«В.Н. Казин, Г.А. Урванцева ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ЭКОЛОГИИ И БИОЛОГИИ Учебное пособие Ярославль 2002 ББК Ес25я73 К 14 УДК 543.87 Казин В.Н., Урванцева Г.А. Физико-химические методы исследования в ...»

где СА - молярная концентрация исследуемого раствора, моль/л; СВ молярная концентрация титранта, моль/л; VВ - объем титранта, соответствующий эквивалентной точке, мл; VA - объем аликвотной (кратной) части раствора, взятый для титрования, мл.

Если требуется определить содержание (г) анализируемого вещества, то используется формула:

где gА - содержание определяемого вещества, г; МР.В. - молярная масса растворенного (анализируемого) вещества, г/моль; VК - объем анализируемого раствора, мл.

Работа 2. Определение удельной электропроводности воды Реактивы. 1. Раствор KCl (х.ч.), С=0,1 моль/л: растворяют 7,456 г KCl в дистиллированной воде и объем доводят в мерной колбе до 1 л.

2. Раствор KCl (С=0,02 моль/л) получают разбавлением предыдущего раствора.

Выполнение работы Электролитическую ячейку ополаскивают 3-4 раза сначала дистиллированной водой, а затем раствором KCl. Наливают в ячейку хлорида калия с концентрацией 0,02 моль/л и измеряют электропроводность раствора (1/R, См). Вычисление константы сосуда производят по формуле:

где - удельная электропроводность (Ом-1см-1) раствора KCl при температуре опыта, R – сопротивление раствора KCl в ячейке (Ом), К – постоянная сосуда (см-1).

Затем электролитическую ячейку снова ополаскивают дистиллированной водой, а затем исследуемой водой (3-4 раза). Определяют сопротивление исследуемой воды, выдержанной в термостате при 250С.

Удельную электропроводность воды рассчитывают по формуле:

где 1/R – электропроводность исследуемой воды.

1. Что называется электропроводностью, какова ее размерность? В чем состоит принцип метода определения электропроводности?

2. Что называется удельной электропроводностью, какова ее размерность? Как зависит удельная электропроводность от концентрации ионов и их подвижности?

3. Что такое постоянная сосуда и какой смысл она имеет?

4. Что называется эквивалентной (молярной) электропроводностью, какова ее размерность? Как зависит эквивалентная электропроводность от концентрации ионов?

5. Как влияет температура на электропроводность? В чем причина зависимости электропроводности от температуры?

6. Почему нельзя проводить измерение электропроводности раствора, если электроды не полностью погружены в жидкость?

7. В чем состоит сущность метода кондуктометрического титрования?

8. От чего зависит ход кривых кондуктометрического титрования?

9. В каких случаях имеет место отклонение кривых от линейного хода?

10. В чем состоит преимущество метода кондуктометрического титрования перед другими объемными методами?

1. Васильев В.П. Аналитическая химия: В 2-х ч. Ч. 2. Физико-химические методы анализа: Учеб. для химико-технол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.

С. 168-188.

2. Практикум по физико-химическим методам анализа / Под. ред.

О.М. Петрухина. М.: Химия, 1987. С. 103-111.

3. Крешков А.П. Основы аналитической химии: В 3-х ч. Ч. 3. Физикохимические (инструментальные) методы анализа. М.: Химия, 1970. С. 72-112.

4. Киреев В.А. Курс физической химии. М.: Химия. 1975. С. 516-550.

Потенциометрия - это метод определения различных физикохимических величин, основанный на измерении электродвижущей силы обратимых гальванических элементов.

где Е – электродвижущая сила (э.д.с.); 1 и 2 – потенциалы электродов исследуемой цепи.

По данным потенциометрических измерений вычисляют константы равновесия, константы диссоциации кислот и оснований, константы устойчивости координационных соединений, произведение растворимости, определяют активность и коэффициент активности электролитов, водородный показатель (pH) и т.д. Если удается провести реакцию в гальваническом элементе и определить его э.д.с., то можно рассчитать значения основных термодинамических функций и характеристик:

где G0 - изменение стандартной молярной свободной энергии; z число электронов, принимающих участие в электродной реакции; F - постоянная Фарадея, равная 96500 Кл/моль; E0 - стандартная э.д.с. гальванического элемента; S0 – изменение стандартной молярной энтропии реакции; T - абсолютная температура, К; H0 - изменение стандартной молярной энтальпии реакции; R - универсальная газовая постоянная; K константа равновесия окислительно-восстановительной реакции, протекающей в элементе.

В настоящее время отсутствуют теоретические и экспериментальные методы определения абсолютных значений потенциалов, соответствующих отдельным электродам. Можно точно определить только э.д.с.

цепи, составленной из данного электрода и стандартного водородного электрода, потенциал которого условно принимают равным нулю.

Потенциометрические методы анализа известны с конца прошлого века, когда Беренд сообщил (1883 г.) о первом потенциометрическом титровании, а Нернст (1889 г.) вывел уравнение, связывающее величину потенциала электрода с активностью и концентрацией веществ, участвующих в электродном процессе:

где - потенциал электрода; 0 - стандартный электродный потенциал, т.е. потенциал данного электрода при активности реагентов, участвующих в электродной реакции, равной единице; ared, aox, Сred, Сox - активности и концентрации соответственно восстановленной и окисленной форм редокс-системы; red, ox - коэффициенты активности.

Коэффициент активности учитывает силы межионного взаимодействия, зависит от ионной силы раствора, а также от степени гидратации ионов и не зависит от химической природы отдельных ионных частиц.

Для бесконечно разбавленных растворов =1; по мере повышения концентрации коэффициент активности сначала уменьшается, а затем возрастает, большей частью оставаясь все же меньше единицы.

Потенциометрические методы анализа подразделяют на прямую потенциометрию (ионометрию) и потенциометрическое титрование.

Методы прямой потенциометрии основаны на прямом применении уравнения Нернста для нахождения активности или концентрации участника электродной реакции по экспериментально измеренной э.д.с. цепи или потенциалу соответствующего электрода. При потенциометрическом титровании точку эквивалентности определяют по резкому изменению (скачку) потенциала индикаторного электрода вблизи точки эквивалентности.

На практике потенциометрия заключается в измерении э.д.с. гальванического элемента, составленного из двух полуэлементов: индикаторного электрода и электрода сравнения. Индикаторным называют электрод, потенциал которого зависит от концентрации (активности) определяемого иона. Потенциал электрода сравнения должен оставаться постоянным независимо от протекания каких-либо реакций в анализируемом растворе.

Электродвижущая сила (Е) исследуемого элемента выражается как разность между потенциалом электрода сравнения (ср) и потенциалом индикаторного электрода (инд):

где д - диффузионный потенциал или потенциал жидкостного соединения.

Электроды сравнения должны обладать устойчивым во времени воспроизводимым потенциалом, не меняющимся при прохождении небольшого тока.

Водородный электрод является основным электродом сравнения.

Его потенциал принимают равным нулю. Это газовый электрод первого рода. Используется в паре с исследуемым электродом для измерения электродного потенциала. Состоит из платиновой пластинки, электролитически покрытой мелко раздробленной чернью (платиновой чернью).

Такая пластинка опускается в раствор, содержащий ионы водорода с активностью аН+ = 1, и непрерывно омывается током чистого водорода с летучестью (f) равной 1. Водород адсорбируется на платиновой черни.

Она является катализатором электродного процесса: ускоряет процесс адсорбции водорода, диссоциации молекул водорода на атомы и ионизации атома водорода с образованием протона и электрона.

Схема водородного электрода: Pt, H2 H+.

Электродная реакция, протекающая на водородном электроде:

Уравнение Нернста для водородного электрода:

так как 0Н2 = 0, aH2 = fH2 =1, рН = -lg aH+, то Н2 = (RT/F) ln aH+ = 2,303 (RT/F) lg aH+ = -2,303 (RT/F) pH.

Если T = 298 K; F = 96500 Кл /моль; R = 8,314 Дж К-1моль-1, то Водородный электрод обладает высокой точностью, хорошей воспроизводимостью результатов. Он может работать в интервале рН от до 14 при любых давлениях водорода и при любых температурах. Недостатки: равновесие между электродом и раствором устанавливается в течение 20 – 30 мин., платина быстро отравляется каталитическими ядами, в присутствии окислителей и восстановителей он дает неверный результат.

На практике в качестве электродов сравнения используются электроды, потенциал которых по отношению к водородному (стандартному) точно известен (хлорсеребряный и каломельный).

Хлорсеребряный электрод представляет собой серебряную проволоку или пластинку, покрытую слоем AgCl и помещенную в раствор KCl или HCl определенной концентрации (обратим относительно ионов хлора).

Схема полуэлемента: Ag, AgCl KCl или Ag, AgCl НCl.

Электродная реакция, протекающая на хлорсеребряном электроде:

Уравнение Нернста для хлорсеребряного электрода:

так как aAg = 1, aAgCl = 1, получаем х. с. = 0х. с. – (RT/F) ln aClВ каломельном электроде паста из ртути и каломели (Hg2Cl2) помещена в раствор KCl (обратим относительно ионов хлора).

Схема полуэлемента: Hg, Hg2Cl2 KCl.

Ему отвечает реакция:

к.э. = 0к.э. – (RT/F) ln aClПотенциалы хлорсеребряного, каломельного и ряда других электродов сравнения изучены при различных концентрационных и температурных условиях и их величины по отношению к стандартному водородному электроду хорошо известны (справочные данные).

Диффузионный потенциал возникает на границе между растворами разных электролитов или растворов разной концентрации одного электролита. Возникновение диффузионного потенциала обусловлено неравномерным распределением катионов и анионов вдоль границы раздела растворов вследствие различия в скоростях диффузии ионов через поверхность раздела. Различие в скоростях диффузии вызывается разницей в подвижностях ионов или градиентом концентраций.

В зависимости от заряда ионов, их подвижностей, концентрации раствора, природы растворителя и других факторов диффузионный потенциал изменяется в очень широких пределах: от долей милливольта до десятков милливольт и более.

На практике диффузионный потенциал стремятся уменьшить (устранить) с помощью так называемого солевого мостика. Солевой мостик представляет собой U-образную трубочку, заполненную гелем (агарагар), который пропитан раствором электролита. Основным назначением солевого мостика является осуществление электролитического контакта, однако с целью элиминирования диффузионного потенциала для солевого мостика применяют концентрированный раствор электролита с приблизительно одинаковыми подвижностями катиона и аниона. Очень часто в качестве солевого мостика используют насыщенный раствор KCl, применяют также растворы NH4NO3, KNO3 и др. Солевой мостик помещают между растворами, заменяя таким образом границу раздела и существенно уменьшая диффузионный потенциал.

