммунологических нарушений у больных с БА на фоне очагов хронической инфекции, а именно: снижение противоинфекционной защиты, выражающееся в снижении функциональной активности нейтрофильного фагоцитоза, Т-клеточного звена иммунитета и соотношения Т-клеток.

Вместе с тем группы значимо различались по количеству CD4+ и CD8+ – лимфоцитов как в абсолютных, так и относительныхзначениях (таблица 18, рисунок 16).

Таблица 18 – Показатели нейтрофильного фагоцитоза, Т-клеточного звена иммунитета у больных с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмы и здоровых доноров CD3+ -кл.

CD4+ -кл.

CD8+ -кл.

Примечание:

* – статистически значимое различие при сравнении групп АБА и НАБА (Mann-Whitney тест, р 0,05);

**– статистически значимое различие при сравнении АБА и НАБА со здоровыми (Mann-Whitney тест, р 0,05).

с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмы (* – статистически значимое различие показателей при сравнении больных с БА Относительное значение CD4+ – лимфоцитов в группе больных с АБА были выше и составили 45,86±0,18% по сравнению со значениям в группе больных с НАБА 44,50±0,10% (Mann-Whitney тест, р = 0,0002). Относительное значение CD8+ – лимфоцитов в группе больных с АБА были ниже и составили 20,84±0,24% по сравнению со второй группой – 22,57±0,18% (Mann-Whitney тест, р = 0,0002).

Аналогичная тенденция наблюдалась по количеству CD4+ и CD8+ – лимфоцитов и в абсолютных значениях (Mann-Whitney тест, р = 0,0001, р = 0,0002). Изменения в Т-клеточном звене иммунитета у изучаемых больных характеризовались изменением соотношения CD4+ и CD8+ – лимфоцитов, что привело к повышению иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+) у больных с вариантом АБА. Отмечены статистически значимые различия (Mann-Whitney тест, р < 0,05) значений CD4+/CD8+ у больных с разными клинико-патогенетическими вариантами БА.

Так у пациентов в группе больных с АБА значения CD4+/CD8+ составили 2,25±0,03 по сравнению с 1,99±0,02 в группе больных с НАБА (Mann-Whitney тест, р = 0,0001) (таблица 19).

В группах с различными клинико-патогенетическими вариантами БА был выявлен разнонаправленный характер изменений уровня общего IgЕ и цитокинов.

Уровень общего IgЕ в группе больных с АБА составил 179,60±5,14 МЕ/мл, что значительно выше по сравнению с уровнем общего IgЕ у больных с НАБА – 90,71±2,71 МЕ/мл (Mann-Whitney тест, р = 0,0001) (таблица 19). Статистически значимых различий по уровню иммуноглобулинов класса IgА, IgМ и IgG у больных с разными вариантами БА получено не было.

Таблица 19 – Оценка уровня иммуноглобулинов у больных с различными клиникопатогенетическими вариантами бронхиальной астмы и здоровых доноров Показатели, 37,00 [26,10;48,00] 164,00 [137,50;197,20] 99,00 [64,90;120,00] Примечание:

* – статистически значимое различие между показателями у больных с АБА и НАБА (Mann-Whitney тест, р 0,05);

** – статистически значимое различие между показателями у больных с АБА и НАБА и здоровых доноров (Mann-Whitney тест, р 0,05).

При изучении уровня цитокинов у больных с разными клиникопатогенетическими вариантами БА был выявлен разнонаправленный характер изменений, а именно: в группе больных с АБА наблюдалось повышение значений ИЛ-4, ИЛ-10, снижение значений IFN-, а в группе больных с НАБА – снижение значений ИЛ-4, ИЛ-10 и повышение значений IFN- (таблица 20, рисунок 17).

Таблица 20 – Оценка уровня цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10 и IFN- у больных с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмой и здоровых доноров Ме [Р25%;Р75%] Примечание :

* – статистически значимое различие показателей между группами больных АБА и НАБА (Mann-Whitney тест, р 0,05);

** – статистически значимое различие показателей между группами АБА и НАБА и здоровых доноров (Mann-Whitney тест, р 0,05).

клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмы Примечание:

* статистически значимое различие показателей между аллергическим (АБА) и неаллергическим (НАБА) фенотипами бронхиальной астмой (Mann-Whitney тест, р 0,05);

** статистически значимое различие показателей между аллергическим (АБА) и неаллергическим (НАБА) фенотипами бронхиальной астмой и здоровыми донорами (Mann-Whitney тест, р 0,05) Уровень ИЛ-4 был выше в 2,6 раза (Mann-Whitney тест, р = 0,0001), ИЛ-10 в 2,1 раза (Mann-Whitney тест, р = 0,001) в первой группе по сравнению со второй.

Значения IFN- были ниже у больных с АБА и в среднем составили 6,76±0,55 пг/мл в сравнении с 9,97±1,92 пг/мл у больных с НАБА (Mann-Whitney тест, р = 0,047). Более значимые различия получены при изучении соотношения ИЛ-4/IFN- в группах, что более показательно для выделения разнонаправленных патогенетических механизмов. Значения соотношения ИЛ-4/IFN- в первой группе составили 0,99±0,12 по сравнению 0,32±0,03 у пациентов 2 группы (MannWhitney тест, р = 0,0001) (таблица 20).

