«Регуляция экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы при проведении неоадьювантной химиотерапии ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ»

СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЛИТВЯКОВ

Николай Васильевич Регуляция экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы при проведении неоадьювантной химиотерапии 14.01.12 – онкология (биологические наук

и)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Чердынцева Надежда Викторовна Томск - Список сокращений АТФ – аденозинтрифосфорная кислота АХТ – адъювантная химиотерапия ВОЗ – всемирная организация здравоохранения ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЗНО – злокачественные новообразования ИГХ – иммуногистохимия МЛУ – множественная лекарственная устойчивость МЧ-ПЦР – метилчувствительная ПЦР НАХТ – неоадъювантная химиотерапия ПЦР – полимеразная цепная реакция РМЖ – рак молочной железы РНК – рибонуклеиновая кислота ТБЕ – трис-боратный буфер УЗИ – ультразвуковое исследование ABC – ATP-Binding Cassette CGH – Comparative Genomic Hybridization CNА – Copy Number Aberration (аберрации числа копий) DTT – дитиотриэтол EDTA – этилендиаминтетрауксусная кислота ER – рецептор эстрогенов HER2 – рецептор эпидермального фактора роста LOH – потеря гетерозиготности MHC I – главный комплекс гистосовместимости 1 класса OR – отношение шансов Pgp – Р-гликопротеин PR – рецептор прогестерона RIN – RNA Integrity Number RR – относительный риск RT-qPCR – количественная обратно-транскриптазная ПЦР в режиме реального времени SE – стандартная ошибка SNP – однонуклеотидный полиморфизм

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Цель работы Задачи исследования Научная новизна Теоретическая и практическая значимость Положения выносимые на защиту Апробация работы Внедрение результатов исследования Публикации Объем и структура диссертации

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Современные представления о неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы 1.2. Множественная лекарственная устойчивость и гены АВС-транспортеров 1.3 Экспериментальные исследования роли АВС-транспортеров в формировании фенотипа МЛУ 1.4 Клинические исследования роли АВС-транспортеров в формировании фенотипа МЛУ 1.5 Характеристика отдельных подсемейств АВС-транспортеров

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2.4 Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени 2.2.9 Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков МЛУ

ГЛАВА 3 ЗНАЧИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ АВС-ТРАНСПОРТЕРОВ В

ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ДЛЯ РЕАЛИЗАЦИИ ОТВЕТА НА

ЛЕЧЕНИЕ

3.1. Экспрессия АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в зависимости от основных клинико-морфологических параметров 3.2. Экспрессия АВС-транспортеров у больных с различной эффективностью неоадъювантной химиотерапии 3.3 Значимость экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в отношении безметастатической выживаемости пациентов

ГЛАВА 4 РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ АВС-ТРАНСПОРТЕРОВ В

ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

4.1 Доказательство феномена снижения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении НАХТ 4.2 Экспрессия белков АВС-транспортеров в опухоли молочной железы 4.3 Экспрессия АВС-транспортеров и внутриопухолевая морфологическая гетерогенность 4.4 Метилирование промоторов генов АВС-транспортеров и их экспрессия в процессе НАХТ 4.5 Ген-супрессор опухолевого роста ТР53 и экспрессия АВС-транспортеров в опухоли молочной железы 4.6 Хромосомные аберрации в опухолевой ДНК и экспрессия АВСтранспортеров в процессе НАХТ 4.7 Клональная эволюция опухоли в процессе НАХТ и изменение экспрессии АВС-транспортеров

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования распространенным злокачественным новообразованием (ЗНО) среди женского населения и в мире ежегодно выявляют более 1 млн. случаев первичного РМЖ [GLOBOCAN 2008, Jemal A., et al., 2010]. В 2009 г. в Российской Федерации зарегистрированы 54 315 новых больных раком молочной железы и 23 757 умерло от данной патологии, за пятилетний период прирост числа случаев заболевания составил 10,3% [Давыдов М.И., и др., 2011]. В результате таких высоких показателей смертности от РМЖ только по Томской области условные экономические потери общества составили в 2006 г. – 44 451 510 рублей [Писарева Л.Ф., и др., 2008]. Только хирургическое лечение получают 27,6% пациенток, а комбинированное лечение, в состав которого входит системная химиотерапия, проводят 70,4% больных РМЖ [Давыдов М.И., и др., 2011]. Системная химиотерапия может быть назначена на предоперационном и/или послеоперационном этапах, она существенно увеличивает безметастатическую и общую выживаемость и показана при трижды негативном, люминальном В, HER2-позитивном РМЖ и при наличии лимфогенных метастазов [Goldhirsch A., et al., 2013, Goldhirsch A., et al., 2011, Kaufmann M., et al., 2012, Семиглазов В.Ф., и др., 2008]. При сравнительном исследовании нескольких тысяч пациентов было показано, что предоперационная и послеоперационная химиотерапия имеют практически равные результаты 10-ти летней безметастатической и общей выживаемости [Cleator S., et al., 2005, Fisher B., et al., 1998, Wolmark N., et al., 2001].

Однако, предоперационная (неоадъювантная) химиотерапия (НАХТ) может использоваться еще и для уменьшения объема первичной опухоли и уровня региональной лимфаденопатии, обеспечивая выполнение радикального оперативного вмешательства, органосохранного лечения, а также позволяет оценивать чувствительность к послеоперационной химиотерапии [Kaufmann M., et al., 2012, Senkus E., et al., 2013].

НАХТ показана для использования у больных с местно-распространенным раком молочной железы IIIA, IIIB, или IIIC стадиями и может применяться у пациентов с IIA (T2N0 или T1N1) или IIB (T2N1 или T3N0) стадиями РМЖ [Goldhirsch A., et al., 2013, Kaufmann M., et al., 2007, Kaufmann M., et al., 2012, Schwartz G.F., et al., 2004]. Для достижения указанных выше целей НАХТ очень важно, чтобы у больных отмечался хороший ответ на химиотерапию (полная или частичная регрессия опухоли) [Bertheau P., et al., 2005, Fisher B., et al., 1998, Kaufmann M., et al., 2006, Kaufmann M., et al., 2003, Kuerer H.M., et al., 1998, Wolmark N., et al., 2001].

формирование фенотипа множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который характеризуется способностью опухолевых клеток выживать в условиях высоких доз широкого спектра химиопрепаратов. Выделяют два типа МЛУ: предсуществующую МЛУ, или исходную, ее определяют индивидуальные особенности опухоли и организма больного, кроме того, она зависит от гистогенеза опухоли, в частности высокая предсуществующая МЛУ у опухолей происходящих из метаболических активных тканей (почки, печень, поджелудочная железа, и др.). При предсуществующей МЛУ все клетки опухоли оказываются устойчивыми к химиотерапии еще до начала лечения. Второй тип лекарственной устойчивости – это приобретенная или адаптивная МЛУ, которая лекарственных средств [Szakacs G., et al., 2006].

функционированием продуктов генов семейства АВС-транспортеров (ATP-Binding Cassette), их работу считают мажорным механизмом лекарственной устойчивости [Gillet J.P., et al., 2012]. Энергозависимые АВС-транспортеры могут экспрессироваться всеми клетками организма и в норме выполняют физиологическую функцию экспорта против градиента концентрации из клеток различных метаболитов, ксенобиотиков, холестерина, нейтральных и катионных органических соединений, глютатиона, органических анионов, лейкотриенов, нуклеотидных аналогов циклических нуклеотидов и мн. др. В опухолевых таргетных (лапатиниб, иресса, софатиниб, герцептин, акситиниб и др.) и гормональных средств из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ [Amiri-Kordestani L., et al., 2012, Eechoute K., et al., 2011, Schinkel A.H., et al., 2012, Wang C.S., et al., 1997, Wind N.S., et al., 2011].

Роль генов АВС-транспортеров в формировании фенотипа предсуществующей и адаптивной МЛУ была доказана в опытах in vitro по их трансфекции в чувствительные к цитостатикам линии клеток и в экспериментах по индукции экспрессии АВСтранспортеров в клетках, которые в результате этого оказывались устойчивыми к химиопрепаратам [Allen J.D., et al., 2000, Gottesman M.M., et al., 2006, Hembruff S.L., et al., 2008, Kool M., et al., 1997]. В широкомасштабных исследованиях Szakacs G., et al., (2004) была изучена экспрессия всех 48 генов МЛУ в 60 раковых клеточных линиях, обработанных 1429 различными химическими агентами (противоопухолевыми препаратами и кандидатами на роль противоопухолевых средств) и установлено, что высокий уровень экспрессии АВС-транспортеров (предсуществующая МЛУ) и индукция их экспрессии при воздействии химиопрепаратов (адаптивная МЛУ) определяет химиорезистентность опухолевых клеток [Szakcs G., et al., 2004]. Кроме того, в исследованиях in vitro определены многие механизмы активации экспрессии АВСтранспортеров при воздействии химиопрепаратов и росте опухоли [Chen K.G., et al., 2012].

В клинических исследованиях предсуществующей МЛУ было показано, что гиперэкспрессия АВС-транспортеров до воздействия химиопрепаратов наблюдается только в опухолях, происходящих из тканей, в норме экспрессирующих высокий уровень АВС-транспортеров, таких как нейробластома, астроцитома, рак почки и надпочечников, гепатома, феохромацитома, и эти опухоли обладают высокой устойчивостью к химиотерапии [Leonard G.D., et al., 2003]. Для других опухолей не показан высокий исходный уровень экспрессии АВС-транспортеров, он был очень вариабелен. Более того, данные о связи исходного уровня экспрессии АВС-транспортеров с показателями ответа безметастатической выживаемостью пациентов оказываются крайне противоречивыми даже для опухолей одной локализации, например, при раке молочной железы [Wind N., et al., 2011]. Рядом авторов в клинике была исследована связь исходного уровня экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы с эффективностью химиотерапии [Chintamani, et al., 2005, Faneyte I.F., et al., 2004, Fletcher J.I., et al., 2010, Gillet J.P., et al., 2007, Kim B., et al., 2013, Park S., et al., 2006, Wang C.S., et al., 1997, Wind N., et al., 2011].

Неоднозначность результатов является общей чертой этих исследований и четкая связь чувствительностью к химиотерапии так и не была идентифицирована.

Клинических исследований адаптивной или приобретенной МЛУ немного.

Ассоциацию повышения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в процессе химиотерапии с отсутствием эффекта НАХТ подтверждают результаты исследования Chevillard et al., (1996). Эти авторы, при помощи полуколичественной ПЦР и иммуногистохимических исследований, наблюдали повышение экспрессии гена АВСВ и его белка P-гликопротеина в опухоли молочной железы на 8 и 28 сутки после первого цикла НАХТ у неотвечающих пациентов. Atalay в 2006 году показал, что у пациентов, у которых в процессе НАХТ индуцировалась экспрессия гена АВСВ1, отсутствовал ответ на химиотерапию [Atalay C., et al., 2006]. В мета-анализе F. Leonessa 2003 года было установлено, что в опухоли молочной железы средний уровень экспрессии АВСВ1 и частота P-гликопротеин-позитивных опухолей повышалась в процессе НАХТ у больных плохо отвечающих на лечение [Leonessa F., et al., 2003]. Kim и соавторы обнаружили повышение экспрессии белка Mrp1, Bcrp и Р-гликопротеина в опухоли молочной железы больных при проведении НАХТ, однако уровень экспрессии этих белков до лечения и после НАХТ не коррелировал с эффектом химиотерапии [Kim B., et al., 2013].