Методы прямой потенциометрии основаны на непосредственном применении уравнения Нернста для нахождения активности или концентрации участника электродной реакции по экспериментально измеренной э.д.с. цепи или потенциалу электрода. Наибольшее распространение среди прямых потенциометрических методов получил метод определения рН, хотя создание в последнее время надежно работающих ионоселективных электродов значительно расширило практические возможности прямых методов. Прямые потенциометрические методы часто стали называть ионометрическими методами анализа или ионометрией.

Эта группа методов интенсивно развивается в связи с успехами в конструировании и улучшении качества ионоселективных электродов, позволяющих проводить быстро и точно определение концентрации или активности ионов и обладающих рядом других достоинств.

4.4.1. Водородный показатель и потенциометрический метод определения рН Понятие о водородном показателе введено в 1909 г. Зеренсеном, который под водородным показателем понимал отрицательный десятичный логарифм молярной концентрации ионов водорода: pH = -lg[H+].

В настоящее время величина рН считается характеристикой активности ионов водорода:

Для разбавленных растворов H+ = 1, поэтому для расчета рН таких растворов можно пользоваться концентрациями.

Надо помнить, что рН является логарифмической функцией концентрации ионов водорода и изменение рН на единицу соответствует десятикратному изменению концентрации ионов Н+.

Величины рН лежат в пределах от 0 до 14. Величины рН ниже нуля (отрицательная величина) и выше 14 возможны для растворов, с концентрацией более 1 моль/л, соответственно, сильной кислоты и сильного основания. Однако наиболее часто встречающиеся значения рН лежат в пределах от 0 до 14. В настоящее время трудно найти отрасль науки или производства, в которой не использовались величины рН. Величина рН характеризует процессы жизнедеятельности животных и растений, кислотность почв. Величиной рН пользуются в гидрохимии и гидрологии.

Потенциометрический метод определения рН основан на применении гальванических элементов, в которых индикаторный электрод обратим по отношению к ионам водорода.

Для экспериментального определения pH могут быть использованы различные индикаторные электроды: водородный, хингидронный, стеклянный и др. Наибольшее практическое применение в последнее время нашел стеклянный электрод, используемый в широком интервале рН и в присутствии окислителей.

Стеклянный электрод (рис. 4.1.) представляет собой тонкостенный стеклянный шарик (1), заполненный раствором HCl либо буферным раствором (2). Внутрь шарика помещают вспомогательный хлорсеребряный электрод (3).

Перед работой стеклянный электрод некоторое время вымачивают в растворе HCl. При этом ионы водорода из раствора обмениваются на ионы натрия из стеклянной мембраны и в системе устанавливается некоторое равновесие. Подготовленный таким образом электрод, в котором протоны поверхности стекла находятся в равновесии с протонами раствора, может быть использован для определения рН. Величина скачка потенциала на границе раствор - внешняя поверхность мембраны стеклянного электрода зависит от активности ионов водорода в исследуемом растворе.

От ранее рассмотренных электродов стеклянный электрод отличается тем, что в потенциалопределяющей реакции электроны не принимают участие. Электродная реакция на стеклянном электроде представляет собой обмен ионами водорода между анализируемым раствором и стеклом (стеклянной мембраной):

Стеклянный электрод является ионообменным электродом. Для его изготовления используются специальные сорта ионитов. Переход иона водорода из одной фазы в другую эквивалентен переносу единицы заряда, поэтому z = 1.

Стеклянный электрод обычно используют в паре с хлорсеребряным электродом сравнения. Применяемую при этом электрохимическую цепь можно записать следующим образом (-) Ag,AgCl HCl(0.1 M) стекло исслед. р-р KCl AgCl, Ag (+) стеклянный электрод хлорсеребряный электрод Потенциал стеклянного электрода включает три скачка:

1) 1 - скачок потенциала на границе раздела металл внутреннего электрода - буферный раствор или C(НCl) = 0,1 моль/л, 1- const;

2) 2 - скачок потенциала на границе буферный раствор или C(HCl) = 0,1 моль/л - внутренняя поверхность мембраны (стекло), 2 const;

3) 3 - скачок потенциала на границе внешняя поверхность мембраны (стекло) - исследуемый раствор, 3 const.

ЭДС этой цепи равна Потенциал стеклянного электрода выражается уравнением Нернста:

Стандартный потенциал стеклянного электрода (0ст) зависит от сорта стекла мембраны, состава внутреннего раствора и температуры.

Рассчитать его невозможно, так как он включает потенциал асимметрии, обусловленный различием электрохимических свойств внутренней и внешней поверхностей стеклянной мембраны. С целью уменьшения потенциала асимметрии стеклянный электрод вымачивают в растворе HCl и после этого хранят в дистиллированной воде. Так как рассчитать 0ст невозможно, поэтому эта операция заменяется настройкой приборов (рН-метров) по стандартным буферным растворам, так как шкала рНметров проградуирована непосредственно в единицах рН.

Основными достоинствами стеклянного электрода являются: простота работы, не подвержен действию ядов, применимость в широкой области рН, быстрое установление равновесия и возможность определения рН в окислительно-восстановительной системе (так как электроны не участвуют в электродном процессе). К недостаткам относят хрупкость их конструкции и усложнение работы при переходе к сильно щелочным и сильно кислым растворам.

4.4.2. Ионоселективные электроды Решающее влияние на развитие и успехи ионометрического метода анализа оказало удачное конструирование ионоселективных электродов на основе различных мембран. Стеклянные ионоселективные электроды чувствительны к ионам щелочных металлов Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, а также к ионам Ag+, Tl+ и NH4+. Их устройство и принцип действия такие же, как и у стеклянного электрода. Наиболее существенным отличием является состав стекла, из которого готовятся мембраны. Установлено, в частности, что введение Al2O3 в стекло положительно влияет на селективность мембраны к ионам металлов, но не к Н+.

Селективный электрод, например, с натриевой функцией находится в равновесии с ионами натрия в растворе:

Na+ (стекло) Na+ (р-р) Важной характеристикой ионоселективного электрода является его коэффициент селективности, показывающий, во сколько раз электрод более чувствителен к данным ионам, чем к посторонним (мешающим).

Например, в паспорте электрода на калий указано, что электрод селективен в присутствии ионов Na+ и NH4+ при превышении их концентрации соответственно в 200 и 20 раз по сравнению к ионам К+.

Стеклянные ионоселективные электроды широко используются для определения катионов щелочных металлов в различных биологических пробах - крови, плазме, сыворотках и т.д., в объектах окружающей среды - водах, растениях, различных экстрактах и т.д. Определения с помощью ионоселективных электродов успешно конкурируют с пламеннофотометрическими методами по точности и нередко превосходят их по скорости.

В твердых мембранных электродах ионочувствительный элемент изготавливается из малорастворимого кристаллического вещества с ионным характером проводимости. Из электродов этого типа широко применяется фторидный электрод, в котором мембраной является монокристалл LaF3, имеющий чисто фторидную проводимость. Чувствительность фторидного электрода позволяет проводить измерения равновесной концентрации фторид-ионов в широкой области концентраций от 10-6 до 1 моль/л. Селективность электрода очень высока - даже тысячекратный избыток посторонних ионов (галогенид-, нитрат-, сульфатионов и др.) по сравнению с фторид-ионом не мешает его определению и только в присутствии ОН-ионов селективность падает.

Фторидный электрод используется для определения фторид-ионов F ) в питьевой воде, различных биологических пробах, витаминах, при контроле за загрязнением окружающей среды и т.д.

Практическое значение имеет ионоселективный электрод с мембраной из сульфида серебра, пригодный для измерения концентрации (активности) Ag+ и S2- -ионов.

На основе сульфида серебра конструируются также различные галогенидные электроды. Для этого в сульфид серебра вводят галогениды серебра. Электроды на основе сульфида серебра с добавкой соответствующего галогенида серебра чувствительны к ионам Cl-, Br -, I-, CN- и др.

4.5. Потенциометрическое титрование Потенциометрическое титрование как метод количественного объемного анализа представляет собой особую ценность в тех случаях, когда по ряду причин (например, при титровании мутных и окрашенных растворов) для фиксирования точки эквивалентности не могут быть применены обычные индикаторы.

Сущность его состоит в том, что точка эквивалентности находится не по переходу окраски индикатора, а по резкому изменению (скачку) потенциала индикаторного электрода.

Потенциометрическое титрование применяют для реакций нейтрализации, осаждения, комплексообразования и окислительновосстановительных. Во всех случаях индикаторный электрод должен быть обратим либо по отношению к ионам водорода в растворе, либо по отношению к ионам, образующим комплексное или труднорастворимое соединение, выпадающее в осадок.

Для потенциометрического титрования собирают гальванический элемент из индикаторного электрода в анализируемом растворе и электрода сравнения.

Индикаторный электрод - электрод, который служит для определения точки эквивалентности при титровании.

В кислотно-основном титровании в качестве индикаторного электрода обычно используют стеклянный электрод. В качестве электродов сравнения чаще всего применяют хлорсеребряный или каломельный.

В известный объем титруемого раствора прибавляют небольшими порциями при постоянном перемешивании титрант и каждый раз измеряют э.д.с. элемента. Титрующий раствор (титрант) должен быть примерно в 10 раз более концентрированный, чем титруемый. Для нахождения точки эквивалентности строят кривую титрования, нанося по оси ординат изменение потенциала индикаторного электрода, а по оси абсцисс - количество миллилитров титранта (рис. 4.2.).

Рис. 4.2. Кривая потенциометрического титрования.

Как видно, в точке эквивалентности происходит резкий скачок э.с.д., вызванный резким изменением потенциала индикаторного электрода. По этому скачку можно определить точку эквивалентности: строят касательные к трем участкам кривой титрования; находят середину отрезка, соответствующего скачку потенциала; опускают перпендикуляр на ось абсцисс и определяют число миллилитров прибавляемого титранта. Зная объем титранта, израсходованного на титрование до точки эквивалентности, концентрацию титранта, можно рассчитать содержание анализируемого вещества во взятой пробе.

Потенциометрическое титрование может применяться не только для определения одного компонента, но и для дифференцированного титрования смеси кислот и оснований.

Потенциометрический метод позволяет провести количественное определение компонентов в смеси кислот, если константы диссоциации в воде различаются не менее чем на четыре порядка. Если константы двух кислот в воде отличаются на 2-3 порядка, то они не могут быть раздельно оттитрованы в водной среде. На кривой титрования имеет место один скачок потенциала, когда обе кислоты оттитрованы совместно.

Существует группа растворителей (неводные), которые обладают дифференцирующим действием. Так, если константы двух кислот в водном растворе близки, то в среде дифференцирующего растворителя различие в величинах констант диссоциации увеличивается: константа диссоциации слабой кислоты уменьшается в большей степени. Например, определение содержания соляной и монохлоруксусной кислот в смеси титрованием водного раствора является сложной задачей в связи с трудностью обнаружения двух скачков титрования. При титровании в ацетоне оба скачка выражены достаточно четко и содержание каждой кислоты в смеси может быть рассчитано. Некоторые двухосновные кислоты не удается ступенчато оттитровать в воде, тогда как в среде кетонов на кривых титрования наблюдается два скачка.