Таким образом, по данным анализа иммунологических параметров можно выделить два механизма в патогенезе БА с сенсибилизацией к инфекционным аллергенам, соответственно, два варианта БА с разнонаправленными изменениями:

1) аллергический вариант БА с IgE-опосредованным механизмом – с преобладанием Th2 иммунного ответа в патогенезе заболевания. Для этого варианта БА характерно: повышение уровня общего IgЕ, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-4/IFN-, CD4+ – лимфоцитов и снижение CD8+ – лимфоцитов, значений IFN-;

2) Неаллергический вариант БА – с преобладанием Th1 иммунного ответа в патогенезе заболеания. Для этого варианта БА характерно: низкий уровень общего IgЕ, снижение уровней ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-4/IFN-, CD4+ – лимфоцитов и повышение CD8+ – лимфоцитов, значений IFN-.

Выделение различных клинико-патогенетических вариантов БА имеет большое практическое и научное значение для выбора метода иммунотераии с учетом ведущего патогенетического механизма БА.

Далее был проведен корреляционный анализ по Спирмену и многофакторный анализ связи разных факторов в группах больных с разными клиникопатогнетическими вариантами БА и ROC-анализ значимых показателей с целью выделения дифференциально-диагностических иммунологических критериев, позволяющих дифференцировать варианты БА.

Корреляционный анализ групп по иммунологическим параметрам выявил наличие сильных связей между группой больных АБА и показателями: уровнем ИЛ-4, уровнем общего IgE и значениями ИЛ-4/IFN-. Следует отметить наличие достаточно слабой обратной связи между группой больных АБА и уровнем IFN-, причем связь данного показателя с группой меньше, чем связь с показателем ИЛ-4/IFN-, поэтому данный фактор в модель включен не был. В таблице 21 приведена корреляционная матрица, отражающая характер и силу связи между показателями. Статистически значимые связи выявлены между следующими показателями: уровнем общего IgE и уровнем ИЛ-4 (р = 00001), уровнем общего IgE и значениями ИЛ-4/IFN- (р = 0,0002), уровнем ИЛ-4 и значениями ИЛ-4/IFNр = 0,0010), уровнем IFN- и значениями ИЛ-4/IFN- (р = 0,0001). С группой больных с аллергическим вариантом БА и неаллергическим вариантом БА: уровень общего IgE, ИЛ-4 и значения ИЛ-4/IFN- (р = 0,0001, р = 0,0002, р = 0,0050).

Таблица 21 – Корреляционная матрица Таким образом, при построении модели были использованы: уровень общего IgE, ИЛ-4 и значения ИЛ-4/IFN-.

Модель для параметра, отражающего вариант БА, получена методом пошагового регрессионного анализа. Коэффициенты модели (В) для факторов, включенных в модель, и их значимость даны в таблице 22.

Таблица 22 – Результаты регрессионного анализа Регрессионный анализ для зависимой переменной «группа по IgE»

Коэффициент детерминации RI = 0, F(3,74) = 67,747 p < 0,00000 Станд. ошибка оценки: 0, N= IgE, МЕ/мл 0,268642 0,079963 0,002121 0,000631 3,359575 0, ИЛ-4, пг/мл 0,515917 0,079946 0,132729 0,020568 6,453333 0, ИЛ-4/ IFN- 0,229485 0,070013 0,191060 0,058290 3,277775 0, В таблице 22 также приводятся оценки качества модели:

коэффициент детерминации (RI = 0,73308396), определяющий ее информационную значимость;

значение F-критерия (F(3,74) = 67,747) и уровень значимости модели (p < 0,00000), определяющие статистическую значимость модели.

Обозначим показатель «группа АБА» как y, уровень общего IgE = x1, уровень ИЛ-4 = x2, значения ИЛ-4/IFN- = x3 тогда модель для диагностики варианта БА будет иметь вид:

Знаки коэффициентов модели отражают прямую связь показателя группы АБА со всеми факторами модели (х1, х2 и х3).

Дисперсионный анализ модели и оценки ее информативности и значимости даны в таблице 23. Вклад факторов, включенных в модель (Regress = 13,53386), составляет 73,3% от общей суммы квадратичных отклонений параметра y (группа по IgE), а часть вклада – 26,7% вносят неучтенные (случайные) факторы (Residual = 4,92768), что свидетельствует об информационной способности модели. По величине F-критерия F = 67,747 с уровнем значимости p = 0,000 модель можно считать значимой, достоверной.

Таблица 23 – Результаты дисперсионного анализа Степень влияния факторов (таблица 24) на диагностику варианта БА рассчитывается по величине стандартизированных коэффициентов регрессии ВЕТА из таблицы 23 с помощью формулы:

Таблица 24 – Степень и значимость влияния факторов на эффективность Таким образом, наибольшее влияние на параметр «АБА» оказывают факторы уровень общего IgE и ИЛ-4, чуть в меньшей степени – ИЛ-4/IFN-.