Таким образом, немногочисленные клинические исследования адаптивной МЛУ, в определенной мере подтверждают только отсутствие эффекта лечения при стимуляции экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в процессе химиотерапии, и даже эти исследования во многом противоречивы и ограничены очень узким кругом АВСтранспортеров [Leonessa F., et al., 2003, Wind N.S., et al., 2011]. При этом совершенно не изучено, с чем связан ответ опухоли молочной железы на химиотерапию, почему, при лечении по одной и той же схеме у одних пациентов наблюдается ответ на химиотерапию, а у других лечение не эффективно, и как во всем этом участвуют АВС-транспортеры. Повидимому, в клинической ситуации, в отличие от экспериментов in vitro на клеточных линиях, происходит активный процесс становления МЛУ при лечении, на который оказывают влияние факторы организма и опухоли. Изучение именно этого процесса, поможет понять причины индивидуальной вариабельности ответа на химиотерапию, механизмы химиочувствительности и химиорезистентности. Это позволит разрабатывать методы прогнозирования ожидаемой эффективности химиотерапии и наметить новые стратегии регулирования фенотипа МЛУ в опухоли молочной железы.

Хорошо известны генные механизмы активации экспрессии генов АВС в опухолевых клетках в ответ на воздействие химиопрепаратов [Chen K.G., et al., 2012, Schinkel A.H., et al., 2012]. Напротив, механизмы, которые связаны с генами лекарственной устойчивости и могут обеспечивать ответ опухоли на химиотерапию, практически не известны. Среди таких возможных механизмов, которые могут теоретически обеспечить эффективный ответ на химиотерапию, можно выделить продукт гена-супрессора опухолевого роста ТР53, связывающегося с промотором АВСтранспортеров и способного ингибировать экспрессию генов АВС [Johnson R.A., et al., 2001, Scotto K.W., 2003, Thottassery J.V., et al., 1997]. Гетерогенность клинической опухоли может вносить определенный вклад в реализацию эффективности химиотерапии [Bhatia S., et al., 2012]. Хромосомные аномалии в опухолевых клетках могут иметь важное значение в реализации активности химиопрепаратов [Han S., et al., 2010, McClelland S.E., et al., 2009]. Наконец адаптационные изменения опухолевых клонов в процессе химиотерапии способны обеспечивать вариабельность ее эффективности.

Неоадъювантную химиотерапию считают очень подходящей моделью для прямого исследования ответа на лечения, в зависимости от экспрессии генов МЛУ до и после терапии [Gillet J.P., et al., 2011]. Учитывая этот факт, мы сосредоточили внимание на исследовании ключевых генов МЛУ (АВС-транспортеров) экспрессируемых в опухоли молочной железы: ABCB1, АВСВ3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1 и ABCG2. Кроме того, был изучен ген MVP (Lung Resistance-Related Protein), который функционирует как эндоплазматический и/или связанный ядерной мембраной транспортер лекарственного средства в соединении с АВС-транспортерами [Mossink M.H., et al., 2003]. Учитывая, что 7 из 8 изучаемых генов являются АВС-транспортерами, а MVP непосредственно связан с ними всю изучаемую группу генов для краткости мы будем называть АВС-транспортеры.

Цель работы Исследование значимости экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы для реализации ответа на лечение и установление факторов, определяющих ее индивидуальную вариабельность в процессе неоадъювантной химиотерапии.

Задачи исследования:

Изучить экспрессию АВС-транспортеров в опухоли молочной железы до лечения и после НАХТ в зависимости от основных клинико-патологических параметров заболевания и непосредственной эффективности химиотерапии.

Оценить прогностическую значимость экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ в отношении гематогенного метастазирования.

Оценить возможность нормализации уровня экспрессии АВС-транспортеров после НАХТ и в промежутках между курсами, на основе изучения динамики экспрессии генов АВС в процессе НАХТ Изучить экспрессию белков АВС и соответствующих им генов АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в процессе НАХТ.

Изучить влияние внутриопухолевой морфологической гетерогенности на экспрессию АВС-транспортеров в процессе предоперационной химиотерапии.

Определить значение метилирования промоторных участков генов лекарственной устойчивости в регуляции их экспрессии в процессе НАХТ.

Изучить влияние функциональных изменений гена-супрессора опухолевого роста ТР53 на регуляцию экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы Определить роль хромосомных аномалий опухолевой ДНК молочной железы в регуляции экспрессии генов лекарственной устойчивости.

Проанализировать изменения мутантных опухолевых клонов в процессе НАХТ и экспрессию АВС-транспортеров в процессе НАХТ 10. Сформировать модель факторов определяющих изменение экспрессии генов АВС в опухоли молочной железы в ответ на НАХТ.

Научная новизна Впервые установлена связь изменения (повышения или снижения) экспрессии АВСтранспортеров в опухолевой ткани молочной железы в процессе лечения с клинической эффективностью НАХТ. Наши исследования четко показали, что в реализации эффекта НАХТ играет роль не предсуществующая, а адаптивная множественная лекарственная устойчивость, которая формируется за счет повышения экспрессии генов АВСтранспортеров в процессе химиотерапии, что и определяет резистентность опухоли молочной железы к химиопрепаратам. Более того, низкий уровень предсуществующей МЛУ (за счет низкой экспрессии генов АВС) в опухоли до лечения не определяет элиминацию опухолевых клонов под действием химиотерапии.

Впервые установлен феномен снижения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли в ответ на воздействие химиопрепаратов, который впоследствии был также показан и в зарубежном исследовании. Снижение экспрессии генов АВС определяет низкую экспрессию белковых продуктов этих генов, обеспечивает объективный ответ опухоли на НАХТ и является благоприятным прогностическим фактором, не зависящим от основных клинико-патологических параметров заболевания. Впервые выявлено однонаправленное изменение экспрессии пяти ключевых генов АВС: ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 в строгом соответствии с эффектом НАХТ, которое отмечено у 75% больных и обозначено как градиентный феномен. Наличие градиентного феномена у больных РМЖ является независимым благоприятным фактором прогноза, в то время как наличие у пациента разнонаправленных изменений экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ ассоциировано с гематогенным метастазированием.

Впервые было проведено комплексное исследование механизмов и факторов, определяющих повышение или снижение экспрессии генов АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в процессе НАХТ. Установлено, что гипо- или гиперметилирование промоторов генов АВС определяет исходный уровень экспрессии АВС-транспортеров в опухоли, или предсуществующую МЛУ, но не оказывает существенного влияния на изменения экспрессии генов АВС и формирование адаптивной МЛУ.

Впервые исследована связь разных морфологических структур инфильтративного компонента рака молочной железы с характером изменений экспрессии АВСтранспортеров и показано, что внутриопухолевая морфологическая гетерогенность не оказывает прямого влияния на регуляцию экспрессии генов АВС. Впервые установлено значение связанного с с молекулами главного комплекса гистосовместимости 1 (MHC1) гена АВСВ3 в реализации высокого уровня химиорезистентности альвеолярных и трабекулярных структур.

Получены новые данные о вовлечении гена-супрессора опухолевого роста ТР53 в регуляцию экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы. Впервые показано, что экзонный полиморфизм TP53+119C>G Arg72Pro rs1042522 и делеция локуса 17р13.1 гена ТР53 оказывают влияние на изменения экспрессии генов АВС-транспортеров в процессе НАХТ, установлена прогностическая значимость делеции локуса 17р13.1.

Впервые при помощи микроматричных исследований хромосомных аберраций в опухолях больных раком молочной железы выявлены делеции локусов генов АВСтранспортеров, установлена их важная роль в негативной регуляции экспрессии своих генов в процессе НАХТ, высокая прогностическая и предсказательная значимость делеций локусов генов АВС.

Впервые идентифицированы хромосомные локусы в опухоли молочной железы, аберрации в которых связаны с регуляцией экспрессии каждого АВС-транспортера в отдельности. Показано что несбалансированные хромосомные аномалии этих локусов определяют снижение экспрессии генов АВС, в то время как нормальное состояние этих локусов связано с повышением экспрессии и формированием адаптивной МЛУ. На основе полученных данных сделан важный вывод о том, что, в большинстве случаев нет специальных механизмов снижения экспрессии генов АВС в клетках, а нарушены механизмы up-регуляции, т.е. ответа опухоли на химиопрепараты. На основе оценки этих нарушений в опухоли до лечения можно прогнозировать ожидаемую эффективность НАХТ. Нарушение механизмов up-регуляции является характерным для клинической опухоли аберрантным явлением.

На основе микроматричных исследований изменения мутантных опухолевых клонов в процессе НАХТ впервые выявлено появление новых мутантных клонов у некоторых больных, при этом у этих больных в 83% отмечается развитие гематогенных метастазов.

Впервые установлено, что в процессе химиотерапии элиминируются, прежде всего, опухолевые клоны с делециями локусов генов АВС и опухолевые клоны, несущие хромосомные аномалии, связанные со снижением экспрессии АВС-транспортеров.

Полученные новые знания позволили значительно расширить представления о механизмах формирования адаптивной множественной лекарственной устойчивости.

Теоретическая и практическая значимость В результате выполнения исследования получены приоритетные данные о механизмах химиорезистентности опухоли молочной железы, установлены новые феномены и закономерности ответа опухоли на химиотерапию, выявлены генетические, морфологические и эпигенетические факторы регуляции формирования множественной лекарственной устойчивости. Новые данные о том, что клиническая эффективность НАХТ зависит не от начального уровня экспрессии генов АВС в опухоли, а от направленности изменения уровня их экспрессии у пациента при проведении химиотерапии, значительно расширяют представления о процессе формирования фенотипа адаптивной МЛУ в клинических условиях и обосновывают новую стратегию управления множественной лекарственной устойчивостью через регулирование экспрессии АВС-транспортеров, а не через подавление активности белков АВС, как это предлагалось ранее.

Установлено, что адаптивная МЛУ, возникновение которой обусловлено повышением экспрессии АВС-транспортеров в опухоли, может продолжаться более трех месяцев, и в краткосрочном периоде не происходит естественной нормализации уровня экспрессии генов АВС в опухоли. Это может иметь важное значение при индивидуальном химиотерапевтического лечения в целом, в плане определения целесообразности двухфазной химиотерапии с предоперационными и послеоперационными циклами.

Приоритетные исследования механизмов химиорезистентности морфологических структур инфильтративного компонента опухоли молочной железы, наличие которых является одним из проявлений внутриопухолевой гетерогенности, указали новое направление поиска механизмов лекарственной устойчивости этих структур, которые не связаны с мажорными механизмами МЛУ.

Выявленный феномен снижения экспрессии генов АВС транспортеров в опухоли, сопряженный с клиническим ответом на НАХТ, и результаты исследования возможных механизмов этого явления позволили сформулировать основную идею работы о том, что в большинстве случаев снижение экспрессии обусловлено нарушением в опухолевых клетках физиологических механизмов активации генов МЛУ в ответ на химиотерапию.

