«Организация и проведение учебного процесса по подготовке специалистов в области биобезопасности и лабораторной диагностики возбудителей некоторых опасных инфекционных болезней (учебно-методическое пособие для ...»

- изучение патологоанатомических изменений внутренних органов;

- приготовление и исследование мазков-отпечатков из органов трупа грызуна, обработанных туляремийной люминесцирующей сывороткой;

- исследование в реакции кольцепреципитации суспензии органов (печень, селезенка) трупа грызуна;

- постановка из суспензии внутренних органов трупа грызуна индивидуальной биологической пробы (п/к заражением белых мышей);

• Вскрытие отловленного грызуна с патологоанатоми патологоанатомическими изменениями во внутренних органах, характерных для туляремии:

- изучение патологоанатомических изменений во внутренних органах грызуна;

- приготовление и просмотр мазков-отпечатков из органов грызуна, окрашенных по Романовскому-Гимза;

- посев на среды Мак-Коя и Анциферова лимфатического узла, крови, печени, селезенки;

- постановка из суспензии внутренних органов грызуна индивидуальной биологической пробы (п/к заражением белых мышей);

• Вскрытие отловленных грызунов без патологоанатомических изменений во внутренних органах:

- постановка из суспензии внутренних органов грызунов биологической пробы (п/к заражением белых мышей).

Примечания:

- работа по заражению и вскрытию животных проводится курсантами в лаборатории экспериментальных животных;

- методы исследования диких грызунов отрабатываются на заранее зараженных возбудителем туляремии белых мышах;

- павших биопробных животных вскрывают немедленно.

Исследование воды:

Вскрытие морской свинки, зараженной подкожно исследуемой водой:

- изучение патологоанатомических изменений во внутренних органах;

- приготовление и исследование мазков-отпечатков из внутренних органов морской свинки, обработанных туляремийной люминесцирующей сывороткой;

- посев печени, селезенки и пахового лимфатического узла на среды Мак-Коя и Анциферова.

Примечание: морскую свинку курсанты заражают исследуемой водой заранее с учетом сроков гибели.

Продолжение исследования грызунов. Выделение • Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

• Отбор подозрительных на туляремию культур, проверка её мазком, окрашенным по Граму, и в ОРА с туляремийной диагностической сывороткой 1:10, пересев на две пробирки каждой среды: Мак-Коя, Анциферова и скошенного МПА.

Продолжение исследования воды. Выделение чистой культуры • Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

• Отбор культуры, подозрительной на туляремию, проверка её мазком, окрашенным по Граму, и в ОРА с туляремийной диагностической сывороткой 1:10, пересев на две пробирки каждой среды: Мак-Коя, Анциферова и скошенного МПА.

Продолжение исследования грызунов. Идентификация • Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

• Проверка на чистоту роста культуры мазком, окрашенным по Граму.

• Учет отсутствия роста на скошенном МПА.

• Постановка развернутой РА с выделенной культурой и туляремийной диагностической сывороткой 1:50.

• Посев выделенной культуры в пробирку со средой Мак-Коя, скошенного агара с глицерином, среду с цитруллином.

• Определение чувствительности выделенной культуры к эритромицину.

Продолжение исследования воды. Идентификация • Просмотр посевов на средах Мак-Коя и Анциферова.

• Учет отсутствия роста на скошенном МПА.

• Проверка на чистоту роста культуры мазком, окрашенным по Граму.

• Постановка развернутой РА с выделенной культурой и туляремийной диагностической сывороткой 1:50.

Примечание: окончательный учет результатов развернутой РА с туляремийной диагностической сывороткой через 18–24 ч.

Окончание исследования грызунов и воды • Просмотр посевов на среде Мак-Коя, скошенном агаре с глицерином, на среде с цитруллином.

• Проверка на чистоту роста культуры мазком, окрашенным по Граму.

• Регистрация чувствительности выделенной культуры к эритромицину.

• Заполннение паспорта на выделенные культуры.

Примечание: обеззараживание всех имеющихся посевов культур, выделенных от грызунов и из воды.

Серологические методы исследования на туляремию Серологическая диагностика туляремии у человека • Постановка развернутой РА с сывороткой больного и туляремийным диагностикумом. Предварительный учет развернутой РА через 1 ч, окончательный - через 18–24 ч.

• Постановка РНГА и РТНГА с сывороткой больного и туляремийным эритроцитарным антигенным диагностикумом. Учет результатов РНГА и РТНГА через 2 ч.

• Постановка кровяно-капельной РА с кровью больного и туляремийным диагностикумом Реакцию применяют для экспрессной серологической диагностики туляремии у людей. В качестве антигена используют туляремийный диагностикум из микробов вакцинного штамма, убитых формалином (1 мл диагностикума содержит 25 млрд. м. кл.).

В чашке Петри смешивают каплю исследуемой крови и каплю дистиллированной воды для получения гемолиза эритроцитов. Затем к крови добавляют каплю диагностикума и перемешивают. Реакция агглютинации наступает немедленно, если в сыворотке крови больного содержатся антитела с диагностическим титром 1:100 и выше. Реакция бывает слабо выраженной и появляется в течение 5 мин, если в сыворотке крови больного содержатся антитела в более низком титре (1:50).

Исследование погадок хищных птиц • Определение двух минимальных сывороточных единиц (2 СЕ) туляремийной диагностической сыворотки и постановка РНАт с материалом из погадок хищных птиц и туляремийным эритроцитарным антигенным диагностикумом.

Примечание: погадки хищных птиц курсанты получают предварительно подготовленными к исследованию.

Окончание исследования погадок хищных птиц Учет РНАт с материалом из погадок хищных птиц.

Аллергические методы исследования на туляремию.

Исследование крови больного на туляремию в реакции лейкоцитолиза.

Эта реакция основана па учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена. Реакция лейкоцитолиза становится положительной к 3–4 дню с момента заболевания или вакцинации, В две лунки полистироловой пластины вносят по мкл 5% раствора цитрата натрия. Кровь для исследования берут у людей из пальца в объеме 200 мкл с помощью микропипетки и вносят по 100 мкл в обе лунки, в первую (опытную) лунку вносят 100 мкл накожного тулярина, во вторую (контрольную) – мкл физиологического раствора (рН 7,2). Содержимое лунок перемешивают стеклянной палочкой, пластину закрывают и помещают на 2 ч в термостат при 37°С.

Через 2 ч содержимое опытной лунки перемешивают, микропипеткой набирают 20 мкл и переносят в лунку, содержащую 400 мкл 3% уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синькой до светло-голубого цвета. То же проделывают с кровью из контрольной лунки. Затем производят подсчет лейкоцитов в камере Горяева. Разрушенные клетки, а также собирающиеся в кучки лейкоциты не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляют по формуле:

mk– количество лейкоцитов в контрольной лунке;

mо – количество лейкоцитов в опытной лунке.

Полученные результаты оценивают по шкале:

К – 15% и ниже – отрицательный или сомнительный;

К – от 16% до 20%–слабо положительный;

К – от 21% до 30%–положительный;

К – выше 30%–резко положительный.

Молекулярно-генетические методы исследования Одним из основных генетических методов, используемых в настоящее время при исследовании на туляремию, является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Она даёт возможность с высокой надёжностью и в максимально сжатые сроки определить наличие возбудителя в пробах и начать своевременное проведение противоэпидемических мероприятий.

Сущность полимеразной цепной реакции состоит в избирательной амплификации определённых последовательностей, присутствующих в исследуемой ДНК.

ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, соответствующего солевого буфера, дезоксинуклеозидтрифосфатов и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени. Реакцию проводят циклически, многократно (на протяжении 25-40 циклов), повторяя три этапа реакции в приборе, называемом термоциклером. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для её детекции с помощью электрофореза. В настоящее время для постановки ПЦР используют генодиагностические препараты, в основе которых лежит амплификация iglABCD, fopA или других видоспецифичных генов туляремийного микроба. К таким препаратам относятся экспериментальные серии «ГенТул» – тест системы для выявления ДНК F. tularensis методом ПЦР» (производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб») и «АмплиСенс F. tularensis –FRT»

– набора реагентов для выявления ДНК F. tularensis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва).

Не допустимо применение для генной диагностики туляремии праймеров, комплементарных гену 16 S рРНК и гену lpn, кодирующему синтез предшественника мембранного белка молекулярной массы 17 kD.

Это связано с тем, что установлена высокая гомология этих генов у туляремийного микроба и F. philomiragia, Wolbachia persica и других эндосимбионтов клещей родов Amblyomma, Ornithodorus и Dermacentor.

К исследуемым образцам добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при 56 оС в течение мин. После обработки мертиолятом натрия 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объёмом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор на основе 6М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции к тест-системе, и инкубируют мин при температуре 65 оС. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.

Выделение ДНК, проведение ПЦР и учет результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

Выявление фрагмента соответствующего по размеру фрагменту положительного контроля или наличие в пробе специфической флуоресценции по соответствующим каналам указывает на наличие в пробе ДНК туляремийного микроба.

Исследование материала для выявления ДНК возбудителя туляремии с использованием ПЦР Занятие включает три последовательных этапа, которые выполняются в течение одного полного учебного дня.

Для постановки реакции используется тест-система, разработанная в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб». Тестсистема предназначена для выявления возбудителя F.

tularensis в клиническом материале и объектах внешней среды при помощи системы праймеров, комплементарных участку гена, кодирующего белок молекулярной массой 23 kD. Принцип реакции заключается в многократно повторяющихся циклах синтеза (амплификации) специфичной области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок – праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК. Каждый цикл включает в себя три стадии с различными температурными режимами. На первой стадии при 94оС происходит разделение цепей ДНК, затем при 53оС – присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНКмишени, на третьей стадии при температуре 72оС – синтез новых цепей ДНК путём удлинения праймеров в направлении 5’ – 3’ конца. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, ограниченного парой выбранных праймеров, что позволяет за 35 циклов наработать ДНК в количестве, достаточном для её детекции с помощью электрофореза.

Материалом для исследования могут быть пробы от больного (пунктат из бубона, соскоб из зева, отделяемое из глаза и др.), пробы из окружающей среды (вода, смывы, суспензии органов грызунов, кровь, кровососущие членистоногие и др.), бактериальные культуры.

Отбор проб осуществляется с соблюдением правил асептики, стерильным инструментом в одноразовые ёмкости. Обеззараживание материала, подлежащего исследованию, проводят согласно МУ 3.5.5-1034- мертиолятом натрия (1:10000) с последующей обработкой лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при 65 оС в течение 15 мин.

