«В.Н. Казин, Г.А. Урванцева ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ЭКОЛОГИИ И БИОЛОГИИ Учебное пособие Ярославль 2002 ББК Ес25я73 К 14 УДК 543.87 Казин В.Н., Урванцева Г.А. Физико-химические методы исследования в ...»

Техника безопасности при работе методом электрофореза 1. Необходимо соблюдать осторожность при работе с прибором для электрофореза, составной частью которого является источник питания УИП-1, имеющий высокое напряжение (до 600 В). Он должен быть надежно заземлен. Кроме того, и другие части прибора находятся под напряжением, поэтому при эксплуатации прибора следует быть осторожным.

2. Изоляция соединительных проводов должна быть безупречной.

3. Необходимо помнить, что акриламид обладает определенной токсичностью, что вызывает раздражение кожи. В связи с этим при работе с акриламидом надо остерегаться его попадания на кожу.

1. Что такое электрофорез и какие биологические макромолекулы можно изучать с помощью метода электрофореза?

2. Чем обусловлен суммарный электрический заряд белков?

3. От чего зависит подвижность белков в электрическом поле?

4. Какие разновидности электрофореза Вы знаете? В чем преимущество методов зонального электрофореза?

5. В чем состоит отличие электрофореза в гелях от других видов электрофореза? Каковы преимущества полиакриламидного геля?

6. Применение метода электрофореза в биологических и экологических исследованиях.

7. В чем заключаются основные этапы разделения белков методом электрофореза в полиакриламидном геле?

1. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение, 1975. С. 45-60.

2. Гааль Г., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. 446 с.

3. Урванцева Г.А., Рязанова А.В. Биохимические методы анализа: Учеб.

пособие / Яросл. гос. ун-т. Ярославль, 1982. С. 3-22.

4. Девени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Мир, 1976.

364 с.

5. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.: Мир, 1971. 247 с.

6. Методы практической биохимии / Под ред. С.Е. Северина, А.Д. Виноградова. М.: Мир, 1978. С. 114 - 137.

7. Королева Е.И., Мешкова Н.П. Практическое руководство к занятиям по биохимии животных. М.: Изд-во МГУ, 1972. 90 с.

8. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М.: Высш. школа, 1975. С. 103-121, 313-329.

9. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот (электрофорез и центрифугирование). М.: Наука, 1981. 279 с.

10. Гаспаров В.С., Дектярь В.С. Определение белка по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250 // Биохимия. 1994. Т. 56.

№ 6. С. 763-767.

11. Коничева А.П., Егорова Т.А., Филиппович Ю.Б. Изучение разнообразия белков гемолимфы различных пород тутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле // Биохимия насекомых. М.: Наука, 1975.

С. 141-156.

6.7. Метод энзимэлектрофореза Существует несколько способов обнаружения ферментов методом электрофореза в полиакриламидном геле, но основными являются два: окрашивание геля и электрофорез в гелях, содержащих субстрат.

Окрашивание геля заключается в следующем. Гель вынимают из трубки и выявляют ферментативную активность отдельных белковых фракций непосредственно на гелевых колонках с помощью химических реакций, протекающих в специально подготовленных инкубационных средах. Инкубационные среды специфичны для каждого фермента. В местах локализации фермента обнаруживают окрашенные зоны. При втором способе субстрат вводят в гель, а затем инкубируют гель при нормальных условиях с соответствующими красителями.

Работа 1. Обнаружение амилазы в тканях животного происхождения методом электрофореза Ферменты амилазного комплекса ускоряют гидролиз полисахаридов (крахмала, гликогена) с образованием разнообразных промежуточных и конечных продуктов.

Как известно, крахмал существует в двух формах: в виде амилозы и амилопектина. Амилоза состоит из длинных неразветвленных цепей, в которых все Д-глюкозные остатки соединены -1,4 связями. Цепи эти полидисперсны. Их молекулярная масса варьирует от нескольких тысяч до 500 000. В воде амилоза не дает истинного раствора, но образует гидратированные мицеллы, которые при добавлении йода окрашиваются в синий цвет. Цепи амилопектина сильно разветвлены. Остов молекулы амилопектина имеет -1,4 гликозидные связи, а в точках ветвления связи. Амилопектин образует коллоидные растворы, которые при добавлении йода окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Молекулярная масса амилопектина может достигать 1 млн.

Основные компоненты крахмала гидролизуются ферментативным путем разными способами. Амилоза может быть гидролизована при участии - и -амилаз. -амилаза или 1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, ускоряет гидролиз -1,4 связей без какого-либо определенного порядка, в результате чего сначала возникают олигосахариды, которые также подвержены действию -амилазы, если они содержат три и более остатков Д-глюкозы. В конечном счете получается смесь -мальтозы и Д-глюкозы. -амилаза найдена у всех растений и животных.

Фермент -амилаза (или -1,4-глюканмальтогидролаза) ускоряет реакцию гидролиза амилозы по 1,4 связям, последовательно отщепляя остатки -мальтозы с нередуцирующего конца. -амилаза характерна только для высших растений.

В природе найдена также -амилаза, или -1,4-глюканглюкогидролаза, ускоряющая гидролиз 1,4-связей в крахмале так, что последовательно отщепляются остатки глюкозы, начиная с нередуцирующего конца.

Амилопектин также гидролизуется при участии,, -амилаз, но так как все эти амилазы не способны расщеплять -1,6-связи в точках ветвления амилопектина, то конечным продуктом при действии амилаз на амилопектин является крупная, сильно разветвленная "сердцевина" полисахарида, называемая остаточным декстрином. -1,4связи в нем гидролизуются при участии особых ферментов ( -1,6глюкозидаз).

В исследуемых препаратах в основном содержится -амилаза.

Выявление ферментативной активности амилазы проводят, используя реакцию взаимодействия крахмала и продуктов его гидролиза с йодом.

Оборудование и реактивы. Приборы и реактивы для определения белка по методу Лоури, приборы и реактивы для проведения электрофореза в ПААГе, трис-глициновый буфер, разбавленный в 5 раз, 1%-ный раствор растворимого крахмала, ацетатный буфер (рН = 5,6), раствор йода, тканевые экстракты, термостат на 37°С.

Выполнение работы Колонки полиакриламидного геля готовят в соответствии с прописью, приведенной ранее (работа 1, стр. 105-106), только вместо 1 части воды при приготовлении нижнего геля берут 1 часть раствора крахмала.

В исследуемом образце определяют содержание белка по методу Лоури и разбавляют его 40%-ным раствором сахарозы до содержания белка 4 000 - 6 000 мкг/мл. На каждую колонку полиакриламидного геля наносят по 0,1 мл белкового экстракта, содержащего 400 - 600 мкг белка, и проводят электрофоретическое разделение по методу, описанному ниже.

По завершении электрофореза гелевую колонку извлекают из трубки и инкубируют в ацетатном буфере (рН = 5,6) при 37°С в течение часа, затем буферный раствор сливают, гель промывают водой и заливают раствором йода.

ВНИМАНИЕ! Перед употреблением раствор йода разбавляют в 6 раз.

Окрашивание проводят в течение 1 – 3 минут. Далее раствор йода сливают и гелевые колонки заливают водой. Гелевая колонка окрашивается в синий цвет, а в отдельных зонах, где разрушен крахмал, введенный в состав геля, имеются неокрашенные участки. Эти участки показывают наличие -амилазы.

Схему расположения форм -амилазы на гелевой колонке нарисовать в тетради, посчитать ОЭП фракций.

1. В чем состоит метод энзимэлектрофореза? Каковы способы обнаружения ферментов методом энзимэлектрофореза?

2. Каков принцип действия амилаз?

3. Каков принцип выявления -амилазы методом энзимэлектрофореза в полиакриламидном геле?

Работа 2. Обнаружение арилэстеразы в тканях животного происхождения методом электрофореза Оборудование и реактивы. Приборы и реактивы для определения белка по методу Лоури; приборы и реактивы для проведения электрофореза в ПААГе; трис-глициновый буфер, разбавленный в 5 раз; 1%-ный раствор 1-нафтилацетата в 50%-ном растворе ацетона; трис-HCl буфер:

С(трис-HCl-буфера) = 0,2 моль/л (рН = 7,1); раствор прочного синего ( мг в 1 мл); тканевые экстракты; термостат на 37°С.

Выполнение работы Колонки полиакриламидного геля готовят в соответствии с прописью, приведенной ранее (работа 1, стр. 105-106), только вместо 1 части воды при приготовлении нижнего геля берут 1 часть раствора крахмала.

В исследуемом образце определяют содержание белка по методу Лоури и разбавляют его 40%-ным раствором сахарозы до содержания белка 4000 - 6000 мкг/мл. На каждую колонку полиакриламидного геля наносят по 0,1 белкового экстракта и проводят электрофоретическое разделение белков.

По завершении электрофореза гелевую колонку, извлеченную из стеклянной трубки, промывают дистиллированной водой и помещают в заранее подготовленную в пробирке инкубационную смесь, состоящую из 9 мл трис-HCl буфера С(трис-HCl буфера) = 0,2 моль/л (рН = 7,1) и 0,5 мл 1%-ного раствора 1-нафтилацетата в 50%-ном растворе ацетона.

Содержимое пробирки (вместе с гелем) тщательно перемешивают и оставляют на 10 – 15 минут в термостате при 37°С. Затем приливают 1 мл раствора прочного синего Б, перемешивают и оставляют в термостате еще на 10 – 20 минут. Белковые фракции, обладающие эстеразной активностью, выявляются на колонке в виде зон, окрашенных в коричневый цвет (от 2 до 6 фракций). Окраска развивается в результате сочетания между I-нафтолом, освобождающимся при гидролизе субстрата (Iнафтилацетата) в присутствии эстеразы, и солью диазония (прочным синим Б) с образованием нерастворимого азосоединения.

Схему расположения белковых фракций, обладающих эстеразной активностью, зарисовать в тетради. Посчитать ОЭП полученных фракций.

1. К какому классу и подклассу ферментов относится арилэстераза?

2. Каковы принципы выявления арилэстеразы методом электрофореза в полиакриламидном геле?

Работа 3. Обнаружение кислой фосфатазы методом электрофореза в полиакриламидном геле Оборудование и реактивы. Приборы и реактивы для определения белка по методу Лоури; приборы и реактивы для проведения электрофореза в ПААГе; трис-глициновый буфер, разбавленный в 5 раз; ацетатный буфер: С(ацетатного буфера) = 0,2 моль/л (рН = 4,8); I-нафтилфосфат;

прочный синий Б; тканевые экстракты; термостат на 37°С.

Кислая фосфатаза принадлежит к классу гидролаз. Фосфатазы расщепляют эфирную связь между фосфатом и остатком спирта (R):

Данный фермент имеет огромное значение в общем метаболизме клетки. Кислая фосфатаза принимает участие как в деструктивных процессах, так и в реакциях анаболизма, являясь ключевым ферментом благодаря широкой субстратной специфичности и многообразию изоформ, которыми представлен энзим в клетках большинства организмов.