Несмотря на высокую значимость модели, следует отметить, что зависимая переменная («АБА») является категориальной, может принимать только 2 значения (1-да или 2-нет) и не является непрерывной, что в данном случае определяет некоторую сложность в интерпретации полученного значения, рассчитанного по полученной формуле. Поэтому было проведено дополнительное исследование параметров между группами АБА и НАБА, а именно провести ROC-анализ этих параметров для определения пороговых диагностических значений (уровня общего IgE, ИЛ-4 и значений ИЛ-4/IFN-). Данный анализ позволил определить пороговое значение интервальной переменной-предиктора, на основании которого можно распределять наблюдения в две альтернативные группы (в данном случае АБА и НАБА) с заданным уровнем чувствительности и специфичности теста. На рисунке 18 приведены кривые распределения значений уровня общего IgE (а), до лечения в группах больных с АБА и НАБА. Как видно из рисунка, кривые распределения имеют достаточно большую площадь пересечения, хотя в группе АБА значения этого показателя очевидно выше. В связи с чем, была поставлена задача определить пороговое значение уровня общего IgE, выше которого располагаются значения, характерные только для группы АБА. Полученная ROC-кривая (рисунок 19) не проходит через верхний левый угол, но находится очень близко к идеальной форме, что позволяет построить достаточно качественный классификатор по уровню общего IgE до лечения с достаточно высокой чувствительностью и специфичностью.

Наблюдения Рисунок 18 – Законы распределения значений общего IgE (а), ИЛ-4 (б), ИЛ-4/IFN- (в) Как видно из таблицы Б.2 (Приложение Б) площадь под кривой для переменной «уровень общего IgE» равна 0,992, что высокозначимо отличается от 0, (р = 0,0002), это свидетельствует о высокоточной классификации на основании данной переменной.

Если исходить из требований максимальной чувствительности и специфичности теста (max (Sensitivity+Specificity) = 1,982), то пороговым значением уровня IgE до лечения следует признать 127,05 МЕ/мл. При этом чувствительность теста равна 98,2%, его специфичность – 100,0%. Если исходить из требований баланса чувствительности и специфичности (min |Sensitivity-Specificity| = 0,010), то пороговым значением будет считаться 125,75 МЕ/мл с чувствительностью 98,2% и специфичностью 99,2%. В данном случае, следует исходить из требований наибольшей специфичности теста: при 100% специфичности, чувствительность составит 98,2% и пороговое значение уровня IgE будет равным 127,05 МЕ/мл. Таким образом, для проведения дифференциальной диагностики больных по уровню общего IgE (группа с НАБА и АБА) было принято решение использовать значение уровня общего IgE до лечения 127,05 МЕ/мл и выше.

Рисунок 19 – ROC-кривая для значений общего IgE (а), ИЛ-4 (б), ИЛ-4/IFN- (в) до лечения Следующим этапом анализа групп больных стал ROC-анализ по уровню ИЛ-4. Как видно из рисунка 18, кривые распределения имеют достаточно большую площадь пересечения, хотя в группе 2 значения этого показателя очевидно выше. В связи с чем, была поставлена задача определить пороговое значение уровня ИЛ-4, выше которого располагаются значения, характерные только для группы АБА. Как видно из рисунка 19, полученная ROC-кривая подобно кривой для уровня общего IgE также не проходит через верхний левый угол, но тоже находится очень близко к идеальной форме, что позволяет построить качественный классификатор по уровню ИЛ-4 до лечения с высокой чувствительностью и специфичностью.

Площадь под кривой для переменной «уровень ИЛ-4» равна 0,994 (таблица Б.2, Приложение Б), что высокозначимо отличается от 0,5 (р = 0,000), что свидетельствует о высокоточной классификации на основании данной переменной.

Если исходить из требований максимальной чувствительности и специфичности теста (max (Sensitivity+Specificity) = 1,924), то пороговым значением уровня ИЛ- до лечения следует признать 4,00 пл/мл. При этом чувствительность теста равна 92,4%, его специфичность 100,0%. Если исходить из требований баланса чувствительности и специфичности (min |Sensitivity-Specificity| = 0,005), то пороговым значением будет считаться 3,85 пг/мл с чувствительностью 95,5% и специфичностью 96,0%. В данном случае, следует также исходить из требований наибольшей специфичности теста: при 100% специфичности, чувствительность составит 92,4% и пороговое значение уровня ИЛ-4 будет равным 4,00 пг/мл. Таким образом, для проведения дифференциальной диагностики больных по вариантам НАБА и АБА было принято решение использовать значение уровня ИЛ-4 до лечения 4,00 пг/мл и выше.

В заключении был проведен ROC-анализ по показателю соотношения ИЛ-4/IFN-. Кривые распределения имеют достаточно большую площадь пересечения (рисунок 18), хотя в группе АБА значения этого показателя очевидно выше.

В связи с чем, была поставлена задача определить пороговое значение показателя ИЛ-4/IFN-, выше которого располагаются значения, характерные только для группы АБА. Как видно из рисунка 19, полученная ROC-кривая не проходит через верхний левый угол, но находится достаточно близко к идеальной форме, что позволяет построить достаточно качественный классификатор по показателю ИЛ-4/IFN- до лечения с высокой чувствительностью и специфичностью.