Пробы крови, содержимого бубона, мазков из зева и с коньюктивы глаза, отделяемого язвы исследуют без предварительной подготовки, отбирая для анализа по 0,1 мл нативного материала в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

К мокроте (1–2 мл) добавляют равный объем приготовленной ex tempore смеси NALC (0,25 г N-ацетил-Lцистеина, 25 мл 4% раствора NaOH, 25 мл 0,1 М тризамещенного цитрата натрия или набор Муколизин, ИнтерЛабСервис). Перемешивают покачиванием в течение 20–30 с. Смесь инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем разводят 0,067 М фосфатным буфером (рН 6,8) до 50 мл. Центрифугируют в течение 15 мин при 10000 об/мин. Осадок используют для выделения ДНК.

Кусочки органов массой до 10 г растирают в стерильной ступке со стеклянным порошком, после чего добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки через ватный тампон в отдельную пробирку. Центрифугируют в течение 15 мин при об/мин, осадок суспендируют в физиологическом растворе и используют для выделения ДНК. Подготовку гидробионтов осуществляют аналогичным образом.

Блох перед исследованием усыпляют эфиром, нанося каплю эфира на ватно-марлевую пробку. Ссыпают в стерильную ступку, куда вносят 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида и растирают. Затем с помощью пипетки через ватный тампон в отдельную микропробирку отбирают надосадочную жидкость, из которой проводят выделение ДНК.

Пробы клещей, объединенных по 5–50 шт., комаров, объединенных по 50–100 шт. (в зависимости от вида, точки сбора, упитанности и т.д.), растирают в охлажденной стерильной фарфоровой ступке с 0,5–1,0 г охлажденного стерильного стеклянного порошка, добавляют 1–2 мл охлажденного 0,9% раствора натрия хлорида. Затем переносят по 1,0 мл жидкой фазы в пластиковые микропробирки объемом 1,5 мл. Подготовленные образцы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для выделения ДНК, для чего отбирают 0,1 мл образца.

Отобранные навески соломы и мякины измельчают при помощи ножниц и пинцета на листе бумаги, затем помещают в банки. К исследуемому материалу добавляют 0,9% раствор натрия хлорида 1:10, тщательно перемешивают в течение 15 мин, отстаивают в течение 10 мин для оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в течение 2–3 мин при 5000 об/мин, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин.

Осадок суспендируют в 0,2–0,5 мл дистиллированной воды. Подготовку гнезд грызунов осуществляют аналогичным образом.

Пробы погадок птиц и помета хищных млекопитающих суспендируют в физиологическом растворе из расчета 1:9 (1 часть пробы + 9 частей физиологичесого раствора). Для исследования отбирают 1 мл суспензии и переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пробирки центрифугируют при об/мин в течение 5 мин. Отдельным наконечником с аэрозольным барьером из каждой пробирки отбирают надосадочную жидкость и переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспендируют в 0, мл 0,9% раствора натрия хлорида и используют для исследования.

Пробы воды открытых водоемов объемом 1,0 л дробно центрифугируют. Первоначально в течение 15 мин при 10000–12000 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в 0,5 мл физиологического раствора, помещают в микроцен трифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 2000–5000 об/мин в течение мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1, мл. Для выделения ДНК используют 0,1–0,2 мл надосадочной фракции.

Для проведения амплификации готовят необходимое количество микропробирок V-0,6 мл, соответствующее числу проб, а также две микропробирки для положительного и отрицательного контролей. Реакционную смесь готовят в отдельной пробирке из рассчёта на одну пробу: Н2О – 7,0 мкл, 10ХБ – 2,5 мкл, дНТФ – 2,5 мкл, МgCl2 – 1 мкл, праймеров FT23s1 и FT23a1 – по 1 мкл каждого, фермента Taq-полимеразы – 0,2 мкл.

Во все пробирки вносят по 15 мкл реакционной смеси и добавляют 30 мкл (1 капля) минерального масла. Все манипуляции осуществляют при 4–5оС.

В соответствующие пробирки для проведения амплификации, используя одноразовые наконечники, вносят под масло по 10 мкл подготовленных проб. В пробирку, помеченную как положительный контроль, вносят 2 мкл контрольной ДНК (1 нг/мкл) и 8 мкл Н2О; в отрицательный контроль – 10 мкл Н2О. Все подготовленные микропробирки центрифугируют 20 сек при об/мин и помещают в амплификатор. Проводят ПЦР в следующем температурном режиме: денатурация при 94оС в течение 3 мин; затем 35 циклов: 94оС – 40 сек, 53оС – 40 сек, 72оС – 40 сек, в заключение проводят дополнительный цикл при 72 оС в течение 5 мин.

Продукты ПЦР анализируют методом гель-электрофореза в 1,5% агарозе, которую готовят на ТАЕ-буфере с бромистым этидием (состав ТАЕ-буфера: трис-НСl – 4,84 г; ледяная уксусная кислота – 1,2 мл; раствор ЭДТА в концентрации 0,5 М; бромистый этидий – до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, общий объём доводят дистиллированной водой до 1 литра, рН 8,0).

К 10–20 мкл ПЦР-продукта добавляют 1–2 мкл 10-кратного буферного раствора, содержащего: бромфеноловый синий – 0,25%, фиколл – 25% в дистиллированной воде. Подготовленные смеси вносят в лунки агарозного геля.

Окрашенный бромистым этидием гель просматривают под ультрафиолетовым излучением, для чего используют трансиллюминатор с максимальной длиной волны 254 нм. Анализируемые фрагменты проявляются в виде светящихся розово-красных полос.

При оценке результатов в отрицательном контроле полосы должны отсутствовать, в положительном контроле выявляется полоса фрагмента размером 548 н.п., в анализируемых пробах отсутствие полосы строго на уровне положительного контроля свидетельствует об отрицательном ответе, а наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю – свидетельствует о наличии в пробе ДНК F. tularensis.

9. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

9.1. Биологические свойства возбудителя сибирской Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием человека и животных (домашних и диких).

Основным источником инфекции при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудителя с мочой, испражнениями и слюной в почву, инфицируя ее, поэтому почва, особенно богатая органическими веществами, становится дополнительным резервуаром возбудителя. Заражение животных происходит главным образом элементарным путем (через корм и питьевую воду, зараженные спорами), реже – трансмиссивным – через укусы кровососущих насекомых и воздушным путем.

Заражение человека сибирской язвой происходит при непосредственном контакте с трупами погибших животных, при разделке туш вынужденно убитых животных, при уходе за больными животными, при употреблении мяса или мясных продуктов, полученных от больных животных, при контакте с шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем или его спорами.

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis относится к семейству Bacillaceae, роду Bacillus. Это крупная палочка длиной 5-8, иногда до 10 мкм, диаметром 1,0–1,5 мкм. Концы у живых палочек слегка закруглены, у убитых они как бы обрублены и слегка вогнуты. Палочки в мазках располагаются цепочками напоминая бамбуковую трость. Сибиреязвенная палочка хорошо красится всеми анилиновыми красителями, грамположительна. Жгутиков не имеет, образует споры, но только вне организма человека или животного при наличии кислорода и определенной влажности.

Оптимум для спорообразования 30-35 С (ниже 12С и выше 43С спорообразования не происходит). Споры располагаются центрально, их диаметр не превышает диаметра бактериальной клетки. Образование спор происходит в тех случаях, когда бактерии испытывают дефицит источников энергии. Поскольку в крови и тканях источники питания бактерий имеются, спорообразования в организме не происходит. Возбудитель сибирской язвы образует капсулу (рис.21), но только в организме животного и человека или на специальных питательных средах. Капсулообразование патогенных бактерий – защитный механизм.

Рис.21. Каспула возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis Возбудитель сибирской язвы – аэроб или факультативный анаэроб. Температурный оптимум для роста 37 – 38С, рН среды 7,2 – 7,6. К питательным средам не требователен. На плотных средах образует характерные крупные матовые шероховатые колонии R-формы.

Структура колоний, благодаря цепочечному расположению палочек, которые образуют нити, отходящие от центра, имеют сходство с локонами или львиной гривой (рис.22).

Рис.22. Морфология колонии Bacillus anthracis.

На агаре и в бульоне, содержащем пенициллин (0, – 0,5 ЕД/мл), через 3 ч инкубации бациллы образуют цепочки из шарообразных клеток - феномен «жемчужного ожерелья». В бульоне палочка, находящаяся в R-форме, растет на дне, образуя осадок в виде комочка ваты, бульон при этом остается прозрачным. B. anthracis вирулентна в R–форме, при переходе в S-форму она утрачивает свою вирулентность. Такие палочки на плотной среде образуют круглые гладкие колонии с ровными краями, а в бульоне – равномерное помутнение. При этом палочки утрачивают способность располагаться в мазках цепочками и приобретают вид коккобактерий.

Основные свойства, выделяющие сибиреязвенный микроб в отдельную систематическую единицу и обусловливающие патогенез заболевания, заключаются в его факторах патогенности – способности клетки синтезировать сложнокомпонентный экзотоксин и капсулу – полипептид d-глутаминовой кислоты. Гены, кодирующие синтез экзотоксина и капсулы, локализованы на плазмидах РХ О1 и РХ О2 м.м. 110 и 60 мДа, соответственно. У близкородственных бацилл эти плазмиды не обнаружены. Токсин, секретируемый B.

anthracis, состоит из трех белковых компонентов, биологическая активность которых проявляется при их сочетанном действии. Согласно принятой классификации, компоненты токсина обозначены как отечный фактор (ОФ), протективный антиген (ПА) и летальный фактор (ЛФ). Установлено, что ОФ является ферментом - аденилатциклазой (цАТФ пирофосфатлиаза), который в неактивной форме продуцируется бактериальной клеткой и способствует повышению уровня цАМФ более чем в 200 раз. Активация аденилатциклазы в клетках макроорганизма происходит под воздействием Са-связывающего белка - кальмодуллина.

Роль ПА заключается в создании рецепторной системы, через которую проникают ОФ и ЛФ. Кроме того, ПА способствует выработке в организме восприимчивого животного и человека специфических иммуноглобулинов, т.е. участвует в формировании антитоксического иммунитета. ЛФ проявляет цитотоксический эффект и вызывает отек легких.

Генетические детерминанты факторов патогенности сибиреязвенного микроба подробно изучены в результате клонирования генов отечного, протективного, летального компонентов токсина и капсулы, определения их нуклеотидных последовательностей, создания моделей возможных механизмов их регуляции. Наиболее распространенными подходами к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба являются определение плазмидного профиля штаммов, гибридизационный и ПЦР-анализ ДНК, которые в преимущественном большинстве случаев позволяют установить различия между полностью вирулентными штаммами, несущими гены факторов патогенности и штаммами со сниженной вирулентностью, частично или полностью утратившими детерминанты факторов патогенности.