Это позволяет обосновано предположить, что для регуляции формирования множественной лекарственной устойчивости опухоли необходимо нарушить механизмы up-регуляции их экспрессии в опухолевых клетках, например, используя сочетание таргетных препаратов, ингибирующих внутриклеточные сигнальные пути, и конвенциональных лекарственных средств, которые и будут оказывать основное противоопухолевое действие. Полученные знания могут стать основой новой стратегии управления множественной лекарственной устойчивостью опухоли.

На основе оценки изменения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы идентифицирован новый информативный прогностический фактор, который может быть определен при проведении НАХТ. Новый прогностический фактор работает не только для пациентов с полной морфологической регрессией опухоли, но и для больных с частичной регрессией опухоли, стабилизацией или прогрессированием процесса, что значительно расширяет диапазон его возможного использования по сравнению с оценкой лекарственного патоморфоза. Установленное в работе явление градиентного феномена имеет высоко значимую связь с развитием метастатической болезни при раке молочной железы. Наличие/отсутствие в опухоли градиентного феномена – это еще один новый прогностический фактор, который позволяет прогнозировать исход РМЖ на этапах лечения после предоперационной химиотерапии.

Высокая прогностическая значимость в отношении безметастатической выживаемости делеции локуса 17p13.1 гена ТР53 определяет возможность использования оценки CNA статуса этого локуса в качестве дополнительного прогностического фактора, который может быть исследован в опухоли молочной железы до лечения. Выявленная связь делеций локусов генов АВС-транспортеров в биопсийном материале опухоли молочной железы до лечения с эффективностью НАХТ и высоким уровнем безметастатической выживаемости обосновывает перспективность использования оценки делеций локусов генов АВС в качестве маркеров прогноза ожидаемой эффективности НАХТ, для персонализированного определения целесообразности ее проведения, и в качестве дополнительного прогностического фактора. В практическом плане проведенные исследования дали возможность установить новые прогностические и предсказательные факторы и наметить мишени для терапевтического воздействия.

В целом проведенное исследование позволило решить важную научную проблему – выявить основные причины вариабельности индивидуального клинического ответа опухоли на химиотерапевтическое лечение, заложить основы персонифицированного подхода к назначению НАХТ и наметить пути формирования новой стратегии управления множественной лекарственной устойчивостью опухоли.

Положения выносимы на защиту Отсутствие клинического ответа на неоадъювантную химиотерапию обусловлено формированием адаптивной множественной лекарственной устойчивости в результате стимуляции экспрессии АВС-транспортеров в опухоли.

При объективном ответе на химиотерапию в опухоли происходит снижение экспрессии АВС-транспортеров при воздействии химиопрепаратов, по сравнению с базовым уровнем до лечения.

Снижение экспрессии АВС-транспортеров обусловлено хромосомными аномалиями в опухолевых клетках, приводящих к нарушениям физиологических механизмов активации генов АВС в ответ на химиопрепараты.

В процессе химиотерапии в первую очередь происходит элиминация опухолевых клонов с нарушениями механизмов регуляции АВС-транспортеров, которые и являются чувствительными к действию цитостатических препаратов клонами.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на:

международной конференции «Фундаментальные науки – медицине»

(Новосибирск, 2007), 4 Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (С.-Петербург, 2008), Российской научно-практической конференции «Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы»

(Томск, 2008), V-VII конференции молодых ученых им. Академика Н.В. Васильева (Томск, 2008 - 2010), Российско-Тайваньском форуме «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии» (Томск, 2009), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Международной конференции «Опухоль и хозяин: новые аспекты старой проблемы»

(Киев, 2010), XVI и X Российских онкологических конгрессах (Москва, 2010, 2013 гг), 3rd Norwegian Cancer Symposium «Growth and Proliferation: Molecular Regulators of Cancer»

(Oslo, 2011), Международной научной школе «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» (Томск, 2011), Всероссийской конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня» (Красноярск, 2012), VII и VIII съездах онкологов и радиологов стран СНГ (Астана, 2012, Алма-Ата, 2014), VIII-IX съездах онкологов России (С.-Петербург, 2013, Казань, 2014), ESMO congress (Madrid, 2014). Результаты и автор исследования удостоены Всероссийской премии в области онкологии «In Vita Veritas»

2013 г. в номинации «За достижения в области экспериментальной онкологии».

Внедрение результатов исследования Результаты работы включены в учебную программу и тематический план лекций для кафедры физиология человека и животных Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета на тему «Применение современных методов исследования генома и транскриптома в физиологии».

Используются в учебном процессе Сибирского государственного медицинского университета и включены:

– в рабочую программу послевузовской подготовки в интернатуре по специальности 040113-патологическая анатомия;

– методические рекомендации для преподавателей СибГМУ на практические и лабораторные занятия по учебной дисциплине патологическая анатомия, специальность «060101 – лечебное дело» по теме: «Клинико-морфологическая характеристика злокачественных опухолей эпителиального происхождения» для 3 курса лечебного, педиатрического, стоматологического и лечебного факультетов.

– в план чтения лекции по онкологии по теме «Молекулярные механизмы формирования и прогрессии злокачественных опухолей» на кафедре онкологии СибГМУ для студентов лечебного и педиатрического факультетов.

Разработано учебное пособие по специальностям 060101 и 060103 «Механизмы множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы», которое было утверждено на кафедре онкологии 4 октября 2013 года протокол № 7. Зарегистрирована база данных: Свидетельство о государственной регистрации базы данных № от 24 сентября 2013 г. Литвяков Н.В., Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Перельмутер В.М., Вторушин С.В., Завьялова М.В., Чердынцева Н.В. «База данных экспрессионный и клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак молочной железы». Разработан лабораторный набор реагентов для оценки экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости и монорезистентности под названием «MDR – MR ЭКСПРЕССИЯ», утвержден 15 октября 2013 г.

Публикации По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ, в том числе 21 статья, из них 9 статей в зарубежных журналах, 1 глава в зарубежной монографии, 1 зарегистрированная база данных.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, глав собственных результатов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 237 страницах и иллюстрирована 38 таблицами и рисунками. Библиография включает 418 литературных источников, из них иностранных.

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Современные представления о неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы В настоящее время, химиотерапевтическое лечение больных с операбельной формой РМЖ (около 85% всех больных РМЖ) включает помимо операции и системную химиотерапию в двух режимах: предоперационную или неоадъювантную и послеоперационную или адъювантную. Они имеют разные цели и могут отличаться по схемам.

Адъювантная химиотерапия (АХТ) – вспомогательное, дополняющее хирургические и лучевые методы, лекарственное лечение. Целью адъювантной терапии является длительное подавление отдаленного метастазирования рака после хирургического лечения. Невидимые микрометастазы приводят к диссеминации болезни и, в конечном счете, являются причиной онкологических больных. С этих позиций цель адъювантной терапии – увеличение выживаемости пациентов и продление безрецидивного (безметастатического) периода [Загрекова Е.И., и др., 2002, Семиглазов В.Ф. 2012, Семиглазов В.Ф., и др., 2008].

комбинированного лечения женщин с местно-распространенным раком молочной железы (РМЖ) IIIA, IIIB, или IIIC стадиями и может быть использована у женщин с IIA (T2N0 или T1N1) или IIB (T2N1 или T3N0) стадиями РМЖ [Goldhirsch A., et al., 2009, Goldhirsch A., et al., 2013, Schwartz G.F., et al., 2004]. При больших размерах опухоли применение НАХТ (в данном случае называется индукционной терапией) позволяет уменьшить объем первичной опухоли и уровень региональной лимфаденопатии, что делает возможным выполнение радикального оперативного вмешательства [Bonadonna G., et al., 1998]. В случае операбельного РМЖ, использование НАХТ позволяет сократить объем оперативного вмешательства у 50-60 % пациентов и проводить органо-сохранное лечение [Mauriac L., et al., 1991, Schwartz G.F., et al., 2004]. В зависимости от используемого режима, объективный ответ на НАХТ, включая и полную и частичную регрессию, составляет 45-65 % и у 35-55 % пациентов не достигается желаемого результата [Ferriere J.P., et al., 1998, Pierga J.Y., et al., 2003]. Во многих исследованиях было показано, что только при получении полной морфологической регрессии опухоли в ответ на проведенную НАХТ значительно улучшаются отдаленные результаты лечения (общая и безрецидивная выживаемости), и в настоящий момент полную морфологическую регрессию оценивают как ключевой фактор прогнозирования ответа на адъювантную химиотерапию [Bertheau P., et al., 2005, Fisher B., et al., 1998, Kaufmann M., et al., 2006, Kaufmann M., et al., 2003, Kuerer H.M., et al., 1998, Wolmark N., et al., 2001]. НАХТ также может иметь некоторые недостатки. Во-первых, у пациентов с опухолями, резистентными к НАХТ, использование другого лечения может быть отстрочено на несколько недель, хотя прямая резистентность к НАХТ и прогрессия опухоли при ее проведении – редкий феномен и встречается менее чем у 5% пациентов [Fisher B., et al., 1998, van der Hage J.A., et al., 2001]. Во-вторых, существует мнение, что НАХТ может увеличивать частоту или тяжесть хирургических или лучевых осложнений, однако исследования последних 30 лет опровергли это утверждение. В-третьих, НАХТ сильно изменяет первичную опухоль и метастазы в региональных лимфоузлах, и это значительно уменьшает возможность получить точную гистологическую оценку операционного материала. Было также показано, что НАХТ изменяет прогностическое значение лимфогенного метастазирования [Bonadonna G., et al., 1998, Kuerer H.M., et al., 1999, Rouzier R., et al., 2002]. Как цинично утверждают многие исследователи НАХТ представляет собой очень хорошую модель для исследования противоопухолевого действия новых фармакологических препаратов и изучения механизмов устойчивости к лекарственным средствам [Gillet J.P., et al., 2011, Goldhirsch A., et al., 2009, Goldhirsch A., et al., 2013, Kaufmann M., et al., 2006] прогнозирования ответа на АХТ, которое позволило бы, с одной стороны, значительно оптимизировать использование химиотерапии, персонифицировано назначать НАХТ и АХТ, избавить пациентов с резистентными и малочувствительными опухолями от токсичного и дорогостоящего лечения, и планировать адъювантную химиотерапию.

Если рассматривать в общем виде, то в эффективности химиотерапии могут играть роль: 1. основные клинико-морфологические параметры, многие из которых связаны с прогнозом заболевания и выбором методов лечения и 2. молекулярно-генетические особенности опухоли, связанные с изменениями (мутации, гипо – и гиперметилирование, амплификация и др.) в онкогенах, в генах-супрессоров и генах-модификаторах, а также с изменениями в паттерне экспрессии многочисленных генов метаболических путей, транспортных генов, генов ферментных систем и т.п. В любом случае для планирования лечения, маркер должен быть связан с прогнозом заболевания, биологией опухоли или патогенетическими механизмами лечебных манипуляций.

Для неоадъювантной химиотерапии многие клинико-морфологические параметры, такие как гистологический тип опухоли, степень злокачественности, слабо ассоциированы с эффективностью [Rouzier R., et al., 2002, Tiezzi D.G., et al., 2007]. Размер опухоли, лимфогенное метастазирование ассоциированы с эффективностью НАХТ, но все эти маркеры показывают низкий уровень значимости и были и только на ограниченных выборках. При TxN0 с большей вероятностью достигается объективный ответ на НАХТ, чем при TxN1-2 (р=0,04-0,003) [Rouzier R., et al., 2002, Smith I.C., et al., 2002, Tiezzi D.G., et al., 2007]. В исследовании китайских авторов [Zhang B., et al., 2006] показано, что размер опухоли менее 3 см ассоциировался с ответом на НАХТ (160 больных), однако уровень значимости, при проведении логистического регрессионного анализа, не превышал 0,03.