Как видно из таблицы Б.2 (Приложение Б) площадь под кривой для переменной «ИЛ-4/IFN-» равна 0,940, что значимо отличается от 0,5 (р = 0,0002) и свидетельствует о высокоточной классификации на основании данной переменной. Если исходить из требований максимальной чувствительности и специфичности теста (max (Sensitivity+Specificity) = 1,728), то пороговым значением показателя ИЛ-4/IFN- следует признать 0,505. При этом чувствительность теста равна 85,3%, специфичность – 87,5%. Если исходить из требований баланса чувствительности и специфичности (min |Sensitivity-Specificity| = 0,001), пороговым значением будет считаться 0,495 с чувствительностью 85,3%, специфичностью 85,4%. В данном случае, следует исходить из требований наибольшей специфичности теста: пороговое значение показателя ИЛ-4/IFN- будет равным 0,505, чувствительность составит 85,3%, специфичность 87,5%, т.е. 12,5% наблюдений среди больных с высоким IgE могут быть ложноположительными. Таким образом, для проведения дифференциальной диагностики больных с вариантами АБА и НАБА было принято решение использовать значение показателя ИЛ-4/IFN- до лечения 0,505 и выше.

Исходя из полученных значений чувствительности и специфичности тестов на уровень общего IgE, уровень ИЛ-4 и значения ИЛ-4/IFN- до лечения, можно определить чувствительность и специфичность совокупности тестов, т.е. случая, когда уровень общего IgE до лечения будет больше 127,05 МЕ/мл, уровень ИЛ- больше 4,00 пг/мл и значения ИЛ-4/IFN- не меньше 0,505. Чувствительность в таком случае составит 77,4%, специфичность 87,5%. Таким образом, в случае, если у пациента уровень общего IgE будет выше 127,05 МЕ/мл, уровень ИЛ-4 – выше 4,00 пг/мл, а показатель ИЛ-4/IFN- не менее 0,505, больной может быть отнесен к варианту АБА; принадлежность к группе с НАБА может быть не более чем в 12,5% случаев (ложноположительные результаты диагностики), причем если у пациента с нАБА, то такой результат будет иметь место в 77,4% случаев.

Таким образом, для проведения дифференциальной диагностики больных по вариантам БА: АБА и НАБА по иммунологическим показателям до лечения необходимо использовать следующие критерии:

уровень общего IgE до лечения 127,05 МЕ/мл и выше;

уровень ИЛ-4 – 4,00 пг/мг и выше;

значения ИЛ-4/IFN- – 0,505 и выше.

При данных значениях можно диагностировать вариант БА аллергический с преобладанием IgЕ-опосредованных реакций. Неаллергический вариант можно диагностировать с учетом вышеперечисленных показателей менее приведенных значений.

Таким образом, БА, осложненная очагами хронической инфекции, можно выделить в самостоятельный фенотип с гетерогенными клиникопатогенетическими вариантами: аллергическим (с преобладанием IgЕопосредованных реакций и с не-IgЕ-опосредованных реакций), наллергический и смешанным. В основе выделенных вариантов лежат разные патогенетические механизмы, определяя их клинические, аллергологические и иммунологические особенности.

Для аллергического варианта БА с преобладанием IgЕ-опосредованных реакций харктерно: сенсибилизация к бактериальным аллергенам, преобладание в патогенезе Тh2 иммунного ответа с повышенной продукцией ИЛ-4, повышенным уровнем общего IgЕ и специфических IgЕ антител к бактериальным аллергенам.

Неаллергический вариант БА проявляется преобладанием неспецифических реакций, сочетанием с сопутствующей патологией ЖКТ и преобладанием в патогенезе Тh1 иммунного ответа с повышенной продукцией IFN-.

Дифференциально-диагностическими критериями АБА против НАБА вариантами БА следует считать: положительные кожные пробы с аллергеном Neisseria perflava, Staphylococcus aureus, уровень общего IgE ИЛ-4, соотношения ИЛ-4/IFN-. Метод А. Вальда с вычислением диагностический коэффициента является комплексным показателем различных вариантов БА, отражающим совокупность клинических, аллергологических и иммунологических параметров БА.

ГЛАВА 3 РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ИЛ-4, ИЛ-10,

ИЛ-17А И TNF- В ПАТОГЕНЕЗЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ,

ОСЛОЖНЕННОЙ КОМОРБИДНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

При изучении генотипа ТНФ наблюдали другую тенденцию: нормозигота GG (GA) встречалась в 5 раз чаще, чем гетерозигота GA (G-308A). Доля выявления мутантной гомозиготы для ИЛ-4, ИЛ-10 и ТНФ- была достоверна по всем видам цитокинов, хотя и встречалась реже по сравнению с другими генотипами. Мутантная гомозигота выделена по ИЛ-4 ТТ (C-589Т) всего у 6 (5,4%), по ИЛ-10 АА (GA) у 3 (2,7%) и по TNF- АА (G-308A) у 3 (2,7%) больных (рисунок 20) Таблица 25 – Частота встречаемости генотипов цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17А и ТНФу больных с бронхиальной астмой Примечание:

* – статистически значимые различия частоты встречаемости гетерозиготы и мутантной гомозиготы (Fisher exact, р < 0,05);

** – статистически значимые различия частоты встречаемости нормозиготы и мутантной гомозиготы (Fisher exact, р < 0,05);

*** – статистически значимые различия уровней изучаемых цитокинов у больных с различными генотипами при сравнении с контролем (тест Mann-Whitney, p < 0,05).