В общем случае дифференцирующее действие является результатом комплексного влияния свойств растворителя на константы диссоциации и отношение констант диссоциации электролитов. В каждом отдельном случае может преобладать то или иное действие растворителя на электролит: величина диэлектрической проницаемости (), сольватирующая способность, кислотно-основные свойства. Например, дифференцирующее действие ацетона объясняется очень низкими кислотно-основными свойствами.

Растворители с противоположными действиями, сближающие константы диссоциации, называются нивелирующими. Примером нивелирующих растворителей является вода.

4.6. Практическое применение и общая характеристика метода Большое практическое значение имеют потенциометрические методы определения рН раствора со стеклянным и другими электродами, а также прямые потенциометрические определения концентрации (активности) других ионов с помощью ионоселективных электродов (ионометрия). Ионоселективные электроды на ионы Cu2+, Ag2+, Ag+, Ca2+, Na+, K+, Cl-, F-, S2-, NO3- и др. успешно применяют в анализе различных растворов, объектов окружающей среды и т.д.

Во многих областях находит практическое применение кальциевый ионоселективный электрод. Помимо традиционного анализа воды, различных растворов большое практическое значение кальциевый электрод имеет в медико-биологических исследованиях, клинической медицине и т.п., поскольку концентрация (активность) ионов кальция влияет на многие процессы жизнедеятельности и физиологические процессы (нервная деятельность, функция ферментов и т.д.). Известен мембранный ионоселективный электрод, позволяющий определять жесткость воды, так как он имеет примерно одинаковую чувствительность на оба иона (кальций и магний).

Основными достоинствами потенциометрического метода являются его высокая точность, высокая чувствительность и возможность проводить титрования в более разбавленных растворах, чем это позволяют визуальные индикаторные методы. Необходимо отметить также возможности определения этим методом нескольких веществ в одном растворе без предварительного разделения и титрования в мутных и окрашенных средах. Значительно расширяется область практического применения потенциометрического титрования при использовании неводных растворителей. Они позволяют, например, найти содержание компонентов, которые в водном растворе раздельно не титруются, провести анализ веществ, нерастворимых или разлагающихся в воде и т.д.

К недостаткам потенциометрического титрования можно отнести не всегда быстрое установление потенциала после добавления титранта и необходимость во многих случаях делать при титровании большое число отчетов.

Работа 1. Анализ кислот и отдельных компонентов их смеси методом потенциометрического титрования Реактивы. 1) Бензойная кислота C6H5COOH (х.ч.).

2) Ацетон (х.ч.) 3) Раствор гидроксида натрия, C(NaOH) = 1 моль/л: 40 г NaOH растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 л и доводят до метки.

4) Раствор уксусной кислоты, C(CH3 COOH) = 0,1 моль/л: 5,6 мл ледяной уксусной кислоты разбавляют дистиллированной водой до 1 л в мерной колбе.

5) Раствор соляной кислоты, C(HCl) = 0,1 моль/л: 8,3 мл соляной кислоты (плотность 1,19) разбавляют водой до 1 л в мерной колбе.

6) Раствор серной кислоты, С(H2SO4) = 0,05 моль/л: 3 мл концентрированной серной кислоты (плотность 1,84) добавляют в дистиллированную воду и доводят объем в мерной колбе до 1 л.

7) Раствор муравьиной кислоты, С(HCOOH) = 0,1 моль/л: 3,7 мл концентрированной муравьиной кислоты (плотность 1,2) разбавляют дистиллированной водой и доводят объем в мерной колбе до 1 л.

Порядок работы 1. Приготовление титранта.

2. Подготовка пробы к работе.

3. Определение концентрации титранта.

4. Снятие кривых потенциометрического титрования кислот (по указанию преподавателя).

5. Титрование одной из следующих смесей кислот по указанию преподавателя в водной среде, а затем, если это необходимо, в среде неводного растворителя:

а) уксусная кислота + соляная кислота, б) муравьиная кислота + соляная кислота, в) серная кислота + муравьиная кислота.

6. Построение графика в координатах значения рН (э.д.с. гальванического элемента) - прибавленный объем титранта (мл) и расчет по кривым титрования количества титруемых кислот как по отдельности, так и в смеси.

Ход работы 1. В мерную колбу емкостью 100 мл отбирают пипеткой 10 мл исходного раствора NaOH (С = 0,1 моль/л). Затем в колбу добавляют 10 мл дистиллированной воды и объем доводят до метки водой или ацетоном по указанию преподавателя. Раствор тщательно перемешивают. Концентрацию полученного раствора определяют по бензойной кислоте (см.

ниже).

2. Сухой стакан для титрования взвешивают на аналитических весах, затем повторяют взвешивание с навеской бензойной кислоты (0,05 г), рассчитывают точную навеску (М = 122,12 г/моль).

3. Навеску растворяют в 20 мл ацетона. В стакан для титрования аккуратно опускают мешалку и погружают электроды в раствор так, чтобы шарик стеклянного электрода находился на расстоянии не менее 5мм от мешалки. Если при этом покрыто менее половины стеклянного шарика, то следует добавить в стакан воды, чтобы погрузить шарик.

4. Потенциометр включить в сеть.

5. Ополоснуть бюретку дистиллированной водой, смазать кран тонким слоем смазки. Затем бюретку ополоснуть раствором титранта и проверить надежность крана. После этого бюретку заполнить титрантом до нулевого деления при заполненном кончике бюретки.

6. В процессе титрования бензойной кислоты титрант добавляют в начале по 0,5 мл, а затем 0,1. После скачка потенциала в точке эквивалентности необходимо сделать еще 6-7 замеров рН, добавляя титрант по 0,1 мл. Полезен предварительный расчет числа мл титранта, требуемых для нейтрализации взятой навески бензойной кислоты.

Если g навеска бензойной кислоты (г); М - молярная масса бензойной кислоты (122,12 г/моль); С(В) - приближенная молярная концентрация титранта, например 0,1 моль/л; VВ - искомый объем титранта (мл), то Предварительный расчет позволяет более рационально проводить титрование: прибавление титранта по 0,1 мл следует начинать за 2 мл до наступления эквивалентной точки. Полезно одновременно с титрованием наносить точки на график; после выхода на горизонтальный участок прилить еще несколько порций избытка титранта. По данным титрования строят график в координатах значения рН (э.д.с. гальванического элемента) - прибавленный объем титранта (V, мл) и рассчитывают точное значение мл NaOH, пошедшее на титрование. Концентрацию титранта рассчитывают из соотношения:

где VВ - объем титранта, соответствующий эквивалентной точке, мл.

7. В стакан для титрования отбирают определенный объем (5 мл) каждой из исследуемых кислот. К раствору добавляют 20 мл воды или ацетона (по указанию преподавателя), проверяют правильность расположения электродов и проводят титрование раствора, добавляя титрант по 0,1 мл.

8. Точно так же оттитровывают смесь кислот.

9. По данным титрования строят график в координатах значения рН (э.д.с. гальванического элемента) - прибавленный объем титранта (V, мл) и определяют число мл щелочи, пошедшее на титрование каждой кислоты (VВ). Затем рассчитывают концентрацию каждой кислоты во всех пробах по формуле:

где С(А) - молярная концентрация исследуемого раствора, моль/л; С(В) - молярная концентрация титранта, моль/л; VA объем аликвотной (кратной) части раствора, взятый для титрования, мл.

Работа 2. Определение нитрат-ионов в техническом образце (фторид-ионов и хлорид-ионов) Приборы и реактивы: рН-метр рН-121 или иономер ЭВ-74; нитратселективный пластифицированный электрод; хлорсеребряный электрод сравнения; магнитная мешалка; мерные колбы вместимостью 100 мл; пипетка вместимостью 10 мл; стаканы вместимостью 50 мл;

нитрат калия (х.ч.); сульфат калия, С = 1 моль/л раствор; технические образцы селитры с содержанием нитрата до 60%.

Как правило, определение нитрат-иона является сложной аналитической задачей, на выполнение которой затрачивается большое количество времени. Применение ионселективных пластифицированных электродов, чувствительным элементом которых является мембрана, содержащая нитратную соль четвертичного аммониевого основания, позволяет быстро решить поставленную задачу.

Выполнение работы По точной навеске методом разбавления готовят серию стандартных растворов нитрата калия (10-1 - 10-5 моль/л). Так как нитратселективный электрод реагирует на изменение активности ионов нитрата, а не концентрации, то более правильно готовить растворы с постоянной ионной силой, создаваемой раствором сульфата калия. В этом случае стандартные растворы KNO3 готовят на фоне раствора K2SO4 с концентрацией 1 моль/л. Исследуемый раствор также готовят на фоне сульфата калия. Погружают электроды в анализируемый раствор и регистрируют зависимость э.д.с. элемента, составленного из нитратселективного электрода и электрода сравнения, от концентрации калия. Строят калибровочный график зависимости E = f (- lgC). Перед началом измерений необходимо несколько раз тщательно промыть электроды дистиллированной водой. При использовании стандартных растворов измерения необходимо проводить, переходя от разбавленных к концентрированным растворам.

Навеску технического образца, в котором необходимо определить содержание нитрата ( 0,10 г), взвешенную на аналитических весах, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки дистиллированную воду. Измеряют э.д.с. элемента в исследуемом растворе.

Используя калибровочный график, определяют содержание нитрата в анализируемом растворе. Содержание нитрата (в %) в техническом образце рассчитывают по формуле:

где C – концентрация NO3-, определяемая из графика, моль/л;

V - вместимость мерной колбы;

M - молекулярная масса нитрата (NO3-), г/моль;

g - навеска технического образца, г.

Описанная методика может быть использована для определения содержания фторидов и хлоридов с помощью фторид- и хлоридселективных электродов соответственно. Для создания постоянной ионной силы целесообразно использовать ацетатный буферный раствор (при определении фторид-ионов) или раствор нитрата калия (при определении хлорид-ионов) с концентрацией 1 моль/л.

1. На чем основаны потенциометрические методы анализа?

2. Что такое гальванический элемент? Что называется э.д.с. гальванического элемента?

3. Что такое электродный потенциал? Уравнение Нернста для электродного потенциала. Стандартный электродный потенциал.

4. Типы электродов.

5. Диффузионный потенциал. Солевой мостик и его назначение.

6. Какие функции выполняют индикаторные электроды и какие – электроды сравнения?

7. Электроды сравнения: водородный, каломельный, хлорсеребряный.

8. В чем сущность потенциометрического определения рН раствора? Какие индикаторные электроды могут быть использованы для определения рН?

9. Как устроен стеклянный электрод? Указать достоинства и недостатки стеклянного электрода.

10. Ионоселективные электроды.

11. Указать достоинства, недостатки и области применения метода прямой потенциометрии.