Кроме возбудителя сибирской язвы, токсинобразующей способностью обладает B. сereus, который продуцирует растворимый диаррогенно-летальный токсин, вызывающий гибель мышей, крыс, грызунов, кроликов в течение 5-30 минут, у людей вызывает пищевую токсикоинфекцию, кератит, эндофтальмит, панофтальмит, эндокардит, менингит, остеомиелит и пневмонию.

Существует ряд отличительных признаков, позволяющих дифференцировать B. anthracis от близкородственных микроорганизмов: капсулообразование, лизис культуры под действием специфических сибиреязвенных бактериофагов, положительная проба с пенициллином (тест «жемчужное ожерелье»), специфическое свечение при исследовании люминесцентно-серологическим методом, отсутствие фосфатазной и лецитиназной активности, роста в условиях культивирования при температуре 45С и др.

Дифференциальные признаки B. anthracis и B. сereus (типовой штамм 504 Т) приведены в таблице 19. Наличие 3 положительных тестов, в числе которых один из признаков патогенности, дает возможность отнести культуру к возбудителю сибирской язвы.

Дифференциальные признаки B. anthracis и B. cereus Специфическое свечеПротеолитическая акПатогенность для жиЛецитиназная активФосфатазная активПенициллиназная возбу- Рост ди- на бульоне теля бульон прозрачен, thracis дне cereus крошковатый осадок) Примечание:

+ - положительный признак – - отрицательный признак ± - в редких случаях, в поздние сроки (3-4 сут выращивания)

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Изучение биологических свойств B. anthracis и B. сereus • Изучение характера роста культур на скошенном мясопептонном агаре.

• Изучение морфологии микробов в мазках, окрашенных по Граму.

• Посев 24-часовых агаровых культур в мясопептонный бульон, 0,3% полужидкий агар, желатин, жидкую среду с желтком, на одну из капсулообразующих сред (скошенный молочно-солевой агар, среду ГКИ, скошенную среду Леффлера), на 2 чашки МПА, чашку МПА с желтком, чашку МПА с фенолфталеинфосфатом натрия и чашку 5% кровяного агара.

Примечания:

- посевы в желатине оставить при комнатной температуре;

- посев на капсулообразующей среде поместить в СО2инкубатор и выращивать при 37 С в течение 24 ч;

- остальные посевы поместить при 37 С.

Изучение биологических свойств B. anthracis и B. сereus • Изучение суточного роста:

а) просмотр колоний на МПА, в том числе морфологии колоний под микроскопом;

б) изучение характера роста в МПБ.

• Изучение морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, приготовленных с МПА и МПБ.

• Изучени подвижности в 0,3% ПЖА.

• Изучение гемолитической активности на 5% кровяном агаре.

• Изучение лецитиназной активности на:

а) жидкой среде с желтком, б) на агаре с желтком.

• Изучение протеолитической активности и характера роста в желатине.

• Изучение фосфатазной активности на МПА с ФФФ.

Наличие или отсутствие фосфатазной активности определяют на питательной среде с фенолфталеинфосфатом натрия, на которую штрихами засевают суточную агаровую культуру для получения изолированных колоний. Через 18-20 ч инкубации при 37 оС на крышку чашки Петри вносят 1-2 мл 25%-ного водного раствора аммиака. Чашку (крышкой вниз) выдерживают в течение 1 мин при 20±2оС, после чего визуально проводят учет теста (крышку при этом заменяют).

Большинство сибиреязвенных штаммов не способны вырабатывать фосфатазу и, следовательно, разлагать фенолфталеинфосфат натрия. Спорообразующие сапрофиты разлагают фенолфталеинфосфат натрия с образованием индикатора фенолфталеина. Выросшие на питательной среде колонии B. anthracis после добавления аммиака, имеющего щелочную реакцию, остаются бесцветными, а колонии спорообразующих сапрофитов окрашиваются в розовый или красный цвет.

• Изучение способности к капсулообразованию: из культур, выращенных на капсулообразующих средах в СО2-инкубаторе, приготовление мазков и окрашивание по методу Гинса.

• Изучение чувствительности к пенициллину:

а) посев стандартной бактериологической петлей суточные бульонные культуры на чашки МПА, содержащие 10 и 50 ЕД/мл пенициллина в 1 мл б) постановка теста «жемчужное ожерелье» методом Груз (приложение);

в) постановка теста «жемчужное ожерелье» методом посева на чашки МПА с пенициллином. Контроль - агар без пенициллина.

• Изучение чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу. При постановке пробы с фагом используют 3-6-часовую бульонную культуру, которую наносят пипеткой на пластинчатый МПА и в центр подсохшей капли петлей наносят бактериофаг. Учет через 6-24ч.

Примечания:

- работа начинается с посева культур в пробирку с МПБ и в пробирку МПБ с 0,5 ЕД/мл пенициллина для постановки теста «жемчужное ожерелье»:

- посевы в желатине оставляют при комнатной температуре.

Изучение биологических свойств B. anthracis и B. сereus • Регистрация чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу.

• Регистрация чувствительности к пенициллину (рост на агаре с пенициллином в концентрации и 50 ЕД/мл).

• Изучение протеолитической активности (характер роста в желатине).

• Изучение способности к спорообразованию:

а) приготовление мазков из 3-суточных агаровых б) окрашивание мазков по методу Пешкова или другим способом.

• Обеззараживание всех имеющихся в наличии культу;

• Заполнение журналов движения культур и учета ПБА, находящихся в рабочей коллекции • Составление акта на уничтожение культуры возбудителя сибирской язвы.

Современная лабораторная диагностика сибирской язвы включает бактериоскопический, бактериологический, биологический, аллергический и серологический методы.

Лабораторное исследование при сибирской язве проводят с целью выявления возбудителя, фрагментов ДНК или специфических антигенов от больного человека (содержимое везикул, карбункулов, отделяемое язв, струп, мокрота, кровь), из органов павших животных, кожевенного сырья, шерсти и объектов окружающей среды (почва, вода, смывы, сточные воды, воздух и т.д.).

Материал от больных людей, из объектов окружающей среды, сырье животного происхождения забирают в стерильные пробирки, банки или другую лабораторную посуду. Кровь для исследования берут из вены в пробирку, засевают в питательную среду и делают два тонких мазка на предметных стеклах. Материал следует отбирать так, чтобы полностью исключить возможность рассеивания заразного начала. С соблюдением строжайших мер предосторожности, согласно ветеринарной инструкции Министерства сельского хозяйства от 5 июня 1981 г. № 115/6 А «О мероприятиях против сибирской язвы», можно произвести отсечение уха у трупа животного с той стороны, на которой оно лежит, и направить его на исследование. Для этого ухо крепко перевязывают выше и ниже предполагаемой линии среза, место среза прижигают. Ухо заворачивают в пергаментную бумагу и полиэтиленовую пленку, упаковывают в металлическую коробку или ящик.

Сырье животного происхождения (шерсть, волосы, щетина) направляют для исследования в количестве не менее 30 г. Почву отбирают в количестве 50-70 г на пробу, воду на исследование направляют в объеме не менее 1 л. Отбор проб воздуха в количестве 50- 250 л производят с помощью приборов Кротова, Дьяконова, Речменского, Киктенко, каскадных импакторов.

Смывы с объектов окружающей среды рекомендуется брать тампоном, смоченным 0,9% раствором хлористого натрия, и помещать в стерильную посуду с плотно закрывающейся крышкой.

На объекты, подлежащие исследованию, составляют сопроводительный документ с указанием места, времени, даты забора и подписи взявшего материал. В лабораторию анализы направляют в пломбированных или опечатанных герметических деревянных или железных ящиках с нарочным.

Из исследуемого субстрата готовят несколько мазков.

Окраску производят по Граму (на вегетативные клетки) и Пешкову (на споры). Бактериоскопию сочетают с люминесцентно-серологическим анализом. В мазках споры выявляются в виде овальных или круглых образований, окрашенных в голубой или синий цвет. В мазках от больного или трупа человека и животных возбудитель сибирской язвы определяется в виде характерных крупных палочек, окруженных капсулой (окрашивание по Гинсу). По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

Не загрязненный посторонней микрофлорой патологический материал от больного засевают на МПА и в пробирки с МПБ.

Загрязненный материал (кусочки органов трупа, мокроту, испражнения, кожу, шерсть, зерно, фураж, почву, мясные продукты, щетину) заливают 5-10-кратным количеством стерильной воды или 0,9% раствором хлористого натрия. Полученную взвесь разливают в две пробирки. Одну пробирку с материалом прогревают на водяной бане при 65 С в течение 30 мин с целью уничтожения вегетативных форм.

Подготовленный для исследования материал (не прогретый и прогретый) засевают на чашки с МПА; МПА, содержащим 5% дефибринированной крови барана;

МПА, содержащим 0,01% ФФФ. Посевы помещают в термостат при температуре 37 С.

Исследуемым материалом заражают биопробных животных (белых мышей и морских свинок) подкожно или внутрибрюшинно по 0,2-0,5 мл. Наблюдение за опытными животными длится до 10 дней, если они не пали. Павших животных вскрывают немедленно, производят посевы инфильтрата из места инъекции, крови и органов (сердце, селезенка, печень) на питательные среды, делают мазки, окрашивают их по Граму, одним из методов для выявления капсулы и антисоматической люминесцирующей сывороткой, отмечают патологоанатомические изменения. В положительном случае в мазках обнаруживают вегетативные клетки в виде коротких цепочек, отдельные микробные клетки, окруженные капсулой и специфически светящиеся клетки типичной морфологии при МФА. При вскрытии животных, павших от сибирской язвы, отмечают увеличенную селезенку, гиперемию внутренних органов, несвернувшуюся кровь. На месте введения материала наблюдаются различной величины студенистый геморрагический отек. Животных, выживших после 10-дневного срока наблюдения, исследуют в полном объеме.

После 20-часовой инкубации посевов исследуемого материала или органов биопробных животных отбирают колонии для дальнейшей идентификации. В первую очередь исследуют колонии, имеющие морфологию, характерную для возбудителя сибирской язвы. В случае отсутствия «подозрительных» колоний с каждого посева следует отбирать и изучать не менее любых шероховатых колоний. Колонии отсевают на МПА и МПБ. Культуру идентифицируют по основным (проба со специфическим сибиреязвенным фагом, тест «жемчужного ожерелья», способность к капсулообразованию) и дополнительным (гемолитическая, фосфатазная и лецитиназная активность, специфическая флуоресценция) тестам.

У выделенной культуры B. anthracis определяют DcL для кроликов и DL50 для морских свинок и белых мышей.