Все это вызывает давний и заслуженный интерес как теоретического, так и прикладного характера к изучению кислой фосфатазы.

Кислая фосфатаза (фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты, 3.1.3.2).

Колонки полиакриламидного геля готовят в соответствии с приведенной ранее прописью. В исследуемом образце определяют содержание белка по методу Лоури и разбавляют его 40%-ным раствором сахарозы до содержания белка 4000 - 6000 мкг/мл. На каждую колонку полиакриламидного геля наносят по 0,1 белкового экстракта и проводят электрофоретическое разделение белков.

Для обнаружения кислой фосфатазы гелевую колонку с электрофоретически фракционированными белками помещают сначала в инкубационную смесь, состоящую из 9 мл ацетатного буфера: С(ацетатного буфера) = 0,2 моль/л (рН = 4,8) и 3 мг I-нафтилфосфата на 10 минут (выдерживают в термостате при 37°С). Затем в смесь добавляют 1 мл раствора прочного синего Б (2 мг в 1 мл воды) и выдерживают в термостате еще 20 минут. Зоны локализации кислой фосфатазы окрашиваются в малиново-красный цвет.

Окраска развивается в результате взаимодействия между 1нафтолом, образующимся при гидролизе субстрата (1-нафтилфосфата) в присутствии кислой фосфатазы, и солью диазония (прочным синим Б) с образованием нерастворимого азосоединения.

Схему расположения белковых фракций, обладающих эстеразной активностью, зарисовать в тетради. Подсчитать ОЭП полученных фракций.

1. К какому классу и подклассу ферментов относится кислая фосфатаза?

2. Каковы принципы выявления кислой фосфатазы методом электрофореза в полиакриламидном геле?

1. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение, 1976. С. 106-115.

2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т. Пер. с англ. М.: Мир, 1985.

С. 226-267.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Общие принципы хроматографии 7.1. История развития хроматографических определения и теоретические основы Хроматографический метод разделения и анализа веществ открыт в 1903 году русским ботаником М.С. Цветом при пропускании сложной смеси растительных пигментов (петролейно-эфирной вытяжки из листьев растений) через трубку (колонку) с карбонатом кальция. В колонке образовался ряд окрашенных зон, что и дало название методу. Слово “хроматография” состоит из двух корней греческого происхождения, означающих “цвет” и “писать”. М.С. Цвет назвал метод хроматографией, то есть цветописью, указывая на возможность разделения и бесцветных веществ. Автор метода опубликовал ряд статей по хроматографии, однако метод не развивался вплоть до 1931 года, когда Куном, Винтерштейном и Ледераром были воспроизведены опыты М.С. Цвета. Более того, им удалось выделить в кристаллическом виде - и -каротины из сырого каротина и продемонстрировать препаративную ценность метода.

В 1938 году появился вариант тонкослойной хроматографии. Он был предложен отечественными учеными Н.А. Измайловым и М.С. Шрайбер. Однако широкие возможности этого метода были открыты позднее благодаря работам Ю. Кирхнера и Э. Шталя.

Началом современной хроматографии принято считать 1941 год, когда американские ученые Л. Мартин и Р. Синдж разработали метод распределительной хроматографии и дали его теоретическое обоснование. Эти же авторы указали на возможность осуществления газожидкостной хроматографии. Середина 70-х годов 20 века ознаменована рождением высокоэффективной колоночной хроматографии (ВЭКХ). В это время появились первые жидкостные хроматографы. В настоящее время хроматография - один из самых распространенных методов в исследовательской работе, нашедший применение в биологии, экологии и на производстве.

Хроматографией называют физико-химический метод, основанный на различии скорости переноса растворенных веществ в системе двух фаз, одна из которых подвижна.

Отличительной чертой хроматографического метода является разделение смеси веществ на основе распределения между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижная, а другая - подвижная, непрерывно протекающая через неподвижную фазу. В роли подвижной фазы чаще всего выступает газ или жидкость, а в качестве неподвижной фазы - жидкость или твердое вещество. Разделение может происходить за счет установления:

а) адсорбционного равновесия между неподвижной твердой и подвижной жидкой фазами (адсорбционная хроматография);

б) равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной газовой фазами (газо-жидкостная хроматография);

в) равновесного распределения между неподвижной жидкой и подвижной жидкой фазами (хроматография на бумаге);

г) ионообменного равновесия между ионообменной смолой (неподвижная фаза) и электролитом (подвижная фаза) (ионообменная хроматография);

д) равновесия между жидкой фазой на внутренней и внешней поверхностях пористой структуры или "молекулярного сита" (эксклюзионная или проникающая хроматография);

е) равновесного связывания макромолекулы с малой молекулой, по отношению к которой она проявляет высокую биологическую специфичность, а следовательно, и сродство (аффинная хроматография).

Во всех случаях разделение компонентов происходит вследствие разности в коэффициентах распределения между подвижной и неподвижной фазами. Закон распределения описывает динамическое равновесие, в котором молекулы непрерывно обмениваются между фазами. Равновесное распределение анализируемого вещества между несмешивающимися фазами характеризуется коэффициентом распределения К.

Коэффициент распределения определяется как отношение концентраций анализируемого вещества в подвижной и неподвижной фазе. Его можно выразить, написав вместо концентраций среднее время пребывания молекул каждого из компонентов в неподвижной и подвижной фазах:

где C, - концентрация и время пребывания молекул компонентов в неподвижной (m) и подвижной (s) фазах соответственно.

Понятие "коэффициент распределения", взятое из закона распределения Нернста, является основополагающим в хроматографии. Величина его зависит только от природы подвижной и неподвижной фаз и температуры. Относительная скорость движения анализируемого вещества обратно пропорциональна коэффициенту распределения К. При больших значениях коэффициента распределения большая часть вещества находится в неподвижной фазе и поэтому не перемещается. Напротив, если коэффициент мал, то это растворенное вещество перемещается с подвижной фазой. При отсутствии взаимодействия растворенных веществ с подвижной и неподвижной фазами в системе быстро устанавливается термодинамическое равновесие, в котором каждому компоненту соответствует определенное среднее время пребывания в подвижкой фазе. Чем больше это время, тем быстрее компонент перемещается с подвижной фазой. Наибольшая скорость, равная скорости перемещения подвижной фазы, наблюдается при К = 0. Наименьшая скорость, равная нулю, отвечает случаю, когда компонент не растворяется в подвижной фазе. Различие молекул компонентов по скоростям движения приводит к разделению их на группы, перемещающиеся с различными скоростями.

Подбор фаз для хроматографического разделения производится так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси в них были различными. Термином "эффективный коэффициент распределения" обозначают отношение общего количества вещества (в отличие от концентрации) в одной фазе к общему количеству этого вещества в другой фазе, следовательно, это есть произведение коэффициента распределения вещества и отношения объемов обеих фаз.

хроматографических методов Многообразие вариантов хроматографического метода вызвало необходимость их систематизации. Предложено несколько классификаций хроматографических систем. Наиболее распространенной является систематизация их по 4 признакам.

1. В зависимости от агрегатного состояния фаз. Сюда отнесены два варианта хроматографии - газовая (газо-адсорбционная и газожидкостная) и жидкостная (жидкостно-жидкостная и жидкостноадсорбционная).

Газовая хроматография. Подвижной фазой является газ (или пар).

В газо-адсорбционной (точнее, газо-твердой) хроматографии неподвижной фазой является твердый адсорбент, а в газо-жидкостной - жидкость, нанесенная на твердый носитель.

Жидкостная хроматография. Подвижной фазой служит жидкость.

В жидкостно-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой является твердый адсорбент, в жидкостно-жидкостной хроматографии жидкость, удерживаемая твердым носителем, в ионообменной - сорбентионит.

2. В зависимости от механизма, лежащего в основе равновесного распределения. Включает адсорбционную, распределительную (хроматография на бумаге), ионообменную, проникающую и аффинную хроматографии. Для каждой из них характерны свои особенности.

Адсорбционная хроматография. Разделение основано на различиях в адсорбируемости компонентов смеси на данном адсорбенте.

Распределительная хроматография. Разделение основано на различии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной фазах.

Ионообменная хроматография. Разделение зависит от констант равновесия между ионообменной смолой (неподвижной фазой) и электролитом (подвижной фазой).

Проникающая хроматография (эксклюзионная, гель-хроматография). Деление веществ обусловлено тем, что молекулы разделяемой смеси отличаются по размеру и, следовательно, обладают разной способностью проникать в поры геля (неподвижную фазу).

Аффинная хроматография. Основана на уникальном свойстве макромолекул - их биологической специфичности. Широко используется для очистки высокомолекулярных биологических соединений.

3. В зависимости от формы проведения процесса. Различают колоночную и плоскостную (тонкослойную и бумажную) хроматографии.

Колоночная хроматография отличается тем, что процесс проводится в хроматографических колонках - трубках, которые наполнены адсорбентом или носителем, содержащим подвижную фазу.

Плоскостная (планарная) хроматография осуществляется в плоском слое сорбента (неподвижной фазе). Она различается на бумажную и тонкослойную хроматографию. В первой в качестве сорбента используется специальная бумага, во второй процессы разделения происходят в тонких слоях сорбента, нанесенного на инертную твердую подложку или в пленках пористого полимерного материала.

4. В зависимости от цели проведения хроматографического процесса различают аналитическую, неаналитическую, препаративную и промышленную хроматографии.

Аналитическая хроматография предназначена для определения качественного и количественного состава исследуемых смесей.

Неаналитическая хроматография - метод исследования физикохимических характеристик веществ при использовании хроматографической аппаратуры.

Препаративная хроматография применяется для выделения небольших количеств очень чистых компонентов в лабораторных условиях.

Промышленная хроматография применяется для выделения чистых веществ в значительных количествах.

В последнее время появились приборы, позволяющие проводить разделение соединений методами хроматографии под высоким давлением. В этом случае неподвижную фазу помещают в узкую стальную колонку, в которую затем под давлением нагнетают подвижную жидкую фазу. Применение высокого давления позволяет использовать значительно более длинные колонки и одновременно сокращать время разделения. Метод универсален, так как может применяться в адсорбционной, распределительной, ионообменной и проникающей хроматографиях.

7.3. Применение методов хроматографии Наибольшей разрешающей способностью отличается интенсивно разрабатываемая в последние годы высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Этот метод хроматографии позволяет проводить микроколичественный анализ веществ в ультрамалых количествах и за короткое время с использованием высокочувствительных детекторов в микроколоночном варианте. Удобство и быстрота обработка аналитической информации, получаемой на хроматографах, обеспечивается вычислительным комплексом, укомплектованным пакетом программ широкого назначения. ВЭЖХ приходит на смену гель-проникающей хроматографии и другим хроматографическим методам. Метод широко применяется для анализа белков, производных аминокислот и других соединений.