80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,5% 30,0% 20,0% Рисунок 20 – Частота встречаемости генотипов цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17А и ТНФу больных с бронхиальной астмой (* – статистически значимые различия частоты встречаемости гетерозиготы и мутантной гомозиготы (Fisher exact, р < 0,05), ** – статистически значимые различия частоты встречаемости нормозиготы и мутантной гомозиготы (Fisher exact, р < 0,05)) Данные были достоверно значимые при сравнении частоты встречаемости гетерозигот с мутантной зиготой и мутантной зиготой с нормозиготой по всем группам генов цитокинов, соответственно (Fisher exact р 0,05) (таблица 25). Мутаций по ИЛ-17A АА (G-197A) среди пробандов БА обнаружено не было. Возможно гетерозиготный генотип по изучаемым цитокинам играет ведущую роль в развитии данной формы БА. Мутантная зигота встречается реже, но клинически приводит к более тяжелому течению астмы.

Известно, что ИЛ-4 является основным цитокином Th2 иммунного реагирования и приводит к развитию атопии, определяя продукцию специфических IgЕ антител к этиотропным аллергенам. Возможно генотип СТ полиморфизма (C-589Т) гена ИЛ-4 является ведущим в развитии не только аллергической, но и БА в сочетании очагов хронической инфекции. Учитывая важную роль ИЛ-17 в противоинфекционной защите организма, большая частота встречаемости генотипа GA полиморфизма (G-197A) гена ИЛ-17A показывает его значимость в хроническом воспалении у больных БА. Таким образом, проявления действия полиморфизма генов ИЛ-4 (C-589Т), ИЛ-10 (G-1082A) и ИЛ-17А (G-197A), с последующим синтезом соответствующих цитокинов, определяет особенности патогенеза БА, а именно сочетание атопических механизмов и хронической инфекции.

Вероятно, для такого сложного заболевания как БА большую роль играют не столько отдельные аллели генов, сколько их сочетания, «генетические ансамбли».

Сравнение групп по числу сочетаний проводилось методом Kruskal-Wallis.

Достоверно чаще отмечено сочетание гетерозигота+гетерозигота (р = 0,0001) и нормозигота+нормозигота (р = 0,0001). Статистической значимости встречаемости других сочетаний генотипов, как гомозигты и гетерозигты (р = 1,000) и мутантной гомозиготы и гетерозиготы (р = 0,094), мутантной гомозиготы и нормозиготы (р = 0,294) по изучаемому полиморфизму цитокинов получено не было.

Вероятно, если у пациента присутствует генотип гетерозиготы по какому-либо цитокину, то у него же большая вероятность гетерозиготы по другим генам цитокинов. Сочетание гетерозигот по нескольким видам цитокинов увеличивает риск развития БА и может определять более тяжелое течение.

Выявлено сочетание гетерозиготного генотипа по генам ИЛ-4 и ИЛ-10 у 42 (37,8%), ИЛ-10 и ИЛ-17А у 52 (47,8%), и ИЛ-4 и ИЛ-17А у 40 (36,0%) пациентов. Возможно, данные варианты сочетаний гетерозигот и определяют особенности клинического течения данной формы БА. Мутантная гомозигота сочеталась с гетерозиготой при сочетании ИЛ-4 (C-589Т) и ИЛ-10 (G-1082A) у 8,1%, ИЛ-4 (C-589Т) и ИЛ-17А (G-197A) у 2,7%, ИЛ-10 (G-1082A) и ТНФ- (G-308A) у 2,7% пациентов, как видим такое сочетание встречалось значительно реже, по сравнению с сочетанием гетерозигот между собой (таблицы 26, 27, 28).

Таблица 26 – Анализ статистической значимости встречаемости генотипов друг с другом у больных бронхиальной астмой

TNF TNF TNF

* – статистически значимые различия между группами сочетаний генотипов (НГ иГ, Г иМГ, НГ и МГ) (Fisher exact, p < 0,05);

НГ – нормозигота, Г – гетерозигота, МГ – мутантная гомозигота.

Таблица 27 – Частота встречаемости различных сочетаний генотипов цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17А и ТНФ у больных бронхиальной астмой ИЛ4+ИЛ10 ИЛ10+ИЛ17 ИЛ17+ТНФ ИЛ10-ТНФ ИЛ4+ИЛ17 ИЛ4+ТНФ ИЛ4+ИЛ10+ИЛ17 ИЛ4+ИЛ10+ИЛ17+ТНФ Таблица 28 –Результаты статистического анализа встречаемости различных сочетаний генотипов цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17А и ТНФ у больных с бронхиальной астмой

НГ НГ НГ НГ НГ НГ

Г Г Г Г Г Г

МГ МГ МГ МГ МГ МГ

Г – гетерозигота, НГ – нормозигота, МГ – мутантная гомозигота.

Возможно, сочетание мутантной и гетерозигот обеспечивает тяжесть клинических проявлений и тяжесть течения астмы у пробанда.