Для сокращения сроков бактериологического анализа предложен ускоренный биологический метод обнаружения возбудителя сибирской язвы. Согласно этому методу, исследуемый материал вводят внутрибрюшинно шести белым мышам по 0,5 мл. Через 1 и 2 ч вскрывают по паре мышей, из перитонеального экссудата и крови сердца делают мазки, из селезенки и печени - мазки-отпечатки. Мазки окрашивают одним из методов на обнаружение капсулы и капсульно-соматической люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Параллельно производят посевы на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя. Оставшуюся пару мышей наблюдают до 10 суток.

Реакцию термопреципитации Асколи используют в случаях, когда трудно рассчитывать на выделение чистой культуры возбудителя: при исследовании шерсти, шкур, щетины, войлока, овчины, костной муки и прочих объектов, а также при начавшихся явлениях трупного разложения и т.д. Реакция основана на обнаружении термостабильных антигенов возбудителя, которые сохраняются гораздо дольше, чем жизнеспособные вегетативные клетки. Реакция Асколи позволяет быстро обнаружить сибиреязвенный антиген. Тем не менее, эту реакцию нельзя признать строго специфичной, поскольку полисахаридный антиген возбудителя сибирской язвы вступает в реакцию с преципитирующими сыворотками против близкородственных микроорганизмов (B. cereus, B. subtilis).

При люминесцентной микроскопии, проводимой с использованием антисоматической или антиспоровой люминесцирующих сывороток, возбудитель обнаруживается в вегетативной или споровой формах. При специфической реакции наблюдается яркое свечение периферии клеток (спор), имеющих характерную морфологию. Чувствительность метода высока и колеблется в пределах сотен тысяч микробных тел в одном миллилитре материала.

Для текущей и ретроспективной диагностики сибирской язвы у человека используют аллергическую пробу с антраксином. Последний вводят в дозе 0, мл внутрикожно на внутреннюю поверхность левого предплечья обследуемого. Результат учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания в виде гиперемии и инфильтрата на месте введения и оценивается в зависимости от размера этих элементов.

В последнее время в практику лабораторных исследований, в том числе при сибирской язве, широко внедряются современные методы генетики и молекулярной биологии. Для типирования штаммов B. anthracis можно использовать величину мол% ГЦ, гибридизационный анализ, различные методы так называемого фингерпринтинга ДНК и РНК, которые методически основываются на рестрикционном анализе, гибридизационных пробах и ПЦР.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Исследование материала от больного и почвы и кожсырья на обнаружение возбудителя сибирской язвы Исследование содержимого карбункула больного • Приготовление мазков для окраски по Граму и сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой.

• Посев исследуемого материала на 2 чашки МПА с целью получения изолированных колоний.

• Постановка пробы на белых мышах (ввести подкожно двум белым мышам по 0,3 мл содержимого карбункула).

Исследование почвы • Приготовление взвеси почвы в 0,9% растворе хлористого натрия (1:10).

• Обработка части полученной взвеси термическим методом:

Прогревание проводят на водяной бане при 65°С в течение 30 мин. Прогретый материал является исходным для посева на питательные среды и заражения биопробных животных.

• Посев обработанной и необработанной почвы на чашки МПА, 2 чашки 5% кровяного агара и 2 чашки МПА с 0,01% ФФФ с целью получения изолированных колоний.

• Постановка биопробы на белых мышах (введение подкожно двум белым мышам по 0,3 мл суспензии термически обработанной почвы).

Продолжение исследования содержимого карбункула больного: выделение чистой культуры • Просмотр роста на чашках МПА.

• Отбор подозрительных колоний, проверка их мазком с окраской по Граму, посев на сектора чашки с 5%-ным кровяным агаром и в МПБ.

• Вскрытие павших биопробных животных, зараженных содержимым карбункула больного.

а) описание патологоанатомической картины, заполнение протокола;

б) посев органов (печень, лимфатический узел, селезенка) на чашку МПА, кровь - в МПБ;

в) приготовление трех мазков: для окраски по Граму, люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой, для обнаружения капсулы по методу Бурри-Гинса.

Продолжение исследования почвы: выделение чистой культуры • Просмотр роста на чашках с посевами нативного материала.

• Отбор подозрительных колоний под контролем мазка с окраской по Граму.

• Посев колоний на сектора 5% кровяного агара и в МПБ.

• Вскрытие павших биопробных животных, зараженных суспензией обработанной почвы:

а) описание патологоанатомической картины, заполнение протокола;

б) посев органов (печень, селезенка) и лимфатического узла на чашку с МПА, кровь - в МПБ;

в) приготовление трех мазков для окраски по Граму, люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой, для обнаружения капсулы одним из методов.

Примечание: при отсутствии роста культур в посевах из нативного материала провведение выделения чистой культуры от биопробных животных.

Идентификация культур, выделенных из карбункула • Просмотр посевов на секторах 5% кровяного агара и МПБ. Проверка культуры на чистоту роста в мазках, окрашенных по Граму.

• Проверка выделенных культур на чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу.

• Посев каждой культуры в желатин уколом, в 0,3% ПЖА, на жидкую среду с желтком или на чашку МПА с желтком, на среду Леффлера, на чашку МПА с ФФФ, на МПА, содержащий 10 и 50 ЕД/мл пенициллина, на скошенный МПА.

• Постановка теста «жемчужное ожерелье» (приложение):

а) на плотной питательной среде с пенициллином 0,5 и 0,05 ЕД/мл;

б) методом Груз (приложение).

• Изучение чувствительности культуры, выделенной из карбункула больного, к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков (табл. 20).

Пограничные критические значения диаметров зон задержки роста для определения чувствительности к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков Антибиотик антибиотиков в Примечания:

- посевы культур в желатине - при комнатной температуре;

- за 3 ч до предлагаемой работы отсев изучаемых культур на МПБ и МПБ с пенициллином.

Исследование кожсырья в реакции Асколи • Подготовка материала для реакции Асколи:

• Измельчение обеззараженного кожевенного сырья, добавление 0,9% раствора хлористого натрия 1:10, настаивание на холоде при 4 С в течение 18-48 ч.

Идентификация культур, выделенных из карбункула • Регистрация протеолитической активности и характера роста в желатине.

• Учет пенициллиназной, лецитиназной, фосфатазной активности на чашках МПА с пенициллином, МПА с желтком (жидкой желточной среде) и на МПА с 0,01% ФФФ.

• Учет пробы с сибиреязвенным бактериофагом.

• Учет результатов изучения чувствительности культуры от больного к антибиотикам (табл. 20).

• Приготовление мазков для определения капсулы у культур, выращенных в СО2-инкубаторе на среде Леффлера.

• Заполнение паспорта на выделенные культуры.

• Передача всех посевов выделенных культур для обеззараживания.

Постановка реакции Асколи • Фильтрование полученного экстракта до полной прозрачности через асбестовую вату или бумагу.

• Постановка реакции Асколи.

Исследование материала от больного для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы при помощи Материал от больного - содержимое карбункула - отбирают (с соблюдением правил забора клинического материала) стерильной платиновой петлей или пастеровской пипеткой в количестве 0,1-1,3 мл. Кожные элементы предварительно очищают ватным тампоном, смоченным спиртом или эфиром. Материалом для исследования могут быть также пробы из внешней среды - почва, смывы с поверхностей, а также суспензии органов павших животных и клеточные взвеси (106- м.к./ мл) при идентификации выделенных культур.

Для обеззараживания материала, содержащего спорообразующие микроорганизмы, в том числе B. anthracis, применяют методический подход, заключающийся в герминации спор и последующей обработке пенициллином, прогреванием и воздействии лизирующего буфера с гуанидинтиоционатом. Принцип метода состоит в прорастании спор в вегетативные клетки при культивировании их в благоприятных условиях.

Далее под действием температуры и пенициллина происходит разрушение клеточной мембраны бацилл с высвобождением ДНК. Последовательность выполнения операций следующая:

1. Для герминации спор исследуемый материал засевают в количестве 0,1 мл в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера рН 7,6 и инкубируют с встряхиванием при температуре 37°С в течение 2,5 ч.

2. В пробирки с материалом добавляют пенициллин в расчете 1000 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение мин, затем прогревают на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 мин.

3. Из проб отбирают по 100 мкл материала в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф, добавляют по 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при температуре 65°С в течение 15 мин.

После выполнения процедур 1-3 этапов материал для исследования считается обеззараженным, при этом не повреждается ДНК и в последующем не ингибируется ПЦР.

Для выделения ДНК из материала, обеззараженного как описано выше, используют набор реагентов, производимый РосНИПЧИ «Микроб», или аналогичный (НПФ «Биоком», «ДНК-технология» или ЗАО «ВекторБест»).

Для постановки ПЦР используется тест-система для выявления ДНК B. anthracis рХО1, выпускаемая РосНИПЧИ «Микроб». Видоспецифичные праймеры выбраны на основе нуклеотидной последовательости гена pag, кодирующего протективный антиген токсинного комплекса и локализованного на плазмиде рХО1.

Тест-систему извлекают из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок (для этого лучше использовать ледяную баню или охладитель проб). После траспортировки или длительного хранения пробирки центрифугируют 20 сек (для осаждения капель со стенок) и тщательно перемешивают на вортексе.

Готовят реакционную смесь в специально предназначенной для этого пробирке из расчета на одну пробу: 10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ - 2,5 мкл, праймеры ВА1 и ВА2 - по 1 мкл, Таq-полимераза - 0, мкл, вода деионизованная - 7,8 мкл.

Фермент в реакционную смесь вносят в последнюю очередь и оставляют его вместе с наконечником в пробирке. Затем в наконечник вставляют дозатор, настроенный на 15 мкл, реакционную смесь тщательно перемешивают не только круговыми движениями наконечника, но и поступательными движениями поршня дозатора (пипетированием). По окончании перемешивания в каждую пробирку, включая контроли, добавляют по 15 мкл реакционной смеси, после чего вносят по одной капле вазелинового масла (для предотвращения испарения реакционной смеси при термоциклировании.). В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль (-), вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирку, обозначенную как положительный контроль (+), - 10 мкл контрольной ДНК (специально предназначенным для этого дозатором!). Пробы в объеме 10 мкл вносят (также предназначенным для этого дозатором) под минеральное масло. По мере заполнения пробирки закрывают, нумеруют, помещают в амплификатор и термоциклируют по программе: предварительная денатурация при 94С (1 цикл) - 3 мин, затем 35 40-секундных циклов при 94, 49 и 72С. В заключение проводят 1 цикл при 72С в течение 10 мин.