12. Что такое рН? В каких пределах может изменяться рН?

13. Активность, коэффициент активности, их вычисление.

14. Расчет рН сильных и слабых электролитов.

15. Кривые потенциометрического титрования.

16. Назвать достоинства и области применения потенциометрического титрования в неводных средах.

1. Васильев В.П. Аналитическая химия: В 2-х ч. Ч. 2. Физико-химические методы анализа: Учеб. для химико-технол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.

С. 188-220.

2. Практикум по физико-химическим методам анализа / Под. ред.

О.М. Петрухина. М.: Химия, 1987. С. 115-138.

3. Крешков А.П. Основы аналитической химии: В 3-х ч. Ч. 3. Физикохимические (инструментальные) методы анализа. М.: Химия, 1970. С. 32-71.

4. Киреев В.А. Курс физической химии. М.: Химия. 1975. С. 560-600.

Глава 5. Вольтамперометрия Вольтамперометрия основана на изучении поляризационных или вольтамперных кривых (кривых зависимости силы тока от напряжения), которые получаются, если при электролизе раствора анализируемого вещества постепенно повышать напряжение и фиксировать при этом силу тока.

Электролиз следует проводить с использованием легко поляризуемого электрода с небольшой поверхностью, на котором происходит электровосстановление или электроокисление вещества (индикаторный или рабочий электрод).

В полярографическом методе анализа используют два электрода индикаторный поляризующий электрод и электрод сравнения (практически неполяризуемый каломельный электрод или хлорсеребряный).

Если в качестве индикаторного выбран электрод с постоянно обновляющейся поверхностью (например, ртутный капающий электрод), то метод анализа называют полярографическим. За открытие и развитие этого метода чешскому ученому Я. Гейровскому в 1959 г. была присуждена Нобелевская премия.

Процесс прохождении постоянного тока через электролитическую ячейку характеризуется соотношением:

где Е – приложенное извне напряжение;

Ea – потенциал анода;

Eк - потенциал катода;

R - сопротивление электролитической ячейки.

При вольтамперометрических измерениях к анализируемому раствору добавляют индифферентный электролит (полярографический фон) большой концентрации, поэтому R 1 кОм и, так как ток в вольтамперометрии не превышает 10-5 А, падением напряжения на ячейке IR можно пренебречь.

Поскольку в вольтамперометрии один из электродов не поляризуется и для него потенциал остается постоянным (электрод сравнения), подаваемое на электролитическую ячейку напряжение проявляется в изменении потенциала только индикаторного электрода. Если потенциал индикаторного электрода измерять относительно потенциала электрода сравнения, условно приняв последний за нуль, то E = Ea для рабочего микроанода и E =- Eк для рабочего микрокатода.

Таким образом, регистрируемая вольтамперная кривая (полярограмма) отражает электрохимический процесс, происходящий только на одном электроде. Если в растворе присутствуют вещества, способные электрохимически восстанавливаться или окисляться, то при наложении на ячейку линейно изменяющего напряжения (скорость не превышает 200 мВ/мин) кривая I = f(E) имеет форму волны (рис. 5.1, кривая 1). В отсутствие электрохимической реакции эта зависимость линейна, как следует из закона Ома (кривая 2).

Рис. 5.1. Вольтамперная кривая в присутствии (1) и в отсутствие (2) полярографически активного соединения Если приложить разность потенциалов к электродам, опущенным в раствор электролита, и постепенно увеличивать эту разность потенциалов, то вначале ток через раствор протекать почти не будет. На участке кривой А (рис. 5.1.) электролиз не протекает. Ток в этом месте вызывается заряжением ртутной капли и восстановлением примесей. По достижении потенциала восстановления на катоде начинается разряд ионов электрохимически активного вещества, называемого деполяризатором (вещество, снижающее поляризацию индикаторного электрода), и сила тока резко возрастает, стремясь к предельной величине диффузионного тока. Участок В характеризует прохождение процесса электролиза, сопровождающегося все более интенсивным обеднением приэлектродного слоя. Участок С - все ионы анализируемого вещества успевают разрядиться.

Для того чтобы ионы определяемого вещества перемещались к индикаторному электроду только вследствие диффузии, а не за счет диффузии и электростатической силы притяжения, в исследуемый раствор добавляют какой-либо индифферентный электролит с катионом, восстанавливающимся гораздо труднее анализируемого катиона, например KCl, NH4Cl, KNO3, при концентрации в 100 - 1000 раз превышающей концентрацию определяемого вещества.

Индифферентную соль, добавляемую для устранения движения анализируемого вещества под действием электрического тока, называют полярографическим фоном или просто фоном.

Катионы электролита-фона движутся к катоду, но не могут разрядиться на нем при данном потенциале. Они остаются у поверхности электрода, образуя двойной электрический слой. Электрическое поле индикаторного электрода экранируется этими ионами фона, и поэтому катионы определяемого вещества не притягиваются электрическим полем катода, а движутся к нему только за счет диффузии. Органические молекулы не имеют обычно электрического заряда и для них в еще большей степени, чем для ионов, справедливо утверждение, что перемещение происходит только под действием диффузионного переноса.

Фон имеет еще и другое значение - он увеличивает электропроводность раствора.

Ход полярографических кривых существенно искажается растворенным кислородом, восстанавливающимся на ртутной капле. Кислород удаляют из растворов продувкой азотом, аргоном и др., и только после этого записывают полярограммы. В случае кислых растворов для удаления кислорода можно использовать CO2. В щелочных средах удобно удалять кислород при помощи Na2SO3. В раствор фона во многих случаях вводят специальные поверхностно-активные вещества, которые устраняют так называемые максимумы на полярографических кривых.

Происхождение максимумов связано с изменением поверхностного потенциала растущей ртутной капли. Максимумы сильно искажают полярограммы главным образом в области плато, где устанавливается предельный диффузионный ток. Для устранения максимумов в раствор добавляют небольшие количества высокомолекулярных соединений (желатин, агар-агар) или некоторых органических красителей (метиловый красный, фуксин и др.).

Силу тока, при которой достигается разряд всех ионов анализируемого вещества (участок С), поступающих в приэлектродное пространство ртутного катода за счет диффузии, называют предельным или диффузионным током.

Диффузионный ток пропорционален концентрации определяемого иона в растворе (концентрация ионов у поверхности катода приближается к нулю, когда ток достигает предельного значения).

Зависимость силы диффузионного тока от концентрации выражается уравнением, выведенным Ильковичем:

где Iд - диффузионный ток, мкА; 605 - числовой множитель, в который входят геометрические факторы, константа Фарадея, плотность ртути;

n - число электронов, принимаемых ионом при восстановлении или отдаваемых при окислении; D - коэффициент диффузии иона, см2с-1; m масса ртути, вытекающей из капилляра за секунду, гс-1; - время жизни ртутной капли, с; С - концентрация определяемого иона, мольл-1.

Если полярографирование проводят с каким-нибудь одним типом ионов, то для них “n” и “D” - const; в случае, если работают с одним и тем же капилляром и с одной и той же скоростью вытекания ртути, то m2/3 1/6 – const, тогда Iд = kС.

Полученная линейная зависимость является основой количественного полярографического анализа. Высота волны “h” (рис. 5.1.) характеризует предельный ток и дает возможность определить концентрацию анализируемого вещества.

В полярографическом анализе для определения неизвестной концентрации наиболее широко применяют метод градуировочного графика на основе уравнения: Iд=kС. График строят по данным полярографирования нескольких стандартных растворов. На оси ординат откладывается пропорциональная силе диффузионного тока высота полярографической волны – h, а по оси абсцисс – концентрация анализируемого вещества. Градуировочный график должен представлять прямую линию, проходящую через начало координат.

При анализе некоторых хорошо изученных систем часто применяется менее трудоемкий метод стандартных растворов. В этом методе в строго одинаковых условиях снимают полярограммы стандартного и анализируемого растворов и рассчитывают неизвестную концентрацию (Сх):

где Сст - концентрация стандартного раствора, hх и hст – высота волны при полярографировании соответственно анализируемого и стандартного растворов.

Широко распространен в количественной полярографии метод добавок. Пусть при полярографировании исследуемого раствора сила диффузионного тока равна Добавим к этому раствору известное количество стандартного раствора (Сст) и снова определим диффузионный ток:

При почленном делении этих уравнений получаем 5.5. Качественный полярографический анализ Для качественного анализа удобно пользоваться потенциалом полуволны. Если отрезок В (рис. 5.1) разделить пополам, восстановить перпендикуляр, то получим отрезок на оси абсцисс, характеризующий потенциал, необходимый для достижения половины предельного тока (потенциал полуволны E1/2). Он не зависит от концентрации растворенного вещества, а зависит только от природы восстанавливаемого иона. Потенциал полуволны является, таким образом, качественной характеристикой иона в растворе данного фонового электролита и определение потенциала полуволны составляет основу качественного полярографического анализа (по соответствующим таблицам можно определить, какой ион находится в растворе).

Если в растворе находится несколько веществ, потенциалы полуволны которых различаются на 100 мВ и больше, то на полярограмме будет не одна волна, а несколько - по числу восстанавливающихся ионов, а возможно и больше, так как при ступенчатом восстановлении один ион может давать две волны. Например, две волны дает ион Cu2+ в присутствии NH3 (С = 1 моль/л): первую при потенциале полуволны В и вторую при -0,48 В. Можно получить таким образом полярографический спектр ионов, а затем по этим данным и измеренному потенциалу полуволны идентифицировать неизвестное вещество. Вполне понятно, что положение элемента в таком спектре будет зависеть от фонового электролита: его природы и концентрации.

Для анализа смесей, содержащих ионы или вещества с близкими потенциалами полуволны, применяют методы дифференциальной полярографии, использующие кривые dI/dE - E (первая производная от полярографической кривой). Дифференциальная полярография имеет значительно более высокую разрешающую способность, позволяя определять в одном растворе ионы с близкими потенциалами полуволны.

Рис. 5.2. Полярограмма раствора, содержащего Pb(NO3)2 и TlNO Например, этим методом могут быть определены свинец и таллий, у которых потенциалы полуволны на фоне KNO3 (с концентрацией 2 моль/л) различаются только на 0,06 В. В методе обычной полярографии (интегральная полярограмма) оба иона образуют одну общую волну, а на дифференциальных кривых четко видны два максимума (рис. 5.2). Кроме того, методы дифференциальной полярографии более точны, так как фиксировать положение максимума и измерять его высоту можно с более высокой точностью.

5.6. Полярографическая установка Систему электродов для вольтамперометрических измерений выбирают таким образом, чтобы плотность тока на этих электродах существенно различалась: на индикаторном (рабочем) электроде плотность тока должна быть велика, на электроде сравнения - ничтожна мала. В этом случае поляризоваться будет только рабочий электрод и, естественно, только на нем возможны электрохимические процессы восстановления или окисления ионов из раствора. Рабочий электрод, как правило, имеет очень малую поверхность по сравнению с поверхностью электрода сравнения – это микроэлектрод, который может быть изготовлен из твердого материала (Pt, Ag, Au, графит специальной обработки и др.) или в виде ртутной капли, вытекающей из капилляра.

