«В.Н. Казин, Г.А. Урванцева ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ЭКОЛОГИИ И БИОЛОГИИ Учебное пособие Ярославль 2002 ББК Ес25я73 К 14 УДК 543.87 Казин В.Н., Урванцева Г.А. Физико-химические методы исследования в ...»

Итак, в методе газожидкостной хроматографии широко варьируются температура, скорость газа-носителя, параметры хроматографической колонки, жидкая фаза, тип детектора. Это создает совершенно уникальные условия для решения различных аналитических задач.

9.3. Качественный и количественный анализ Что такое хроматограмма? Каждому компоненту смеси на хроматограмме соответствует отдельный пик (рис. 9.2.). Время от начала хроматограммы до появления вершины пика называется временем удерживания. При строгом воспроизведении всех условий время удерживания является такой же физико-химической характеристикой вещества, как его плотность, показатель преломления и т.д.

Определение качественного состава смеси проводится путем сопоставления времени удерживания данного компонента и эталона-вещества известной структуры. Совпадение времени удерживания эталона и определяемого компонента может указывать на их идентичность. Эталон чаще всего добавляется в исследуемую смесь (метод метки). При этом число пиков на хроматограмме не должно изменяться, а интенсивность пика одного из компонентов должна увеличиваться.

Определение количественного состава смеси основано на допущении того, что интенсивность пика каждого компонента пропорциональна его содержанию в смеси. В качестве меры интенсивности принимается площадь пиков S. Обычно для этого умножают его высоту (h) на ширину (w), измереную на полувысоте пика: S=hw. Анализ данных в современных хроматографах автоматизирован. Как правило, полученные данные обрабатываются ЭВМ, сопоставляются с базами данных, подвергаются статистической обработке.

Рис. 9.2. Хроматограмма трехкомпонентной смеси:

0 - момент введения пробы в прибор; 1, 2, 3 - хроматографические пики компонентов смеси; tr1, tr2, tr3 –время удерживания компонентов Основными в количественной хроматографии являются методы:

нормировки, нормировки с калибровочными коэффициентами, внутренней стандартизации и абсолютной калибровки.

При использовании метода нормировки принимают сумму высот всех пиков или сумму их площадей за 100%. Тогда отношение высоты отдельного пика к сумме высот или отношение площади одного пика к сумме площадей, умноженное на 100, будет характеризовать массовую долю (%) компонента в смеси. Вполне понятно, что такой метод предполагает существование одинаковой зависимости величины измеряемого параметра от концентрации для всех компонентов смеси.

В методе нормировки с калибровочными коэффициентами за 100% принимается сумма параметров пиков с учетом чувствительности детектора. Различие в чувствительности детектора учитывается с помощью поправочных коэффициентов для каждого компонента. Один из преобладающих компонентов смеси считают сравнительным и поправочный коэффициент для него принимают равным единице. Калибровочные коэффициенты (К) рассчитывают по формуле:

где Sст - площадь пика стандартного вещества; Si - площадь пика определяемого вещества.

Концентрация компонентов в анализируемой смеси рассчитывается по формуле:

Наиболее точным является метод абсолютной калибровки. В этом методе экспериментально определяют зависимость высоты или площади пика от концентрации вещества и строят градуировочные графики. Далее определяют те же характеристики пиков в анализируемой смеси и по градуировочному графику находят концентрацию анализируемого вещества. Этот простой и точный метод является основным методом определения микропримесей. Кроме того, метод не требует разделения всех компонентов смеси, а ограничивается лишь теми, определение которых необходимо в данном конкретном случае.

Метод внутреннего стандарта основан на введении в анализируемую смесь точно известного количества стандартного вещества. В качестве стандартного выбирают вещество, близкое по физико-химическим свойствам к компонентам смеси. После хроматографирования измеряют параметры пиков анализируемого компонента и стандартного вещества.