После первого этапа амплификации для повышения чувствительности и специфичности реакции проводят вторую стадию. Реакционную смесь готовят из расчета на одну пробу: 10х буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ - 2,5 мкл, праймеры ВА3 и ВА4 - по 1 мкл каждого, фермент Taq-полимераза - 0,2 мкл, вода деионизованная - 16,8 мкл. Далее реакциионную смесь разливают по 24 мкл в каждую пробирку, наслаивают на нее по одной капле вазелинового масла и под масло вносят по 1 мкл амплификата, полученного после первого этапа реакции. Термоциклирование на втором этапе проводят по следующей программе: 1 цикл - 1 мин при 94С, 25 40-секундных циклов при 94, 49 и 72С и 1 цикл при 72С в течение 10 мин.

Наиболее простой метод выявления продукта ферментативной амплификации ДНК в ПЦР - электрофорез в агарозном геле. По окончании программы амплификации анализируемые образцы смешивают с 2,0-2,5 мкл раствора для нанесения проб и вносят в лунки горизонтального агарозного геля. Для более четкого разделения амплифицированных фрагментов целесообразно использование агарозного геля плотностью 1,3%. Электрофорез проводят в 1хТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0, мкг/мл при напряженности 6 В/см в течение 1 ч, не допуская выхода бромфенолового синего из геля. Затем гель просматривают в ультрафиолетовом свете на транс-иллюминаторе и результат фоторегистрируют.

Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицируют по размеру, сравнивая флуоресцирующие в геле полосы анализируемых образцов с полосами положительного контроля или в соответствии с маркерами молекулярного веса.

Оценка результатов ПЦР:

- положительный контроль - выявляется полоса фрагмента 154 п.н.;

- отрицательный контроль - полоса на уровне положительного контроля отсутствует - анализируемые пробы: наличие полосы на уровне положительного контроля (154 п.н.) указывает на присутствие ДНК возбудителя в исследуемом материале, - наличие полос выше или ниже положительного контроля является неспецифичным ответом и во внимание не принимается.

Режим работы с бактериями, образующими споры Вся работа с культурами возбудителя сибирской язвы и зараженными животными должна проводиться в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

При работе с возбудителем сибирской язвы для дезинфекции применяют 3-6% растворы Н2О2. Для снижения высокого поверхностного натяжения Н2О2 в ее растворы добавляют моющие средства до 0,5% концентрации. Повышение температуры смеси до 50- С значительно усиливает бактерицидную активность Н2О2 в отношении микроорганизмов и позволяет снизить экспозицию 6% раствора с 6 ч до одного часа.

Приготовление рабочих растворов и активацию производят в резиновых перчатках, предохранительных очках, 4-слойной марлевой маске.

Кроме вышеперечисленных веществ, для дезинфекции применяют растворы велтолена, формалина, едкого натра, септодора-форте и др.

В лаборатории основным методом обеззараживания объектов, инфицированных возбудителем сибирской язвы, является автоклавирование при температуре 132±2 С под давлением 2,0 кгс/см2 в течение 90 мин.

Эффективность автоклавирования контролируется физическим, бактериологическим, химическим методами. Физический метод контроля - непосредственное наблюдение за процессом стерилизации по показаниям термометра, манометра. Бактериологический контроль осуществляется с помощью тест-объектов.

В качестве тест-объектов используется отмытый стерильный песок, пропитанный термофильными бактериями «С». Пробирки с тест-объектами (не менее штук) помещают на разных уровнях в автоклав. Одна пробирка остается контрольной. После прохождения цикла автоклавирования все пробирки стерильно заливают 1% пептонной водой (не менее 5 мл в каждую пробирку), в том числе и в контрольную. Пробирки помещают в термостат при 60 С и выдерживают не менее 5 сут. В автоклавированных пробирках среда должна оставаться прозрачной, в контроле - мутной.

Химический контроль проводят с помощью веществ, имеющих строго определенную точку плавления: бензамид или сукцинимид (126±2 оС), мочевина (132± С). К последним добавляют анилиновые краски: фуко син, сафранин и др., которые при плавлении индикатора окрашивают его в тот или иной цвет.

Дезинфекция При работе за лабораторным столом пипетки, отработанные предметные и покровные стекла погружают в сосуд с 4% раствором активированного хлорамина или 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства не менее чем на 60 мин., после чего дезинфицирующий раствор сливают в канализацию, а пипетки кипятят в мыльном растворе или 2% растворе пищевой соды.

Приготовленные мазки из споровой культуры фиксируют 30 мин 96 о спиртом, содержащим 3% Н 2О2.

После отмывания мазков вода подлежит обеззараживанию автоклавированием или добавлением хлорамина до 4% концентрации с последующим его активированием. Высушивание мазков у вентилятора не допускается.

Лабораторные столы после работы протирают двукратно с интервалом 30 мин 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства. Бумагу, вату, картонные коробки и другие материалы, подлежащие уничтожению, сжигают в кремационной печи или автоклавируют, металлические предметы обжигают.

Трупы лабораторных животных сжигают в кремационной печи или автоклавируют.

Металлические ящики, садки, банки из-под животных с подстилочным материалом и экскрементами, сетчатые крышки автоклавируют или заливают на 48 ч 4% активированным раствором хлорамина либо 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

Противочумные костюмы (халаты, косынки, ватномарлевые маски) автоклавируют или замачивают в 1% активированном растворе хлорамина на 2 часа либо в 3% растворе перекиси водорода при температуре 50°С на 1 ч. Перчатки замачивают в 6% растворе перекиси водорода на 1 ч либо кипятят в 2% растворе соды 60 мин. Сапоги протирают 6% раствором перекиси водорода двукратно с интервалом в 15 мин. Помещение обрабатывают УФ при текущей дезинфекции и парами формалина при заключительной.

После проведения текущей и заключительной дезинфекции споры возбудителя сибирской язвы должны отсутствовать.

Не ранее, чем через час, но не позднее двух часов после обработки, производят контроль эффективности дезинфекции. Для этого с поверхности 100 см 5-10 объектов, подвергшихся обработке (лабораторные столы, стены, оконные рамы, двери), делают смывы ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9% раствором. Тампоны помещают в стерильные пробирки с 4-5 мл МПБ. Посевы инкубируют в термостате при 37°С 18-24 ч. Из пробирок, в которых обнаружено помутнение бульона, производят высев на МПА и посевы выдерживают 18-20 ч при 37°С.

Удовлетворительная оценка качества дезинфекции дается при отсутствии роста во всех исследованных смывах.

Методики изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы Тест «жемчужного ожерелья» на плотных питательных средах с пенициллином Перед постановкой пробы 2% питательный агар разливают по 10 мл в 3 пробирки. В первую после расплавления и охлаждения добавляют пенициллин из расчета 0,5 ЕД/мл, во вторую - 0,05 ЕД/мл, третья пробирка - контрольная (без антибиотика). Содержимое каждой пробирки выливают в заготовленные чашки. Дно каждой чашки после застывания среды расчерчивают на квадраты или кружки, на которых подписывают номер анализа. На площадь квадрата или кружка наносят одну каплю 3-часовой бульонной культуры исследуемого штамма. На одной чашке может быть поставлено до 10 проб. Чашки инкубируют при 37 С, через 3 ч просматривают рост под микроскопом, предварительно накрыв каждый квадрат или кружок покровным стеклом. На среде, содержащей пенициллин, наблюдаются сферопласты B. аnthracis, отдельные шары - «жемчужины», расположенные в виде цепочек. Другие аэробы имеют обычную форму клеток. В контрольной чашке B.

anthracis и B. cereus образуют длинные цепи клеток.

Модификация теста «жемчужного ожерелья» по Груз К бульону Хоттингера pH 7,2 добавляют стерильно 20% инактивированной лошадиной сыворотки и 0, ЕД/мл пенициллина. Соблюдая стерильность, среду разливают в пробирки по 2-3 мл и засевают 2 каплями бульонной или петлей агаровой культуры. Пробирки с посевами инкубируют в течение 3 ч при С. Затем делают мазки, которые фиксируют, окрао шивают метиленовым синим 20 сек и микроскопируют. Для B. anthracis характерны шарообразные клетки в виде цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга. B. cereus и другие сапрофиты бацилл на среде с пенициллином растут, не меняя морфологии. Контролем служат мазки, приготовленные из бульона без пенициллина.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ДИАГНОЗ ЧУМЫ

10.1. Биологические свойства возбудителя чумы Возбудитель чумы относится к семейству Enterobacteriaceae, роду Yersinia, виду pestis. В качестве внутривидовой классификации самой признанной за рубежом считается классификация Р. Девинья, которая, учитывая принципы формирования разновидностей в исторические эпохи и некоторые биохимические свойства штаммов, делит вид на 3 биовара: antiqua (древний), mediаevalis (средневековый) и orientalis (восточный) (табл.21).

Внутривидовая классификация Yersinia pestis (R. Devignat) Номенклатура и краткая характери- ФерментаНитрифи- Денитрифистика разновидностей поR. Devignat ция глицекация кация Y. pestisvar. orientalis (восточная разновидность, причина пандемии 1894 г.) Y. pestisvar. antiqua (древняя разновидность, причина пандемии «юстинианова чума») Y. pestisvar.mediaevalis (средневековая «черная смерть») В нашей стране принята единая систематическая схема подвидовых категорий, наименование которых отражает конкретные географические территории. В основу схемы положены результаты изучения штаммов, выделенных на данных территориях, методами геносистематики и нумерической таксономии. Она учитывает степень фенотипического сходства, а так же различия по содержанию ГЦ-пар в ДНК и др. Согласно этой схеме вид Y. pestis делится на 5 подвидов:

Y.pestisssp. pestis (основной), Y. pestisssp. caucasica (кавказский), Y. Pestis ssp.altaica (алтайский), Y. Pestis ssp. hissarica (гиссарский) и Y. Pestis ssp. ulegeica (улэгейский) (табл.22).

Таксономические признаки, характеризующие различные подвиды Y. Pestis Подвиды Yersinia pestis subsp.

ulegeica + + + + + +/- + + Монголия, Примечание:

«+» -наличие признака;

«-» -отсутствие признака;

«±» - наличие признака не у всех штаммов; «+/-» -чувствительны к пестицину штаммов основного и алтайского подвидов и нечувствительны к пестицину штаммов собственного подвида.

Y. pestis-полиморфная овоидная грамотрицательная палочка, длиной 1-2 мкм, толщиной 0,3-0,7 мкм, с закругленными концами и утолщенной серединой.

