На правах рукописи

НОСАЧ

Екатерина Сергеевна

Микробиологические аспекты диагностики хламидийных

и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых

коллективах.

03.02.03 – микробиология

АВ ТОР ЕФЕР АТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток 2014 Диссертация выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Мартынова Алина Викторовна

Официальные оппоненты:

Паньков Александр Сергеевич, доктор медицинских наук, доцент кафедры эпидемиологии и инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Оренбург).

Чубенко Галина Ивановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Амурской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Благовещенск).

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Ростовский научно исследовательский институт микробиологии и паразитологии»

Роспотребнадзора (г. Ростов на Дону).

Защита состоится 03 июня 2014 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета ДКМ208.007.02 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, ГСП, проспект Острякова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте (www.tgmu.ru) государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации».

Автореферат разослан 31 марта 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.м.н, доцент Скляр Л.Ф.

Общая характеристика работы

Актуальность темы: Заболеваемость внебольничными пневмониями – одна из лидирующих проблем современной медицины. Заболеваемость внебольничными пневмониями (ВП) увеличивается как в мире, так и на территории Российской Федерации. Заболеваемость внебольничными пневмониями любой этиологии у лиц молодого возраста в Российской Федерации составляет 14-15‰, что составляет более 1,5 млн человек ежегодно (А.И Синопальников,2006, Жестков А.В., 2010). Актуальна проблема внебольничных пневмоний и в других странах: более 4 миллионов человек заболевает внебольничной пневмонией в США, а в странах Евросоюза - более миллионов человек (Benson RE, 2012, Graninger W., 2013). Минздравсоцразвития РФ приводит данные о смертности в нашей стране по причине пневмонии на уровне 31 случая на 100 тысяч населения (что в абсолютных цифрах выражается как 44438 человек). Это также определяет актуальность внебольничных пневмоний как проблемы и в нашей стране. Объективно, противоречивость информации об эпидемиологических аспектах данной нозологии, учет различных факторов риска, данные о микробиологическом спектре этиологически значимых возбудителей, низкая оценка региональных особенностей устойчивости к антибактериальным препаратам, а также отсутствие современных методов лабораторной диагностики определяют основные причины, из-за которых внебольничные пневмонии занимают лидирующую позицию в структуре заболеваемости и смертности. При этом, заболеваемость внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста (18-35 лет) является особенно актуальной, что связано с особой экономической и социальной активностью людей этой возрастной группы. Еще более актуальна проблема заболеваемости внебольничными пневмониями у молодых лиц из организованных военных коллективов, где отмечается тенденция к росту заболеваемости (Огарков П.И., 2006, Жоголев С.Д., 2008). Согласно данным ежегодных отчетов медицинской службы МО РФ, заболеваемость внебольничными пневмониями у военнослужащих срочной службы в период с 2000 по 2006 годы колебалась от 35,3‰ до 45,5‰ (Редько Н.М., 2009). Очевидно и то, что молодые люди заболевали внебольничными пневмониями в течение первого месяца после прибытия в учебный отряд, когда организм молодого человека проходил период адаптации к новым условиям жизни, преодолевал психологический и физический стресс, подвергался снижению общей иммунорезистентности при активации механизма передачи инфекционного агента.

По данным ряда авторов, заболеваемость внебольничными пневмониями лиц молодого возраста еще в течение первых двух месяцев после призыва достигает 250Мельниченко П.И., 2003, Жоголев С.Д., 2006).

Действительно, при достаточно подробно изученных микробиологических свойствах основных этиологически значимых возбудителей при внебольничной пневмонии, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и др., до сих пор остаются не ясными особенности формирования эпидемически значимых вариантов возбудителей, большинство из которых является условно-патогенными возбудителями, не изучена их молекулярно-генетическая структура. Особенно спорными остаются вопросы об этиологической значимости выделения при атипичной внебольничной пневмонии таких сложнокультивируемых возбудителей как (Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumohilla, Chlamydophila pneumoniae), не определено значение выделения их в ассоциации с такими возбудителями как S.pneumoniae и H.influenzae.