У 28 человек (25,2%) было выявлено сочетание гетерозиготного генотипа по трем видам генов: ИЛ4+ИЛ10+ИЛ17, сочетаний геторозигот с мутантной не выявлено ни у одного больного с изучаемой формой БА. Все эти пациенты получали высокие дозы стероидов и имели неконтролируемое течение БА. Сочетание гетерозиготы с нормозиготой так же выявлялось достаточно часто: ИЛ-4+ИЛ-10 (n=45, 40,6%), ИЛ10+ИЛ17 (n= 49, 44,1%), ИЛ17+ТНФ (n=68, 61,3%), ИЛ10-ТНФ- (n=81, 73,0%), ИЛ4+ИЛ17 (n=52, 46,9%), ИЛ4+ТНФ- (n=62, 55,9%). Статистически значимых различий по клиническому течению в зависимости от приведенных сочетаний выявлено не было. Сочетаний гетерозигот и мутантных с гетерозиготами по всем четырем изучаемым генам цитокинов ИЛ4+ИЛ10+ИЛ17+ТНФ- получено не было. Возможно, данное сочетание более редкое и определяет более тяжелое течение БА, что требует дальнейшего изучения и анализа.

Помимо частотного анализа встречаемости генотипов изучаемых интерлейкинов, с клинической точки зрения, важно было проанализировать распределение генотипов разных цитокинов у одного больного и клиническое течение БА при этом. Анализ течения и контроля БА у пробандов с мутантной гомозиготой показал, что у 4 из 6 пациентов по генотипу СС ИЛ-4 (C-589Т) наблюдалось сочетание БА и хронической крапивницы с отеком Квинке. Крапивница и отек Квинке имели торпидность к проводимой стандартной десенсибилизирующей терапии, характеризовались частыми рецидивами (у 2 пациентов ежедневно в течение года наблюдения) и возникали даже без действия причинно-значимого фактора. Клинические симптомы БА имели более тяжелые проявления. БА имела неконтролируемое течение, несмотря на высокие дозы противовоспалительной терапии. Контроль БА у этих пациентов соответствовал 3 баллам (некотролируемая). У 3 пациентов наблюдалось сочетание гетерозигот по генам СТ ИЛ-4 (C-589Т), GA ИЛG-1082A) и GA ИЛ-17А (G-197A) и мутантной гомозиготой АА по ТНФ- (GA). Все эти пациенты имели БА в сочетании с полипозом носа и непереносимостью аспирина. Этим пациентам проводилась неоднократно полипэктомия от до 15 раз за последние 5 лет, рост полипов наблюдался, несмотря на прием топических стероидов. Хронический ПРС характеризовался тяжелым непрерывно рецидивирующим течением с выраженным нарушением носового дыхания и частыми обострениями. Так же эти пациенты получали базисную терапию высокими дозами ИГКС. У 3 человек выявлено сочетание генотипов всех изучаемых цитокинов по нормозиготе. Клиническое течение БА при этом характеризовалось частично-контролируемым, более легким течением с редкими обострениями, пациенты получали низкие дозы стероидов.

Результаты сопоставление клинического течения БА и определяемых генотипов подтверждает факт, что сочетание гетерозиготного и монозиготного генотипирования является прогностически неблагоприятным для респондентов с БА и определяет более тяжелое течение основного и сопутствующих заболеваний, а нормозиготное наоборот – более благополучное, контролируемое. Сочетание полиморфизма генов различных цитокинов у одного больного помимо основного заболевания, может определять тип и тяжесть сопутствующей патологии.

Таким образом, генетические факторы играют важную роль в развитии любдго фенотипа БА, определяя клиническое течение патологии. Наибольшее значение имеет гетерозиготный генотип по изучаемым цитокинов, наиболее неблагоприятное течение имеет сочетание гетерозигот по нескольким видам генов между собой, определяя тяжесть БА.

3.2 Сравнительная оценка полиморфизма генов цитокинов у больных с различными клинико-патогенетическими Полученные результаты показали значимость генетических факторов в патогенезе БА, осложненной сопутствующей патологией респираторного и желудочно-кишечного тратка. Был проведен анализ генетического полиморфизма цитокинов зависимости от ведущего клинико-патогенетического варианта БА: пациентам с аллергическим вариантом БА и 63 пациентам с неаллергическим вариантом БА.

Частота встречаемости изучаемых генотипов интерлейкинов значительно отличался у больных с разными клинико-патогенетическими вариантами БА (таблица 29).

Таблица 29 – Анализ генетических маркеров цитокинов у больных с различными клиникопатогенетическими вариантами бронхиальной астмой

АБА НАБА

* – статистически значимые различия по генотипам между группами АБА и НАБА (Fisher exact, p < 0,05).

При аллергическом варианте с преобладанием IgЕ-опосредованных реакцийдостоверно чаще встречалась гетерозигота СТ ИЛ-4 (C-589Т) у 32 (66,7%) (Fisher exact, р = 0,033) и мутантная гомозигота ТТ ИЛ-4 (C-589Т) у 6 (12,5%) пациентов (Fisher exact, р = 0,014). Нормозигота СС ИЛ-4 (C-589Т) определялась чаще при неаллергическом варианте БА у 35 (55,6%) больных (Fisher exact, р = 0,001) (таблица 29, рисунок 21). Известно, что ИЛ-4 является основным цитокином Th2 иммунного реагирования и приводит к развитию атопии, определяя продукцию специфических IgЕ антител к этиотропным аллергенам. Таким образом, именно аллель гена СТ ИЛ-4 (C-589Т) возможно является ведущей в развитии аллергического варианта БА.