В мазках с плотной питательной среды палочки могут быть удлиненными, нитевидными; описаны также фильтрующиеся формы. При затяжном заболевании в мазках из бубона и органов больного возбудитель чумы может принимать форму шаров различной величины и теней. В мазках-отпечатках из тканей и органов, а также в мазках из бульонных культур окрашивается биполярно (более интенсивно на концах клетки). Биполярность ярче выявляется при окраске метиленовой синькой Леффлера.

Возбудитель чумы не имеет жгутиков и спор. Капсулу образует в организме теплокровных животных и людей, кровяном и сывороточном агаре при температуре 37°С.

Чумной микроб – облигатный паразит с факультативным анаэробным типом дыхания, относится к природным ауксотрофам. Помимо источника энергии нуждается в дополнительных факторах роста – аминокислотах и витаминах. Для роста при 28°С необходимы фенилаланин, валин, метионин, изолейцин и глицин или треонин;

при 37°С - биотин, тиамин, глютаминовая кислота и пантотенат. Штаммы из разных очагов чумы, как правило, имеют неодинаковые потребности в факторах роста, что находит отражение в схеме внутривидовой таксономии чумного микроба.

Для культивирования возбудителя требуются питательные среды с глубоким расщеплением белка. Лучшими по качеству являются среды, приготовленные из ферментативных гидролизатов кровяных сгустков (не требуют добавления стимуляторов и рост наблюдается при посеве 10-100 микробных клеток) и казеина, перевара Хоттингера, кислотного гидролизата рыбокостной муки.

Самые распространенные среды для изучения чумного микроба: бульон и агар Хоттингера, Мартена, казеиново-дрожжевой агар (питательный агар для выращивания чумного микроба, сухой), дезоксихолатноцитратный агар.

Оптимальные условия выращивания: температура 28-30°С и pH 7,0-7,2, но возбудитель способен расти на питательных средах в температурном диапазоне от до 45°С и показателях pH среды от 5,8 до 8,0.

Чумной микроб на плотных питательных средах имеет характерную морфологию роста. При посеве бактериологической петлей через 24-48 часов инкубации представляет собой бурый «тяж» в начале штриха и отдельные шероховатые колонии в конце. Морфология колоний под микроскопом является одним из основных диагностических признаков возбудителя чумы.

Через 12 ч инкубации появляются микроколонии в виде нежных прозрачных образований чаще треугольной или прямоугольной формы, напоминающих битое стекло (рис.23).

Через 18-24ч микроколонии сливаются в плоские прозрачные образования с фестончатыми краями - «кружевные платочки» (рис.24).

Рис.24. «кружевные платочки» (18-24 ч) В дальнейшем (24-48ч) «кружевные платочки» превращаются в зрелые колонии. Типичные зрелые колонии имеют бурый зернистый центр с постепенно уплощающейся прозрачной периферической зоной с фестончатыми краями.

На скошенном агаре возбудитель чумы растет в виде сочного, серовато-белого налета, хорошо фиксированного на среде. На жидкой питательной среде (МПБ, бульон Хоттингера и др.) образует хлопьевидный или порошковидный, легко распадающийся при встряхивании осадок, в совершенно прозрачном бульоне и нежную пленку на поверхности.

Бактерии чумы растут в R-форме, которая является вирулентной. Однако они относительно легко могут диссоциировать под влиянием ряда факторов (например, под действием фага) и через О-форму переходить в S-авирулентную форму.

Возбудитель чумы имеет признаки, характерные для представителей семейства Enterobacteriaceae.

Он оксидазо-отрицателен и каталазо-положителен;

проявляет выраженную ферментативную активность по отношению к различным моно-, ди-, трисахаридам и спиртам; расщепляет на 1-3 сутки глюкозу, маннозу, маннит, мальтозу, эскулин, до кислоты без газа; не ферментирует лактозу, сахарозу, сорбит, инозит, дульцит, мочевину. Отношение к глицерину, салицину, арабинозе, рамнозе и мелибиозе - вариабельное. Не образует индол, сероводород, ацетилметилкарбинол. Дает положительную реакцию с метиловым красным. Протеолитические свойства выражены слабо: не разжижает желатин и не свертывает молоко (табл. 23).

Основные ферментативные свойства возбудителей чумы Глюкоза «+» - расщепление;

«-»-отсутствие расщепления;

«±» - возможны варианты расщепления.

Важным свойством чумного микроба является его способность к денитрификации, т.е. восстановлению нитратов в нитриты. Эта окислительно-восстановительная реакция служит стойкой генетической меткой, используемой во всех схемах внутривидовой классификации штаммов чумного микроба.

Чумной микроб (кроме штаммов, выделенных от полевок на Закавказском нагорье), в отличие от псевдотуберкулезного микроба, синтезирует ферменты патогенности - фибринолизин и плазмокоагулазу.

Фибринолизин обладает способностью локально растворять сгустки фибрина и фибриногена крови в очагах воспаления. Плазмокоагулаза обусловливает свертывае-мость плазмы крови кролика, морской свинки и человека. Фибринолизин-коагулазная система обеспечивает возбудителю чумы высокую инвазивную способность и генерализацию чумной инфекции.

Большинство штаммов чумного микроба продуцируют в окружающую среду антибиотикоподобное вещество (бактериоцин), который получил название пестицин 1(Р1). Он представляет собой видоспецифический термолабильный мономерный белок. Р1 участвует в гидролизе муреинлипопротеина клеточной стенки чувствительных к нему клеток, превращая их в нежизнеспособные сферопласты. Он подавляет рост штаммов Y. Pseudotuberсulosis I серовара (по Талю) и некоторых штаммов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах чумы Закавказского нагорья, Горного Алтая, на Гиссарском хребте, в Таджикистане, и т.д., что связано с наличием в их составе 3,6-ди-деоксидВ-рибогексозы, которая выполняет роль рецептора для Р1. Способность к продукции пестицина 1, фибринолизина и плазмокоагулазы является видовым признаком штаммов Y. pestis и играет важную роль в таксономии и дифференциальной диагностике чумы.

Исключение составляют штаммы кавказского подвида, которые выделяются от полевок в Закавказском нагорье и Горном Дагестане. Они не только не продуцируют Р1, но и проявляют к нему чувствительность.

Пестицин-фибринолизин-плазмокоагулаза кодируются одной низкомолекулярной плазмидой - pPst. Эти признаки сцеплены друг с другом и потеря одного из них сопровождается потерей двух других.

В настоящее время методами иммунохимического анализа в чумном микробе обнаружено до 90 иммунохимически активных компонентов, среди которых многие являются общими с Y. pseudotuberсulosis, E.

coli, Schigella и эритроцитами человека О-группы. И только некоторые из них, как капсульный антиген (фракция I, FI), являются специфическими для возбудителя чумы.

FI-основой компонент, связанный с капсулой, представляет собой чистый белок. Наиболее интенсивно синтез FI происходит при 37°С выращивания in vitro и организме животных (in vivo). При более низких температурах культивирования капсульный антиген у микроорганизма не обнаруживается. В организме членистоногих (блох) FI не выявляется. Фракция I является основным иммуногеном и обладает строгой специфичностью, хотя в природе описаны штаммы, не синтезирующие этот белок.

Геном возбудителя чумы состоит из хромосомы размером 4,65 т.п.н. и трех плазмид-пестиногенности (pPst), кальцийзависимости (рСаd), фракции I и «мышиного токсина» (pFra), имеющих молекулярные массы соответственно 6, 47 и 61-65 мегадальтон.

pPst кодирует продукцию пестицина I, устойчивость к нему, синтез фибринолизина и плазмокоагулазы. Наличие этой плазмиды повышает вирулентность возбудителя чумы в опытах при подкожном заражении морских свинок и белых мышей.

рСаd определяет характер роста клеток при 37°С в зависимости от наличия в среде ионов кальция, а также отвечает за синтез антигенов V, W и других поверхностных белков.

pFra ответственна за продукцию фракции I и синтез «мышиного» токсина.

Возбудитель чумы относится к группе полипатогенных бактерий с высокой инвазивностью, но с относительно невысокой токсичностью. К ферментам патогенности относятся гиалуронидаза, фибринолизин, коагулаза, нейраминидаза, каталаза и др. Характерными признаками вирулентных штаммов возбудителя чумы являются: наличие капсулы, V- W- и рН6-антигенов, способность синтезировать пурины, образование пигментированных колоний на среде с гемином, пестициногенность, неспособность расти на средах при 37°С в отсутствии ионов кальция.

Дифференциальная диагностика культуры чумного микроба от большинства видов патогенных бактерий и банальной микрофлоры, как правило, особого труда не составляет. Если культуру чумного микроба невозможно дифференцировать от палочки Фридлендера, кишечной палочки, сальмонелл и других представителей кишечной группы бактерий при микроскопии мазков, так как они практически ничем не отличаются, то по морфологии колоний на агаре и характеру роста на жидких питательных средах это сделать, возможно.

Исключением является возбудитель псевдотуберкулеза в R- и OR- формах, который по морфологии микроба в мазках, а так же культуральным свойствам часто просто невозможно отличить от возбудителя чумы. В таблице 24 представлена дифференциальная диагностика.

Дифференциация возбудителей чумы и псевдотуберкулеза Подвижность в полужидком агаре при 20-22°С Лизабельность чумным фагом ПоЛизируется Не лизируется (+**) кровской Лизабельность фагом Лариной Л-413С Лизируется Не лизируется Лизабельность псевдотуберкуЛизируется Лизируется лезным фагом Способность синтезировать специфический капсульный антиген F Наличие пестицин-фибринолизинплазмокоагулирующей активности Полимеразная цепная реакция (ПЦР) pFra и pPst Примечание:

* - типичныевирулентные штаммы.

** - 17-25% штаммов Y. Pseudotuberculosis лизируются чумным фагом Покровской.

*** - свежевыделенные штаммы чумного микроба могут фер ментировать мочевину.

**** - способность синтезировать капсульный антиген (F1) отсутствует у штаммов возбудителя чумы, выделяемых во Вьетнаме (в том числе и от людей), а также – от грызунов в некоторых Среднеазиатских природных очагах чумы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Биологические свойства Y. pestis и Y. pseudotuberculosis • Изучение характера роста культуры на скошенном агаре.

• Изучение морфологии микробов в мазках, приготовленных из агаровой культуры, и в мазках-отпечатках органов грызунов, павших от чумы. Окрашивание мазков по Граму и синькой Леффлера.

Постановка пробы с 3% КОН.

• Посев каждой культуры на 3 чашки питательного агара (ПА), 2 чашки агара с генцианвиолетом, в пробирки с 0,3% питательным агаром, средами Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, глицерином, рамнозой, арабинозой, маннитом, мальтозой, со средой Кристенсена, цветной дифференциальной средой (ЦДС), в питательный бульон (ПБ), ПБ с KN03, в пробирки со скошенным питательным агаром.