Не выявлены особенности формирования антибактериальной резистентности у наиболее значимых сложнокультивируемых возбудителей внебольничной пневмонии, таких как M.pneumoniae, C.pneumoniae, не определены молекулярногенетические особенности их распространения, что не позволяет обосновать рациональную антибактериальную терапию. Также не выявлена и молекулярноэпидемиологическая структура этиологически значимой популяции микроорганизмов, не определена их внутривидовая вариабельность, что не позволяет организовывать рациональные противоэпидемические мероприятия в отношении внебольничной пневмонии.

Цель исследования: изучить особенности микробиологической диагностики возбудителей внебольничных пневмоний хламидийной и микоплазменной этиологии и оценить их значимость в этиологической структуре пневмоний у лиц молодого возраста для разработки рекомендаций по оптимизации диагностики, рационализации антимикробной химиотерапии и обоснования профилактических мероприятий.

Задачи исследования:

1) Изучить этиологическую структуру и оценить роль выявления штаммов C.pneumoniae и М.pneumoniae в развитии внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста.

2) Выявить генетические особенности формирования антибиотикорезистентности и патогенности штаммов C.pneumoniae и М.pneumoniae, идентифицируемых в структуре этиологически значимых возбудителей внебольничных пневмоний 3) Изучить эпидемиологические особенности заболеваемости внебольничными пневмониями среди лиц молодого возраста в закрытых коллективах.

4) Оценить влияние фактора нахождения в закрытом коллективе на особенности формирования микробиоценоза дыхательных путей с участием C.pneumoniae и микоплазменной этиологии у лиц молодого возраста.

Научная новизна. Впервые комплексно оценена микробиологическая структура этиологически значимых возбудителей внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста с идентификацией как бактериальных, так и вирусных возбудителей. Определена роль в микробиологической диагностике идентификации хламидийных и микоплазменных возбудителей, в том числе и при выделении их в ассоциации с другими бактериальными возбудителями.

Оценена роль фактора пребывания в закрытом коллективе для развития атипичных внебольничных пневмоний, вызванных штаммами C.pneumoniae и М.pneumoniae, у лиц молодого возраста.

Изучены особенности популяционной структуры микроорганизмов, входящих с внебольничной пневмонией.

устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам у штаммов, доминирующих в структуре внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста, предложены эпидемиологического надзора.

Полученные данные об этиологической структуре внебольничных пневмоний хламидийной и микоплазменной этиологии определяют дальнейшие направления изучения проблемы инфекций дыхательных путей, а также предлагают решение теоретических проблем в области медицинской микробиологии, в том числе, в исследованиях, направленных изучение механизмов действия факторов патогенности микроорганизмов, что обусловливает характер микробиоценоза дыхательных путей у пациентов молодого возраста.

Практическая значимость исследований. Результаты изучения структуры этиологически значимых возбудителей внебольничных пневмоний у молодых лиц позволили получить представление об эпидемической ситуации по заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста.

Охарактеризованы эпидемиологические аспекты заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц молодого возраста, выявлен фактор влияния закрытого коллектива на формирование заболеваемости.

идентифицированных в лабораторном материале от больных внебольничными пневмониями, позволил выявить значимость идентификации штаммов C.pneumoniae и М.pneumoniae, а также определил превалирование в микробиологической структуре этиологически значимых возбудителей такого микроорганизма как S.pneumoniae.

Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов, доминирующих в структуре внебольничных пневмоний, позволил получить представление об эффективности антимикробной химиотерапии, а также, учитывая механизм формирования устойчивости к антибактериальным средствам, определить возможность рационализации антибиотикотерапии инфекций дыхательных путей у лиц молодого возраста.

Изучив популяционную структуру возбудителей внебольничных пневмоний, а также определив видовой состав штаммов, выделенных в качестве доминирующих, в микробиоценозе дыхательных путей у лиц молодого возраста, возбудителеля - стало возможным корригировать противоэпидемические мероприятия в отношении внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста.

Внедрения: По материалам диссертации изданы методические рекомендации, информационные письма, подготовлена информационная справка.

Результаты исследования использованы в создании рекомендаций по коррекции формуляров антибиотикотерапии и при организации мероприятий эпидемиологического надзора.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс при подготовке врачей на кафедре эпидемиологии и военной эпидемиологии ГОУ ВПО ТГМУ, на кафедре биохимии и микробиологии Дальневосточного Федерального Университета, в работе пульмонологического отделения Военно-морского клинического госпиталя ТОФ.