Если стандартное вещество не входит в состав анализируемой смеси, массовую долю компонента (%) рассчитывают по формуле где Si и Sст - площади пиков анализируемого компонента и стандарта соответственно; r - отношение массы внутреннего стандарта к массе пробы 9.4. Применение газовой хроматографии Газовая хроматография находит применение в нефтяной, металлургической, химической, фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности. С повышением экологических требований к среде обитания, продуктам, лекарствам резко возросла роль газовой хроматографии как аналитического метода анализа. Так, этот метод широко используется в настоящее время в анализе органических суперэкотоксикантов. Как отмечалось выше, с помощью метода газовой хроматографии определяют хлор-, азот- и фосфорорганические пестициды, полихлорированные и полибромированные бифенилы, нитроароматические соединения и многие другие вещества.

Метод хромато-масс-спектрометрии позволяет определять полихлорированные дибензо-п-диоксины, полихлорированные дибензофураны, полихлорированные бифенилы и многие другие высокотоксичные ксенобиотики в природных объектах и биопробах. Кроме того, газовая хроматография используется во многих областях медицины, в гигиене и экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах. Этот метод используют также в токсикологии и судебной медицине для диагностики отравлений техническими жидкостями (хлорпроизводными углеводородами, алкоголем и его суррогатами), в фармакологии и фармации для контроля качества препаратов, исследования метаболизма лекарственных средств.

Применение газовой хроматографии в биохимических целях сравнительно долго не получало должной оценки. Считалось, что биологические объекты недостаточно летучи и мало устойчивы к различным физико-химическим воздействиям, применяемым в газохроматографическом анализе. Успехи в разработке методов расщепления липидов, углеводов и белков до более простых компонентов и превращение их в летучие соединения открыли широкую дорогу для применения метода в биохимическом анализе. Особенно велики успехи в исследовании липидов, в особенности жирных кислот. Возможность определения индивидуального состава жирных кислот тех или иных липидов является мощным инструментом в познании структуры и функции биологических мембран, процессов внутриклеточного метаболизма. Газохроматографическое определение спектра карбоновых кислот цикла Кребса внесло большой вклад в понимание процессов метаболизма при различных патологических состояниях. Газовая хроматография используется в медицинской микробиологии и диагностике врожденных нарушений метаболизма. Перспективой применения данного метода является концепция метаболических профилей - систем интегральной оценки метаболизма.

С унификацией основных техник газовой хроматографии, ростом чувствительности детекторов станет возможно повседневное использование метаболических профилей в целях практической диагностики.

Работа 1. Анализ многокомпонентной смеси углеводородов методом газо-жидкостной хроматографии Оборудование и реактивы: Хроматограф; медицинские шприцы на 1см3; колбы с притертыми пробками объемом 10 мл; толуол; ксилол;

ацетон; изопропилбензол; циклогексан; этилацетат.

Задание 1. Анализ смеси компонентов методом нормировки с калибровочными коэффициентами Выполнение работы Из компонентов, входящих в состав анализируемой пробы, готовят искусственные (калибровочные) смеси известного процентного содержания (например, смешивают толуол, ксилол, этилацетат и изопропилбензол в объемных соотношениях 1:1:1:1 и т.д.). Смеси составляют в колбочках с притертыми пробками с помощью пипеток, набирая жидкости грушей. Для каждой жидкости необходимо иметь специальную пипетку. Нельзя загрязнять чистые вещества, используя одну пипетку для нескольких жидкостей без тщательной просушки. Анализируемую смесь получают у лаборанта.

Для определения времени удерживания компонентов, входящих в состав смеси, необходимо сначала записать хроматограммы чистых компонентов. Чистые компоненты, искусственные смеси и анализируемую пробу вводят в испаритель хроматографа последовательно в количестве 0,05 мл. Перед каждым отбором проб шприц следует просушить для удаления следов предыдущей пробы. Следующую пробу вводят в испаритель только после записи всех пиков предыдущей пробы. Если проба введена неудачно (когда проба мала, пики получаются низкими, велика - тумблер зашкаливает), анализ пробы следует повторить после выхода всех компонентов. На хроматограммах нужно сделать соответствующие пометки.