Иммуногистохимические показатели экспрессии в опухоли гормональных рецепторов (ER и PR), белков р53, р21 и рецептора эпидермального фактора роста (HER2) не коррелируют с эффективностью НАХТ [Tiezzi D.G., et al., 2007]. В исследовании [Lee J., et al., 2008] из всех изученных иммуногистохимических показателей опухоли молочной железы (ER, PR, HER-2, Ki-67) только Ki-67 показал ассоциацию с эффективностью адриомицин/доцетаксел НАХТ и общей выживаемостью (уровень значимости 0,033). В других исследованиях [Fernandez-Sanchez M., et al., 2006, Learn P.A., et al., 2005, Zhang F., et al., 2003] уровень экспрессии HER2 ассоциировался с ответом на НАХТ, но эта взаимосвязь сильно зависит от схемы химиотерапии и не является универсальной.

В исследованиях Burcombe R и коллег (2004) наоборот показали, что никакой ИГХ параметр не предсказал ответ на НАХТ. Кроме того, ряд опухолей изменяли ИГХ маркеры (ER, PR, Ki67) в процессе НАХТ [Burcombe R., et al., 2004].

Еще одним важным фактором для выбора химиотерапии является наследственный РМЖ, который составляет не более 10 % всех случаев и чаще диагностируется у женщин репродуктивного возраста моложе 35 лет. Наследственная неполноценность систем обеспечения целостности генома связана с зародышевыми мутациями в генах BRCA1, BRCA2, ATM, p53, CHEK2 и NBS1 [Имянитов Е.Н., и др., 2010]. Предполагается, что BRCA1-ассоциированные стандарту» терапии РМЖ – препаратам из группы таксанов [Byrski T., et al., 2010]. В то же время, РМЖ у BRCA1 гетерозигот демонстрируют исключительно выраженный регресс при лечении цисплатином – хорошо известным и дешёвым препаратом, который широко используется для лечения других разновидностей опухолей, но пока не входит в стандарты терапии карцином молочной железы [Byrski T., et al., 2010, Moiseyenko V.M., et al., 2010].

Важным прогностическим фактором является мульцентричность роста опухоли, которую рассматривают как одну из форм прогрессии РМЖ [Вторушин С.В., и др., 2011].

В исследовании Coombs N.J., Boyages J. (2005) было установлено, что при мультицентрическом раке молочной железы поражение подмышечных лимфатических узлов встречается значительно чаще, чем при уницентрическом. Это явление характерно для больных с разным гистологическим типом опухоли молочной железы. Оказалось, что лимфогенное метастазирование при мультицентрическом росте опухоли не является неблагоприятным фактором прогноза, поскольку выживаемость больных с мультифокальным и унифокальным раком молочной железы была абсолютно идентичной [Coombs N.J., et al., 2005].

злокачественности, которая определяется по модифицированному методу Bloom & Richardson [Bloom H., et al., 1957] и включает полуколичественную оценку трех морфологических особенностей – процента формирования тубулярных структур, степень ядерного плеоморфизма и митотический индекс. Установлена очень сильная корреляция степени злокачественности с прогнозом; у больных с I степенью значительно лучшее выживаемость, чем у больных с III степенью злокачественности (p < 0,0001) [Elston C., et al., 1991]. Недостатком данного прогностического фактора остается высокая степень неопределенности прогноза у больных со II степенью злокачественности, которая встречается у 80-90% пациентов [Pereira H., et al., 2007, Rakha E.A., et al., 2010].

Некоторые сывороточные маркеры связаны с прогнозом РМЖ. F. Ebeling и соавт.(2002) показали, что высокий уровень СА 15–3 является неблагоприятным прогностическим фактором [Ebeling F., et al., 2002]. Несколько исследований установили, что увеличение уровней СА 15–3 и СА 27.29 после НАХТ или адъювантной терапии позволяет прогнозировать рецидивирование за 5–6 мес [D'Alessandro R., et al., 2001, Kokko R., et al., 2002, Nicolini A., et al., 2006]. Всего в рекомендациях ASCO 2007 года рассмотрено 13 маркеров опухолей молочной железы. Оказались достоверно клинически применимыми и были рекомендованы для практического использования следующие маркеры: CA 15–3; CA 27.29; РЭА (при метастатическом РМЖ); ER; PR; рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2 (HER2neu) и другие [Harris L., et al., 2007, Семиглазов В.Ф., и др., 2011].

В настоящее время для определения врачебной тактики наиболее перспективным гистогенетической классификации рака молочной железы, предложенной в 2000 г. Perou C.M. и соавт [Perou C.M., et al., 2000]. Были определены такие молекулярные подтипы рака молочной железы, как люминальный А, люминальный В, HER2 позитивный, «трижды негативные» опухоли и группа опухолей, в которой экспрессия генов молочной железы оставалась в норме. Каждый из перечисленных молекулярно-генетических типов РМЖ характеризовался рядом клинико-морфологических особенностей и диктовал определенную тактику ведения пациенток, относящихся к той или иной группе [Parker J.S., et al., 2009].

Считается, что НАХТ показана при люминальном В, трижды-негативном, и HER2позитивном РМЖ. Для люминального А субтипа, в сравнении с остальными, выживаемости, эта гистогенетическая группа рака молочной железы характеризуется высокой чувствительностью к гормональной терапии (тамоксифен, ингибиторы ароматазы), неоадъювантная химиотерапия не показана [Cheang M.C.U., et al., 2009, Goldhirsch A., et al., 2013, Hugh J., et al., 2009, Parker J.S., et al., 2009, Yanagawa M., et al., 2012]. Люминальный тип В встречается в 14-18% случаев, для этой группы характерно чувствительность к гормональной терапии [Cheang M.C.U., et al., 2009, Hugh J., et al., 2009, Parker J.S., et al., 2009, Sotiriou C., et al., 2009]. Трижды-негативный рак молочной железы является агрессивной опухолью, часто имеет мутации гена BRCA1, метастазирует в лимфатические узлы и отдаленные органы, характеризуются более низкими показателями выживаемости. Трижды-негативный рак особенно чувствителен в НАХТ по антрациклини таксан-содержащим схемам [Carey L., et al., 2010, Imyanitov E.N., et al., 2007, Schneider B.P., et al., 2008]. HER2-позитивный рак молочной железы часто имеет низкую степень дифференцировки, лимфогенное метастазирование, низкие показатели общей выживаемости, высокочувствителен к герцептину и не чувствителен к гормонотерапии [Burris H.A., et al., 2011, Theillet C., 2010, Valero V., et al., 2011].

Предложенная классификация остается актуальной до сих пор. Однако, имеются трудности в трактовке иммуногистохимических реакций, связанные с гетерогенностью опухоли, в которой сосуществуют клоны клеток, экспрессирующие разные маркеры и поразному реагирующие на проводимую терапию [Laakso M., et al., 2006]. Экспрессия рецепторов ER, PR и HER2 в существенной степени вариабельно, и меняется в процессе предоперационной химиотерапии, может быть различной в различных участках опухоли (внутриопухолевая гетерогеннность), кроме того первичная опухоль и метастазы (лимфогенные и гематогенные) могут существенно различаться по рецепторному статусу [Yang J., et al., 2012].

Несмотря на значительные успехи в определении, казалось бы, наиболее экспрессионных характеристик опухоли с целью определения дальнейшей тактики ведения таких пациенток, многое до сих пор остается не ясным. Лечение триждынегативного рака, его прогноз, остается непонятным и очень вариабельным. Назначение схем лечения НАХТ и адъювантной химиотерапии при лимфогенном метастазировании для люминального А и В рака также не определено. Группа люминального А типа рака метастазированию. Проведение гормонотерапии у N0 пациентов с люминальным А раком в ~15% случаев заканчивается гематогенным метастазированием. По сути, предсказать эффективность НАХТ в зависимости от молекулярных субтипов РМЖ не удается [Rouzier R., et al., 2005].

неоднозначностью имеющихся в мировой литературе сведений о молекулярных механизмах, участвующих в реализации ответа опухоли молочной железы на химиотерапию и отсутствием внедренных в клиническую практику информативных персонифицированный выбор схем химиотерапии и прогнозирования ее эффективности.

1.2. Множественная лекарственная устойчивость и гены АВС-транспортеров В настоящее время множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам считается одной из наиболее важных причин неэффективности терапии злокачественных новообразований. Множественная лекарственная устойчивость – вид лекарственной резистентности клеток опухоли, для которой свойственна широкая перекрестная устойчивость (кросс-резистентность) клеток к различным веществам, несходным по химической структуре и механизму действия, которая может индуцировать одним или несколькими несходными по структуре веществами [Gottesman M.M., et al., 2002].

На сегодняшний день множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам является одной из наиболее важных причин неэффективности терапии злокачественных новообразований. Развитие МЛУ, связывают и с плохим ответом на химиотерапию и с плохим прогнозом [O'Driscoll L., et al., 2006, Szakacs G., et al., 2006].

Показано, что 75-80% случаев низкой эффективности химиотерапии при раке молочной железы (РМЖ) обусловлены лекарственной устойчивостью (ЛУ) опухоли [O'Driscoll L., et al., 2006, Szakacs G., et al., 2006], и в настоящее время рассматривают главных механизма ЛУ в клетках:

1. Изменение экспрессии белков-переносчиков, которые обеспечивают поступление лекарств в клетки (2-5% случаев ЛУ).

2. Изменения в клеточном цикле, повышение активности репарации поврежденной ДНК, снижение апоптоза и изменение метаболизма лекарств (10-15%).

3. Повышение экспрессии энергозависимых белков-транспортеров лекарств, которые осуществляют выброс цитостатических препаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации – собственно множественная лекарственная устойчивость (75O'Driscoll L., et al., 2006, Schinkel A.H., et al., 2012, Szakacs G., et al., 2006].

устойчивости (МЛУ) произошел в 1976 году, когда была показана достоверная корреляция резистентности к химиопрепарату с чрезмерной экспрессией единственного белка, продукта гена ABCB1; также известного как P-гликопротеин или MDR1 [Juliano R.L., et al., 1976]. Высокая экспрессия ABCB1 была связана с отсутствием ответа на химиотерапию при различных злокачественных новообразованиях, включая рак почки, печени и толстой кишки, а так же лимфомы, и при лейкемии [Ambudkar S.V., et al., 2003].

Несколько лет спустя был найден ген ABCC1 (MRP1), который, как показали, играет роль в формировании лекарственной устойчивости при мелкоклеточном и немелкоклеточном раке легкого [Cole S., et al., 1992]. Кроме этого, высокий уровень экспрессии данного гена наблюдался и коррелировал с резистентностью к химиопрепаратам при раке простаты, раке легкого, в опухоли молочной железы, а так же при нейробластомах [Munoz M., et al., 2007]. Третьим ABC-транспортером лекарственных средств был обнаружен продукт гена ABCG2 (также известный как BCRP), который осуществляет выброс химиопрепаратов из опухолевых клеток молочной железы [Austin Doyle L., et al., 2003, Robey R.W., et al., 2007]. Таким образом, наиболее часто МЛУ связывают с повышением экспрессии осуществляют выброс цитостатических препаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ.