Ртутный капающий электрод в качестве рабочего микроэлектрода используют широко при полярографическом анализе веществ, восстанавливающихся в области потенциалов +0,3 -2,0 В (в щелочных или нейтральных растворах) или до –1,0 В (в кислых растворах) относительно насыщенного каломельного электрода. Постоянно обновляющаяся поверхность ртутной капли, а также высокое перенапряжение выделения водорода, позволяющее электрохимически восстанавливать на таком электроде ионы металлов, расположенных в ряду напряжений левее водорода (т.е. почти все катионы), делает ртутный капающий электрод одним из наиболее широко используемых.

Рис. 5.3. Схема полярографической установки Принципиальная схема полярографической установки представлена на рис. 5.3.

Анализируемый раствор 2 находится в электролизере 3, на дне которого имеется слой ртути 1, являющийся анодом. Часто в качестве анода используют насыщенный каломельный электрод. Катодом служит ртутный капающий электрод 4, соединенный с резервуаром ртути 5.

Внешнее напряжение, подаваемое на электроды, можно плавно менять с помощью реохорда или делителя напряжения 7 и измерять при этом гальванометром 6 силу тока, проходящего через раствор.

Рассмотрим процессы, происходящие на ртутном капающем электроде (катоде) и на электроде сравнения, который является анодом (каломельный электрод).

На катоде происходит процесс восстановления:

Образовавшийся свободный металл диффундирует в глубь капли.

Затем капля амальгамы (раствор металла друг в друге) падает и процесс начинается снова на новой капле. Благодаря очень малой силе тока, протекающего через электролизер (порядка 10-6 А), концентрация вещества в растворе очень мало изменяется и остается почти постоянной во время электролиза (величина предельного тока не изменяется с течением времени).

Процесс на аноде заключается в том, что атомы ртути отдают электроны, причем ионы ртути образуют с ионами хлора, находящимися в растворе, осадок каломели:

2Hg + 2Cl- = Hg2Cl2 + 2eПолярографический метод применяют также для определения органических веществ, способных восстанавливаться на ртутном капающем электроде. Одним из недостатков полярографического метода является необходимость применения ртути. Ртуть обладает способностью накапливаться в организме, что приводит к тяжелым отравлениям. В связи с этим полярографы устанавливаются в специально оборудованных ртутных комнатах с хорошей вентиляцией.

В вольтамперометрии с успехом применяют также твердые микроэлектроды, изготовляемые из благородных металлов (платины, золота и т.д.) или различных углеродных материалов (графит, стеклоуглерод, углеситалл, угольная паста). Твердые электроды представляют собой проволочки или стержни, запрессованные в изолирующий материал (стекло, тефлон и др.). Рабочая поверхность такого электрода приблизительно 0,2 см2. Конструктивно твердые электроды более удобны и безопасны, чем ртутные, но область их использования ограничена. Использование твердых электродов позволяет проводить анализ в более положительной области потенциалов (до +1,3 В). Наиболее удобным из твердых электродов является платиновый электрод. Перенапряжение водорода на платине невелико, поэтому водород восстанавливается при потенциале (-0,1 В). Это ограничивает использование платины в отрицательной области потенциалов. Из металлов на платиновом электроде могут быть определены серебро, золото и ртуть. Использование твердых электродов также имеет свои трудности, связанные, главным образом, с обновлением поверхности электродов. Стационарные твердые электроды не нашли широкого применения в практике из-за медленности установления предельного тока, невысокой чувствительности и других недостатков.

Значительно более широкое применение имеют вращающиеся и вибрирующие платиновые микроэлектроды (вращающийся дисковый электрод), на которых устойчивая сила тока устанавливается быстро.

При работе таких электродов раствор непрерывно перемешивается, благодаря чему к поверхности электрода ионы доставляются не только за счет диффузии, но и за счет механического перемешивания. Вращающийся дисковый электрод позволяет кроме простой съемки кривых I = f(E) изучать механизм электрохимических процессов. Каждый раз перед началом работы твердые электроды следует промывать раствором HNO (1:1), а затем многократно водой.

5.7. Хроноамперометрия с линейной разверткой Новые возможности в анализе и изучении электродных процессов открывает хроноамперометрия с линейной разверткой потенциала.

Обычная скорость изменения потенциала в этом методе составляет до мВ/с вместо 2-3 мВ/с в классической полярографии. Для измерения силы тока здесь вместо гальванометра используют безынерционный осциллограф.

Полярограмма, получаемая в этом методе, представлена на рис. 5.4.

Рис. 5.4. Осциллографическая Рис. 5.5. Кривая анодного При достижении потенциала восстановления ток резко возрастает и достигает максимума, превышая величину (Iд) классической полярографии, поскольку происходит электровосстановление практически всех ионов приэлектродного слоя, и затем падает, так как приэлектродный слой обедняется ионами, а скорость диффузии недостаточна, чтобы пополнить дефицит за столь короткое время. Потенциал максимума на этой кривой (E max) является качественной характеристикой иона, а высота максимума (h max) пропорциональна концентрации иона. Хроноамперометрия с линейной разверткой потенциала имеет более низкий предел обнаружения, чем обычная вольтамперометрия.

5.8. Инверсионная вольтамперометрия Существенное увеличение чувствительности дает инверсионная вольтамперометрия. Идея метода инверсионной полярографии состоит в выделении определяемого элемента из очень разбавленного раствора на ртутной капле или тонкой пленке ртути на графитовом электроде или просто на графитовом электроде электролизом с последующим анодным растворением полученного на электроде соединения. Процесс накопления происходит при потенциале, соответствующем предельному току.

Зависимость силы тока от напряжения при анодном растворении имеет вид характерного пика (рис. 5.5.), глубина которого h пропорциональна концентрации определяемого иона, а потенциал минимума (E min) определяется природой иона. Предел обнаружения в методике инверсионной вольтамперометрии на 2-3 порядка ниже предела обнаружения в обычных полярографических методиках. Рабочая область потенциалов для инверсионных электрохимических методов находится от +1,5 до – 0,7 В для графитовых электродов в водной среде.

5.9. Практическое применение Вольтамперометрический метод достаточно универсален и применим к многочисленному кругу объектов. Основными достоинствами метода являются быстрота анализа, возможность определения нескольких веществ в смеси без предварительного разделения, достаточно высокая точность и применимость к анализу небольших содержаний определяемого элемента. Погрешность полярографического анализа в обычных условиях составляет ±2 % для растворов концентрации порядка 10-3-10- моль/л и около ±5 % для более разбавленных растворов.

Вольтамперометрический метод применяют для определения многих металлов. Кадмий, кобальт, медь, свинец, марганец, никель, олово, цинк, железо, висмут, уран, ванадий и многие другие могут быть определены в рудах, концентратах, сплавах и иных природных и технических объектах.

В условиях вольтамперометрического анализа легко восстанавливаются и могут быть определены соединения с сопряженными кратными связями, многие альдегиды, кетоны, галогенсодержащие соединения, хиноны, гидроксиламины; нитро-, нитрозо-, азо-, азоксисоединения; соли диазония, многие серусодержащие и гетероциклические соединения;

пероксиды и редуцирующие сахара.

Широко используется полярографический метод для анализа биологически важных материалов: крови, сыворотки и т.д.

Методика выполнения анализа вольтамперометрическим методом на полярографе любого типа сводится к выполнению следующих операций.

1. Готовят систему электродов: выбирают соответствующий электрод сравнения, очищают поверхность твердого электрода или устанавливают режим капания ртутного капающего электрода, регулируя высоту столба ртути над капилляром.

2. Электролитическую ячейку заполняют анализируемым раствором, погружают в него рабочий микроэлектрод и электрод сравнения.

3. Проводят деаэрацию анализируемого раствора, продувая азот или аргон.

4. Соблюдая полярность, подключают электроды к соответствующим клеммам на полярографе.

5. Полярограф включают в сеть и прогревают согласно паспортным указаниям к прибору.

6. Устанавливают на полярографе необходимый режим работы: амплитуду развертки поляризующего напряжения, начальное напряжение, скорость изменения поляризующего напряжения, чувствительность и другие параметры.Чувствительность выбирают при потенциале, большем чем Е1/2 на 0,2 В; высота полярографической волны должна быть 25 см.

7. Откорректируют чувствительность и потенциал начала поляризации, а затем регистрируют вольтамперную кривую. Следует учесть, что число волн на полярограмме не должно быть меньше, чем предполагаемое число полярографически активных компонентов в анализируемом растворе, но может быть больше за счет многоступенчатости электрохимического процесса. Полярограмму регистрируют несколько раз.

8. Отключают электролизер от полярографа. Выключают полярограф, соблюдая последовательность выключения тумблеров на нем, указанную в паспорте к прибору. Электролизер промывают и заливают дистиллированной водой. Электрод сравнения погружают в насыщенный раствор KCl, твердый электрод высушивают фильтровальной бумагой, ртутный капающий электрод оставляют в электолизере или помещают капилляр в стакан с дистиллированной водой. Опускают сосуд со ртутью в нижнее положение штатива или перекрывают соответствующий кран, прекращая капание ртути.

После окончания работы необходимо тщательно убрать рабочее место.

Работа 1. Обнаружение ионов Cu2+, Cd2+, Zn2+, Mn2+ На фоне аммиачного буферного раствора полярографические волны ионов, образующих аммиакаты, достаточно четко выражены и Е1/2 существенно различаются.

Приборы и реактивы. Полярограф любой марки; электролизер;

твердый электрод или ртутный капающий электрод; насыщенный каломельный электрод; очищенный азот; градуированные пипетки вместимостью 10 мл; кристаллический сульфат натрия; фоновый электролит – аммиачный буферный раствор; стандартные растворы сульфатов меди, кадмия, цинка, марганца, С = 10-3 моль/л; анализируемый раствор сульфатов солей, С = 10-3 моль/л.

Выполнение работы Регистрируют полярограмму фонового электролита. Для этого в электролизер вносят 10 мл аммиачного буферного раствора, несколько кристаллов Na2SO3, перемешивают, опускают электроды, ячейку подключают к полярографу и регистрируют полярограмму при потенциалах –0,2 -1,8 В.

Регистрируют полярограмму стандартных растворов: в электролизер вносят 10 мл аммиачного буферного раствора, 0,5 мл стандартного раствора CdSO4 и полярографируют, как указано выше. Аналогично полярографируют растворы MnSO4, CuSO4 и ZnSO4.

Исследуемые растворы анализируют, как стандартные растворы.