Качественый анализ основан на сравнении времени удерживания известных чистых компонентов с временем удерживания веществ, входящих в состав анализируемой пробы.

Количественный анализ. Содержание отдельных компонентов рассчитывают по площадям полученных пиков. Замер площади отдельного пика осуществляется следующим образом: измеряют высоту h от базовой (нулевой) линии до вершины пика, делят ее пополам и на расстоянии, равном половине высоты, замеряют отрезок - отрезок прямой, параллельный нулевой линии на высоте 1/2 h. Отрезок замеряют или по середине ширины линии, вычерченной пером самописца или от внешней стороны одной линии до внутренней стороны другой. Площадь хроматографического пика вычисляют как площадь треугольника:

S=(h/2) (рис.9.3.).

Рис. 9.3. Параметры хроматографического пика Концентрациz компонентов в анализируемой смеси рассчитывается методом нормировки с калибровочными коэффициентами по формуле:

% = (SiKi/SiKi)100.

Примечание: данный метод расчета процентного содержания компонентов в смеси может быть использован только в том случае, если все компоненты смеси дают хорошо записанные хроматографические пики и имеют различные времена удерживания.

Задание 2. Анализ смеси методом внутреннего стандарта Преимущество метода внутреннего стандарта заключается в том, что в отличие от предыдущего метода нет необходимости идентифицировать все пики хроматограмм: достаточно определить необходимые пики. Метод основан на добавлении в анализируемую смесь известного количества определенного вещества, называемого внутренним стандартом. При этом стандарт не должен реагировать с компонентами смеси.

Например, при анализе смеси гомологов стандарт должен быть членом этого гомологического ряда. Время удерживания стандарта должно быть равно среднему времени удерживания компонентов смеси.

Выполнение работы После хроматографирования искусственных смесей измеряют параметры пиков анализируемых компонентов и стандартного вещества и строят калибровочные кривые. По оси ординат откладывают отношение площадей пиков определяемого вещества и внутреннего стандарта, а по оси абсцисс - отношение объемных или весовых процентных содержаний обоих веществ (рис. 9.4.).

Рис. 9.4. Калибровочные кривые для определения состава смеси Затем получают у лаборанта анализируемую смесь, содержащую компоненты, для которых были построены калибровочные кривые. Добавляют к этой пробе определенное количество внутреннего стандарта (например, толуола) в таком количестве, чтобы концентрация стандарта соответствовала среднему ее значению в искусственных смесях. Хроматографируют анализируемую смесь и определяют отношение площадей компонентов Si/Sст для всех компонентов.

Пользуясь калибровочными кривыми (рис. 9.4.), находят отношение (ci/cст) для всех компонентов и рассчитывают их концентрацию. Если идентифицируются и определяются все компоненты смеси, то можно проверить полученный результат: сумма всех концентраций должна составлять 100 %.

1. В чем состоят теоретические основы газо-жидкостной хроматографии?

2. Принцип выбора газа-носителя, жидкой фазы, твердого носителя.

3. Неполярные и полярные жидкие фазы.

4. Качественный анализ.

5. Способы количественного обсчета хроматограмм.

6. Зависимость времени удерживания от различных факторов.

7. Принципиальная схема хроматографической установки.

8. Каков принцип работы дифференциальных детекторов?

9. В чем сущность капиллярной газо-жидкостной хроматографии?

10. Каковы области применения газовой хроматографии?

1. Аранович Г.А., Коршунов Ю.Н., Ляликов Ю.С. Справочник по физико-химическим методам исследования окружающей среды. Л., 1979. 647 с.

2. Яворовская С.Ф. Газовая хроматография - метод определения вредных веществ в воздухе и в биологических средах. М.: Медицина, 1972. С. 5-32.

3. Гольберт К.А., Вигдергауз М.С. Курс газовой хроматографии. М.: Химия, 1974. С. 160-202.

4. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. М.: Медицина, 1978. С. 15-85.

5. Зеленин К.Н. Газовая хроматография в медицине // Соросовский образовательный журнал. 1996. № 11. С. 20-25.