Простота, эффективность, универсальность хроматографических методов обусловили их широкое применение в биологии,экологии, химии, физике, медицине и многих других направлениях, в лабораторных и промышленных условиях.

Хроматографические методы находят с каждым годом все большее применение в анализе и мониторинге токсикантов в окружающей среде.

В литературе описано достаточно большое число методик по определению хлор-, азот-, и фосфорорганических пестицидов, полихлорированных и полибромированных бифенилов, нитроароматических соединений, полиароматических углеводородов (ПАУ) методом газовой хроматографии. С помощью тонкослойной хроматографии определяют пестициды и продукты их метаболизма в почвах, грязевых шламмах и почвенных водах, а также в питьевой воде и водах минеральных источников. Метод ВЭЖХ в последние годы считается одним из наиболее важных в определении следовых количеств пестицидов и полиароматических углеводородов, в анализе пищевых продуктов и фармацевтических препаратов. В отличие от газовой хроматографии этот метод используется для анализа термически нестойких, нелетучих или очень полярных соединений. Широко используется также сочетание тонкослойной хроматографии с ВЭЖХ. Например, такой прием применяют при анализе сточных вод.

В настоящем учебном пособии описаны основные и наиболее доступные для использования методы хроматографическото анализа, применяемые в студенческих практикумах и при выполнении курсовых и дипломных работ.

1. В чем состоят теоретические основы методов хроматографии?

2. Каковы принципы классификации хроматографических методов?

3. Проанализируйте основные виды хроматографии и их применение в биологии и экологии.

1. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. М.: Высшая школа, 1968. 183 с.

2. Безвершенко И.А. Аффинная хроматография. Киев: Наукова думка, 1973.

3. Жидкостная колоночная хроматография: В 3 т. / Под ред.

В.Г. Березина. М.: Мир, 1978. Т. 2. С. 388-417.

4. Методы практической биохимии / Под ред. С.Е. Северина. М.: Мир, 1978. С. 65-112.

5. Практикум по физико-химическим методам в биологии. М.: Изд-во МГУ, 1981. С. 154-206.

6. Яворовская С.Ф. Газовая хроматография - метод определения вредных веществ в воздухе. М.: Медицина, 1972. С. 5-32.

7. Яшин Я.И. Физико-химические основы хроматографического разделения. М.: Химия, 1976. 214 с.

8. Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Мальцев В.Г. Капиллярная жидкостная хроматография. Л.: Наука, 1983. С. 5-45, 168-189.

9. Евгеньева И.И. Планарная хроматография и анализ органических веществ // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 11. С. 50-56.

10. Карцова А.А. Жидкостная хроматография в медицине // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 11. С. 35-41.

11. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981.

12. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965.

508 с.

Жидкостная хроматография Жидкостная хроматография, в свою очередь, разделяется на жидкостно-адсорбционную, жидкостно-жидкостную и ионообменную хроматографию.

8.1. Жидкостно-адсорбционная хроматография В жидкостно-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент, а подвижной - жидкость. Она основана на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе.

Адсорбент в общепринятом смысле представляет собой твердое вещество, способное удерживать на своей поверхности молекулы. Эта способность особенно ярко выражена в тех случаях, когда поверхность адсорбента содержит большое количество мелких пор.

Адсорбенты подразделяются на неполярные (гидрофобные) - активированный уголь - и полярные (гидрофильные) - силикагель, оксид алюминия, искусственные и природные силикаты. Адсорбционное сродство полярных веществ с полярными адсорбентами значительно выше неполярных. Это различие используется при выборе адсорбентов. Сорбция может быть специфической, что позволяет избирательно адсорбировать одно вещество из смеси.

Колонка для адсорбционной хроматографии представляет собой стеклянную трубку, заполненную адсорбентом. На адсорбент в колонке наносят смесь веществ. Затем через них пропускают растворитель или смесь растворителей, служащих подвижной фазой, т.е., как правило, применяют проявительный способ хроматографии. Разделение основано на том, что вещества с более высоким эффективным коэффициентом распределения продвигаются на колонке с большей скоростью, отделяясь таким образом от веществ более низким коэффициентом.

Если исследуемые вещества окрашены, то при разделении можно видеть движение по колонке окрашенных зон. Образующиеся в результате разделения зоны извлекают одним из двух способов. В первом случае столбик сорбента выталкивают из колонки, зоны разделяют шпателем. Затем элюируют из зон разделенный материал. Другой способ состоит в том, что растворитель (элюент) пропускают через колонку до тех пор, пока не соберут все фракции по мере их выхода. Этот способ применяется чаще.

Если разделяемые с помощью хроматографии на колонке вещества не окрашены, то весь выходящий из колонки раствор (элюент) собирают в виде фракций, а потом анализируют их. При этом часто элюат контролируют, освещая, например, ультрафиолетовыми лучами. При выходе чистого растворителя флуоресценция отсутствует, а возникает во время появления примесей компонентов.

Для получения адсорбционных хроматограмм применяют растворители, обладающие слабой адсорбируемостью на применяемых адсорбентах. При выборе растворителя руководствуются правилом, согласно которому неполярные адсорбенты адсорбируют из полярных растворителей, особенно из воды и спирта, значительно хуже, чем из полярных;

полярные же адсорбенты слабее адсорбируют из полярных растворителей. В большинстве случаев вымывание осуществляется за счет увеличения полярности растворителя (градиентная элюция).

Эффективность разделения зависит от правильного заполнения колонки адсорбентом. Если плотность заполнения колонки неодинакова, особенно у стенок, то при анализе окрашенных веществ можно обнаружить затекание, т.е. проникновение вещества из одной зоны в другие.

Затекание может привести к сильному снижению эффективности разделения, оно особенно опасно при разделении неокрашенных веществ, так как в этом случае его трудно обнаружить в ходе хроматографии.

В настоящее время жидкостно-адсорбционная хроматография на колонке применяется при разделении и изучении состава углеводов, фенолов, углеводородов, липидов, стероидов, производных аминокислот, компонентов нуклеиновых кислот, алкалоидов, пестицидов, витаминов и других веществ.

8.1.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ) Тонкослойная хроматография занимает особое место среди других хроматографических методов благодаря простоте методики и доступности оборудования, широкой области применения, высокой экономичности, достаточно высокой селективности и чувствительности.

Данный метод успешно применяется для разделения очень малых количеств веществ (до 0,1 - 0,005 мкг). Впервые на тонком слое были разделены алкалоиды лекарственных растений. В отличие от колоночной хроматографии при ТСХ слой сорбента наносят на горизонтальную стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинки (ТСХ с незакрепленным слоем) или применяют закрепление слоя крахмалом, сульфатом кальция и другими связывающими агентами. Кроме того, можно использовать выпускаемые промышленностью ЧССР (фирма Кавалиер) готовые пластинки для ТСХ с закрепленным слоем силикагеля на алюминиевой фольге (силуфоловые пластинки) или подобные им пластины для тонкослойной хроматографии “Sorbfil” отечественного производства.

Для приготовления незакрепленного слоя можно применять различные сорбенты, но чаще всего используют оксид алюминия и силикагель. На пластинку насыпают слой сорбента и раскатывают его валиком, снимая им избыточное количество вещества. Валиком может служить стеклянная палочка диаметром 10 мм и длиной несколько больше, чем ширина пластинки. На концы палочки надевают кольца из резиновой трубки, толщина которых определяет толщину слоя сорбента, т.е. трубку подбирают такой, чтобы при накатывании образовался слой в 1 мм.

Кольца надевают на палочку на таком расстоянии, чтобы по обеим сторонам пластинки оставались свободные от сорбента полосы. Для приготовления закрепленных слоев в качестве сорбентов чаще всего используют силикагель, оксид алюминия, целлюлозу, полиамид, кизельгур. В этом случае на стеклянную пластинку (9x12 см или 13x18 см) наносят смесь сорбента со связующими веществами и водой в виде кашицы.

Смесь распределяют равномерно по всей поверхности пластинки слоем 100 – 300 мкм. Нанесенный слой оставляют па строго горизонтальной поверхности (20 – 25 ч.). Для получения более активного слоя пластинку выдерживают при 110 - 120°С в течение 30 мин. При использовании готовых пластинок полоску материала нужного размера отрезают ножницами.

Процедура анализа смеси веществ методом ТСХ такова. На расстоянии 1,5-2 см от короткого края пластинки проводят поперечную линию, являющуюся линией старта, и на нее капиллярами, микропипетками или микрошприцами в виде точки или полоски наносят анализируемую смесь и стандартные вещества (“свидетели”). В одну точку можно наносить 50 мкг 1 мг вещества. После нанесения образцов на сорбент пластинку переносят в герметичную камеру для хроматографического анализа и погружают в растворитель, который выполняет роль подвижной фазы. Растворитель (или смесь растворителей) заливают заранее в хроматографическую камеру, чтобы в ней установилась равновесная упругость паров. В противном случае растворитель, поднимаясь вверх по пластинке, будет интенсивно испаряться, что отразится на качестве разделения. При погружении пластинки в растворитель нужно следить за тем, чтобы стартовая линия была выше уровня растворителя. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их разделению. Принцип разделения такой же, как в других видах хроматографии, - неодинаковое сродство разделяемых веществ к подвижной жидкой фазе и стационарному сорбенту. После достижения растворителем линии фронта пластинку высушивают и проводят идентификацию компонентов смеси. Многие вещества не обнаруживаются в видимой области, и для их определения невидимые зоны (пятна) проявляют опрыскиванием пластины ТСХ специальными реагентами. Неокрашенные вещества иногда выявляют также с помощью выдерживания пластинки в течение нескольких минут в парах йода, или ее облучают УФ-лучами или проводят термическую деструкцию разделяемых веществ.

Важной характеристикой степени разделения определяемых соединений является величина Rf –отношение расстояния от центра пятна на пластинке до линии старта (x) к расстоянию (y), пройденному растворителем от линии старта до линии фронта. Величина Rf является характеристикой природы определяемого соединения.

Поскольку величина Rf зависит от свойств сорбента и растворителя, используемых для разделения, необходимо сравнение величин Rf исследуемого вещества со стандартным веществом-“свидетелем”, наносимым на ту же пластинку. “Свидетелем” служит предполагаемое чистое вещество. Идентификацию веществ (качественный анализ) можно проводить по равенству значений Rf анализируемого вещества и стандарта (“свидетеля”) как это показано на рис. 8.1.

Количественный анализ осуществляют или непосредственно на хроматограмме, или анализируемое вещество вымывают из слоя сорбента и полученный раствор анализируют с помощью спектральных и радиометрических методов. Для количественных определений в ТСХ широко используются денситометры, которые измеряют интенсивность поглощения электромагнитного излучения при сканировании хроматографической пластинки.