Семейство ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), насчитывает 50 генов и наиболее известные из них: АВСВ1 -MDR1 (multidrug resistance gene-1), АВСС1 - MRP1- (multidrug resistance-associated protein), ABCG2 и ABCG1- BCRP и BCRP1 (breast cancer resistance protein), т.е. главными подсемействами являются ABCB, ABCC и ABCG (рисунок 1) [Kerr I.D., et al., 2011]. Структурное строение всех представителей семейства является консервативным и объединено доменной организацией, которая включает в себя различные комбинации из двух функциональных субъединиц: ТMD (transmembran ebinding domen) или MSD-трансмембранная субъединица, состоящая из шести спиралей, и NBD (nucleotid binding domen) – субъединица, состоящая из двух доменов. Домены NBD носят название Walker A, он связывается с остатком фосфорной кислоты молекулы АТР, а второй содержит аспартат, связывается с магнием, ассоциированным с нуклеотидами, это Walker B домен [Lockhart A.C., et al., 2003, Szakacs G., et al., 2008, Szakcs G., et al., 2009, Tusndy G.E., et al., 2006, Walker J.E., et al., 1982]. Все АВС-транспортеры по своей структуре подразделяются на полные и неполные (половинными). Полные характеризуются структурой (TMD-NBD)2 и локализуются в плазматической мембране клетки. Транспортеры со структурой TMD-NBD называют неполными и находятся обычно на внутриклеточных мембранах (лизосомальных, митохондриальных, эндоплазматическом ретикулуме), единственным исключением является неполный протеин Abcg2 (он же Bcrp), локализованный и на плазматической мембране клетки [Rocchi E., et al., 2000, Tusndy G.E., et al., 2006].

Рисунок 1. – Архитектура АВС-транспортеров человека [Kerr I.D., et al., 2011] Показаны пять подсемейств человеческих белков ABC-транспортеров с числом генов, идентифицированным в человеческом геноме (в круглой скобке). Трансмембранную архитектуру показана схематически, с N-и C-концами последовательности.

Приблизительное положение мембраны обозначено пунктиром. Под диаграммой указан спектр субстратов и диапазон размера белка (количество аминокислотных остатков).

Существуют два механизма (естественный или предсуществующий и приобретенный или адаптивный), благодаря которыми экспрессия генов АВС может привести к ЛУ клеток опухоли. Естественная или предсуществующая МЛУ свойственна клеткам опухоли из-за высокой экспрессии генов АВС-транспортеров, существующей в нормальных тканях, из которых происходит опухоль. В этом случае химиотерапия малоэффективна.

Было показано, что частота встречаемости гиперэкспрессии генов АВС-транспортеров зависит от типа опухоли и ее гистогенеза. Повышенная экспрессия наблюдается в опухолях, происходящих из тканей в норме экспрессирующих высокий уровень генов МЛУ, таких как нейробластома, астроцитома, рак почек и надпочечников, гепатома, химиотерапии [Leonard G.D., et al., 2003].

химиотерапии, находятся в состоянии готовности к быстрой активации экспрессии генов АВС-транспортеров в ответ на химиотерапию. После проведения химиотерапии погибают чувствительные клетки, но промоторные и энхансерные участки генов АВС (например, АВСВ1) оставшихся клеток увеличивают экспрессию, повышая резистентность к повторной химиотерапии [Scotto K.W., 2003]. Считается, что исследования, учитывающие спектр резистентности опухоли к химиопрепаратам, зависимый от генов АВС, являются наиболее перспективными для формирования подходов к индивидуальной лекарственной терапии опухолей [Dorai T., et al., 2004].

1.3 Экспериментальные исследования роли АВС-транспортеров в формировании фенотипа МЛУ эксперименте in vitro на линиях клеток опухоли молочной железы показал себя весьма однозначно. Роль всех АВС-транспортеров в формировании фенотипа МЛУ была доказана в опытах in vitro по их трансфекции в чувствительные к цитостатикам линии клеток и в экспериментах по индукции МЛУ на клеточных линиях при помощи химиопрепаратов [Allen J.D., et al., 2000, Gottesman M.M., et al., 2006, Hembruff S.L., et al., 2008, Kool M., et al., 1997]; [Allen J.D., et al., 2002, Chan H.S., et al., 1990, Deeley R.G., et al., 1997, Kampinga H.H., 1995, Raghu G., et al., 1996, Tew K.D., 1994].

В микроматричных и ПЦР-исследованиях Szakacs G., et al., (2004) была показана отрицательная корреляция экспрессии всех генов АВС в 60 раковых клеточных линиях с чувствительностью к 1429 различным химическим агентам (противоопухолевым препаратам и кандидатам на роль противоопухолевых средств) [Szakcs G., et al., 2004].

Был проведен эксперимент, в котором исследовали связь между экспрессией ABCтранспортеров, их активностью и чувствительностью к химиотерапии. Для проведения данного исследования Hembruff с коллегами использовал панель клеточных линий MCF-7, отобранных по устойчивости к различным химиотерапевтическим препаратам. Клеточные линии были резистентны к воздействию паклитацела (MCF-7tax-2), доцетакцела (MCFtxt), доксорубицина (MCF-7dox-2) и эпирубицина (MCF-7epi). Как показал ПЦР-анализ, уровень экспрессии гена ABCB1 был существенно увеличен в клеточных линиях MCFtax-2, MCF-7txt, MCF-7epi, тогда как в клеточной линии, устойчивой к воздействию доксорубицина MCF-7dox-2, был повышен уровень ABCC1 [Hembruff S.L., et al., 2008]. В другом исследовании экспрессию гена АВСВ1 оценили в доксорубицин-чувствительной и доксорубицин-устойчивой линиях мышей, по сравнению с экспрессией в нормальной ткани. Средний уровень экспрессии в чувствительной линии был сопоставим с нормальной тканью. В резистентных к доксорубицину клеточной линии было показано двукратное увеличение уровня мРНК АВСВ1, по сравнению с нормальной тканью [Schinkel A.H., et al., 2012].

Таким образом, в исследованиях in vitro на клеточных линиях было установлено, что высокий уровень экспрессии генов АВС-транспортеров до воздействия химиопрепаратов, формирующий фенотип предсуществующей МЛУ, определяет устойчивость клеток к химиопрепаратам. При повышении экспрессии АВС-транспортеров формируется фенотип адаптивной МЛУ, которая, как было продемонстрировано в эксперименте, достаточно однозначно определяет устойчивость опухоли к химиотерапии. Вот два характерных эксперимента in vitro и in vivo:

Была оценена экспрессия генов ABCB1, ABCC1 и ABCG2 в клеточной линии рака молочной железы до и после обработки таксанами. Установлено статистически значимое повышение экспрессии генов после воздействия таксанов, т.е. формирование адаптивной МЛУ [Brooks T., et al., 2003]. В 2009 году было проведено исследование экспрессии АВСтранспортеров на модели мышей с наследственным раком молочной железы (K14cre;

Brca1F/F; p53F/F). Возникающие у мышей опухоли изначально были чувствительны к действию цисплатина, доксорубицина, топотекана и карбоплатина. После нескольких курсов лечения этими химиопрепаратами опухоли становились к ним устойчивыми. В опухолевой ткани после терапии доксорубуцином в пять раз, по сравнения с уровнем до лечения повышался уровень экспрессии гена АВСВ1, кодирующего белок P-гликопротеин, после терапии топотеканом увеличивалась экспрессия гена ABCG2 [Pajic M., et al., 2009].

Эти данные свидетельствуют о формировании в изначально чувствительной опухоли адаптивной МЛУ, которая и определяла ее устойчивость к химиотерапии. Таким образом, в экспериментальных исследованиях достаточно четко доказана роль АВС-транспортеров в формировании фенотипа предсуществующей и адаптивной МЛУ и их определяющую роль в устойчивости опухоли к действию химиопрепаратов.

1.4 Клинические исследования роли АВС-транспортеров в формировании фенотипа МЛУ В отличие от экспериментов in vitro и in vivo, результаты клинических исследований, которые и должны были определить значение АВС-транспортеров в реализации ответа на химиотерапию, оказались весьма противоречивыми.

Клинические исследования значения АВС-транспортеров в формировании фенотипа МЛУ опухоли начались с 90-х годов прошлого столетия. Мы условно разделили эти работы на исследования клинической значимости уровня экспрессии АВС-транспортеров и предсуществующей МЛУ и изменения экспрессии АВС-транспортеров в процессе химиотерапии и адаптивной МЛУ в реализации устойчивости и чувствительности опухоли молочной железы к химиотерапии.

Высокий уровень экспрессии генов АВС в опухоли молочной железы до лечения коррелирует со степенью злокачественности, размером опухоли и отмечается при низкой степени дифференцировки опухолевых клеток. Однако, эти зависимости в значительной степени вариабельны и далеко не всегда наблюдаются при той или иной локализации, например при РМЖ [Fletcher J.I., et al., 2010]. В мета-анализе 2003 года было установлено, что уровень экспрессии Р-гликопротеина не коррелировал с лимфогенным метастазированием, рецепторным статусом, степенью злокачественности и размером опухоли молочной железы [Leonessa F., et al., 2003].

Многочисленные исследования стремились установить роль ABC-транспортеров в формировании МЛУ и связать их экспрессию до лечения или предсуществующую МЛУ с реакцией на химиотерапию. Исследования 26 у больных РМЖ опухоли с плохим ответом на НАХТ не показали экспрессию Р-гликопротеина до лечения [Dixon A., et al., 1992].

Испанские ученые изучали экспрессию генов и белков АВСВ1 и MVP у 52 больных РМЖ, которые получали 6 курсов НАХТ по схема FAC и CMF. Эффективность химиотерапии оценивали по шкале RECIST. Была обнаружена связь экспрессии генов АВСВ1 и MVP с лимфогенным метастазированием до и после НАХТ, но связь с ответом на химиотерапию так и была установлена [Schneider J., et al., 2001]. В исследованиях Faneyte I.F., et al., (2004) показано, что хотя и мРНК АВСС1 - 3 была обнаружена в опухолях молочной железы всех пациентов, но связи с эффективностью НАХТ не установлена [Faneyte I.F., et al., 2004]. Кроме этого, Faneyte исследовал экспрессию гена BCRP (ABCG2) и его связь с эффективностью химиотерапии по антрациклин-содержащим схемам. Никакой достоверной корреляции между уровнем экспрессии данного гена и эффектом терапии найдено не было [Faneyte I.F., et al., 2002].

Иммуногистихимические исследования 50 больных РМЖ показали связь экспрессии Р-гликопротеина до лечения с плохим ответом на НАХТ [Chintamani, et al., 2005]. Chang Shu Wang et al., (1997) было показано, что экспрессия гена АВСВ1, коррелировала не только с резистентностью к НАХТ, но и с резистентностью к гормональной терапии РМЖ [Wang C.S., et al., 1997].