80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 30,0% 0,0%

ИАБА ИПАБА

ИАБА ИПАБА

АБА НАБА АБА НАБА

АБА НАБА АБА НАБА

ИАБА ИПАБА ИАБА ИПАБА

Гетерозигота GA ИЛ-17A (G-197A) выявлена у 52 (82,5%) пациентов (Fisher exact р = 0,0001), тогда как нормозигота GG ИЛ-17A (G-197A) чаще встречалась при IgЕ-опосредованном механизме (25 человек – 52,1%) (Fisher exact р = 0,0001) (таблица 29). Учитывая важную роль ИЛ-17 в противоинфекционной защите организма, большая частота встречаемости гетерозигты GA ИЛ-17A (G-197A) показывает его значимость в хроническом воспалении при неаллергическом варианте БА.

Достоверных различий встречаемости полиморфизма генов ИЛ-10 (G-1082A) и ТНФ- (G-308A) при различных вариантах БА получено не было. Генотип GA ИЛ-10 (G-1082A) в равной мере встречался как у пациентов с АБА, так и с НАБА (Fisher exact, р > 0,05). По гену ТНФ- чаще встречалась нормозигота GG ТНФ- (G-308A) в обеих группах (Fisher exact, р > 0,05) Далее был проанализирован уровень цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ- и общего IgЕ в зависимости от полиморфизма изучаемых генов (таблица 30, рисунок 22).

Таблица 30 – Взаимосвязь генотипов полиморфизма (C-589Т) гена ИЛ-4 с уровнем ИЛ- и общего IgЕ у больных с бронхиальной астмой Примечание: * – статистически значимые различия между группами (тест Mann-Whitney, p < 0,05).

Р1 – достоверность значений между СС и СТ Р2 – достоверность значений ИЛ-4 с контролем Р3 – достоверность значений общего IgЕ с контролем Уровень цитокинов и общего IgЕ различался в зависимости от изучаемого полиморфизма генов. Уровень ИЛ-4 был статистически более высоким у больных с выявленной гетерозиготой СТ ИЛ-4 (C-589Т) и составил 4,85±0,68 пг/мл по сравнению с 2,77±0,40 пг/мл у больных с нормозиготой СС ИЛ-4 (C-589Т) (тест Mann-Whitney, р = 0,040) (таблица 30, рисунок 23).

Аналогичные результаты получены и по уровню общего IgЕ, содержание которого в сыворотке крови составило 161,45±12,08 МЕ/мл при выявлении гетерозиготы СТ ИЛ-4 (C-589Т) по сравнению с 79,72±4,12 МЕ/мл – при нормозиготе СС ИЛ-4 (C-589Т), контроль – 44,80±5,00 МЕ/мл (тест Mann-Whitney, р = 0,0001) (таблица 30, рисунок 22).

Рисунок 22 –Уровень общего IgE у больных с разными генотипами ИЛ- * – статистически значимые различия показателя у больных с различными генотипами ИЛ- Уровень ИЛ-17 был статистически выше у больных с генотипом гетерозиготы GA ИЛ-17А (G-197A) и составил 7,13±0,39 пг/мл, по сравнению с уровнем у больных с нормозиготой GG ИЛ-17 (G-197A) 4,01±0,45 пг/мл (тест Mann-Whitney, р = 0,006) и контролем 3,74±0,83 пг/мл (тест Mann-Whitney, р = 0,005) (таблица 31, рисунок 23). Статистически достоверных различий в уровне ИЛ-10 у больных с генотипом нормозиготы GG и гетерозиготы GA ИЛ-10 (G-1082A) получено не было (тест Mann-Whitney, р = 0,328).

Таблица 31 – Взаимосвязь генотипов гена ИЛ-17А (G-197A) и ИЛ-10 (G-1082A) с уровнем ИЛи ИЛ-10 у больных с бронхиальной астмой Примечание:

* – статистически значимые различия (тест Mann-Whitney p < 0,05).

Р1 – уровень ИЛ17 и ИЛ10 при генотипах нормозиготы с гетерозиготой Р2 – уровень ИЛ17 и ИЛ10 при генотипах нормозиготы, гетерозиготы с контролем Рисунок 23 – Значения цитокинов у больных с различными генотипами * – статистически значимые различия (тест Mann-Whitney, p < 0,05).

Выявлено статистически значимое различие в уровнях ИЛ-4 при различных клинико-патогенетических вариантах БА (таблица 32, рисунок 24). Уровень ИЛ- у больных с выявленной гетерозиготой СТ ИЛ-4 (C-589Т) при варианте БА, осложненной коморбидной патологией составил 5,34±0,76 пг/мл, что достоверно выше, чем уровень ИЛ-4 у больных с гетерозиготой по данному цитокину при НАБА (2,57±1,04 пг/мл (тест Mann-Whitney, р = 0,041). Различий в уровне ИЛ-4 у больных с выявленной нормозиготой СС ИЛ-4 (C-589Т) при разных клиникопатогенетических вариантах БА получено не было (тест Mann-Whitney, р = 0,884).

Уровень ИЛ-10 в сыворотке крови у больных при разных вариантах БА не был статистически достоверным при сравнении с контролем и выявленным генотипом (рисунок 24).

АБА НАБА

Таблица 32 – Взаимосвязь генотипов генов цитокинов ИЛ-4 (C-589Т) и ИЛ-10 (G-1082A) с уровнем ИЛ-4, ИЛ-10 и общего IgЕ у больных с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмы Примечание:

* – статистически значимые различия (тест Mann-Whitney, p < 0,05).