Рис. 8.1. Схема анализа методом ТСХ: 1-анализируемая смесь, 2-4 - стандартные вещества (“свидетели”) В последние годы метод ТСХ получил новый импульс для развития и наблюдается возрастание его роли в хроматографических методах. Это связано с меньшей стоимостью оборудования для ТСХ, разработкой двумерного и радиального вариантов разделения, внедрением пластин для высокоэффективной хроматографии, появлением систем автоматизированного многократного хроматографического проявления (АМХП).

В двумерной хроматографии пробу наносят в виде отдельного пятна в нижний угол пластинки и проводят разделение в одном направлении.

Затем пластинку вынимают из камеры, высушивают и проводят разделение в другой системе растворителей в направлении, перпендикулярном первому. В радиальной хроматографии растворитель с регулируемой скоростью подают в центр пластинки, заставляя зоны перемещаться от центра к перифирии. Это позволяет существенно ускорить процесс разделения.

Особенно перспективной является методика АМХП. Она удобна для определения пестицидов и продуктов их метаболизма в почвах, грязевых шламах, а также в питьевой воде и водах минеральных источников. Хроматографическое разделение проводят в АМХП-системе, работа которой управляется и контролируется при помощи компьютера. Проводят многократное хроматографическое проявление (прогон растворителя). При таких многоступенчатых проявлениях (до 25 шагов) возможно разделение до 40 веществ на разделительной полосе длиной 8 см.

Большое значение имеет развитие высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). За счет создания принудительного движения подвижной фазы с регулируемой скоростью, уменьшения размера частиц сорбента (до 5 - 7 мкм) и насыщения пространства над пластиной парами растворителя удается существенно ускорить процесс и повысить четкость разделения.

Как отмечалось, в настоящее время широко используется сочетание ТСХ с высокоэффективной жидкостной хроматографией. При этом первоначально анализируемый образец разделяют на колонках ВЭЖХ. После этого отдельные фракции наносят на пластинки ТСХ и проводят разделение с использованием методики АМХП. Таким образом, в анализируемой смеси разделяется до 30 отдельных фракций. В каждой из этих фракций, в свою очередь, на пластинке ТСХ определяется до 10 соединений. В отдельных случаях в образцах сточных вод обнаруживали до 300 веществ. Такой прием продемонстрировал эффективность совместного использования двух методов при определении веществ в диапазоне концентраций от нанограммов до пикограммов.

Использование пластинок с более толстым слоем адсорбента (до 5 мм) позволяет хроматографировать гораздо большее количество материала (препаративная ТСХ). При этом удается проводить не только анализ, но и получать достаточные для микрометодов количества чистых веществ. В этом случае пробу наносят не в виде пятен, а полосой вдоль одной из сторон пластинки. После хроматографирования соединения располагаются на пластинке в виде отдельных полос.

На практике в тонком слое сорбента адсорбционная хроматогрфия часто сопровождается распределительной. Это происходит в тех случаях, когда разделение проводят на слабо активных сорбентах в системах, содержащих воду (например, на А1203).

Ниже приведены некоторые примеры использования метода ТСХ.

Работа 1. Определение состава смеси аминокислот методом тонкослойной хроматографии на закрепленном Объекты исследования: спиртовые растворы аминокислот - лейцина и глицина.

Оборудование и реактивы. Стеклянные пластинки размером 912 см; силуфоловые пластинки; фарфоровая ступка с пестиком; термостат на 110°С; пульверизатор для опрыскивания нингидрином хроматографических пластинок; цилиндры на 10, 50 мл; эксикаторы; электроплитка; асбестовая сетка; капиллярные пипетки; карандаш; леацин и глицин: С(лейцина и глицина) = 0,1 моль/л в 20%-ном этиловом спирте;

1%-ный раствор нингидрина в ацетоне; бутанол; уксусная кислота; силикагель; гипс.

Выполнение работы 1. Приготовление закрепленного слоя силикагеля. В фарфоровой ступке растирают 2 г силикагеля, 100 мг гипса (можно использовать силикагель, содержащий 13% гипса). Добавляют затем 5 мл воды и быстро смешивают. Образовавшуюся суспензию наливают на пластинку размером 912 см, которую держат при этом в горизонтальном положении большим и указательным пальцами левой руки. Нанесенный слой разравнивают сначала пестиком, затем осторожным покачиванием пластинки в поперечном и продольном направлениях, после чего пластинку оставляют на строго горизонтальной поверхности до полного закрепления нанесенного слоя (20 - 25ч). Для приготовления более активного слоя сразу же после его получения пластинку нагревают в термостате при 80°С в течение часа или при 110°С в течение 30 мин. До употребления пластинки хранят в эксикаторах.

2. Хроматография аминокислот. В эксикаторы, служащие хроматографическими камерами, за 1 час до разделения наливают по 40 мл смеси бутанола, уксусной кислоты, воды в соотношении 4:1:1.

Для проведения анализа берут пластинки с закрепленным слоем силикагеля, силуфоловую пластинку или пластину для тонкослойной хроматографии “Sorbfil”. Смесь аминокислот и стандартные растворы лейцина и глицина наносят на стартовую линию хроматографических пластинок, осторожно проведенную мягким простым карандашом на расстоянии 1,5 см от короткого края пластинок. Точки нанесения также отмечают карандашом так, чтобы между ними было расстояние не менее см. Растворы аминокислот наносят специальными капиллярными пипетками с хорошо отшлифованными концами, стараясь не повредить слоя сорбента и не допуская расплывания нанесенного раствора до пятна диаметром более 0,2 см. В точки 1 и 2 наносят растворы отдельных аминокислот, а в точку 3 - их смесь (рис. 8.2.).

Рис. 8.2. Схема разделения веществ на пластинке Хроматографическую пластинку с нанесенными растворами аминокислот помещают в эксикатор с растворителями и закрывают его крышкой (нужно следить за тем, чтобы растворитель был ниже линии старта).

Процесс хроматографирования длится около часа. По истечении указанного срока пластинку высушивают в сушильном шкафу или на электроплитке, покрытой асбестом. Высушенную пластинку опрыскивают с помощью пульверизатора 1%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Затем пластинку нагревают в течение 8 – 10 мин на электроплитке или выдерживают ее в термостате при температуре 110 - 130°С до появления пятен аминокислот. На основании полученных данных вычисляют для аминокислот значения Rf - индексов и сравнивают их между собой; сопоставляют положение пятен аминокислот на закрепленном слое силикагеля с гипсом и на готовых пластинках. Необходимо сделать рисунки хроматограмм и выводы по результатам опыта.

методом тонкослойной хроматографии Объекты исследования. Культуральная среда, вода или водный экстракт из клеточной массы.

Оборудование и реактивы. Стеклянные пластинки размером 1318 см; стеклянная камера для хроматографирования; сушильный шкаф; эксикатор; силикагель марки КСК; медицинский гипс; борная кислота: С(борной кислоты) = 0,1 моль/л; 20%-ный раствор серной кислоты; 0,2%-ный раствор нафторезорцина в этаноле; метилэтилкетон; атанол; уксусная кислота; пульверизатор.

Выполнение работы Пластинки для получения тонкослойных хроматограмм получают быстрым нанесением на поверхность стекла смеси толщиной 0,1 мм, состоящей из 6,11 г силикагеля, 0,32 г медицинского гипса и 18 мл борной кислоты: С(борной кислоты) = 0,1 моль/л. Этот набор реактивов используется для приготовления одной пластинки размерам 1318 см. Пластинки с нанесенной массой высушивают на воздухе, а затем нагревают 30 мин в сушильном шкафу для активирования (температура 110°С). До употребления пластинки хранят в эксикаторах, чтобы они не сорбировали влагу.

Культуральную среду или водный экстракт из клеточной массы наносят на хроматограмму в виде тонкой полоски на стартовой линии с последующим высушиванием. Объем исследуемой вытяжки зависит от концентрации углеводов и находится в пределах 1 – 5 мл.

Хроматографирование проводят в системе растворителей метилэтилкетон-этанол-уксусная кислота в соотношении 3:1:1 методом восходящий хроматографии. После подъема растворителей до края хроматограмм пластинки высушивают.

Обнаружение углеводов проводят опрыскиванием пластинки из пульверизатора смесью 20%-ной серной кислоты и 0,2%-ного раствора нафторезорцина в этаноле в соотношении 1:1. Обработанные проявителем хроматограммы высушивают в сушильном шкафу при температура 105°С до появления пятен. При этом мальтоза окрашивается в краснокоричневый цвет (Rf -0,29), глюкоза - в фиолетовый (Rf - 0,42).

Необходимо сравнить состав углеводов у различных объектов исследования, обосновать причины их разного состава, сделать выводы.

1. На чем основано разделение веществ методом адсорбционной хроматографии?

2. Каковы методы приготовления закрепленного и незакрепленного слоев сорбентов для тонкослойной хроматографии?

3. Каковы основные этапы анализа смеси веществ методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое?

4. Что такое Rf -индекс, от чего он зависит и как рассчитать величину Rf на хроматограммах?

5. Каковы методы количественного определения веществ с помощью тонкослойной хроматографии?

6. Какова роль тонкослойной хроматографии и каковы сферы ее применения в биологических и экологических исследованиях?

1. Ахрем А.А., Кузнецова Л.И. Тонкослойная хроматография. М.: Наука, 1965. 110 с.

2. Лейте В. Определение органических загрязнений питьевых, природных и сточных вод. М.: Химия, 1975. С. 95-98, 124, 150-152, 163.

3. Сиренко Л.А. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. Киев, 1975. 241 с.

4. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965.

506 с.

5. Шеллард Э. Количественная хроматография на бумаге и в тонком слое. М.: Мир, 1971. 138 с.

6. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981.

7. Ольшанова К.М. Практикум по хроматографическому анализу. М.:

Высшая школа, 1970. С. 73-137.

8. Евгеньева И.И. Планарная хроматография и анализ органических веществ // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 11. С. 50-55.

8.2. Жидкостно-жидкостная (распределительная) хроматография 8.2.1. Теоретические основы метода В жидкостно-жидкостной хроматографии разделение веществ осуществляется за счет их различной растворимости в подвижной фазе элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твердого адсорбента. Следовательно, она основана на распределении веществ между двумя жидкими фазами, одна из которых неподвижна. По форме проведения процесса выделяются два вида распределительной хроматографии - на бумаге и на колонке. Иногда к распределительной хроматографии относят и метод тонкослойной хроматографии. Однако преобладание адсорбции при разделении веществ делает предпочтительным отнесение ее к адсорбционной хроматографии, как это и сделано в настоящем пособии.

Распределительная хроматография стала использоваться с 1941 года, когда А. Мартин и Р. Синдж впервые показали возможность использования для разделения смеси веществ различий в их коэффициентах распределения между двумя несмешивающимися жидкостями и разработали совместно с Р. Консденом и А. Гордоном метод бумажной хроматографии. За разработку распределительной хроматографии А. Мартин и Р. Синдж в 1952 году была удостоены Нобелевской премии.