Полученные полярограммы обрабатывают графически и путем построения полулогарифмического графика рассчитывают Е1/2 и число электронов, участвующих в электродном процессе. Значение Е1/2 для полярограммы неизвестного раствора сравнивают с найденными значениями Е1/2 для стандартных растворов и табличными данными. Делают вывод о качественном составе анализируемого раствора.

Работа 2. Обнаружение ионов Pb2+ и Tl+ В кислых и нейтральных растворах полярографические волны восстановления ионов Pb2+ и Tl+ практически сливаются: в растворе соляной кислоты (С = 1 моль/л) потенциал полуволны для ионов свинца равен -0,44 В, для ионов таллия Е1/2=-0,48 В. В щелочной среде на полярограмме смеси появляются две раздельные волны: свинец образует гидроксокомплекс (PbO)OH-, который восстанавливается при –0,16 В, незакомплексованные ионы таллия восстанавливаются при –0,49 В.

Приборы и реактивы. Полярограф любой марки; электролизер;

твердый электрод или ртутный капающий электрод; насыщенный каломельный электрод; очищенный азот; градуированные пипетки вместимостью 10 мл; раствор нитрата калия (С = 0,1 моль/л), сухой гидроксид натрия, 0,2%-ный раствор желатины, анализируемый раствор, С[Pb(NO3)2] 10-3 моль/л и С(TlNO3) 10-3 моль/л/ Выполнение работы В электролизер вносят 10 мл фонового раствора KNO3, 0,2 мл анализируемого раствора, 3 капли раствора желатины. Продувают азот 5 мин и регистрируют полярограмму. Затем в этот же раствор вносят примерно 0,5 г NaOH и после растворения пропускают азот 5 мин.

Вновь регистрируют полярограмму. Полярограммы обрабатывают графически и делают вывод о качественном составе раствора и возможности определения ионов Pb2+ и Tl+ в смеси.

1. Сущность вольтамперометрического метода.

2. Что такое вольтамперная кривая?

3. Полярографический фон и его назначение.

4. Диффузионный ток, его определение и связь с концентрацией растворенного вещества.

5. Потенциал полуволны, применение потенциала полуволны в качественном анализе.

6. Устройство простейшего полярографа, ртутного капающего и вращающегося платинового микроэлектродов. Электрохимические процессы, протекающие на ртутном капающем электроде.

7. Хроноамперометрия с линейной разверткой потенциала.

8. Инверсионная вольтамперометрия.

9. Практическое применение вольтамперометрии.

1. Васильев В.П. Аналитическая химия: В 2-х ч. Ч. 2. Физико-химические методы анализа: Учеб. для химико-технол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.

С. 220-244.

2. Практикум по физико-химическим методам анализа / Под. ред.

О.М. Петрухина. М.: Химия, 1987. С. 138-153.

3. Крешков А.П. Основы аналитической химии: В 3-х ч. Ч. 3. Физикохимические (инструментальные) методы анализа. М.: Химия, 1970. С. 147Киреев В.А. Курс физической химии. М.: Химия, 1975. С. 607-626.

6.1. Общие принципы электрофореза Электрофорезом называют движение заряженных коллоидных частиц в постоянном электрическом поле к противоположно заряженному электроду.

Биологические макромолекулы находятся в растворе в виде частиц, которые по своим размерам соответствуют коллоидным частицам. Кроме того, белки и нуклеиновые кислоты содержат ионизирующиеся группы, вследствие чего в растворе они могут существовать в заряженной форме, в виде катионов или анионов. Молекулы с близкими по величине зарядами, но различающиеся молекулярными массами, отличаются друг от друга отношением заряда к массе. На указанных различиях основано разделение ионов при их движении в растворе под действием электрического поля. В этом и состоит принцип электрофореза.

Суммарный электрический заряд белковой молекулы зависит от рН среды и соотношения радикалов аминокислот, обладающих кислотными и основными свойствами. Кислотные свойства радикалов аминокислот обусловлены карбоксильными и сульфгидрильными группами, а также фенольными гидроксилами. Основные свойства возникают за счет наличия в радикалах аминокислот амино-, имино- и гуанидиновых групп.

Следовательно, белки, являясь амфотерными электролитами, могут диссоциировать как кислоты или как основания. Преобладание одного из этих процессов зависит от аминокислотного состава данного белка, а также от окружения, в котором находятся его молекулы, главным образом от рН среды. В кислой среде основные группы радикалов аминокислот протонированы, тогда как диссоциация кислотных групп подавлена, поэтому белки оказываются заряженными положительно. В щелочной среде, наоборот, основные группы не имеют заряда, а кислотные легко диссоциируют, вследствие чего в молекуле белка образуется избыток отрицательно заряженных групп и белок в целом имеет суммарный отрицательный заряд.

Скорость движения молекул в электрическом поле (электрофоретическая подвижность) возрастает с увеличением суммарного электрического заряда. Так как величина заряда зависит от рН раствора, то подвижность белковых молекул тем выше, чем больше рН раствора отличается от изоэлектрической точки самого белка.

На электрофоретическую подвижность белковых молекул влияют следующие факторы:

1. Форма и величина белковой молекулы.

Молекулы одного размера, но разной формы, например, фибриллярные и глобулярные белки, обладают различной подвижностью в электрическом поле. Это обусловлено различиями в силе трения и электростатическом взаимодействии с окружающей средой. Чем крупнее молекула, тем меньше ее подвижность, так как при этом возрастает сила трения и электростатического взаимодействия крупных молекул по сравнению с молекулами меньших размеров. Кроме того, молекулы с близкими по величине зарядами, но различающимися молекулярными массами отличаются друг от друга отношением заряда к массе. Это также способствует разделению ионов при движении их в растворе под действием электрического поля.

2. Электрическое поле.

Как известно, по закону Ома сила тока I (в амперах, А), напряжение V (в вольтах, В) и сопротивление R (в омах, Ом) связаны следующим соотношением: I=V/R. На разделение ионов в электрическом поле влияют все три фактора.

Сила тока. Поскольку ток в растворе между электролитами обусловлен исключительно переносом ионов буфера и образца, скорость их перемещения прямо пропорциональна силе тока. Длина пути, пройденного ионами, пропорциональна времени пропускания тока. Следовательно, для максимальной воспроизводимости результатов сила тока в процессе электрофореза не должна меняться.

Напряжение. Электрофоретическая подвижность белковых молекул пропорциональна падению напряжения в поддерживающей (опорной) среде или градиенту потенциалов (приложенное напряжение, деленное на длину слоя носителя). Используются как низкие (100 – 600 В), так и высокие (600- 1000 В) напряжения. Высокие напряжения применяют в основном для разделения низкомолекулярных веществ.

Сопротивление. Подвижность молекул белка обратно пропорциональна сопротивлению, которое в свою очередь зависит от типа и размеров носителя и ионной силы буфера. Сопротивление возрастает с увеличением слоя носителя и уменьшается при увеличении его ширины, а также с возрастанием концентрации буферных ионов. В ходе электрофореза выделяется тепло, сопротивление при этом уменьшается. Таким образом, при постоянном напряжении такое нагревание приводит к увеличению силы тока и испарению растворителя. Для обеспечения максимальной воспроизводимости результатов применяют стабилизированные источники питания, которые автоматически поддерживают на постоянном уровне либо силу тока, либо напряжение, несмотря на неизбежные изменения сопротивления. Испарение сводят до минимума, накрывая прибор для электрофореза крышкой и проводя разделение веществ при температуре + 4 0С.

3. Характер буфера и его ионная сила.

Буфер создает и стабилизирует рН носителя, а также самым различным образом влияет на скорость движения разделяемых веществ. В качестве буферных растворов для электрофоретического разделения белковых молекул используют практически все буферные системы, применяемые для экстракции белков. Так, например, широко применяют трисглициновый, трис-цитратный буферы и др. Они обеспечивают широкий выбор диапазонов рН, ионной силы и подвижности катионов и анионов буферной системы, что обуславливает разделение белков без изменения их растворимости, химических свойств и биологической активности.

По мере увеличения ионной силы буфера скорость движения образца уменьшается. При высокой ионной силе буфера суммарный ток, обусловленный переносом ионов буфера и образца, увеличивается, и, следовательно, возрастает количество выделяемого тепла.

При низкой ионной силе ток, обусловленный переносом ионов буфера, уменьшается, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца, возрастает. При этом подвижность образца увеличивается. В буфере с низкой ионной силой общая сила тока и выделение тепла уменьшаются, но диффузия возрастает, вследствие чего разрешающая способность меньше, чем при высокой ионной силе. Таким образом, при выборе ионной силы приходится идти на компромисс. Применяющиеся обычно буферы имеют ионные силы в интервале концентраций от 0,005 до 0, моль/л.

4. Природа носителя.

Чаще всего в качестве носителей используют относительно инертные вещества, но их состав все же оказывает влияние на подвижность разделяемых веществ, поэтому выбор носителя зависит от природы образца.

Существует три основных типа электрофоретических систем:

1) электрофорез с подвижной границей (метод подвижной границы) без каких-либо опорных сред; 2) зональный (в основном с использованием опорных сред); 3) стационарный (или вытесняющий) электрофорез.

В системах первого типа электрическое поле прикладывается к исходно резкой границе между раствором макромолекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся частиц. В такой системе индивидуальные компоненты нельзя разделить на отдельные зоны, так как наслоенный сверху буферный раствор имеет более низкую плотность по сравнению с находящимся под ним раствором молекул. Если бы и удалось достигнуть разделения зон, то все равно произошло бы их перемешивание, так как плотность раствора внутри этих зон была бы выше, чем между ними. Электрофорез по методу подвижной границы нашел применение преимущественно при исследовании белков, в частности, свойств отдельных белков, анализе белковых смесей, оценке гетерогенности препаратов различных белков, изучению взаимодействий между белками и низкомолекулярными веществами, а также белков между собой. В настоящее время метод подвижной границы редко применяют в повседневной лабораторной практике ввиду доступности более удобных методик, не требующих такой сложной и дорогостоящей аппаратуры, как данный метод.

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон предотвращено. В основном это достигается путем применения опорных, поддерживающих сред, таких как фильтровальная или хроматографическая бумага, пленки из ацетата целлюлозы или различные гели (например, крахмальный, агаровый, полиакриламидный). Все перечисленные вещества образуют капиллярную структуру. Выбор опорной среды определяется конкретными условиями анализа. При использовании зонального электрофореза общая особенность состоит в том, что разделяемые вещества движутся в виде отчетливых зон, которые легко обнаружить соответствующим аналитическим методом.

Оборудование, необходимое для зонального электрофореза, состоит из двух частей: источника питания и собственно электрофоретического блока. Источник питания генерирует стабилизированный постоянный ток и имеет системы контроля напряжения и силы тока на выходе. Для работы с низким напряжением применяют источники питания с выходным напряжением до 600 В и силой тока до 150 мА. В электрофоретический блок входят электроды (угольные или платиновые), буферные камеры, опора для носителя и прозрачная изолирующая крышка.