• Определение пестициногенной активности (приложение).

• Посев культуры возбудителя чумы и возбудителя псевдотуберкулеза на чашку 1,5% питательного агара с генцианвиолетом бляшками диаметром 0,5-1,0.

Примечания:

- посев на ПА поместить при 28°С, 37°С и при комнатной температуре;

- посевы на агаре с генцианвиолетом - при 28°С и при комнатной температуре;

- посев на 0,3% ПА - в шкаф при комнатной температуре;

Биологические свойства Y. pestis и Y. pseudotuberculosis • Изучение морфологию формирующихся колоний на ПА, ПА с генцианвиолетом.

• Изучение морфологии роста культур в бульоне.

• Приготовление мазков из агаровой и бульонной культур, окрашивание по Граму и синькой Леффлера.

• Определение подвижности на 0,3% ПА.

• Изучение ферментации углеводов и спиртов на средах Гисса, уреазной активности на среде Кристенсена и ЦДС (приложение).

• Изучение фаголизабельности.

• Постановка пробы на чувствительность к бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному методом «стерильного пятна».

• Постановка пробы на чувствительность к бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному двухслойным методом (приложение).

• Постановка пробы на чувствительность к бактериофагу Покровской методом дифференциального рабочего титра (приложение).

• Постановка пробы на чувствительность к бактериофагу Л-413С ускоренным методом.

• Посев культуры в пробирки со скошенным питательным агаром.

Биологические свойства Y. pestis и Y. pseudotuberculosis • Изучение морфологии 2-х суточного роста возбудителей чумы и псевдотуберкулеза на ПА, ПА с генцианвиолетом.

• Изучение морфологии роста культур в бульоне через 48 ч.

• Регистрация ферментации углеводов и спиртов на средах Гисса.

• Определение фибринолитической и коагулазной активности (приложение).

• Посев культуры возбудителя чумы на пластинчатый и скошенный ПА с кровью.

• Посев культуры на скошенный ПА.

• Изучение фаголизабельности.

• Учет пробы с фагами.

• Определение пестициногенной активности (приложение).

Примечание: инкубирование посевов с кровью на ПА при 37°С.

Биологические свойства Y. pestis и Y. pseudotuberculosis • Учет пробы на фибринолизин и коагулазу.

• Постановка пробы на нитриты с реактивом Грисса.

• Определение пестициногенной активности.

• Регистрация зоны задержки роста индикаторного штамма возбудителем чумы.

• Изучение вирулентности чумного микроба на специальных питательных средах.

Рост на среде Джексона-Берроуза На поверхность среды с гемином или ДАС нанести 0,1 мл взвеси односуточной агаровой культуры, содержащей 5х103 м.к./мл, и распределить шпателем по поверхности агара. Посевы инкубировать 4-5 сут. при 28°С. Вирулентные бактерии чумы вырастают в виде бурых колоний на среде с гемином, темно-красных или темно-синих на ДАС (Psb)+. Бактерии, утратившие вирулентность, образуют бесцветные колонии (Psb)-.

Рост на среде Хигучи-Смита и питательной среде для определения потребности чумного микроба в ионах кальция сухой (ВМ) Для исследования на среде Хигучи-Смита и ВМ из односуточной агаровой культуры готовят взвеси, содержащие 103 или 2х103м.к./мл. Из каждого разведения по 0,1 мл высевают на чашки со средой. Посевы инкубируют при 37°С. Через 48 ч отмечают колонии I порядка (бактерии, независимые от ионов кальция, авирулентные). Через 24 ч дополнительной инкубации при той же температуре регистрируют колонии II порядка, состоящие из авирулентных иммуногенных клеток. Затем посевы помещают при 28°С и подсчитывают вновь появившиеся колонии, состоящие из вирулентных клеток. В качестве контроля 100 или 200 м.к.

высевают на агаровые пластины с 1% дефибринированной крови барана или кролика при использовании среды Хигучи-Смита или питательный агар для выращивания чумного микроба-при работе со средой ВМ.

• Посев суточной культуры возбудителя чумы на среду ВМ с контролем и Джексона-Берроуза или ДАС для выявления вирулентных и авирулентных клеток.

• Изучение антигенной структуры возбудителя чумы. Определение фракции I чумного микроба.

• Определение 2 сывороточных единиц (СЕ) противочумной сыворотки.

• Приготовление микробной взвеси 109 м.к./мл на 2% растворе формалина из культуры возбудителя чумы, выращенной на ПА с кровью при 37°С.

• Контрольный высев через 1 ч из обработанной формалином взвеси на чашку ПА.

Примечание: инкубация посевов на среде ВМ и контроля - при 37°С, на среде Джексона-Берроуза - при 28°С.

Биологические свойства Y. pestis и Y. pseudotuberculosis • Изучение антигенной структуры. Определение F чумного микроба.

• Люминесцентно-серологический метод.

• Серологические реакции с применением эритроцитарных диагностикумов (РПГА, РНАт).

Биологические свойства Y. pestis • Изучение вирулентности возбудителя чумы на специальных средах.

• Регистрация всех колоний (I - II порядка), выросших на среде ВМ при 37°С в течение 42-48 ч, сравнение с ростом на контрольной чашке. Инкубация посевов при 28°С.

• Выявление ДНК (pFra и pPst) Y.pestis методом полимеразной цепной реакции.

• Подготовка пробы - микробной взвеси 104 м.к./мл.

• Постановка ПЦР:

ГенПест тест-система предназначена для выявления ДНК возбудителя чумы в исследуемом материале методом ПЦР.

Для детекции Y. pestis подобрана система, состоящая из двух пар праймеров, выбранных на основе двух собственных плазмид чумного микроба pFra и pPst. Первая пара праймеров, соответствующих нуклеотидной последовательности гена pla (плазмида pPst), обеспечивает амплификацию фрагмента 478 п.н., вторая пара праймеров F21-F22, комплементарных участку гена caf (плазмида pFra), амплифицирует фрагмент - 295 п.н.

В состав тест - системы входят следующие компоненты: деионизованная вода,10 х буфер, дНТФ, plaY 1 – праймер, plaY 2 – праймер, F 21 - праймер, F 22 – праймер, фермент Taq - полимераза, контрольная ДНК, масло вазелиновое.

Набор хранится при температуре -20°С. Срок хранения не более 6 месяцев.

Объектом для исследования может быть клинический материал, объекты внешней среды, органы животных, а также клеточные взвеси при идентификации выделенных культур. При работе с клиническим материалом и загрязненными объектами внешней среды необходим предварительный этап подготовки проб (выделение ДНК). Подготовку проб осуществляют с помощью поставляемого отдельно набора и прилагаемой к нему инструкции.

При работе с микробными взвесями (109 м.к./мл) возможна их обработка мертиолатом натрия (0,01%) с последующим прогреванием при 56°С в течение 30 мин для обеззараживания. Разведения чистых культур из 109 м.к./мл до 104~ 106 м.к./мл следует готовить на бидистиллированной воде, поскольку хлорид натрия, входящий в состав физиологического раствора, является ингибитором ПЦР.

Для проведения ПЦР готовят необходимое количество 0,6 мл микропробирок, соответствующее числу исследуемых проб, а также еще три пробирки - для приготовления реакционной смеси, положительного и отрицательного контролей. Затем извлекают тестсистему из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок (для этого лучше использовать ледяную баню). После транспортировки или длительного хранения пробирки центрифугируют на микроцентрифуге 20 сек (для осаждения капель со стенок) и тщательно перемешивают на вортексе. После этого готовят реакционную смесь в специально предназначенной для этого микропробирке из расчета на одну пробу: деионизованной воды - 5,8 мкл, 10х буфера – 2, мкл, дНТФ - 2,5 мкл праймеров - по 1 мкл каждого и фермента Taq - полимеразы - 0,2 мкл. Фермент в реакционную смесь вносят в последнюю очередь и оставляют его вместе с наконечником в микропробирке. Затем в этот наконечник вставляют дозатор, настроенный на 15 мкл, тщательно перемешивают реакционную смесь не только круговыми движениями наконечника, но и поступательными движениями поршня дозатора (пипетированием). По окончании перемешивания добавляют по 15 мкл реакционной смеси в каждую микропробирку, включая контроли, после чего раскапывают минеральное масло. Минеральное масло вносят по одной капле из 1 мл наконечника микродозатора для предотвращения испарения реакционной смеси при термоциклировании. После этого в пробирку, обозначенную как отрицательный контроль, вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирку, обозначенную как положительный контроль, - 10 мкл контрольной ДНК (контрольную ДНК необходимо вносить специально предназначенным для этого микродозатором!). Пробы в объеме 10 мкл вносят (также предназначенным для этого микродозатором) под минеральное масло.

По мере заполнения пробирки закрывают, нумеруют, помещают в амплификатор и проводят термоциклирование по следующей матричной программе:

94°------------3 мин х 1 цикл 94°-----------40 сек !

58°-----------40 сек ! 35 циклов 72°-----------40 сек !

72°------------3 мин х 1 цикл 10°-----------хранение Учет результатов. Продукты, полученные в ПЦР, анализируют методом электрофореза в 1,5–2% агарозе с добавлением бромистого этидия. Агарозу готовят на 1х ТАЕ буфере, который готовят из 50-кратного, путем разведения в 50 раз (состав 1 литра 50- кратного ТАЕ буфера: 242 г триса, ледяная уксусная кислота - 57 мл, 0,5 М раствор ЭДТА - 100 мл, бромистый этидий - 0, мкг/мл, рН 8,0). Доведенную до кипения и охлажденную до 50°С агарозу заливают в специальную ванночку, устанавливают гребенку и оставляют застывать при комнатной температуре. После полимеризации осторожно извлекают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза. Затем к амплификату добавляют 4-5 мкл смеси, состоящей из 0,25% бромфенолового синего и 25% фиколла-400, приготовленной на дистиллированной воде, перемешивают при помощи того же наконечника и вносят в карманы геля. По окончании камеру подключают к источнику тока и задают напряжение 10-15 в/см. Электрофоретическое разделение продолжают в течение 25-35 мин до прохождения лидирующего красителя около 2/3 длины трека (рекомендуемая длина трека - 4 см), после чего извлекают гель из камеры и помещают на стекло трансиллюминатора с УФ излучением 310 нм.

Внимание! С гелем агарозы следует работать в перчатках, поскольку бромистый этидий является мутагеном.

Оценка результатов ПЦР:

1. Положительный контроль - выявляются две специфичных полосы размером 478 п.н. и 295 п.н.