Апробация: Материалы научно-исследовательской работы доложены на:

постоянно действующих семинарах «Актуальные вопросы госпитальной эпидемиологии» (Главный Госпиталь ТОФ, 2008г), на 10-й, 11-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель, 2010 г., апрель, 2011 г, Владивосток), на VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность»

(Москва, 2009г), на конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 28-30 сентября, 2009 г), на III международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль 2009г), на IV международной конференции по инфекционным заболеваниям DITAN (Пекин, июль, 2010), на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, Военномедицинская академия, 2009 г), на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (Владивосток, ноябрь, ДВГУ, 2009 г), на V-й научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 19-20 мая 2010 г), на Международном симпозиуме по изучению пневмококковых инфекций (Israel, ISPPD 7, Tel-Aviv, 2010), на Европейском Респираторном Конгрессе (Барселона, сентябрь, 2010г), на Третьем Съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил РФ «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия ВС РФ» (декабрь, 2010г), на Первом Евроазиатском конгрессе «Инфекционные болезни:

проблемы, достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, декабрь, 2010г), в работе 16 Азиатско-Тихоокеанского международного симпозиума по изучению проблем респирологии (Филиппины, Манила, февраль, 2011г).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ (в журналах, рекомендованных ВАК- 2 статьи), из них в центральной печати 5, в зарубежной - 6.

Личный вклад автора: Анализ данных литературы по теме диссертации, бактериологическое обследование, анализ эпидемиологической информации, молекулярно-генетические исследования (80%), статистическая обработка полученных результатов и их анализ, написание диссертации выполнены лично автором.

на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 23 рисунками, 8 схемами. Список литературы содержит 237 источников, из них 113 принадлежит отечественным, 124 зарубежным авторам.

Исследование одобрено Этическим комитетом ВГМУ (протокол №5, дело № от 19 апреля 2010г).

Положения выносимые на защиту:

1)Заболеваемость внебольничными пневмониями является значимой в структуре заболеваемости лиц молодого возраста в закрытых коллективах и составляет от 2,26‰ до 6,77‰ с умеренным темпом прироста. Фактор пребывания в закрытом коллективе более двух месяцев увеличивает вероятность заболевания внебольничной пневмонией бактериальной и вирусно-бактериальной этиологии.

2)Этиологическая структура характеризуется преобладанием таких возбудителей как S.pneumoniae (26%), H.influenzae (18%), при этом, такие сложнокультивируемые единственными идентифицируемыми возбудителями в 39%, что подтверждает их значимость в развитии внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста.

3)Для идентификации этиологически значимого возбудителя в случае диагностики внебольничных пневмоний, молекулярно-диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции представляются наиболее перспективными:

чувствительность ПЦР идентификации M.pneumoniae и С.pneumoniae в лабораторном материале составляет 94%, специфичность 86%.

4)Распространенность в геноме маркеров антибиотикорезистентности и патогенности подтверждает возможность формирования моноклональности.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИ РАБОТЫ

Объем, материалы и методы исследования Исследуемая популяция (всего 200 пациентов), средний возраст которой составил 19±1,9 лет - мужчины в возрасте от 18 до 34 лет. Все они являлись военнослужащими по призыву, поступившими в пульмонологическое отделение Главного Госпиталя ТОФ с диагнозом внебольничная пневмония в период с 2008 г. по 2010 г. Для оценки распространенности носительства бактериальных возбудителей инфекций респираторного тракта, в том числе и вызывающих атипичные пневмонии, были обследованы на носительство 200 военнослужащих, проходящих подготовку в одном из учебных отрядов.