Итак, преимущество зонального электрофореза в сравнении с методом подвижной границы заключается в следующем:

1) приборы для зонального электрофореза имеют простое устройство;

2) необходимое количество исследуемого материала весьма мало;

3) разделяемые вещества движутся в виде отчетливых зон, которые можно фиксировать в поддерживающей среде и выявлять с помощью специфического окрашивания;

4) разделение белковых фракций происходит довольно быстро;

5) зональный электрофорез применяется как в аналитических, так и в препаративных целях.

Стационарный (или вытесняющий) электрофорез характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода: изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез.

Этот метод стал широко применяться для разделения смесей макромолекул с 1950 года. Он фактически открыл путь для обширных аналитических исследований во многих отраслях биологии. К настоящему времени значение его снизилось в связи с использованием других сред, более подходящих для зонального электрофореза.

Электрофорез на бумаге – самый простой из электрофоретических методов. Носителем служит, как правило, специальная хроматографическая бумага, которая не требует никакой подготовки: ее просто нужно разрезать на куски требуемого размера. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. После электрофореза белки фиксируют высушиванием, а затем красят красителями, специфичными для белков. Окрашенные полосы белковых фракций можно хранить или, разрезав на участки, элюировать для фотометрического определения каждой фракции. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови удается получить до 5 фракций.

Бумага не является абсолютно инертным носителем и может адсорбировать некоторые вещества (это нежелательное ее свойство удается устранить при использовании ацетата целлюлозы). Кроме того, при электрофорезе на бумаге вследствие особенностей ее химического состава в той или иной степени проявляется электроэндоосмос (то есть возникновение заряда между молекулами буферного раствора и поверхностью носителя), что резко снижает разрешающую способность метода.

Электроэндоосмос менее заметен в носителе из ацетата целлюлозы, к тому же ацетат целлюлозы менее гидрофилен, чем бумага, поэтому он удерживает меньшее количество буферного раствора. Пленки из ацетата целлюлозы в качестве поддерживающей среды для электрофореза были предложены в 1957 году и с тех пор нашли широкое применение. Они несколько дороже хроматографической бумаги. Во многих случаях это препятствует их применению вместо бумаги при электрофорезе. Данный метод целесообразно применять для разделения малых количеств веществ. К тому же электрофорез на ацетате целлюлозы обладает более высокой разрешающей способностью по сравнению с электрофорезом на бумаге.

В 60-е годы предложена модифицированная поддерживающая среда - желатинизированный ацетат целлюлозы, получивший название целлогеля.

В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агаровый, полиакриламидный гели.

Характерной особенностью данной разновидности зонального электрофореза является высокая разрешающая способность. Дело в том, что гели являются не только поддерживающей средой, они функционируют как молекулярные сита. Принцип действия молекулярного сита состоит в том, что крупные молекулы двигаются через него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле. Гель-электрофорез особенно ценен для разделения смесей веществ, имеющих одинаковые заряды, но слегка различающих по массе.

Электрофорез в крахмальном геле был первым электрофоретическим методом, в котором для улучшения разделения веществ была использована среда, обладающая свойствами молекулярного сита. Этот метод предложен в 1955 году. Крахмал - это нерастворимый в воде полисахарид. В нативном состоянии он связывает некоторое количество воды и набухает, но не способен превратиться в жидкость при повышении температуры. Путем частичного кислотного гидролиза крахмал может быть превращен в форму, представляющую собой жидкий золь при температуре выше 700С и твердый гидрогель при комнатной температуре. Для электрофореза вполне подходит картофельный крахмал. Размер пор в геле определяется концентрацией крахмала и степенью его гидролиза. Наибольшее применение крахмальные гели нашли при разделении сложных смесей структурных и физиологически активных белков. Так, при разделении белков сыворотки крови удается получить 20 – 30 полос.

Агар, используемый в качестве носителя при электрофорезе, выделяют из клеточных мембран различных водорослей. Чистота и химический состав отдельных препаратов значительно различаются в зависимости от источника получения и способа очистки. Точная структура агара неизвестна. Вероятно, он содержит, по крайней мере, два полисахарида, а именно агарозу и агаропектин. Агар растворяется в водных растворах при нагревании на кипящей водяной бане, при 380С он застывает.

Агаровый гель механически прочен. После высушивания он превращается в прозрачную пленку, которую удобно фотометрировать оптическими методами и легко хранить. Кроме того, агар является и нетоксичным материалом. Агар и особенно агароза широко используются в биохимии в качестве поддерживающей среды при электрофорезе, в основном для исследования макромолекул. Агаровый гель содержит большое количество воды (концентрация агарозы и агаропектина в геле всего 1%), вследствие чего ионы в процессе электрофореза движутся очень быстро. Благодаря этому свойству агар очень удобен для разделения и обнаружения антигенов методом иммуноэлектрофореза.

Общими недостатками рассмотренных вариантов гельэлектрофореза являются наличие электроэндоосмоса (хотя и меньшего, чем на бумаге) и нестандартность материалов, используемых для приготовления гелей.

Самым перспективным из перечисленных выше гелей является полиакриламидный гель (ПААГ). Полиакриламидные гели введены в биологическую практику в 1959 году Раймондом. Они лишены недостатков, характерных для крахмального и агарового гелей.

Электрофорез в ПААГе в настоящее время является самым эффективным из существующих методов и широко используется в различных областях биологии. Этот метод обладает большей разрешающей способностью по сравнению с методами, где используются другие гели. Полиакриламидный гель прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен. Размер пор у ПААГа можно варьировать в широких пределах, его можно применять с самыми различными буферами, удобно использовать для количественного определения разделяемых веществ.

Полиакриламидный гель получают непосредственно перед работой полимеризацией акриламида и метиленбисакриламида.

акриламид При этом возникает полимер сетчатой структуры, в котором линейные участки из акриламида “сшиваются” поперечными мостиками из метиленбисакриламида. Чем больше концентрация метиленбисакриламида, тем более плотной получается сетчатая структура геля. Полимеризацию проводят в присутствии тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭДа) в качестве инициатора и персульфата аммония или калия как катализатора. Изменяя соотношение мономеров, можно регулировать величину ячеек получаемого полимера трехмерной структуры. Концентрация мономера от двух до 30% дает возможность получать гели пористостью от 40 до 0,1 нм. Полиакриламидный гель дает возможность исследовать растворы разной концентрации и в небольших объемах (до 0,001 мл), использовать охлаждение и проводить разделение очень быстро – в течение 60 – 70 минут.

При разделении макромолекул на полиакриламидном геле адсорбция и электроосмос малы. Полиакриламидный гель не поглощает ультрафиолетовый свет при 270 нм, и, следовательно, местоположение белков после разделения можно определить по поглощению при этой длине волны. И, наконец, после разделения молекул их можно окрашивать и определять количество вещества с помощью денситометра – прибора, измеряющего оптическую плотность.

Вариантов проведения электрофореза в полиакриламидном геле много (вертикальный и горизонтальный, в трубках и на пластинах). Чаще других используют метод вертикального электофореза. В нем сочетаются две системы полиакриламидных гелей: крупнопористая (верхний гель) и мелкопористая (нижний гель). В верхнем геле происходит отделение клеточного материала и уплотнение белков. В нижнем геле происходит разделение белков.

Электрофорез в ПААГе часто называют диск-электофорезом. Это название происходит от двух английских слов – discontinuity, обозначающего в данном случае неоднородность электрофоретической среды, и discoid – дискоообразный. Дело в том, что по случайному совпадению при стандартных условиях проведения опыта разделенные зоны имеют форму дисков.

Для диск-электрофореза характерны скачкообразные изменения pH, концентрации геля и градиента напряжения. Как известно, нижняя часть трубки заполнена разделяющим гелем с порами, которые действуют как молекулярное сито по отношению к разделяемым молекулам. Над разделяющим гелем имеется концентрирующий гель, имеющий крупные поры и поэтому не обладающий свойствами молекулярного сита, а еще выше располагается стартовый гель, содержащий пробу и краситель, использующийся в качестве свидетеля. Смысл диск-электрофореза состоит в создании очень узкой стартовой зоны, которая обеспечивает высокую разрешающую способность. Как это достигается?

Дело в том, что в состав как электродного буфера, так и буфера концентрирующего геля входит слабое аминное основание - трис, но в электродный буфер к трису прибавлена слабая кислота глицин (трисглициновый буфер, pH = 8,3), а концентрирующий гель содержит соляную кислоту, что дает буферную систему трис-HCl, pH = 6,7 (рис. 6.1.).

Глицин при pH = 8,3 находится в виде цвиттериона (биполярного иона) и только 5% приходится на долю глицинатного аниона. В электрическом поле глицинатные ионы, движущиеся из верхнего резервуара в концентрирующий гель, имеют гораздо меньшую подвижность, чем ионы хлора, и, следовательно, ”тянутся” позади них. В среде верхнего геля при pH=6,7 подвижность глицинатных ионов становится еще меньше, так как в результате дополнительного протонирования увеличивается количество цвиттерионов (изоэлектрическая точка глицина).

Ионы хлора, наоборот, продвигаются очень быстро, и между этими двумя разновидностями ионов возникает граница раздела. Так как и ионы хлора, и глицинатные ионы представляют собой часть одной и той же электрической системы, то в области локализации менее подвижных глицинатных ионов напряжение увеличивается, а в области более подвижных ионов хлора – уменьшается. Следовательно, замыкающие ионы будут стремиться догнать ведущие, а белковые анионы, промежуточные по подвижности, будут располагаться между первыми и вторыми ионами. В итоге происходит концентрирование белковых анионов позади ведущих ионов. Образуется чрезвычайно узкая белковая полоса, которая подходит к разделяющему гелю вслед за ионами хлора.

Рис. 6.1. Разделение белков с помощью диск-электрофореза - крупнопористая противоконвекционная среда Когда замыкающие глицинатные ионы доходят до нижнего геля, их число и подвижность увеличиваются, поскольку значение pH = 9,5 приближается к pK глицина. Теперь подвижность глицинатных ионов становится выше, чем у белковых анионов, подвижность которых замедляется в разделительном геле вследствие эффекта молекулярного сита.

Глицинатные ионы перегоняют все белковые молекулы и догоняют анионы хлора. Как только последний ион хлора уходит из нижнего геля, pH повышается, потому что ионы хлора заменяются более основными глицинатными, и вместо исходной буферной системы трис-HCI образуется трис-глициновый буфер. Вследствие этого возрастает отрицательный заряд белковых анионов, и их движение происходит в соответствии с величинами отношения заряд/масса.