2. Отрицательный контроль: полосы на уровне положительного контроля должны отсутствовать, наличие полос свидетельствует о контаминации тест-системы.

3. Анализируемые пробы: наличие одной или двух полос строго на уровне положительного контроля указывает на присутствие ДНК данного возбудителя.

4. Наличие полос, располагающихся выше или ниже контрольных, является неспецифичным ответом и во внимание не принимается.

5. Полученные результаты можно документировать с помощью видеосистемы или фотографированием геля с использованием оранжевого или интерференциального (594 им) светофильтра.

Чувствительность метода – не менее 1000 геномов Y.

pestis в 1 мл.

Биологические свойства Y. pestis и Y. pseudotuberculosis • Изучение многосуточного роста возбудителей чумы и псевдотуберкулеза на плотных и жидких питательных средах.

• Приготовка и просмотр окрашенных по Граму мазков с агаровой и бульонной культур.

• Регистрация ферментации углеводов и спиртов на средах Гисса.

• Изучение потребности штаммов чумного микроба в аминокислотах.

• Изучение вирулентности возбудителя чумы на специальных средах.

• Подсчет вновь появившихся колоний (III порядка) на среде ВМ, сравнение с ростом на контрольной чашке.

• Обеззараживание посевов.

• Окончательный учет РПГА и РНАт.

Биологические свойства Y. pestis • Подсчет количества вирулентных и авирулентных клеток на среде Джексона-Берроуза или ДАС.

• Обеззараживание посевов.

Биологические свойства Y. pestis • Изучение потребности чумного микроба в аминокислотах.

• Учет результатов. Обеззараживание посевов.

10.2. Контроль диагностических питательных сред Для выделения культуры возбудителя чумы и ее изучения используют питательные среды лабораторного изготовления, а также коммерческие сухие среды, имеющие номер госрегистрации и лицензию на изготовление. Каждая серия агара должна быть проверена на ростовые свойства и обеспечение формирования типичных по морфологии и характеру роста колоний. Нормативно-методические требования, предъявляемые к качеству сред, изложены в методических указаниях «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза» 2007 г.

(МУ 3.3.2.2124-06).

Качество сред оценивают по следующим биологическим показателям:

- чувствительность (определяют по максимальному разведению культуры, при котором на всех засеянных чашках или пробирках наблюдается рост);

- прорастание (процент выросших колоний микроорганизмов от числа засеянных клеток);

- эффективность (выход микробных клеток с 1 мл питательной среды);

- стабильность (отношение числа атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим свойствам колоний к числу колоний тест-штаммов);

- ингибиция (степень подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору);

- скорость роста (минимальное время вырастания культуры).

Для проверки диагностических питательных сред используют тест - штаммы:

Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680 - Закавказского горного очага иY. pestis И- 2377 - Горно-Алтайского очага.

Методика проведения контроля питательных сред, схема и оценка качества представлены в приложении.

Проверенные питательные среды должны храниться в темном месте при постоянной температуре (от 4 до 20°С). Срок хранения агара не более 2 месяцев, после чего он должен проходить переконтроль для продления срока годности еще на 1 месяц.

Контроль ингибирующих свойств питательных сред.

При выделении возбудителя чумы из биологического материала или объектов внешней среды для подавления сопутствующей микрофлоры применяют среды с генцианвиолетом (генциановый фиолетовый), кристаллвиолетом или питательную среду для выделения и культивирования чумного микроба. Ингибирующие свойства среды определяют как по отношению к чумному микробу, так и по отношению к микробам - ассоциантам, для этой цели используют тест-штаммы Р. Vulgaris HX 19 №222, B.

cereus 8, E. сoli 18.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Бактериологический контроль диагностических питательных сред на чуму • Приготовление взвеси суточной культуры Y. pestis EV концентрацией 109 м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича ОСО 42П 10 единиц и последовательных десятикратных разведений до 102м.к./мл.

• Посев из взвесей, содержащих 104 и 103 м.к./мл, по 0,1 мл каждой дозы в 3 пробирки с 10 мл ПБ.

• Посев из взвесей, содержащих 103и 102 м.к./мл, по 0,1 мл каждой дозы на 3 чашки проверяемого агара.

• Приготовление смеси из 1 мл взвеси культуры Y.

pestis EV, содержащей 103 м.к./мл, и 1 мл взвеси протея, содержащей106 м.к./мл.

• Посев смеси 0,1 мл на ПА с генцианвиолетом (1:500000 и 1:200000) по 3 чашки на каждую дозу ингибитора.

• Посев 0,1 мл из взвеси культуры EV концентрацией 103 м.к./мл на чашку с генцианвиолетом (1:500000 и 1:200000), по 3 чашки на каждую дозу.

Контроль питательных сред на чуму • Просмотр посевов на пластинчатом агаре, регистрация величины и количества колоний.

• Регистрация появления видимого роста в бульоне.

• Оценка качества сред с генцианвиолетом. Подбор для работы ингибирующего разведения генцианвиолета.

Бактериологический контроль питательных сред на чуму • Подсчет колоний па пластинчатом агаре.

• Регистрация наличия роста в бульоне.

• Заключение о пригодности сред.

• Обеззараживание посевов.

Лабораторная диагностика чумы у человека Лабораторные исследования на чуму проводят специализированные лаборатории, имеющие лицензию на данный вид деятельности.

Объектами для исследования от людей (больных, контактных) и трупов являются:

- отделяемое язвы или пунктат из карбункула, везикулы (кожная форма);

- содержимое бубона (бубонная форма);

- мокрота, слизь из зева и мазок с миндалин (легочная форма);

-испражнения (кишечная форма);

- кровь (все формы);

- в зависимости от поражений отдельных органов и систем - моча при наличии в ней крови, спинномозговая жидкость - при менингиальных явлениях (табл. 25).

5%-ным раствором йода и вновь спиртом. Иглу осторожно вводят с таким расчетом, чтобы ее острие доПунктат из бубона стигло центральной части бубона. Затем, оттянув до отказа поршень, медленно вытягивают иглу. После извлечения иглы из бубона через нее набирают содержимое выливают в стерильную пробирку и закрывают резиновой пробкой.

Содержимое вези- Иглу вводят у края образования и медленно продвикулы (пустулы) гают в центр.

Пунктат из язвы и карбункула Вскрывшийся бубон Слизь из зева Забирают стерильным ватным тампоном.

Мокрота От трупа кусочки пораженных оргабанки с притертыми пробками или крышками.

нов Посевы взятого материала желательно проводить у постели больного. Время от момента взятия материала и до начала его исследования не должно превышать 5-6 ч, если нет условий для хранения его на холоде.

С целью сохранения материала можно использовать транспортную среду Кери-Блэра, консерванты Берлина и Башевой, жидкость Брокэ.

Лабораторное исследование на чуму начинается одновременно бактериоскопическим, бактериологическим, биологическим, иммуносерологическим и генетическим методами. Наряду с классической схемой лабораторного исследования выполняются экспресс-методы, позволяющие дать предварительный положительный ответ в течение 2-5 ч от начала исследования материала. К методам экспресс-диагностики относятся: иммунофлуоресцентный анализ, ПЦР, иммуно-суспензионные методы: система 2-3-компонентных реакций с эритроцитарными диагностикумами, иммуноферментный анализ, дот-иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ. Все экспресс-методы выполняются только после обеззараживания материала. Экспресс-методы используют на всех этапах исследования материала (нативный материал, после подращивания, материал от «биопробных» животных, при идентификации культуры).

Из доставленного материала готовят мазки с окраской по Граму и метиленовым синим. При обнаружении первых случаев заболеваний подозрительных на чуму или трупа человека готовят не менее 6-8 мазков (один окрашивают метиленовым синим, второй – по Граму, третий – чумной люминесцирующей сывороткой, остальные оставляют неокрашенными для повторных исследований). Наличие типичных для заболевания чумой клинических проявлений и обнаружение в мазках биполярных грамотрицательных палочек овоидной формы дает право поставить предварительный диагноз - подозрение на чуму. Выявление специфически светящихся микробов, окрашенных чумной люминесцирующей сывороткой, подтверждает предварительный ответ.

Для посева необходимо использовать среды, имеющие регистрационное удостоверение Росздравнадзора и разрешенные к применению в РФ. Из отечественных сред – питательная среда для выделения и культивирования чумного микроба сухая, выпускаемая ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора», и среды зарубежного производства, разрешенные к применению согласно методическим рекомендациям (МР 02.0-06) РосНИПЧИ «Микроб» производства компании HiMediaLaboratoriesPvtLtd.

Незагрязненный посторонней микрофлорой материал (пунктат из бубона, карбункула, содержимое пустулы, везикулы, кровь и т.д.) засевают на плотные и жидкие питательные среды. Материал, содержащий постороннюю микрофлору (мокрота, слизь из зева, вскрывшийся бубон, содержимое язвы), засевают на плотные среды с ингибитором посторонней микрофлоры. Пунктат из бубона, везикулы наносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой на чашку агара и распределяют его шпателем или петлей частыми штрихами, оставшийся материал вносят в пробирку с бульоном.

Жидкую мокроту (особое внимание уделяют участкам с прожилками крови) петлей (2-3 петли) или пастеровской пипеткой с широким капилляром наносят на поверхность агара, растирают шпателем или частыми штрихами петлей. Затем без обжигания переносят на вторую и третью чашки плотного агара. Если мокрота вязкая, то ее комочек захватывают стерильным пинцетом, переносят на поверхность агара и тщательно растирают шпателем или частым штрихом бактериологической петлей сначала в первой, затем во второй чашке.

Слизь из зева засевают ватным тампоном, остатки материала промывают в 1мл жидкой питательной среды и используют для заражения биопробных животных. Сгусток крови (если посев не сделан у постели больного) из пробирки осторожно переносят в чашку Петри, разрушают его целостность стерильными препаровальными иглами, затем жидкую часть крови набирают в пипетку, засевают во флаконы с бульоном и 0,1 мл - на агаровую пластину, рассевая частым штрихом. Посевы инкубируют в термостате при 28°С, а для обнаружения фракции FI - при 37°С.

В первый день исследования с нативным материалом целесообразно ставить пробы с чумным бактериофагом ускоренным методом (приложение) и на чувствительность к антибактериальным препаратам дискодиффузионным методом (прямым посевом нативного материала сплошным газоном на чашку Петри). Это позволит при значительном числе клеток возбудителя чумы в материале получить результат чувствительности к антибиотикам через 20-24 ч с момента исследования, а не через 36-40 ч, как при постановке пробы на чувствительность к антибиотикам стандартизированным методом. Для выбора антибиотиков необходимо обратиться к схемам применения антибактериальных препаратов при экстренной профилактике чумы.