В ходе одного исследования ученые попытались связать уровни экспрессии всех генов МЛУ с клиническим результатом лечения пациентов. Park с коллегами при использовании микроматриц исследовал экспрессию 48 генов АВС в опухоли до лечения и связь с эффективностью неоадъювантной химиотерапии [Park S., et al., 2006]. Выборка включала 21 пациента с РМЖ, которые получали 4 курса химиотерапии по схеме 5фторурацил, эпирубицин и циклофосфан (FEC). Больные были разделены на две группы: с наличием (Полная+Частичная регрессия) и отсутствием клинического ответа (Стабилизация+Прогрессирование) на неоадъювантную химиотерапию. С эффектом НАХТ связан как высокий, так и низкий уровень экспрессии ряда генов АВС до лечения [Park S., et al., 2006]. Ген ABCC5 формировал резистентность к 5-фторурацилу и показал самый высокий уровень в группе пациентов без клинического эффекта НАХТ [Pratt S., et al., 2005].

Голландские ученые провели исследование уровня экспрессии 4-х АВСтранспортеров АВСВ1, АВСС1, АВСС2 и ABCG2 у больных РМЖ до и после неоадъювантной химиотерапии. Группа пациентов включала в себя 59 человек, которые были разделены в зависимости от эффекта НАХТ. У 34 пациентов отмечался ответ на НАХТ и у 22 больных ответ на НАХТ отсутствовал. Статистически значимая связь с эффектом НАХТ отмечалась только для гена АВСВ1. Ответ на НАХТ наблюдался при низком уровне экспрессии АВСВ1 до лечения, экспрессия остальных генов не коррелировала с ответом на НАХТ [Burger H., et al., 2003].

Chintamani, J. P. В 2005 году при исследовании экспрессии Р-гликопротеина в биопсии до лечения и в операционном материале после НАХТ 50 больных раком молочной железы показал значительную отрицательную корреляцию между уровнем экспрессии Р-гликопротеина в опухоли до лечения и ответом на НАХТ. экспрессия АВСВ в 70% (при n=50) опухолей молочной железы значительно увеличена по сравнению с нормальной тканью железы. Далее было показано для гена ABCB1, что изначально высокий уровень экспрессии данного гена сопряжен со слабым клиническим эффектом на НАХТ. Уровень экспрессии гена АВСВ1 в опухоли 80 больных до лечения статистически не различался у отвечающих и неотвечающих на НАХТ пациентов [Singh L.C., et al., 2012].

поликоличественного иммуногистохимического метода изучали экспрессию белков Ргликопротеина, Bcrp и Mrp1 в опухоли молочной железы до лечения и после НАХТ.

Уровень экспрессии белков до лечения не показал связи с эффектом НАХТ. Только у больных с полной морфологической регрессией уровень Р-гликопротеина был статистически значимо выше, чем у всех остальных пациентов, что вызвало у авторов существенное недоумение [Kim B., et al., 2013].

Результаты мета-анализов, которые по идеи должно были объединить все исследования и расставить все точки над «и» также оказались в значительной степени противоречивы. Мета-анализ B.J. Trock (1997), включающий 660 пациентов показал Примечание: p-value – уровень статистической значимости различий между группами.

Для пятилетней выживаемости р вычислялся по log-rank тесту для кривых выживаемости, для сравнения количества больных с метастазами между группами в зависимости от клинико-патологических параметров использовался двусторонний критерий Фишера (http://vassarstats.net/odds2x2.html); полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия; n – количество больных с метастазами в группе; N – количество больных без метастазов в группе.

Согласно полученным результатам, из числа всех исследованных генов только уровень экспрессии гена ABCB3 в опухоли до лечения был связан с безметастатической выживаемостью. У больных с высоким уровнем экспрессии АВСВ3 пятилетняя безметастатическая выживаемость была выше, чем у больных с низкой экспрессией, а частота больных с метастазами была ниже (таблица 14). Использование других способов дискриминации групп с низким и высоким уровнем экспрессии (верхний и нижний квартили, менее 30 и более 70% уровень и др.) не выявило статистически значимых различий между группами по показателям безметастатической выживаемости ни по одному гену (данные не представлены).

Таблица 14. – Пятилетняя безметастатическая выживаемость в зависимости от уровня экспрессии генов МЛУ в опухоли молочной железы до лечения Экспрессия генов Пятилетняя p-value Количество больных p-value Примечание: p-value – уровень статистической значимости различий между группами.

Для пятилетней выживаемости р вычислялся по log-rank тесту для кривых выживаемости, для сравнения количества больных с метастазами между группами в зависимости от уровня экспрессии АВС-транспортеров использовался двусторонний критерий Фишера (http://vassarstats.net/odds2x2.html); полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия; n – количество больных с метастазами в группе; N – количество больных без метастазов в группе.

Как уже говорилось выше, ген АВСВ3 экспрессируется во всех клетках и играет эндоплазматический ретикулум, где они объединяются вместе с молекулами главного комплекса гистосовместимости 1 класса (MHC I) для представления антигенов (http://omim.org/entry/1702600).

пептиды (в том числе и вирусные) цитотоксическим Т-лимфоцитам и репрессия АВСВ является механизмом, который позволяет вирусам при заражении клеток избегать иммунного ответа [Ghanem E., et al., 2010, Loch S., et al., 2005]. Описан наследственной мутацией в гене АВСВ3, в результате которой отсутствует экспрессия белка ТАР2 и МНС I на поверхности клеток. Синдром проявляется гранулематозными поражениями кожи и рецидивными бактериальными инфекциями, существенными нарушениями функции CD8+ Т-лимфоцитов [Moitra K., 2012]. Наши исследования показали, что уровень экспрессии гена АВСВ3 до лечения коррелирует с эффектом НАХТ.

У больных с полной и частичной регрессией исходный уровень экспрессии в 1,8 раза выше, чем у больных со стабилизацией и прогрессированием (1,10 ± 0,12 против 0,62 ± 0,09, р = 0,003 соответственно). Можно предположить, что высокий уровень экспрессии гена АВСВ3 обусловливает усиление CD8+ Т-лимфоцитарного иммунного ответа в опухоли молочной железы, благодаря чему и увеличивается эффективность НАХТ и безметастатическая выживаемость.

Таким образом, среди 8-ми изученных АВС-транспортеров только уровень АВСВ до лечения связан с безметастатической выживаемостью, что может быть обусловлено другим механизмом его действия, не связанным с выбросом препаратов из клетки.

Исходный уровень экспрессии основных АВС-транспортеров, которые определяют множественную лекарственную устойчивость опухоли молочной железы, не показал связи с безметастатической выживаемостью. Это подтверждает противоречивость данных о прогностической значимости исходного уровня экспрессии АВС-транспортеров до лечения (см. лит. обзор).

Ранее было выдвинуто предположение о том, что прогностическую значимость может иметь не уровень экспрессии АВС-транспортеров в опухоли до лечения, а изменение экспрессии (повышение или снижение) при проведении химиотерапии. Это предположение основано на том, что была выявлена связь направления изменения опухолевой экспрессии АВС-транспортеров с эффектом НАХТ. Мы оценили безметастатическую выживаемость в зависимости от повышения или снижения экспрессии генов АВС, детектированных при проведении НАХТ. В это исследование включены 106 из 120 больных, т.к. для 14 больных, у которых в процессе НАХТ была достигнута полная морфологическая регрессия, не представлялось возможным оценить уровень экспрессии генов МЛУ в опухоли и соответственно, определить вектор его изменения. Кроме того, уже хорошо известно, что достижение полной морфологической регрессии при проведении НАХТ является благоприятным прогностическим фактором и ключевым маркером эффективности адъювантной химиотерапии и повышения выживаемости пациентов [Caudle A.S., et al., 2010, Gralow J.R., et al., 2008, Kaufmann M., et al., 2003, Wolmark N., et al., 2001].

В таблице 15 представлена пятилетняя безметастатическая выживаемость и частота отдаленного метастазирования в группах со снижением и повышением экспрессии генов МЛУ в опухоли при проведении НАХТ. По трем генам (ABCB1, ABCC2 и ABCG1) был достигнут статистически значимый уровень р в log-rank тесте (0,006-0,03) для пятилетней выживаемости и по двухстороннему критерию Фишера (0,014-0,039) для частоты метастазирования в группах. Кривые безметастатической выживаемости в зависимости от изменения экспрессии генов ABCB1, ABCC2 и ABCG1 представлены на рисунке 14.

Показатели безметастатической выживаемости существенно выше у больных со снижением экспрессии генов ABCB1, ABCC2 и ABCG1 в опухоли по сравнению с пациентами, для которых показано повышение их экспрессии после НАХТ (73-78% против 50-55%).

Таблица 15. – Пятилетняя безметастатическая выживаемость в зависимости от направления изменения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли при проведении НАХТ Примечание: см. табл. Таким образом, изменение экспрессии генов АВС-транспортеров при воздействии химиопрепаратов, в отличие от исходного уровня экспрессии, имеет прогностическую значимость. Повышение опухолевой экспрессии ABCB1, ABCC2 и ABCG1 в процессе НАХТ является неблагоприятным прогностическим признаком, а снижение экспрессии этих генов – благоприятным прогностическим фактором.

Безметастатическая выживаемость Безметастатическая выживаемость Рисунок 14. – Безметастатическая выживаемость больных РМЖ в зависимости от изменения опухолевой экспрессии АВС-транспортеров при проведении НАХТ.

Возникает закономерный вопрос, связано ли изменение экспрессии АВСтранспортеров, как потенциальный прогностический фактор, со стандартными факторами прогноза. Для ответа на этот вопрос было проведено сопоставление групп пациентов со снижением () и повышением () экспрессии генов МЛУ по основным клиникопатологическим характеристикам, которые могут вносить вклад в клиническое течение заболевания (таблица 16). Оказалось, что группы со снижением и повышением экспрессии трех генов МЛУ (ABCB1, ABCC2 и ABCG1) не различаются между собой по возрасту пациенток, их менструальному статусу, а также размеру опухоли, частоте лимфогенного метастазирования, рецепторному статусу опухоли (ER, PR и HER2), по частотам молекулярных подтипов, гистологической форме и схеме НАХТ (таблица 16). Следует лишь отметить тенденцию к увеличению частоты больных с мультицентрическим РМЖ в группах с повышением экспрессии генов АВСВ1 и АВСС2, но в группе с повышением экспрессии ABCG1 нет даже тенденции. Результат анализа таблицы 16 позволяет сделать достаточно обоснованный вывод о том, что направление изменения опухолевой экспрессии генов МЛУ при проведении НАХТ является независимым прогностическим фактором.

Ранее мы уже высказывали предположение о том, что изменение (повышение или снижение) экспрессии АВС-транспортеров в ответ на воздействие химиопрепаратов – является отражением индивидуального паттерна регуляции генов МЛУ, свойственного конкретному пациенту и его опухоли.

Таблица 16 – Клинико-патологические параметры в группах больных РМЖ со снижением () и повышением () экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении НАХТ параметры Примечание: С – снижение опухолевой экспрессии гена при проведении НАХТ; П – повышение опухолевой экспрессии гена при проведении НАХТ; p-value – уровень статистической значимости различий по двустороннему критерию Фишера.