6. Столяров Б.В., Савинов И.М., Витенберг А.Г. Карцова А.А. Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: Изд-во СПбГУ, 1998. 610 с.

7. Васильев В.П. Аналитическая химия: В 2-х ч. Ч. 2. Физико-химические методы анализа: Учеб. для химико-технол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.

384 с.

8. Васильев В.П. Аналитическая химия: В 2 ч. Ч. 2. Физико-химические методы анализа: Учеб. для химико-технол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.

С. 327-328.

9. Практикум по физико-химическим методам анализа / Под ред.

О.М. Петрухина. М.: Химия, 1987. 248 с.

10. Вольтамперометия органических и неорганических соединений / Под ред. П.К. Аганесяна, С.И. Жданова. М.: Наука, 1985. 248 с.

11. Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов В.С. Физическая химия. М.:

Высш. шк., 1990. 416 с.

12. Алесковский В.Б., Бардин В.В., Булатов М.И. Физико-химические методы анализа. Практическое руководство. Л.: Химия, 1988. 376 с.

13. Ольшанова К.М. Практикум по хроматографическому методу анализа. М.: Высш. шк., 1970. 312 с.

7. Галюс З. Теоретические основы электро-химического анализа. М.:

Мир, 1974.

14. Каплан Б.Я., Пац Р.Г., Салихджанова Р.М.-Ф. Вольтамперометрия переменного тока. М.: Химия, 1985.

15. Жарский И.М., Новиков Г.И. Физические методы исследования в неорганической химии: Учеб. пособие для вузов. М.: Высш. шк., 1988.

ВВЕДЕНИЕ

СПЕКТРАЛЬНЫЕ (ОПТИЧЕСКИЕ) МЕТОДЫ АНАЛИЗА................ ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ............... ГЛАВА 1. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ

1.1. ЗАКОНЫ ПОГЛОЩЕНИЯ СВЕТА

1.2. ЭЛЕКТРОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ (УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ И ВИДИМАЯ

ОБЛАСТИ)

1.2.1. Механизм поглощения видимых и ультрафиолетовых лучей... 1.2.2. Спектры поглощения

1.2.3. Устройство приборов

1.2.4. Практическое применение

1.2.5. Практические работы

Работа 1. Определение хрома дифенилкарбазидным методом..... Работа 2. Определение концентрации аминокислот спектрофотометрическим методом

Контрольные вопросы

Литература

1.3. ИНФРАКРАСНАЯ (КОЛЕБАТЕЛЬНАЯ) СПЕКТРОСКОПИЯ

1.3.1. Элементарная теория колебательных спектров

1.3.2. Спектры поглощения

1.3.3. Возможности метода и практические рекомендации........... 1.3.4. Устройство приборов

1.3.5. Практические работы

Работа 1. Определение строения ароматических соединений по инфракрасным спектрам

Работа 2. Определение концентрации циклогексанона в циклогексане

Контрольные вопросы

Литература

ГЛАВА 2. ЭМИССИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ

2.1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭМИССИОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

И ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА

2.2. ФОТОМЕТРИЯ ПЛАМЕНИ (ПЛАМЕННАЯ ЭМИССИОННАЯ

СПЕКТРОСКОПИЯ)

2.3. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1: Определение щелочных и щелочноземельных металлов методом пламенной фотометрии

Контрольные вопросы

Литература

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

ГЛАВА 3. КОНДУКТОМЕТРИЯ

3.1. ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТЬ РАСТВОРОВ ЭЛЕКТРОЛИТОВ

3.1.1. Удельная электропроводность

3.1.2. Эквивалентная электропроводность

3.2. ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТЬ ПРИРОДНЫХ ВОД

3.3. КОНДУКТОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ

3.4. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Анализ кислот и отдельных компонентов их смеси методом кондуктометрического титрования

Работа 2. Определение удельной электропроводности воды......... Контрольные вопросы