В хроматографии на бумаге используют свойство хроматографической бумаги поглощать воду из атмосферы и задерживать ее между целлюлозными волокнами. Воду можно рассматривать поэтому как один из растворителей, она представляет собой неподвижную фазу. При движении по бумаге под действием капиллярных сил неводного растворителя (подвижная фаза) молекулы вещества распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вслед за растворителем, и наоборот.

Часто подвижная фаза представляет собой смешивающийся с водой растворитель (например, бутанол). Казалось бы, что в таких случаях разделения не должно происходить, так как имеется только одна фаза.

Однако комплекс воды с целлюлозой хроматографнческой бумаги по свойствам напоминает концентрированные водные раствора полисахаридов. Они не смешиваются с органическими растворителями, в том числе и с теми, которые смешиваются с водой.

Скорость движения веществ определяется величиной коэффициента скорости движения Rf, величина которого зависит от свойств бумаги, температуры, степени чистоты растворителей, однотипности процедур и аппаратуры.

Для проведения хроматографического разделения используют полоски хроматографической бумаги. Существует три сорта этой бумаги, отличающиеся различной толщиной и впитывающей способностью медленная, средняя, быстрая. Одномерную хроматографию следует проводить по направлению волокон.

Принцип нанесения веществ на бумажные хроматограммы тот же, что и в ТСХ. Для разделения обычно применяют растворы с концентрацией 0,5 – 1 мг вещества в 1 мл. После подсушивания хроматограммы помещают в камеру с подвижной фазой так, чтобы бумага не касалась стенок камеры и растворитель не доходил до стартовой линии. Хроматографическая камера должна хорошо закрываться, чтобы исключить возможность испарения компонентов подвижной фазы. Хроматограмму вынимают, когда фронт растворителя приблизится к верхней кромке бумаги. После высушивания и соответствующего проявления определяют компоненты. В зависимости от направления распространения элюента на хроматограмме различают восходящую и нисходящую хроматографии.

При восходящей хроматографии бумажную полоску погружают нижним концом в растворитель. По мере продвижения растворителя под действием капиллярных сил вертикально вверх происходит разделение веществ. При нисходящой хроматографии верхний конец бумаги с образцом закрепляют в "лодочке" с растворителем, находящейся в верхней части камеры, а нижний конец бумаги опускают вниз так, чтобы он не соприкасался с налитым на дно растворителем. Роль налитого на дно камеры растворителя заключается в поддержании равновесной упругости паров растворителя в камере. Под действием капиллярных сил и силы тяжести растворитель начинает двигаться вниз по бумажной полосе, в ходе чего и происходит разделение. Восходящая хроматография более проста в работе и применяется чаще, но скорость движения растворителя при нисходящей хроматографии гораздо выше, чем при восходящей.

Для лучшего разделения веществ используют повторное хроматографирование в той или другой системе растворителей. Хорошее разделение сложных смесей веществ достигается при двухмерной хроматографии. В этом случае повторное разделение проводят в направлении, перпендикулярном первоначальному, и в другом растворителе или при сочетании электрофореза с хроматографией во взаимно перпендикулярном направлении (метод "пептидных карт" или "отпечатка пальцев").

Метод пептидных карт применяют чаще всего при сравнительном изучении близких по химическому строению белков.

Для определения местоположения пятен хроматограммы просматривают в ультрафиолетовом свете или опрыскивают специальными растворами. Использование бумажной хроматографии в препаративных целях ограничено. В тех случаях, когда такое разделение все же производится, участки хроматограмм, содержащие интересующее вещество, вырезают, а затем элюируют материал с помощью соответствующих растворителей.

Метод хроматографии на бумаге широко используется в биологии для разделения аминокислот, пептидов, углеводов, пигментов, органических кислот и других веществ. Бумажная хроматография применяется и в качестве аналитического метода определения смесей.

Работа 1. Количественное определение аминокислот методом хроматографии на бумаге Оборудование и реактивы. Хроматографическая бумага марки "Ленинградская медленная"; хроматографическая камера; фотоэлектроколориметр; ножницы; пластинки стеклянные (332 см) – 3 шт.; держатель для хроматограмм; сушильный шкаф; микропипетки; пробирки с притертыми пробками; бюретка на 25 мл; стандартная смесь аминокислот; испытуемая смесь аминокислот; бутанол, уксусная кислота, вода в соотношении 15:3:7, 1%-ный раствор нингидрина в 95%-ном ацетоне;

этиловый спирт (75%-ный), насыщенный медным купоросом.

Выполнение работы Берут лист хроматографической бумаги размером 1828 см и на расстоянии 3 см от его короткого края проводят простым карандашом горизонтальную линию. Затем ее делят на неравные отрезки в соответствии с прилагаемой схемой и выделяют стрелками границы нанесения стандартной и испытуемой смесей и делают соответствующие надписи простым карандашом (рис. 8.3.):

Бумагу укрепляют над поверхностью стола и на линию старта, ограниченную стрелками, наносят сначала стандартную смесь при помощи специальной микропипетки тонкой линией, пока весь раствор из микропипетки не будет перенесен на стартовую линию (микропипетку заполняют на 2-3 см). Измеряют массу нанесенного раствора, для чего взвешивают пипетку, заполненную стандартной смесью (до нанесения раствора), и пустую (после нанесения раствора). На бумагу обычно наносят 0,02 - 0,03 г стандартного раствора. Затем заполняют чистую пипетку испытуемой смесью аминокислот (выданной преподавателем для исследования), взвешивают ее и наносят смесь на линию старта с соответствующей пометкой.

Рис. 8.3.

Схема разметки бумажной хроматограммы Приготовленную хроматограмму помещают в хроматографическую камеру с предварительно налитой в нее системой растворителей для разделения смеси аминокислот, например, смеси бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:3:7. Разделение ведут методом восходящей хроматографии в течение 4 – 5 ч., пока линия фронта не дойдет на 2 – 3 см до верхнего края хроматографической бумаги. После этого хроматограмму вынимают из камеры и верхний конец бумаги немедленно вставляют в держатель, сделанный из трех скрепленных резиновым кольцом стеклянных палочек, и помещают на 20 мин в вытяжной шкаф для удаления из бумаги растворителей.

Высушенную хроматограмму обмакивают в 1%-ном растворе нингидрина в ацетоне для обнаружения на ней положения пятен аминокислот. Затем хроматограмму помещают на 10 мин в вытяжной шкаф для удаления ацетона и переносят в сушильный шкаф, где оставляют ее на 15 мин при 70°С. Аминокислоты стандартной и испытуемой смесей обнаруживают в виде сине-фиолетовых пятен, расположенных цепочкой по направлению движения системы растворителей от линии старта к верхнему краю хроматограммы.

Рис. 8.4. Схема расположения аминокислот на хроматограмме:

А - точка нанесения смеси аминокислот; 1 - цистин и цистеин;

2 - лизин; 3 - гистидин; 4 - аргинин; 5 - аспарагиновая кислота, серии и глицин; 6 - глутаминовая кислота и треонин; 7 - аланин;

8 - пролин; 9 - тирозин; 10 - валин и метионин; 11 - триптофан; 12 фенилаланин; 13 - лейцин и изолейцин Идентификацию аминокислот, содержащихся в испытуемой смеси, ведут по совпадению на хроматограмме позиций, занимаемых аминокислотами стандартной и испытуемой смесей (рис. 8.4.).

Для определения количественного содержания аминокислот в испытуемых смесях хроматограмму расчерчивают простым карандашом так, чтобы лежащие на одном уровне окрашенные зоны, соответствующие одной и той же аминокислоте, оказались заключенными внутри примерно одинаковых прямоугольников (рис. 8.5.).

Рис. 8.5. Схема расположения аминокислот на хроматограмме:

Очерченные участки бумаги вырезают и помещают в пробирки, номера которых должны соответствовать номерам пятен на хроматограммах. В каждую пробирку наливают из бюретки по 10 мл 75%-ного раствора этилового спирта, насыщенного сульфатом меда (к 500 мл этилового спирта добавляют 0,2 мл насыщенного раствора сульфата меди).

Пробирку закрывают пробкой и, периодически перемешивая, добиваются полного перехода кирпично-красной окраски (медной соли синефиолетового Руэмана) с бумаги в раствор. На это уходит 15 – 20 мин.

Оптическую плотность стандартного и испытуемого растворов измеряют на фотоэлектрокалориметре с зеленым светофильтром (540 нм). В поток сравнения устанавливают кювету с 75%-ным раствором этилового спирта с сульфатом меди.

Количественное содержание аминокислот в исследуемом растворе рассчитывают по соотношению экстинкций исследуемой и стандартной проб.

Пример расчета. Допустим, что в стандартной смеси содержится 1,8 мг глицина в 1 мл, на стартовую полосу нанесено 0,02 г этого стандартного раствора. Следовательно, на хроматограмму поступило (1,8х0,02) = 0,036 мг глицина. Условимся далее, что оптическая плотность окрашенных растворов составила 0,288 для стандарта и 0,336 для неизвестной смеси. Тогда содержание глицина в исследуемой смеси, нанесенной на хроматограмму, составит (360,336): 0,288 = 42 мкг. Если далее принять, что исследуемая смесь нанесена на хроматограмму и количестве, например 0,0250 г, то содержание глицина в 1 мл исследуемого раствора составит (42:0,0250) = 1680 мкг, или 1,68 мг/мл.

Оформите результаты собственного эксперимента, сделайте по ним выводы.

1. На чем основано разделение веществ методом хроматографии на бумаге?

2. Какие существуют виды бумажной хроматографии?

3. Каковы этапы качественного анализа аминокислот методом хроматографии на бумаге?

4. Какова методика количественного определения аминокислот с помощью хроматографии на бумаге?

1. Королева Е.И., Мешкова В.П. Практическое руководство к занятиям по биохимии животных. М.: Изд-во МГУ, 1972. 90 с.

2. Пасхина Т.О. Количественное определение аминокислот при помощи хроматографии на бумаге // Современные методы в биохимии. М., 1964. Т. 1.

С. 162.

3. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.Л., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение, 1975. С. 28-31.

4. Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хейса и К. Мацека. М., 1962.

5. Шеллард Э. Количественная хроматография на бумаге и в тонком слое. М.: Мир, 1971. 188 с.

8.3. Ионообменная хроматография 8.3.1. Теоретические основы метода Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника. Разделение достигается за счет обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента-ионита. Широкое применение ионообменных процессов в практике началось после создания синтетических ионообменников - так называемых ионообменных смол или ионитов. Используемые ранее естественные ионообменники (различные алюмосиликаты и другие соединения) не обладали достаточной воспроизводимостью свойств, не были химически устойчивыми и поэтому существенного практического значения не имели. Применяемые в настоящее время синтетические ионообменники имеют высокую обменную емкость и воспроизводимые ионообменные и другие свойства, устойчивы к действию кислот и оснований, не разрушаются в присутствии многих окислителей и восстановителей и т.д. Обычно синтетический ионообменник представляет собой высокомолекулярный полимер, например, поперечносшитый полистирол, содержащий различные функциональные группы, которые и определяют наиболее характерные свойства смол. Известны также синтетические неорганические иониты, например, активированный оксид алюминия, гели на основе соединений железа или циркония.