Этот паттерн может определяться, прежде всего, генетическими механизмами регуляции экспрессии, такими как полиморфизм генов АВС-транспортеров [Chang H., et al., 2009], метилирование ДНК, деацетилирование гистонов, факторы транскрипции, мутации и микроРНК, которые могут быть вовлечены в модуляцию экспрессии генов МЛУ или модуляцию процессов сплайсинга и трансляции [Glubb D.M., et al., 2011, Reed K., et al., 2010, Sharma G., et al., 2010], и/или особенности строения опухоли, связанные с внутриопухолевой морфологической гетерогенностью [Zavyalova M., et al., 2011, Завьялова М.В., и др., 2008], или же определяться хромосомными аберрациями, которые мы изучили в следующих разделах. Трудно объяснить, каким образом изменение экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении НАХТ связано с гематогенным метастазированием. Возможно, стойкое повышение экспрессии АВС-транспортеров в остаточной после НАХТ опухоли является всего лишь маркером такого же стойкого повышения экспрессии генов АВС в клетках микрометастазов, в результате чего последние оказываются малочувствительными к адъювантной химиотерапии, призванной подавлять очаги микрометастазирования [Загрекова Е.И., и микрометастатической болезни [Caudle A.S., et al., 2010, Precht L.M., et al., 2010].

Таким образом, в результате исследования был установлен новый информативный прогностический фактор – изменение экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы, который может быть определен при проведении НАХТ. Повышение экспрессии генов ABCB1, ABCC2 и ABCG1 в процессе химиотерапии является неблагоприятным прогностическим признаком, а снижение экспрессии этих генов – благоприятным прогностическим признаком. Новый потенциальный прогностический фактор не зависит от стандартных клинико-патологических факторов прогноза (лимфогенного метастазирования, размера опухоли молочной железы, рецепторного статуса, молекулярных подтипов, гистологической формы роста опухоли и др.) и может существенно повысить эффективность прогнозирования исхода РМЖ.

В параграфе 3.2 было продемонстрировано, что в клинической ситуации эффективность НАХТ рака молочной железы связана с изменением экспрессии АВСтранспортеров в опухоли в процессе НАХТ, а не с исходным уровнем экспрессии генов АВС до лечения. Уменьшение экспрессии пяти основных ATP-Binding Cassette – ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 в опухоли молочной железы после проведения НАХТ по сравнению с биопсийными образцами до лечения сочеталось с объективным ответом на НАХТ. Повышение экспрессии этих генов было связано с отсутствием непосредственного эффекта НАХТ. У большинства пациентов наблюдается однонаправленное изменение экспрессии пяти основных АВС-транспортеров в процессе НАХТ в строгом соответствии с ее эффектом, т.е. снижение при хорошем ответе на НАХТ и повышение при его отсутствии. Это явление было названо нами градиентным феноменом. У четверти пациентов не наблюдалось однонаправленного изменения экспрессии АВС-транспортеров (оно было разнонаправленным) в соответствии с эффектом НАХТ – градиентный феномен отсутствовал. Поскольку мы показали, что снижение экспрессии генов МЛУ при проведении НАХТ является благоприяным прогностическим фактором, а повышение экспрессии – неблагоприятным фактором. В этой связи правомочен вопрос, как градиентный феномен связан с прогрессией РМЖ.

В данном разделе проведено исследование связи наличия/отсутствия градиентного феномена, который наблюдается у больных раком молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии, с безметастатической выживаемостью. Проводилось сравнение уровня экспрессии генов ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 до лечения и после НАХТ, и определялось направление изменения их экспрессии. Отмечалось повышение опухолевой экспрессии генов МЛУ в процессе НАХТ (уровень до лечения был меньше, чем после НАХТ), или снижение экспрессии генов АВС. Если направление экспрессии всех 5-ти или 4-х генов совпадало с эффектом НАХТ (при повышении экспрессии – отсутствие клинического эффекта НАХТ, при снижении экспрессии – частичная регрессия), то у больного констатировали наличие градиентного феномена.

Таким образом, градиентный феномен можно определить как однонаправленное изменение опухолевой экспрессии генов ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 в процессе НАХТ в строгом соответствии с эффектом химиотерапии. Градиентный феномен наблюдался у 80 (75%) из 106 обследованных больных. Если изменение экспрессии генов МЛУ в процессе НАХТ было разнонаправленным и изменение хотя бы 2-х и более из 5-ти генов не соответствовало эффекту НАХТ, у таких пациентов констатировали отсутствие градиентного феномена. Градиентный феномен отсутствовал у 26 (25%) больных. В этой связи, все обследованные были поделены на 2 группы: 1 группа – с наличием градиентного феномена (80 пациентов) и 2 группа – с отсутствием градиентного феномена (26 больных). На первом этапе исследований было показано, что группы больных с наличием и отсутствием градиентного феномена не отличались друг от друга по основным клинико-патологическим параметрам (таблица 17). Можно отметить только тенденцию к увеличению частоты встречаемости отрицательного рецепторного статуса (ER- и PR-) в группе больных без градиентного феномена. Также исследуемые группы не различались между собой по среднему уровню экспрессии генов ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 в биопсийном образце опухоли до лечения и операционном материале после НАХТ (данные не представлены). Это дает основания полагать, что наличие/отсутствие градиентного феномена не определяется основными клиникопатологическими параметрами, в том числе и молекулярными подтипами РМЖ и позволяет корректно провести сравнение показателей безметастатической выживаемости в исследуемых группах. На следующем этапе была изучена связь градиентного феномена с показателями безметастатической выживаемости. В общей группе из 106 обследованных пациентов отдаленные метастазы развились у 35 (33%) больных в сроки 3-48 месяцев от даты постановки диагноза. Трехлетняя безметастатическая выживаемость пациентов составила 72%, а пятилетняя – 65%.

Таблица 17 – Клинико-патологические параметры в группах больных РМЖ с наличием и отсутствием градиентного феномена.

Клинико-патологические параметры Градиентный феномен p-value Примечание: p-value – уровень статистической значимости различий по двустороннему критерию Фишера.

На рисунке 15А представлены кривые безметастатической выживаемости у больных с наличием и отсутствием градиентного феномена. При наличии градиентного феномена пятилетняя безметастатическая выживаемость составила 73% против 39% у больных без градиентного феномена (log-rank test p=0,0018). Частота метастазирования составила: 25% и 58% соответственно (р = 0,0021 по критерию Фишера). Это позволяет рассматривать наличие градиентного феномена у пациентов в качестве благоприятного прогностического фактора. При отсутствии градиентного феномена относительный риск развития гематогенных метастазов составляет RR = 1,77(95%CI 1,11-2,83),(р = 0,005).

Безметастатическая выживаемость Безметастатическая выживаемость Рисунок 15 – Безметастатическая выживаемость больных РМЖ в зависимости от наличия/отсутствия градиентного феномена. А – общая группа, Б –только больные с размером опухоли Т2, В – Только больные с лимфогенным метастазированием, Г – только больные с люминальным раком.

Статистический анализ: p-value –вычислялся по log-rank тесту;

успешно работает и позволяет дифференцировать больных по исходу в таких (RR = 2,32(95%CI 1,19-4,52), р = 0,001), пациенты с лимфогенным метастазированием (рисунок 15В) (RR = 2,45(95%CI 1,12-5,36), р = 0,01) и больные с люминальным раком (рисунок 15Г) (RR = 1,74(95%CI 0,90-3,38), р = 0,03). Таким образом, градиентный феномен имеет высокозначимую связь с развитием метастатической болезни при раке молочной железы.

при проведении НАХТ, является маркером (также как и повышение экспрессии АВСтранспортеров в опухоли при проведении НАХТ является маркером процесса формирования МЛУ), показывающим наличие в опухолевых клетках сбалансированной системы генной регуляции, поэтому не случайна однонаправленность изменений экспрессии изученных генов МЛУ в опухоли при лечении в строгом соответствии с эффектом НАХТ, характерная для градиентного феномена. Учитывая, что все изученные АВС-транспортеры локализованы в разных хромосомах (АВСВ1 – 7q21.12; ABCC1 – 16p13.11; ABCC2 – 10q24.2; ABCG1 – 21q22.3; ABCG2 – 4q22.1 http://www.genecards.org/), они не являются сцепленными. Мы полагаем, что он показывает сохранность в опухолевых клетках баланса многих систем жизнеобеспечения, реактивности и гибели.

Отсутствие градиентного феномена является маркером серьезных нарушений в реакции клеток и в системе генной регуляции (дизрегуляция и дисбаланс) опухолевых клеток, показывая их высокий агрессивный потенциал. В отсутствии градиентного феномена при НАХТ могут играть роль такие нарушения процесса апоптоза, индуцируемого лекарственными средствами, как неадекватность ответа на химиопрепараты вплоть до стимуляции пролиферации вместо апоптоза. Возможны нарушения в трансдукции сигнала вплоть до реверсии реактивности клеточных рецепторов: адгезии (кадхеринов, интегринов, катенинов), рецепторов факторов роста, frizzled рецепторов и др. [Gillet J.P., et al., 2012]. Высокая внутриопухолевая гетерогенность, свойственная РМЖ, с большим числом клонов, несущих разные первичные и вторичные драйверные мутации и мутации «пассажиры» [Bhatia S., et al., 2012], может вносить вклад в формирование градиентного феномена. Например, драйверные мутации гена-супрессора опухолевого роста ТР53 могут приводить к инактивации или парадоксальной реализации (активации вместо ингибирования и наоборот) многих клеточных функций, таких как апоптоз, репарация, регуляции экспрессии множества генов, в том числе и генов АВС [Cherdyntseva N., et al., 2010, Johnson R.A., et al., 2001, Litviakov N.V., et al., 2010, Sampath J., et al., 2001, Чумаков П., 2007]. При этом интересно, что частота мутаций ТР53 при РМЖ составляет 25% [Olivier M., et al., 2010], и это совпадает с частотой отсутствия у больных градиентного феномена (25%). Механизмы, которые определяют наличие/отсутствие градиентного феномена, его значение для клеточной регуляции, требуют дальнейшего тщательного исследования, актуальность которого обусловлена прогностической значимостью этого феномена.

Заключение к 3 главе Исследование связи экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы с основными клинико-морфологическими параметрами показало, что связь экспрессии генов АВС с клиническим параметрами носит редкий и случайный характер, и такие ассоциации, обусловлены большим количеством сравниваемых параметров. Из всех клинических параметров рака молочной железы значимая связь экспрессии 6 из 8 АВСтранспортеров в опухоли молочной железы после НАХТ установлена с размером первичной опухоли. Далее была изучено значение экспрессии АВС-транспортеров в реализации непосредственного эффекта химиотерапии и безметастатической выживаемости пациентов.

Средние уровни экспрессии практически всех изученных генов до лечения не различались у пациентов с объективным клиническим ответом на НАХТ и отсутствием ответа, т.е. предсуществующая МЛУ не играет существенной роли в реализации эффекта НАХТ. Это хорошо согласуется с данными клинических исследований многих авторов, которые также не могли установить ясной связи начального уровня экспрессии белков и генов АВС-транспортеров и эффекта неоадъювантной химиотерапии. Из всех АВСтранспортеров, только уровень экспрессии гена АВСВ3 в опухоли до лечения различался у больных с объективным ответом и отсутствием ответа на НАХТ и был статистически значимо выше у больных с объективным клиническим ответом.