Метод электрофореза в полиакриламидном геле широко используется в различных отраслях биологических, экологических и медицинских исследований. Приведем лишь некоторые примеры его применения:

1) в медицине (диагностика заболеваний - изучение белков и ферментов различных органов и тканей в норме и патологии);

2) в серологии (разделение белков сыворотки крови для определения родов и видов и их идентификации);

3) в генетике (выявление мутаций путем изучения белковых спектров);

4) в гистологии и цитологии (анализ компонентов клеточных фрагментов и тканей);

5) в ботанике (исследование белков семян растений);

6) в микробиологии (изучение белков бактерий, вирусов и фагов, определение принадлежности микроорганизмов к определенному штамму);

7) в биохимии (изучение белковых спектров, множественных молекулярных форм ферментов, разделение смесей нуклеиновых кислот в различных органах и тканях организмов);

8) в экологии (изучение влияния абиотических и биотических факторов окружающей среды на биохимические показатели обитающих в ней организмов).

Работа 1. Фракционирование белков методом электрофореза в полиакриламидном геле Разделение белков осуществляют в слабощелочной среде (pH 8,3 Оборудование и реактивы. Прибор для электрофореза фирмы “Реанал”, универсальный источник питания, рефрактометр, лейкопластырь, ножницы, парафин, набор пипеток и микропипеток, соляная кислота: С(HCl) = 1 моль/л, триоксиметиламинометан (трис), ТЕМЭД, акриламид, N,N - метиленбисакриламид, персульфат аммония, сахароза (40%-ный раствор), глицин, амидовый черный 10 В (1%-ный раствор в смеси этанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 10:1:30), уксусная кислота (7%-ный раствор), рибофлавин, свежепрокипяченная дистиллированная вода.

Материалы.

Сыворотка крови. Цельную кровь в широких пробирках оставляют на сутки в холодильнике. Для лучшего отделения сгустка содержимое пробирок обводят вязальной спицей. Через сутки сыворотку отбирают пипеткой с резиновой грушей. Чистая сыворотка имеет соломенножелтый цвет. Если есть в сыворотке крови примесь форменных элементов (красный оттенок), то ее центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин.

Экстракт белков хирономид, моллюсков. 1 г хирономид, моллюсков замораживают в морозильной камере холодильника, а затем растирают в фарфоровой ступке с 2 мл трис-глицинового буфера (pH = 8,6). Экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 10 000 - 12 000 об/мин. Отбирают надосадочную жидкость. Для нанесения на гель готовят раствор в 40%ной сахарозе.

Выполнение работы Приготовление колонок полиакриламидного геля Для приготовления нижнего и верхнего геля используют следующие исходные растворы (их можно хранить месяц в холодильнике):

Раствор А: раствор соляной кислоты: C(HCl) = 1 моль/л – 48 мл;

трис – 36,6 г.; ТЕМЭД – 0,23 мл; вода – до 100 мл (pH = 8.6).

Раствор Б: раствор соляной кислоты C(HCl) = 1 моль/л - 48 мл;

трис-5,98 г; ТЕМЭД – 0.46 мл; вода – до 100 мл (pH = 6.7).

Раствор В: акриламид - 30 г; бисакриламид – 0,735 г; вода – до 100 мл.

Раствор Г: акриламид –10 г; бисакриламид – 2,5 г; вода –до 100 мл.

Раствор Д: рибофлавин – 4,0 мг; вода – до 100 мл.

Раствор Е: сахароза – 40 г; вода – до 100 мл.

Раствор Ж: персульфат аммония – 0,14 г; вода –до 100 мл.

Процесс полимеризации геля ведут без доступа кислорода. С этой целью нижние концы сухих обезжиренных электрофоретических трубок (диаметр 0,6 см, длина 8 см) закрывают водонепроницаемыми донышками из лейкопластыря и закрепляют их парафином. Из запасных растворов, доведенных до комнатной температуры, готовят смесь для нижнего, разделительного геля. Для этого смешивают 1 часть раствора А, 2 части раствора В, 1 часть воды и 4 части раствора Ж. Эту смесь перемешивают и заливают в электрофоретические трубки (примерно 2 мл).

На смесь сразу наслаивают пипеткой по стенке колонки слой свежепрокипяченной дистиллированной воды высотой примерно 8 мм. Полимеризация нижнего геля при комнатной температуре продолжается около часа. Для ускорения процесса полимеризации трубки с гелем помещают в термостат при температуре +370С. Полимеризация геля в термостате длится около 30 мин. Об окончании процесса полимеризации нижнего геля можно судить по появлению четкой границы между гелем и слоем воды над ним. После окончания процесса полимеризации геля с него удаляют воду и заливают в колонку смесь для верхнего геля. Для этого смешивают 1 часть раствора Б, 2 части раствора Г, 1 часть раствора Д и 4 части раствора Е. Смесь для верхнего геля наносят высотой 0,5 см, что составляет примерно 0,2 мл. На эту смесь снова наслаивают воду и ведут полимеризацию верхнего геля на солнечном свету или под УФ-лампой.

Начало полимеризации определяют по переходу флуоресцирующего желто-зеленого цвета смеси в опаловый, а конец – по резкой границе между гелем и водой. Полимеризация верхнего геля длится 10-15 мин.

После удаления воды колонки готовы для нанесения исследуемого раствора.

Подготовка материала для электрофоретического разделения Оптимальное количество вносимого однородного белка на одну гелевую колонку - от 10 до 100 мкг. При выполнении данной работы следует вносить 200 мкг, так как белки сыворотки крови неоднородны.

Следующий этап работы - определение содержания белка в исследуемом экстракте или сыворотке крови и разведение его до нужной концентрации. Для количественного определения содержания белка в биологическом материале чаще всего используют рефрактометрический метод или один из колориметрических методов. После определения содержания белка сыворотку крови разводят 40%-ным раствором сахарозы до концентрации 2000 мкг в мл (на одну гелевую колонку наносят по 0,1 мл раствора, содержащего 200 мкг белка). Так как в сыворотке крови содержится примерно 9% белка, то ее разводят раствором сахарозы в 45 раз. По 0,1 мл полученного раствора сыворотки крови наносят на приготовленный гель. Затем трубки доверху заполняют трисглициновым буфером, разбавленным в 10 раз, снимают водонепроницаемые донышки и укрепляют колонки в приборе для электрофореза.

Для приготовления трис-глицинового буфера (pH = 8,6) берут 6 г триса и 28,8 г глицина, растворяют их в воде и доводят объем до 1 л дистиллированной водой в мерной колбе. Этот же раствор, разбавленный дистиллированной водой в 10 раз, используют для заправки электродных камер прибора для электрофореза. Такой разведенный буферный раствор называют электродным буфером. Его ионная сила равна 0,075.

Монтаж прибора для электрофореза в полиакриламидном геле Основные части прибора представлены на рис. 6.2.

Рис. 6.2. Схема прибора для электрофореза в полиакриламидном геле:

1 - мелкопористый гель; 2 - крупнопористый гель;

3 - исследуемый раствор белка; 4 - стеклянная трубочка;

5, 6 - электроды; 7 - верхний резервуар для катодного буфера;

8, 10 - электродные буферы; 9 - нижний резервуар Угольный электрод закрепляют в центре нижнего буферного резервуара и наливают в последний охлажденный электродный трисглициновый буфер (pH = 8,6). Затем стеклянные трубки с нанесенными образцами ввинчивают в отверстия, просверленные в дне верхнего резервуара. Устанавливают электрод верхнего резервуара и собранную верхнюю часть прибора присоединяют к нижнему резервуару так, чтобы концы трубок были погружены в буферный раствор нижнего резервуара.

Удаляют воздушные пузырьки с концов трубок. Осторожно заполняют верхний резервуар трис-глициновым буфером, разбавленным в 10 раз, следя за тем, чтобы электрод был полностью погружен в раствор. В верхний резервуар добавляют 2 мл раствора бромфенолового синего, служащего индикатором окончания электрофореза.

Проведение электрофореза Прибор для электрофореза подключают к универсальному источнику питания марки УИП-1. В качестве источника питания можно использовать также блок питания от аппаратов электрофореза на бумаге. На каждую колонку подают первые 10 - 15 минут силу тока 2 мА, а затем 5 мА, напряжение от 300 до 600 В, длительность электрофореза 60 – 70 мин, температура не выше +40С (прибор для электрофореза помещают в холодильник). Электрофорез заканчивают, когда индикаторная краска окажется на расстоянии 5 – 6 мм от нижнего края трубки. По окончании электрофореза прибор разбирают, трубки вынимают и извлекают из них гель. Отслаивание геля от стенок стеклянных трубок проводят тонкой металлической иглой. Хорошо использовать с этой целью мандрену от шприцевой иглы или шприц, наполненный водой. Колонку на время извлечения геля с помощью металлической иглы помещают в кристаллизатор с водой. После извлечения гелевую колонку помещают в пробирку и быстро дважды промывают дистиллированной водой. Затем ее заливают 7%-ным раствором уксусной кислоты на 15-20 минут для фиксации зон расположения белков и отмывают дистиллированной водой (10 – 15 минут). Замечено, что чем лучше произошла фиксация, тем быстрее и легче отмывается гель от красителя впоследствии.

Обнаружение белковых фракций Расположение фиксированных уксусной кислотой белковых фракций на колонках полиакриламидного геля определяют, окрашивая их 1%-ным раствором амидового черного 10 В в смеси этанола, уксусной кислоты, воды (10:1:30). Для этого гелевые колонки опускают в раствор красителя на 1 мин. В результате вся колонка окрашивается в темный цвет, но только белковые фракции удерживают краситель прочно. От остальной части геля он отмывается смесью этанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 10:1:30, заменяемой многократно.

Электрофореграмму (схему расположения белковых фракций на гелевой колонке) нужно зарисовать в тетради. Каждая белковая фракция может быть охарактеризована по интенсивности окраски и по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП). ОЭП белковых фракций рассчитывают, деля длину пути, пройденного фракцией, на длину пути, пройденного индикаторной краской. Тот и другой путь измеряют с точностью до десятых долей миллиметра, а ОЭП рассчитывают с точностью до сотых долей.

При сравнении электрофореграмм на основании статистической обработки данных разницу в 0,01 значения ОЭП у двух фракций с величинами ОЭП вдоль колонки в пределах от 0 до 0,3 считают несущественной. Аналогично этому разницу значения ОЭП 0,02 считают несущественной в пределах от 0,3 до 0,6, а разницу в 0,03 - в пределах от 0,6 до 1,0.

Гелевые колонки после окрашивания можно фотографировать в проходящем свете, используя для этого ультрахемоскоп (столик для просмотра хроматограмм), на пленку КН-1 при помощи открытой диафрагмы фотоаппарата (лучше зеркальная камера “Зенит” с удлиненными кольцами) при выдержке 1/30 с.

Для количественного определения белков гели фотометрируют.

Хранение и реставрация гелей Гелевые колонки с окрашенными белковыми фракциями хранят много месяцев в отмывающем растворе в плотно закрытых пробирках.

Высохшие электрофореграммы могут быть размочены и реставрированы в этом же отмывающем растворе.