Однако, органические ионообменные смолы имеют намного большее применение.

В зависимости от знака заряда функциональных групп ионообменные смолы являются катионитами или анионитами. Катиониты содержат -СОО-; -PO3-), поэтому каркас катионита, несущий фиксированные отрицательные заряды, заряжен отрицательно. Отрицательные заряды каркаса компенсируются положительными зарядами противоионов, так что в целом катионит остается электронейтральным. Однако, противоионы, в данном случае катионы, в отличие от функциональных групп каркаса, обладают подвижностью и могут переходить в раствор в обмен на эквивалентное количество ионов из раствора. Этот обмен приводит к установлению подвижного равновесия между ионами, находящимися в фазе смолы, и ионами в растворителе. Наиболее распространенными катионитами являются сульфокислоты, образованные сульфированными продуктами сополимеризации стирола и дивинилбензола. Это отечественные смолы КУ-2, СДВ-3 и др., иностранные дауэкс-50, амберлит IR- и др. Сульфокатиониты характеризуются высокой химической стойкостью и механической прочностью, большой скоостью установления ионообменного равновесия.

Функциональными группами каркаса анионитов являются четвертичные –NR3+, третичные –NR2H+ или первичные –NH3+ аммониевые, пиридиновые или другие основания, а в качестве подвижных противоионов выступают анионы. Анионообменные смолы получаются также путем проведения реакций полимеризации или поликонденсации с использованием различных аминосоединений. Так были получены аниониты АН-1, АН-2Ф, амберлит. Широкое распространение получил полифункциональный анионит ЭДЭ-10П, содержащий амины различной степени замещения, включая четвертичные. Амфотерные иониты или амфолиты способны осуществлять одновременный обмен катионов и анионов.

Взаимодействие ионообменной смолы с раствором электролита включает несколько сложных процессов, наиболее важными из которых являются собственно ионный обмен, физическая абсорбция ионов и молекул на смоле и набухание смолы за счет поглощения растворителя и проникновения электролита внутрь смолы.

К настоящему времени установлено несколько эмпирических закономерностей, связывающих константы ионного обмена со свойствами ионов. Так, в частности, найдено, что с ростом заряда сродство ионов к смоле увеличивается. С повышением температуры избирательность поглощения несколько уменьшается, хотя этот эффект не очень велик.

Введение в раствор веществ, способных образовывать комплексные соединения с присутствующими ионами, сдвигает равновесие ионного обмена, так как в результате комплексообразования уменьшается равновесная концентрация иона в растворе.

Ионообменная хроматография используется преимущественно для разделения ионов. Количественые определения компонентов после разделения могут быть выполнены любым подходящим методом.

Простейшая методика ионообменного разделения состоит в поглощении компонентов смеси ионитом и последовательном элюировании каждого компонента подходящим растворителем. Например, катионы щелочных металлов легко элюируются разбавленным раствором соляной кислоты (0,1 М HCl).

Известны ионообменные методики для разделения изотопов. Большое практическое значение имеет основанный на ионном обмене процесс деминерализации воды.

Одним из вариантов разделения на ионитах является ионная хроматография. В этом методе используются поверхностно-слойные сорбенты с небольшой емкостью, небольшим размером частиц, повышенное давление на входе в колонку и высокочувствительные детекторы с автоматической записью сигнала. Для ионной хроматографии характерны экспрессность, удобство работы и высокая разделительная способность.

Детекторы ионообменных разделений должны регистрировать концентрацию анализируемых ионов в элюате в присутствии ионов элюента. Особенно широко в ионной хроматографии используют кондуктометрический детектор, являющийся универсальным, так как он реагирует на все ионы в растворе. Применяют также селекивные детекторы:

электрохимические (полярографический, кулонометрический) и спектрофотометрический.

Методом ионной хроматографии определяют очень многие анионы в питьевой и технической воде, в продуктах технологической переработки, в пищевой, фармацевтической и других отраслях промышленности. Описаны методики определения свыше 70 анионов неорганических и органических кислот, в том числе галогенидов, нитрита, нитрата, сульфата, ацетата. Число определяемых катионов значительно меньше.

Этим методом определяют главным образом катионы щелочных и щелочно-земельных металлов, а также органические катионы замещенных солей аммония. Определение многих других катионов оказывается ненадежным, так как они выпадают в осадок в компенсационной колонке с сильно основной смолой.

Ионная хроматография успешно применяется в анализе объектов окружающей среды (атмосферы, воды и т.д.), в клинических исследованиях и многих отраслях промышленности.

В основу одной из разновидностей жидкостной хроматографии ион-парной хроматографии положены принципы классической экстракции ионных веществ из водной в органическую фазу в виде ионных пар.

Для этого в подвижную фазу добавляется противоион, способный вступать в селективное комплексообразование с анализируемыми компонентами с образованием ионной пары. Основные преимущества такого варианта заключаются в том, что одновременно могут быть проанализированы вещества кислотного, основного и нейтрального характера.

1. В чем состоит сущность ионообменной хроматографии?

2. Каковы области применения ионообменной и ионной хроматографии?

1. Васильев В.П. Аналитическая химия: В 2 ч. Ч. 2. Физико-химические методы анализа: Учеб. для химико-технол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989.

С. 357-359.

2. Карцова А.А. Жидкостная хроматография в медицине // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 11. С. 35-40.

8.4. Проникающая или эксклюзионная 8.4.1. Теоретические основы метода Подвижной фазой в проникающей хроматографии является растворитель (жидкость), а неподвижной - та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля), т.е. и подвижную, и неподвижную фазы составляет одно и то же вещество или одна и та же смесь веществ. Гель готовят на основе декстрана, полиакриламида или других природных и синтетических соединений.

Способность молекул анализируемого вещества проникать в растворитель, поглощенный частицами набухшего геля, зависит от степени пористости частиц геля и от размера молекул соединения. Распределение веществ на колонке, заполненной набухшим гелем, зависит от общего объема растворителя внутри и снаружи частиц геля.

Для данного вида геля распределение анализируемого вещества в растворителе внутри и снаружи геля определяется коэффициентом распределения Kd, который зависит от размера молекул вещества. Если молекулы крупные, в растворителе внутри частиц геля их будет мало, величина Kd в этом случае практически равна 0. Если молекулы вещества достаточно малы и могут беспрепятственно проникать внутрь частиц геля, то Kd =1. Поскольку размеры пор варьируют, молекулы среднего размера будут проникать в растворитель, находящийся в порах, лишь частично; следовательно, величина Kd в этом случае будет находиться между 0 и 1. Это позволяет разделять на данном геле вещества, молекулярные массы которых различаются лишь весьма незначительно.

Проникающая (эксклюзионная) хроматография используется для очистки высокомолекулярных биологических соединений. Так проводят очистку и разделение вирусов, белков, ферментов, гормонов, антител, нуклеиновых кислот и полисахаридов. Этим методом можно отделять аминокислоты от пептидов, фракционировать пептиды, образующиеся в результате гидролиза белков, а также олигонуклеотиды из гидролизатов нуклеиновых кислот. Метод проникающей хроматографии позволяет определять молекулярные массы неизвестных белков, проводить обессоливание белков и концентрирование их растворов, а также удалять фенол из растворов нуклеиновых кислот, моносахариды отделять от полисахаридов и аминокислоты от белков. С помощью этого вида хроматографии в Институте вирусологии в Москве в 1990 году был выделен вирус СПИДа.

Работа 1. Разделение высоко- и низкомолекулярных веществ методом проникающей хроматографии Наиболее часто в проникающей хроматографии применяют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. К числу таких соединений относятся декстраны с поперечными сшивками (сефадекс). Сефадекс - это полимер в виде гранул, построенных из молекул бактериального полисахарида декстрана (1,6-глюкана), "сшитых" через определенные промежутки поперечными связками за счет взаимодействия с эпихлоргидрином.

Примерная структура ячейки сефадекса:

Чем больше число поперечных сшивок, тем меньше размеры отверстий молекулярного сита. Сефадексы очень хорошо набухают в воде, растворах солей. Получается гель-сефадекс. В зависимости от степени сшивки молекул декстрана друг с другом различные сефадексы отличаются набуханием гранул сефадекса и пределами эксклюзии (выражаемой значениями молекулярной массы веществ, еще способных входить внутрь гранул сефадекса), в связи с чем и построена классификация сефадексов.

Объекты исследования. Голубой декстран, хромат калия.

Оборудование и реактивы. Трубка с краном размером 201,2 см, софадекс G-25, голубой декстран (или гемоглобин кристаллический), хромат калия.

Выполнение работы Сефадекс G-25 (4 г) помещают в химический стакан, заливают водой и оставляют набухать при комнатной температуре в течение 3 ч. Колонку укрепляют вертикально в штативе. Ее нижнее отверстие закрывают пробкой из стекловаты (или пористым диском из полиуретана) и наполняют на 1/3 дистиллированной водой. Из стакана с набухшим гелем сливают избыток воды, хорошо перемешивают оставшуюся в нем суспензию (объем около 50 мл) стеклянной палочкой и переносят суспензию в колонку. Нужно следить за тем, чтобы в суспензии не было пузырьков воздуха. Избыток воды из суспензии можно осторожно слить.

Следующую порцию суспензии добавляют, не дожидаясь полной усадки слоя сорбента. Когда весь гель окажется в колонке, высота его должна быть около 15 см. Полностью открывают кран колонки и в течение примерно 30 мин промывают (стабилизируют) слой дистиллированной водой. При вводе в колонку растворителя нельзя обнажать поверхность слоя.

Пробу готовят, растворив 5 мг голубого декстрана и 5 мг хромата калия в 1 мл дистиллированной воды (голубой декстран растворяется медленно, лучше его растирать). В колонку добавляют небольшое количество воды, закрывают кран, пипеткой осторожно вводят в нее зеленый раствор пробы (лучше всего по стенкам трубки колонки). Затем открывают кран и после того, как проба впитается в слой геля, промывают остаток одной или двумя порциями по 1 мл воды и заливают колонку доверху водой. Больше воды в процессе данного эксперимента не добавляют. Разделенные фракции собирают в калибровочные пробирки объемом 3 мл. Однородность (чистота) зон разделенных компонентов свидетельствует о том, что колонка приготовлена правильно. Объем воды, требующийся для элюирования голубого декстрана, равен свободному объему колонки.