Р1 – различия уровня цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10 при генотипах нормозиготы и гетерозиготы;

Р2 – различия уровня ИЛ-4, ИЛ-10 при генотипах нормозиготы и гетерозиготы при различных вариантах БА.

Таким образом, у больных с БА на фоне очагов хронической инфекции наиболее часто встречается генотип СТ полиморфизма (C-589Т) гена ИЛ-4 у 54,1%, генотип GA полиморфизма (G-1082A) гена ИЛ-10 у 70,3% и генотип GA полиморфизма (G-197A) гена ИЛ-17A у 67,6% пациентов, при этом, выявлено различие встречаемости изучаемых генотипов при разных клинико-патогенетических вариантах.

У больных БА с аллергическим вариантом БА (с преобладанием IgЕопосредованного механизма патогенеза) наиболее часто встречается генотип СТ полиморфизма (C-589Т) гена ИЛ-4 у 66,7% пациентов (тест Mann-Whitney, р = 0,033), у больных с БА с неаллергическим вариантом БА – генотип GA полиморфизма (G-197A) гена ИЛ-17A у 82,5% пациентов (тест Mann-Whitney, р = 0,0001).

Выявлена взаимосвязь генотипа СТ полиморфизма (C-589Т) гена ИЛ-4 с повышением продукции ИЛ-4 и общего IgЕ, генотипа GA полиморфизма (G-197A) гена ИЛ-17A с уровнем ИЛ-17 у больных БА.

Таким образом, полиморфизм генов цитокинов может определять различный тип иммунного реагирования и формирование различных клиникопатогенетических вариантов БА, что необходимо учитывать при выборе метода лечения.

ГЛАВА 4 ЭФФЕКТИВНОСТЬ АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОЙ

ИММУНОТЕРАПИИ АЛЛЕРГЕНОМ NEISSERIA PERFLAVA У БОЛЬНЫХ

С РАЗЛИЧНЫМИ КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИМИ ВАРИАНТАМИ

БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

Мужчин – 20 (30,8%) человек, женщин – 45 (69,2%).

Анализ сопутствующей патологии показал, что у половины пациентов этой группы встречалась патология респираторного тракта (n=30,46,2%), заболевания желудочно-кишечного тракта (n=14, 21,5%), сочетание патологии дыхательной системы и органов ЖКТ (n=21, 32,3%) (рисунок 25, таблица 33).

Рисунок 25 – Сопутствующие заболевания по системам у больных БА Очаги хронической инфекции оказывают влияние на течение БА, приводят к частому применению АБП, к увеличению объема ГКС терапии, аллергены условно-патогенных бактерий формируют бактериальную сенсибилизацию и усиливают тяжесть клинических проявлений БА. Сопутствующие заболеваия ЖКТ могут вносить свои особенности в течение БА.

Таблица 33 – Сопутствующие заболевания у больных БА с сенсибилизацией к Neisseria perflava по нозологическим формам Сопутствующие заболевания респираторного тракта Сопутствующие заболевания желудочно-кишечного тракта Крапивница, отек Квинке Среди заболеваний дыхательной системы преобладал инфекционноаллергический риносинусит у 29 (44,6%) пациентов, различия достоверны при сравнении с данными по этой патологии у пациентов 3 (Fisher exact, р = 0,0030) и 4 (Fisher exact, р = 0,027) групп. При сравнении данных со 2 группой достоверных различий не получено (Fisher exact, р = 0,062). Инфекционно-аллергический риносинусит у больных БА с сенсибилизацией к Neisseria perflava и Staphylococcus aureus встречался с одинаковой частотой. Хронический гайморит, полисинусит отмечен у 7 (10,8%) больных, что меньше, чем во второй группе – у 14,6% (Fisher exact, р = 0,0021). Значительно реже выявлялся полипозный риносинусит у больных 1 группы в отличие от 2-й (Fisher exact, р = 0,0020), 3-й (Fisher exact, р = 0,0021) и 4-й (Fisher exact, р = 0,027) групп. ПРС выявлен только у 2 (3,1%) пациентов. При сенсибилизации к Staphylococcus aureus ПРС встречается чаще (n=17, 35,4%). Непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов (ННПВП) и аспириновая триада (БА + ПН + ННПВП) не зарегистрированы ни у одного пациента этой группы. Вероятно, сенсибилизация к нейссерии перфлява не имеет ведущего значения в развитии полипов у больных БА. Среди других заболеваний респираторного тракта чаще встречался хронический фарингит (n= 26, 40,0%) и хронический бронхит (n=25, 38,5%). На ранее перенесенную пневмонию указывали 3 (4,6%) пациента. Среди патологии ЖКТ выявлены: хронический гастрит (n=12, 18,5%), хронический холецистит (n=7, 10,8%) и дисбактериоз кишечника (n=5, 7,7%). Сопутствующая крапивница, отек Квинке выявлены только у 4,6% человек, что достоверно меньше, чем у пациентов 2-й группы, где данная патология отмечена у 6,3% пациентов (Fisher exact, р = 0,0030), у 7,7% пациентов 3-й группы (Fisher exact, р = 0,0030) и особенно – у 28,3% (Fisher exact, р = 0,0001) пациентов 4-й группы.