Уровень экспрессии генов АВСВ1, АВСС1, АВСС2, АВСС5, ABCG1 и ABCG2 в опухоли после проведения НАХТ статистически значимо различался в группах с объективным ответом и отсутствием ответа на лечения. В группе с объективным ответом экспрессия данных генов значительно выше, чем у больных со стабилизацией или прогрессированием. Эти данные показали, что изначально, у больных с объективным ответом и отсутствием ответа экспрессия АВС-транспортеров до лечения не различается, но после проведения НАХТ группы расходятся по уровню экспрессии генов в операционном материале опухоли после НАХТ. У ответивших пациентов экспрессия низкая, а у не ответивших больных – экспрессия высокая. По сути, нами впервые было показано, что происходит разнонаправленное изменение экспрессии генов АВСтранспортеров в процессе НАХТ. У больных с объективным ответом на НАХТ наблюдается снижение экспрессии генов АВС-транспортеров, а у больных с отсутствием ответа происходит повышение экспрессии генов АВС. Эффект химиотерапии связан не с уровнем экспрессии гена АВС, а с изменением их экспрессии в опухолевой ткани в процессе лечения. Это подтверждает и анализ связи частоты снижения и повышения экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХ с эффектом химиотерапии. У пациенток с объективным клиническим ответом в опухоли наблюдается снижение экспрессии генов МЛУ в опухоли в 61-84% случаев, а у пациенток с отсутствием ответа в процессе проведения химиотерапии наблюдается повышение уровня экспрессии этих генов в опухоли в 63-88 % случаев (0,02 < p < 1,1х10-12).

Таким образом, нами был впервые установлен и подтвержден несколькими видами анализов факт связи с эффективностью НАХТ не уровня, а изменения экспрессии генов АВС: ABCB1, ABCC1, ABCC2, MVP, ABCG1 и ABCG2 в опухоли в процессе лечения.

Повышение экспрессии АВС-транспортеров в опухоли в процессе химиотерапии обусловливает отсутствие ответа на химиотерапию, а снижение экспрессии АВСтранспортеров – хороший ответ на НАХТ. Показано индивидуальное повышение или снижение экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении химиотерапии и связи с этими изменениями экспрессии ответа на химиотерапию, т.е.

наши исследования четко показали, что в реализации эффекта НАХТ играет роль не предсуществующая, а адаптивная (изменяемая в процессе лечения) множественная лекарственная устойчивость. С практической точки зрения наши данные обосновывают новую стратегию управления множественной лекарственной устойчивостью через регулирование экспрессии АВС-транспортеров.

Высокий уровень экспрессии АВС-транспортеров и их продуктов в опухолевых клетках не обеспечивает устойчивость к химиопрепаратам и не имеет прогностическую значимость. Из числа всех исследованных генов только уровень экспрессии гена ABCB3 в безметастатической выживаемостью. Впервые было показано, что изменение экспрессии генов АВС-транспортеров при воздействии химиопрепаратов, в отличие от исходного уровня экспрессии, имеет прогностическую значимость. Повышение экспрессии ABCB1, ABCC2 и ABCG1 в процессе НАХТ является неблагоприятным прогностическим признаком, а снижение экспрессии этих генов в опухолевой ткани имеет благоприятную прогностическую значимость. Таким образом, в результате исследования был впервые установлен новый информативный прогностический фактор – изменение экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы, который может быть определен при проведении НАХТ. Повышение экспрессии генов ABCB1, ABCC2 и ABCG1 в процессе химиотерапии является неблагоприятным прогностическим признаком, а снижение экспрессии этих генов – благоприятным прогностическим признаком. Из прогностических факторов, которые могут использоваться после НАХТ, в настоящее время используются только оценка эффекта и лекарственный патоморфоз (при полной морфологической регрессии (не более 14% случаев) благоприятный исход). Однако, большинство опухолей в процессе НАХТ конвенциональными препаратами не достигают полной регрессии, поэтому применение этого прогностического фактора сильно ограничено. Мы установили новый прогностический фактор, который как раз работает у больных с частичной регрессией и стабилизацией процесса. Новый прогностический фактор не зависит от стандартных клинико-патологических факторов прогноза (лимфогенного метастазирования, размера опухоли молочной железы, рецепторного статуса, молекулярных подтипов, гистологической формы роста опухоли и др.), что значительно расширяет диапазон его возможного использования, которое может существенно повысить эффективность прогнозирования исхода РМЖ.

В последнем разделе главы 3 проводилось сравнение уровня экспрессии генов ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 до лечения и после НАХТ, и определялось направление изменения их экспрессии. В результате впервые у больных был обнаружен градиентный феномен, который можно определить как однонаправленное изменение опухолевой экспрессии генов ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 в процессе НАХТ в строгом соответствии с эффектом химиотерапии. Если изменение экспрессии всех 5-ти или 4-х генов совпадало с эффектом НАХТ (при повышении экспрессии – отсутствие клинического эффекта НАХТ, при снижении экспрессии – частичная регрессия), то у больного констатировали наличие градиентного феномена. Если изменение экспрессии генов МЛУ в процессе НАХТ было разнонаправленным и изменение хотя бы 2-х и более из 5-ти генов не соответствовало эффекту НАХТ, у таких пациентов констатировали отсутствие градиентного феномена. Было отмечено, что градиентный феномен наблюдался у 80 (75%) из 106 обследованных больных и отсутствовал у 26 (25%) больных. Градиентный феномен показал существенную клиническую значимость. Было установлено, что при наличии градиентного феномена пятилетняя безметастатическая выживаемость составила 73% против 39% у больных без градиентного феномена (log-rank test p=0,0018). Это позволяет рассматривать наличие градиентного феномена у пациентов в качестве благоприятного прогностического фактора. Таким образом, градиентный феномен имеет высокозначимую связь с развитием метастатической болезни при раке молочной железы. В результате этого исследования был впервые установлен совершенно новый прогностический фактор, не зависящий от основных клинико-патологических факторов прогноза. Предполагается, что градиентный феномен является маркером наличия или отсутствия в опухолевых клетках сбалансированной системы генной регуляции и реактивности. Наличие/отсутствие градиентного феномена – это еще один новый прогностический фактор, который позволяет прогнозировать исход РМЖ на этапах лечения после предоперационной химиотерапии.

Подытоживая 3 главу диссертационной работы, хочется сказать, что для понимания механизмов формирования адаптивной множественной лекарственной устойчивости необходимо понять, почему при использовании одной и той же схемы лечения у одних больных происходит снижение экспрессии генов АВС в опухоли и это сочетается с хорошим эффектом, а у других происходит повышение экспрессии генов АВС и это обусловливает плохой ответ? Ответу на этот вопрос будет посвящена 4 глава настоящей работы.

ГЛАВА 4 РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ АВС-ТРАНСПОРТЕРОВ В ОПУХОЛИ

МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Повышение и снижение экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении НАХТ и связь этих изменений экспрессии генов АВС с эффективностью НАХТ и прогнозом – это тот феномен, который был впервые установлен в наших исследованиях. При этом, повышение экспрессии генов АВС-транспортеров в процессе химиотерапии является универсальным механизмом, характерным для всех основных генов АВС, который определяет формирование адаптивной МЛУ и резистентность опухоли молочной железы к химиопрепаратам. Повышение экспрессии генов АВС в ответ на химиопрепараты является нормальной реакцией клеток (в том числе и опухолевых) в ответ на химиопрепараты, исходя из физиологической функции АВСтранспортеров, и потому феномен повышения экспрессии этих генов в процессе химиотерапии широко известен в литературе и во многом понятны механизмы активации системы АВС-транспортеров [Chen K.G., et al., 2012]. Прежде всего, увеличение экспрессии генов МЛУ после НАХТ связано с индукцией экспрессии этих генов в опухолевых клетках. Практически все известные механизмы направлены на индукцию экспрессии АВС-транспортеров в ответ на многие внешние воздействия. Большинство проводящих путей Raf/MEK/ERK, MAPK и JNK индуцируют экспрессию АВСтранспортеров лекарственных средств [Sui H., et al., 2012, Weinstein-Oppenheimer C.R., et al., 2001]. Должно быть принято во внимание и то, что во многих случаях экспрессия генов АВС-транспортеров обратно пропорциональна уровню экспрессии нескольких микроРНК. В свою очередь, ингибиция активности микроРНК может быть модулирована химиотерапевтическими препаратами через повреждение ДНК, деметилирование ДНК и диацетилирования гистонов, которые сочетаются с быстрым изменением уровней миРНК [Hu H., et al., 2011, Iorio M.V., et al., 2012].

Феномен снижения экспрессии в образцах после НАХТ относительно биопсийных образцов до лечения и его клиническая значимость впервые был установлен в наших исследованиях. Только в одной клинической работе мы находим прямое подтверждение феномена снижения [Kim B., et al., 2013, Linn S.C., et al., 1997]. В опытах in vitro на опухолевых линиях не было показано снижения экспрессии генов МЛУ под действием химиопрепаратов, хотя проводились исследования механизмов регуляции экспрессии генов АВС. Отсюда вытекают важные логические предположения, которые будут подробно рассмотрены в этой главе: либо снижение экспрессии в ответ на химиопрепараты является следствием несовершенства методических подходов измерения и их интерпретации, в противном случае следует полагать, что снижение проявляется только в клинических условиях, а значит обусловлено индивидуальными факторами опухоли, микроокружения и является атрибутом аберрантной опухоли in vivo.

К таким факторам могут относиться эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов АВС, в частности, метилирование промоторных регионов. Известный факт – продукт гена-супрессора опухолевого роста p53 дикого типа down-регулирует транскрипцию АВС-транспортеров [Johnson R.A., et al., 2001, Thottassery J.V., et al., 1997], в то время как мутантный p53 активирует экспрессию генов АВС [Sampath J., et al., 2001].

Морфологическая гетерогенность в опухоли молочной железы, которая проявляется как наличие пяти различных морфологических типов инфильтративного компонента (морфологических структур), отражающих архитектурное устройство опухоли, имеет влияние эффективность НАХТ [Завьялова М.В., и др., 2008] и морфологические структуры могут отличаться по генной экспрессии АВС-транспортеров. Аберрации, изобилующие в солидных опухолях, могут отражаться на регуляции экспрессии АВСтранспортеров в системе in vivo, наконец, клональная эволюция опухоли, определяемая изменением опухолевых клонов в процессе НАХТ и снижением количества опухолевых клеток [Greaves M., et al., 2012], экспрессирующих гены АВС, вследствие некроза клеток во время химиотерапии, несомненно, вносит свой вклад. Кроме того, снижение экспрессии может быть связано с тем, что операция выполнялась через 4-5 недель после последнего курса НАХТ и экспрессия АВС-транспортеров в пост-НАХТ образцах опухоли могла вернуться нормальному уровню естественным образом.

Фактически 4 глава будет посвящена решению проблемы поиска путей и факторов регуляции экспрессии АВС-транспортеров, которые объясняют вариабельность индивидуального ответа опухоли больного на НАХТ, поскольку, как было установлено в 3 главе, эту вариабельность определяет изменение экспрессии генов АВС в процессе химиотерапии. Прежде всего, будут представлены доказательства существования феномена снижения экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ, одного из главных «маркеров» ответа опухоли на химиотерапию.

4.1 Доказательство феномена снижения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении НАХТ Мы задались целью доказать действительное существование феномена снижения экспрессии АВС-транспортеров. Прежде всего, полностью исключается возможность технической ошибки при проведении ПЦР в режиме реального времени, поскольку было проведено множество отработочных экспериментов и все исследования проводились в нескольких, в том числе и в независимых повторах. Кроме того, ПЦР в режиме реального времени считается «золотым» стандартом для оценки экспрессионной активности генов АВС-транспортеров [Gillet J.P., et al., 2011].