методом гель-фильтрации через сефадекс Оборудование и реактивы. Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр; коллектор фракций; колонка для гель-фильтрации; пробирки химические (150 – 200 штук); склянка на 5 л; трубки каучуковые (диаметр 0,5 - 0,7 см); зажим винтовой; насос, сефадекс G-75; хлорид натрия:

С(хлорида натрия) = 0,09 моль/л; реактивы для определения белка по Лоури; яичный альбумин с М = 45000, трипсин с М = 22680; рибонуклеаза c М = 13700.

Выполнение работы Готовят гель сефадекса. Для этого 25 г сефадекса G-75 предварительно заливают в двухлитровом стакане 1,5 л раствора хлорида натрия:

C(NaCl) = 0,09 моль/л, хорошо перемешивают и оставляют на 24 ч. Через сутки набухший сефадекса промывают 5 раз раствором хлорида натрия C(NaCl) = 0,02 моль/л путем декантации. Полученным гелем сефадекса заполняют колонку. Заполнение колонки ведут осторожно, заливая его медленно и непрерывно по стенке колонки, что предохраняет от захвата им пузырьков воздуха.

Сразу после внесения сефадекса в колонке создают рабочее давление, подключая к колонке пятилитровую склянку с элюирующим раствором (раствором хлорида натрия: C(NaCl) = 0,09 моль/л). Этим раствором немедленно начинают промывку колонки и ведут ее около 12 ч.

Рис. 8.6. Установка для колоночной хроматографии:

1 - коллектор фракций; 2 - колонка с сефадексом; 3 - насос;

Содержание белка в растворе, подлежащем гель-фильтрации, должно быть около 10 мг/мл. Поэтому готовят смесь белков в соотношении:

яичный альбумин – 5 мг, трипсин – 3 мг, рибонуклеаза – 2 мг и растворяют ее в 1 мл раствора хлорида натрия: C(NaCl) = 0,09 моль/л.

Перед нанесением образца, предназначенного для фракционирования, отключают склянку с элюирующим раствором от колонки. Слегка ослабляют кран колонки и устанавливают уровень элюирующего раствора вровень с поверхностью сефадекса. Осторожно, стараясь ни в коем случае не взмутить верхний слой сефадекса, пипеткой наслаивают 1 мл смеси белков. Ослабляя зажим в нижней части колонки, нанесенной образец вводят в сефадекс и очень осторожно, наслоив по каплям или по стенке при помощи пипетки элюент, подключают к колонке склянку с раствором хлорида натрия: C(NaCl) = 0,09 моль/л и начинают элюцию (рис. 8.6.).

Собирают фракции по 5 мл при помощи коллектора фракций со скоростью 1 мл в минуту. Элюцию завершают после сбора 30 фракций.

Содержание белка по всех исследуемых фракциях можно определять спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность каждой пробы на спектрофотометре СФ-16 при 280 нм или на фотоэлектроколориметре, предварительно проведя цветные реакции по методу Лоури. Строят выходную кривую (рис. 8.7.).

Рис. 8.7. Выходная кривая: А - абсорбция вещества во фракциях, Отчет по работе. Он должен содержать схему прибора, рисунок выходной кривой, построенной по результатам определения количества белков во фракциях на фотоэлектроколориметре.

1. В чем сущность метода гель-проникающей хроматографии?

2. Какова структура ячейки сефадекса и чем отличаются различные марки сефадекса?

3. Каков принцип разделения смеси белков с различной молекулярной массой на геле сефадекса?

4. Каковы методы количественной оценки белков во фракциях?

1. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. 253 с.

2. Жидкостная колоночная хроматография: В 3 т. / Под ред.

В.Г. Березина. М.: Мир, 1978. Т. 2. 471 с.

3. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по биохимии. М.; Просвещение, 1975. С. 42-45, 75-76.

4. Карцова А.А. Жидкостная хроматография в медицине // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 11. С. 35-40.

8.5. Высокоэффективная жидкостная 8.5.1. Теоретические основы метода Жидкостная хроматография в ее классическом варианте (при атмосферном давлении) и высокоэффективная жидкостная хроматография (при повышенном давлении) используются для определения химически и термически нестойких, нелетучих или очень полярных веществ, но в то же время могут быть применены для анализа веществ, которые обычно определяются с помощью высокоэффективной газовой хроматографии.

Начав развиваться с середины 70-х годов, метод ВЭЖХ в первое время существенно проигрывал из-за отсутствия подходящих сорбентов для заполнения колонок. Однако с появлением привитых фаз насадочные колонки стали обеспечивать воспроизводимые результаты, что сделало ВЭЖХ идеальным инструментом для определения большинства пестицидов, включая хлор- и фосфорорганические производные, полиароматических углеводородов, относительно нелетучих высокомолекулярных загрязнителей. С помощью жидкостной хроматографии можно разделять также белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, красители, полисахариды, взрывчатые вещества, лекарственные препараты, метаболиты растений и животных.

Блок-схема прибора для жидкостной хроматографии представлена на рис. 8.8.

Рис. 8.8. Блок-схема жидкостного хроматографа Для эффективного хроматографического разделения определяемых компонентов чаще всего применяют колонки длиной до 25 см и внутренним диаметром 4 – 5 мм, заполненные сферическими частицами силикагеля размером от 5 до 10 мкм с привитыми октадецильными группами. Появление в последние годы колонок меньшего диаметра, заполненных более мелкими частицами силикагеля, привело к уменьшению расхода растворителей и продолжительности анализа, увеличению эффективности разделения.

Следует отметить, что колонки для ВЭЖХ довольно дорогие. Поэтому их защищают от загрязнения предохранительным картриджем (предколонкой). Очень сложные смеси лучше предварительно разделять другими методами, а при переходе от одного растворителя к другому следует избегать резких скачков их полярности. Растворы проб и растворители перед вводом в колонку необходимо фильтровать.

Для обнаружения анализируемых веществ в ВЭЖХ широко применяются устройства, работа которых основана на измерении поглощения в ультрафиолетовой области, флуоресценции или электрохимических характеристик. Возможно также сочетание жидкостного хроматографа с масс-спектрометром. Чаще всего применяется УФ-детектор. Он представляет собой высокочувствительный СФ-спектрометр с проточной микроячейкой, который регистрирует оптическую плотность раствора при определенной длине волны.

На практике часто бывает необходимо проводить измерение на различных длинах волн одновременно, когда определяемые соединения плохо разделяются хроматографически. Высокочувствительная запись спектров стала реальностью с помощью детекторов на диодной матрице, так как это обеспечивает получение аналитических данных с гораздо большей степенью достоверности.

В частности, с появлением УФ-В-детектора на диодной матрице ВЭЖХ стала стандартным методом контроля качества природной и питьевой воды на содержание пестицидов. Известно, что многие из них термически нестабильны, например, производные феноксиуксусной кислоты. Анализируемые вещества извлекают из воды с помощью жидкостной или твердофазной экстракции.

Работа 1. Определение пестицидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Данная методика позволяет определять в воде одновременно 9 гербицидов на основе феноксикислот с пределом обнаружения 20 нг/л при стандартном отклонении 6-10%. Диапозон определяемых концентраций составляет 20-1000 нг/л.

Оборудование и реактивы. Жидкостной хроматограф, колба объемом 1 л, испаритель, воронка, фильтровальная бумага, универсальная индикаторная бумага. Фосфорная кислота, хлорид натрия, этилацетат, безводный сульфат натрия, ацетонитрил, вода, метанол.

Выполнение работы Пробу воды объемом 1 л подкисляют фосфорной кислотой до pH = 2,0, добавляют 30 г хлорида натрия и экстрагируют последовательно тремя порциями по 100 мл этилацетата. Объединенные экстракты фильтруют через 20 г безводного сульфата натрия, промывают осадок на фильтре двумя порциями по 10 мл этилацетата и удаляют растворитель сначала упариванием до объема 4 – 5 мл в ротационном испарителе, а затем испарением в токе азота. Сухой остаток растворяют в смеси ацетонитрил:вода = 15:85 и вводят 25 мкл пробы в жидкостной хроматограф.

Разделение пестицидов осуществляют на колонке 1004,6 мм Hypersil ODS с градиентом концентрации подвижной фазы (В) от 15 до 55% в течение 22 мин при температуре 450С. В качестве подвижных фаз применяют растворы КНPO4 с С(KHPO4) = 0,005 моль/л с 0,01% СН3С00Н в воде (фаза А) и 0,01% СН3С00Н в смеси ацетонитрил:метанол = 1:1 (фаза В). Параметры детектирования: длина волны 230 нм, ширина полосы 12 нм, длина волны сравнения – 180 нм, ширина полосы сравнения – 80 нм. Идентификацию веществ проводят по временам удерживания и по библиотечным спектрам исследуемых соединений для УФ-диапозона.

В случае твердофазной экстракции пробу воды объемом 2 л подкисляют фосфорной кислотой до pH = 2,0, добавляют 200 г хлорида натрия и пропускают через картридж С со скоростью 1 000 мл/ч. Затем картридж высушивают током азота в течение 20 мин и элюируют определяемые вещества 4 мл ацетона. Элюент испаряют в токе азота до сухого остатка, растворяют в 0,5 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 15:85 и подвергают хроматографированию. Картридж перед употреблением промывают последовательно 5 мл метанола и 6 мл воды, подкисленной до pH = 2.

1. На чем основано разделение веществ методом ВЭЖХ?

2. Как построена блок-схема жидкостного хроматографа?

3. Каковы области применения ВЭЖХ?

1. Карцова А.А. Жидкостная хроматография в медицине // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 11. С. 35 –40.

2. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. М.: Химия, 1996. С. 270-277.

или биоспецифической хроматографии Особое место в жидкостной хроматографии занимает так называемая аффинная, или биоспецифическая, хроматография (от англ. affinityсродство). Аффинная хроматография основана на исключительной способности биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества. Научные основы метода заложены в 1951 году в США, хотя первые экспериментальные указания на большие потенциальные возможности аффинной хроматографии были получены еще в 1910 году Штаркенштейном, использовавшим крахмал для выделения амилазы. В основе аффинной хроматографии лежит уникальное свойство биологически активных соединений узнавать строго определенные вещества, в процессе которого реализуется так называемый принцип молекулярного распознавания. Фермент узнает свой субстрат, антиген-антитело, гормон-рецептор.

Процесс разделения веществ с использованием аффинной хроматографии включает несколько самостоятельных этапов. Хроматографическую колонку заполняют носителем, ковалентно связанным с какимлибо биологически активным веществом (лигандом). Лигандами могут служить самые различные соединения: белки, пептиды, аминокислоты, витамины, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и многие другие вещества. В качестве носителей в аффинной хроматографии получили широкое распространение гранулированные гели агарозы и полиакриламида (биогель P), полистирольные смолы с химически активными группами, целлюлоза и ее производные и т.д. Затем через колонку пропускают анализируемую смесь веществ, к одному из которых иммобилизованный лиганд обладает биологическим сродством. Выбирая из смеси требуемое соединение, лиганд образует с ним комплекс. Остальные компоненты пройдут через колонку, не задерживаясь. Специфически адсорбированный компонт может быть освобожден из комплекса изменением природы элюента, pH или ионной силы.