Литература

ГЛАВА 4. ПОТЕНЦИОМЕТРИЯ

4.1. ЭЛЕКТРОДНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ

4.2. ЭЛЕКТРОДЫ СРАВНЕНИЯ

4.3. ДИФФУЗИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ

4.4. ПРЯМАЯ ПОТЕНЦИОМЕТРИЯ

4.4.1. Водородный показатель и потенциометрический метод определения рН

4.4.2. Ионоселективные электроды

4.5. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ

4.6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА..... 4.7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Анализ кислот и отдельных компонентов их смеси методом потенциометрического титрования

Работа 2. Определение нитрат-ионов в техническом образце (фторид-ионов и хлорид-ионов)

Контрольные вопросы

Литература

ГЛАВА 5. ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЯ

5.1. КРИВАЯ ТОК-ПОТЕНЦИАЛ

5.2. ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ ФОН

5.3. ДИФФУЗИОННЫЙ ТОК

5.4. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ

АНАЛИЗ

5.5. КАЧЕСТВЕННЫЙ ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

5.6. ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКАЯ УСТАНОВКА

5.7. ХРОНОАМПЕРОМЕТРИЯ С ЛИНЕЙНОЙ РАЗВЕРТКОЙ ПОТЕНЦИАЛА.......... 5.8. ИНВЕРСИОННАЯ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЯ

5.9. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

5.10. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Обнаружение ионов Cu2+, Cd2+, Zn2+, Mn2+

Работа 2. Обнаружение ионов Pb2+ и Tl+

Контрольные вопросы

Литература

ГЛАВА 6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

6.1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

6.2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА БУМАГЕ И АЦЕТАТЕ

ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

6.3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ГЕЛЯХ

6.4. ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

6.5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

6.6. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Фракционирование белков методом электрофореза в полиакриламидном геле

Контрольные вопросы

Литература

6.7. МЕТОД ЭНЗИМЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ........ 6.8. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Обнаружение амилазы в тканях животного происхождения методом электрофореза в полиакриламидном геле

Контрольные вопросы

Работа 2. Обнаружение арилэстеразы в тканях животного происхождения методом электрофореза в полиакриламидном геле

Контрольные вопросы

Работа 3. Обнаружение кислой фосфатазы методом электрофореза в полиакриламидном геле............. Контрольные вопросы

Литература

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

ГЛАВА 7. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ХРОМАТОГРАФИИ

7.1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ

И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ

ОСНОВЫ

7.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ

МЕТОДОВ

7.3. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИИ

Контрольные вопросы

Литература

ГЛАВА 8. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

8.1. ЖИДКОСТНО-АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

8.1.1. Хроматография на колонке

8.1.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ)

8.1.3. Практические работы

Работа 1. Определение состава смеси аминокислот методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое.......... Работа 2. Определение углеводов методом тонкослойной хроматографии

Контрольные вопросы

Литература

8.2. ЖИДКОСТНО-ЖИДКОСТНАЯ (РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ) ХРОМАТОГРАФИЯ 8.2.1. Теоретические основы метода

8.2.2. Хроматография на бумаге

8.2.3. Практические работы

Работа 1. Количественное определение аминокислот методом на бумаге

Контрольные вопросы

Литература

8.3. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

8.3.1. Теоретические основы метода

Контрольные вопросы

Литература

8.4. ПРОНИКАЮЩАЯ ИЛИ ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОРАФИЯ.................. 8.4.1. Теоретические основы метода

8.4.2. Практические работы

Работа 1. Разделение высоко- и низкомолекулярных веществ методом проникающей хроматографии

Работа 2. Разделение белков методом гель-фильтрации через сефадекс

Контрольные вопросы

Литература

8.5. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ВЭЖХ)..... 8.5.1. Теоретические основы метода

8.5.2. Практические работы

Работа 1. Определение пестицидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Контрольные вопросы

Литература

8.6. ПОНЯТИЕ ОБ АФФИННОЙ ИЛИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Контрольные вопросы

Литература

ГЛАВА 9. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

9.1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА

9.2. АППАРАТУРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ............... 9.3. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

9.4. ПРИМЕНЕНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

9.5. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Анализ многокомпонентной смеси углеводородов методом газо-жидкостной хроматографии

Контрольные вопросы

Литература