Микробиологические исследования проводились в течение всего периода исследования (с сентября 2008 по март 2010гг.) на базе клинической лаборатории Военноморского клинического госпиталя (заведующий доктор медицинских наук Этическим комитетом ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава (протокол № 5, дело 35 от 19 апреля 2010г.), а при проведении исследования было получено информированное согласие пациентов и обследуемых на проведение исследования. Основными материалами для проводимых исследований у пациентов и обследуемых являлись мокрота, оро- и назофарингеальный мазок, жидкость бронхоальвеолярного лаважа. Исследуемый клинический материал в первые сутки поступления больного в стационар до проведения лечения доставляли в лабораторию. Дальнейшие исследования проводили с учетом (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно - профилактических учреждений” от 22 апреля 1985 года. Материал для идентификации возбудителей атипичных пневмоний (M.pneumoniae, C.pneumoniae, L.pneumophilla) хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекции методом цепной полимеразной реакции - №95-106», утв. Минздравмедпромом РФ 08.08.1995. Для проведения исследования мы использовали эталонные тестовые штаммы культур и препараты ДНК, полученные кафедрой эпидемиологии Тихоокеанского государственного медицинского университета и кафедрой биохимии и микробиологии Дальневосточного Федерального Университета в Государственном Контрольном институте биологических препаратов им. В.Г. Тарасевича. В данном исследовании для подтверждения видовой принадлежности выделенных штаммов, исследования генетических детерминант факторов их вирулентности, а также проведения серотипирования, была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Mullis 1986; Saiki 1988]. Исследование проводилось на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (кандидат биологических наук, руководитель проекта грант РФФИ, н.с. Балабанова Л.А.).

исследований №п/п анамнестический Микробиологические исследования Иммунологические исследования МолекулярноСравнительный геномный анализ штаммов эпидемиологические исследования Статистические А.Н., 2007;Петри А.,2009/, исследования 2.Построение и анализ дендрограмм Результаты исследования и их обсуждение. При анализе данных о заболеваемости внебольничными пневмониями по Дальневосточному Федеральному округу (информация предоставлена Военно-морским клиническим госпиталем, заведующей отделом сбора и обработки информации – Белимовой С.Г.), мы получили данные, согласно которым, помимо увеличения в летний период заболеваемости внебольничными пневмониями легкой и средней степени тяжести, имеется увеличение удельного веса случаев с отрицательным микробиологическим подтверждением диагноза внебольничной пневмонии в период первого осеннего подъема заболеваемости (с августа по сентябрь), что также подтверждает необходимость совершенствования диагностического процесса на уровне рутинной работы клинической микробиологической лаборатории (табл. 2).

Результаты микробиологической диагностики внебольничных пневмоний Результаты бактериологических сентябрь декабрь исследований микроорганизмов Отрицательный 99 (51,03%) 35(14,4%) 62(38,03%) 196 (32,6%) результат *p 2 месяцев) Таким образом, нами выявлено, что ген, кодирующий синтез метилтрансфераз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков – 23S рибосомальную РНК, является определяющим в развитии устойчивости к макролидам, что снижает, в свою очередь аффинность к макролидам, и ухудшает, соответственно, терапевтическую эффективность схем лечения микоплазменных и хламидийных пневмоний. У исследованных 25 образцов ДНК штаммов бактерий, вызвавших атипичные внебольничные пневмонии данный ген был выделен в 40% ДНК микоплазм (6 из 15 образцов) и 50% (5 из 10 образцов ) хламидий. Это же нашло и подтверждение и в ДНК штаммов, идентифицированных у носителей – у микоплазм он был выделен у 50%, у C.pneumoniae – в 20%. В целом, можно ожидать распространенность данной генетической детерминанты антибиотикорезистентности в 61,7±13,1%. Мутации в генах, кодирующих рибосомальные белки L4 и L22, встречаются несколько реже: у пациентов с внебольничной пневмонией - 24,0±15,1% (причем при микоплазменных пневмониях- 20,0±2,06%, при хламидийных пневмониях- 30,0±2,45%).

Мониторинг устойчивости к фторхинолонам, по нашему мнению, представляет более сложную задачу и должен решаться методами молекулярноэпидемиологического анализа с исследованием полиморфизма рестрикционных фргаментов, так как большинство генов, кодирующих устойчивость к данным антибиотикам являются конститутивными. Для изучения возможности поиска единой генетической детерминанты, определяющих первый этап инфицирования макроорганизма хламидиями и микоплазмами, мы провели анализ распространения детерминант адгезии в штаммах микоплазм и хламидий (табл.8) и выяснили, что основной генетической детерминантой факторов адгезии у штаммов M.pneumoniae является белок P1 (выявлен в 46,6% ДНК, выделенной от пациентов и в 30% ДНК, выделенной от носителей).

Распространенность генетических детерминант факторов вирулентности, выделенных в штаммах - возбудителях атипичных пневмоний