1. На чем основан метод аффинной хроматографии?

2. Каковы основные этапы аффинной хроматографии?

1. Безвершенко А.И. Аффинная хроматография. Киев: Наукова думка, 1973.

2. Карцова А.А. Жидкостная хроматография в медицине // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 11. С. 35-40.

Газовая хроматография - универсальный метод разделения смесей разнообразных веществ, испаряющихся без разложения. Этот метод впервые был реализован в 1952 году Джеймсом и Мартином для разделения летучих жирных кислот.

9.1. Теоретические основы метода Подвижной фазой в газовой хроматографии является газ или пар. В зависимости от состояния неподвижной фазы газовая хроматография подразделяется на газо-адсорбционную, когда неподвижной фазой является твердый адсорбент, и газо-жидкостную, когда неподвижной фазой является жидкость, а точнее пленка жидкости на поверхности частиц твердого сорбента. Принцип разделения - неодинаковое сродство органических веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке.

В первом случае происходит непрерывное распределение компонентов смеси между движущейся газовой фазой, называемой газомносителем, и твердым адсорбентом, обусловленное чередованием процессов сорбции и десорбции. Чем хуже вещество сорбируется, тем раньше оно выходит из колонки.

Во втором случае происходит чередование растворения компонента в пленке жидкой фазы, нанесенной на твердый носитель, с обратным выделением в газовую фазу, т.е. в поток газа-носителя.

Твердый носитель, применяемый в газовой хроматографии, должен иметь большую площадь поверхности и однородный размер частиц.

Обычно используются частицы размером 0,25 - 0,35 мм.

В то время, как в газо-адсорбционной хроматографии сорбентами служат активные адсорбенты (активированный уголь, силикагель, мелекулярные сита), в газо-жидкостной хроматографии применяются твердые инертные носители типа диатомита, используется также фарфор, стекло, пластмассы. Имеются различные типы твердых носителей промышленного изготовления.

Количество твердых фаз все же ограничено, поэтому поверхность твердого носителя часто покрывают тонким слоем жидкости (неподвижная фаза). Обычно применяются жидкости с низкой упругостью паров, химически инертные по отношению ко всем компонентам смеси. Число жидких фаз, пригодных для хроматографии, во много раз превышает число адсорбентов, что позволяет в каждом отдельном случае подобрать наиболее эффективную жидкость. Последняя может быть твердой при низкой температуре, но обязательно должна быть жидкой и практически нелетучей при температурах, обеспечивающих разделение компонентов смеси.

Основной характеристикой жидкой фазы является степень ее полярности. При прочих одинаковых условиях более полярные фазы дают лучшее разделение. Неполярные фазы, как правило, имеют больший молекулярный вес и устойчивы при высоких температурах. Полярные фазы обладают высокой избирательностью, однако они менее устойчивы при повышенных температурах, разлагаясь, могут нарушать процесс разделения. Количество жидкой фазы в процентах к твердому носителю варьирует в широких пределах от 1 до 30 - 50%, что зачастую позволяет влиять на быстроту и качество разделения смесей. Примером неполярной жидкой фазы служит, например, вазелиновое масло. К полярным жидким фазам относятся полигликоли, полиэфиры. Обычно для анализа биологических объектов используют силиконовые производные.

При выборе жидкой фазы полезным оказалось старое правило подобное растворяется в подобном”. В соответствии с этим правилом для разделения смеси двух веществ выбирают жидкую фазу, близкую по химической природе одному из компонентов. Ограниченность такого подхода для веществ с близкими свойствами или смесями сложного состава очевидна. Эффективным оказалось применение колонок, содержащих несколько неподвижных фаз или сложные сорбенты.

Компоненты смеси селективно удерживаются неподвижной фазой, а затем выходят из колонки и регистрируются детектором. Сигналы детектора записываются в виде хроматограммы автоматическим потенциометром (самописцем) или же регистрируются на экране компьютера.

9.2. Аппаратурное оформление газовой Основными узлами газового хроматографа являются источник газаносителя и блок подготовки газов, испаритель, термостат колонок и сами хроматографические колонки, детектор, система регистрации и обработки данных (рис. 9.1.).

Рис. 9.1. Принципиальная схема газового хроматографа:

1 - газ-носитель, 2 - испаритель, 3 - хроматографическая колонка, 4 детектор, 5 - самопишущий регистратор, 6 - измеритель скорости потока, 7 – термостат Для точного количественного отбора пробы и введения ее в хроматографическую колонку используют дозатор. Одним из основных требований к дозатору является воспроизводимость размера пробы и постоянство условий ее введения в колонку. Кроме того, введение пробы не должно вызывать резкого изменения условий работы колонки и других узлов хроматографической установки, а внутренняя поверхность дозатора не должна обладать каталитической или адсорбционной активностью по отношению к пробе.

Газообразные и жидкие пробы обычно вводят с помощью специальных шприцев, прокалывая в месте ввода пробы каучуковую мембрану. Применяются газовые шприцы для газообразных проб и микрошприцы для жидких. Микрошприцы позволяют вводить в хроматограф пробы объемом от долей до десятков микролитров. Нередко в лабораторной практике в качестве дозатора применяется медицинский шприц.

Твердые пробы вводятся в хроматограф или после перевода их в раствор или непосредственным испарением пробы в нагретом дозаторе, куда она вводится с помощью игольного ушка. Известны и другие устройства.

Испаритель служит для перевода жидкой пробы в паровую фазу.

Сердце газового хроматографа - хроматографическая колонка. Существует два основных типа колонок: насадочные и капиллярные. Насадочные колонки представляют собой стеклянные или металлические трубки длиной от 1 до 5 м с внутренним диаметром от 1,5 до 5 мм. Они заполнены “насадкой” - твердой основой с нанесенной на нее неподвижной фазой. В качестве твердой основы используются различные пористые вещества, на поверхности которых должна образоваться тончайшая пленка неподвижной фазы.

Можно использовать саму стенку колонки как твердую основу. Тогда речь идет о капиллярной колонке. Технология изготовления капиллярной колонки - это нанесение на стенку длинного капилляра из кварцевого стекла (как правило, до 30 м) тончайшего слоя неподвижной фазы. Эта технология позволила существенно улучшить параметры разделения смесей. У капиллярных колонок предпочтение отдают малым диаметрам (0,25 мм). Для выполнения хроматографического анализа необходимо подобрать характеристики колонки. Наиболее важный этап выбор стационарной фазы. Неподвижная фаза должна соответствовать следующим критериям: химическая стойкость, низкое давление пара в диапазоне рабочих температур колонки, достаточные коэффициенты распределения и селективность по отношению к исследуемым веществам, низкая вязкость.

Использование легких газов-носителей (гелий) ускоряет анализ, а относительно тяжелых (азот) улучшит качество разделения в ущерб скорости. Скорость газа выбирают экспериментально для достижения хорошего разделения компонентов смеси и максимального ускорения времени анализа. Так как характер разделения находится в зависимости от температуры, хроматографическая колонка размещается в программируемом термостате. Разделение смеси веществ с широким диапазоном температур кипения начинают при низкой температуре термостата, а затем программируют постоянное повышение температуры для элюирования высококипящих компонентов. Казалось бы, с увеличением длины колонки и уменьшением скорости передвижения эффективность разделения должна возрастать. Но при этом вещества размываются из-за диффузии. Поэтому существует оптимальный компромисс между эффективностью работы колонки, диффузией и временем анализа.

Эволюция газовой хроматографии во многом - история совершенствования систем детектирования. Детектор фиксирует изменение какого-либо свойства газа-носителя при попадании в поток исследуемого вещества. В настоящее время в газовой хроматографии применяются следующие основные виды детекторов: детектор по теплопроводности (катарометр), пламенно-ионизационный детектор, термоионный детектор, детектор электронного захвата, масс-спектрометр. Кроме того, достаточно широко применяются фотоионизационный детектор, детектор хемилюминесценции, атомно-эмиссионный детектор, спектрофотометрические детекторы.

Одним из наиболее распространенных дифференциальных детекторов является катарометр. Принцип его работы основан на измерении сопротивления нагретой платиновой или вольфрамовой нити, которое зависит от теплопроводности омывающего газа. Количество теплоты, отводимое от нагретой нити при постоянных условиях, зависит от состава газа. Чем больше теплопроводность определяемых компонентов смеси будет отличаться от теплопроводности газа-носителя, тем большей чувствительностью будет обладать катарометр. Наиболее подходящим газом-носителем с этой точки зрения является водород, теплопроводность которого значительно превышает соответствующую характеристику большинства других газов. Однако в целях техники безопасности чаще применяется гелий (азот), теплопроводность которого также достаточно высока. В последнее время металлические нити в катарометре успешно заменяются термисторами, имеющими более высокий, чем у металлов, температурный коэффициент электрической проводимости. Достоинствами катарометра являются простота, достаточная точность и надежность в работе. Однако из-за сравнительно невысокой чувствительности он не применяется для определения микропримесей.

Принцип действия пламенного детектора основан на том, что температура водородного пламени горелки изменяется при попадании в него органических веществ. Наибольшей чувствительностью обладают ионизационные детекторы, например, пламенно-ионизационный (ПИД), позволяющий обнаруживать до 10-12 г. В этих детекторах измеряют электрическую проводимость пламени водородной горелки. Чисто водородное пламя обладает очень низкой электрической проводимостью.

При появлении в водороде примесей органических соединений происходит ионизация пламени, пропорциональная концентрации примеси, что легко может быть измерено. Высокая чувствительность детекторов этого типа к органическим соединениям обусловила их широкое применение.

Выбор детектора принципиально важен для анализа проб. Критериями выбора являются чувствительность и диапазон применения. Катарометр позволяет определить вещество, содержание которого в пробе составляет 10-3%. Чувствительность ионизационных детекторов к органическим веществам значительно выше (10-8%). Для термоионного детектора чувствительность по отношению к фосфорорганическим соединениям возрастает еще на 3 – 4 порядка. Электронозахватный детектор практически нечувствителен к соединениям без атомов галогенов, зато по отношению к полигалогенпроизводным он на 2-3 порядка чувствительнее, чем ионизационно- пламенный детектор. Таким образом, при правильном выборе колонки, детектора и с учетом малого объема пробы предел обнаружения веществ методом газовой хроматографии составляет 10-12 - 10-13 г, что превосходит многие другие методы анализа.

Применение масс-спектрометра в качестве детектора газового хроматографа явилось событием такого масштаба, что потребовало самостоятельного наименования. Эта разновидность метода называется хромато-масс-спектрометрия. Масс-спектрометр обладает способностью не только зарегистрировать появление в нем разделяемого компонента, но и установить его структуру. Широкое применение хромато-массспектрометров вызвало необходимость создания гигантских библиотек баз данных масс-спектрометров всевозможных соединений.