«ЧЕБОТАРЕВА Наталья Александровна ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИКОГЕНОЛИЗА В УСЛОВИЯХ МОЛЕКУЛЯРНОГО КРАУДИНГА 03.00.04 – Биохимия ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук ...»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

На правах рукописи

ЧЕБОТАРЕВА Наталья Александровна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИКОГЕНОЛИЗА

В УСЛОВИЯХ МОЛЕКУЛЯРНОГО КРАУДИНГА

03.00.04 – Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в отделе структурной биохимии белка Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич доктор химических наук, профессор Клячко Наталья Львовна доктор биологических наук, профессор Крицкий Михаил Сергеевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится 26 июня 2006 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: Москва, Ленинский пр. 33, кор.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в Библиотеке Биологической Литературы РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, кор. Диссертация в виде научного доклада разослана « 10 » мая 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Валуева Т.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Взаимодействия между молекулами лежат в основе всех биохимических процессов. Развитие новых представлений, новой техники и новых методик играет большое значение для более глубокого понимания этих взаимодействий. Отличительная особенность живых систем состоит в том, что биохимические процессы протекают в среде, содержащей высокие концентрации макромолекул (50-400 мг/мл) [Zimmerman and Minton, 1993]. При этом важно подчеркнуть, что концентрации макромолекул одного сорта относительно невелики. Однако в совокупности макромолекулы, присутствующие в клетке, занимают значительную часть объема среды (до 40%), вследствие чего доступный объем в клетке сокращается. Подобные условия в клетке обозначаются как макромолекулярный краудинг (crowding).

Этот термин означает неспецифическое влияние исключенного объема на биохимические и биофизические процессы. «Молекулярный краудинг» более точно означает «эффект исключенного объема», потому что главная его характеристика – это взаимная непроницаемость всех молекул растворенных веществ. Влияние исключенного объема на гидродинамические и термодинамические свойства растворов компактных глобулярных белков можно объяснить с помощью моделей, рассматривающих молекулы белка как жесткие частицы сферической формы. Исключается объем, который недоступен центру сферы. Было предсказано теоретически и показано экспериментально значительное влияние краудинга на скорости и равновесия биохимических реакций [Zimmerman and Minton, 1993; Minton, 2001; Ellis, 2001, Ellis and Minton 2003; Чеботарева и др., 2004]. Любые реакции, приводящие к увеличению доступного клеточного объема, будут стимулироваться в условиях краудинга. К таким реакциям относятся ассоциация макромолекул, образование мультиферментных комплексов, фолдинг белков и нуклеиновых кислот с образованием компактных структур, образование агрегатов и амилоидных тел включения при некоторых заболеваниях (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и др.).

Условия краудинга в клетке могут создаваться не только присутствием макромолекул, но и высокими концентрациями осмолитов – соединений, которые накапливаются живыми организмами в ответ на стресс (осмотический, химический или термический). Осмолиты – это низкомолекулярные органические соединения, такие как полиолы, некоторые аминокислоты и метиламины. Накоплено много экспериментальных данных по защитному действию осмолитов, однако молекулярные механизмы их действия в значительной степени остаются невыясненными.

Для понимания биохимических процессов, происходящих в живой клетке, необходимо имитировать условия краудинга в экспериментах in vitro. В настоящей работе для имитации условий молекулярного краудинга использовали высокие концентрации природных осмолитов.

Главными объектами исследования в настоящей работе были ключевые ферменты гликогенолиза – гликогенфосфорилаза b и киназа фосфорилазы.

Седиментационный анализ остается одним из наиболее действенных методов исследования макромолекулярных взаимодействий. Метод основывается на равновесной и неравновесной термодинамике и позволяет получить характеристики гидродинамических свойств белков, мультиферментных комплексов и взаимодействий типа белок-лиганд. В настоящей работе седиментационный анализ является одним из основных методов исследования.

Целью нашей работы было изучение взаимодействия ферментов гликогенолиза в условиях молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями осмолитов. В соответствии с данной целью в работе решались следующие конкретные задачи:

• охарактеризовать взаимодействие белок-лиганд в случае ассоциирующей ферментной системы типа димер-тетрамер, • изучить роль пиридоксаль-5’-фосфата как конформационного кофактора фосфорилазы b (Phb), • исследовать тепловую и химическую (под действием гуанидингидрохлорида) денатурацию Phb, • исследовать влияние краудинга на взаимодействие типа белок-лиганд на примере Phb и аллостерического ингибитора, FAD; исследовать взаимодействие киназы фосфорилазы (PhK) с FAD, • исследовать влияние краудинга на ассоциацию фосфорилазы b, • изучить влияние краудинга на ассоциацию киназы фосфорилазы, на ее взаимодействие с гликогеном и с белковым субстратом, фосфорилазой b, • изучить эффект молекулярного «ограничения» (confinement), создаваемого в обращенных мицеллах, на олигомерное состояние фермента.

Для достижения поставленных целей было необходимо провести компьютеризацию аналитической ультрацентрифуги, модель Е, и использовать новейшее математическое обеспечение для седиментационного анализа.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые проведены систематические исследования влияния молекулярного краудинга на ключевые ферменты гликогенолиза: фосфорилазу b и киназу фосфорилазы. In vitro условия краудинга имитировались высокими концентрациями осмолитов. Установлено влияние краудинга на взаимодействия типа белок-лиганд и белок-белок, на реакцию изомеризации макромолекул и образование надмолекулярных структур.

Показано стимулирующее действие осмолитов (триметиламин-N-оксида и бетаина) на ассоциацию киназы фосфорилазы c образованием надмолекулярных структур.

Впервые было исследовано взаимодействие FAD с киназой фосфорилазы.

Показано, что FAD связывается с киназой фосфорилазы. В условиях молекулярного краудинга FAD ингибирует ассоциацию киназы фосфорилазы. Разработана новая методика для седиментационного анализа взаимодействий белок-лиганд в случае ассоциирующей ферментной системы типа димер-тетрамер.

Выполненные исследования имеют фундаментальное значение, поскольку реальное функционирование биохимических систем протекает в условиях краудинга. Практическую ценность может представлять использование условий краудинга для стабилизации белков при решении биотехнологических задач или для кристаллизации белка. Исследования такого рода помогут в дальнейшем найти подходы к разработке новых методов лечения таких серьезных заболеваний, как болезни Паркинсона и Альцгеймера, связанные с образованием неспецифических белковых ассоциатов.

На защиту выносятся следующие основные положения:

• Для ферментов метаболизма гликогена молекулярный краудинг является фактором, оказывающим существенное влияние на такие биохимические реакции, как ассоциация, изомеризация, взаимодействие ферментов с гликогеном и специфическими лигандами.

• Молекулярное «ограничение» (разновидность краудинга), моделируемое системой обращенных гидратированных мицелл аэрозоля ОТ в октане, влияет на олигомерное состояние белка, включая образование надмолекулярных комплексов (на примере фосфорилазы b).

• Термоденатурация фосфорилазы b протекает по диссоциативному механизму, то есть включает стадию обратимой диссоциации димера на мономеры и следующую за ней стадию необратимой денатурации мономера. Осмолиты оказывают стабилизирующее действие при денатурации фосфорилазы b под действием GuHCl.

• Пиридоксаль-5’-фосфат в молекуле Phb играет роль конформационного кофактора, стабилизирующего активную структуру нативного фермента и регулирующего сродство к субстратам и эффекторам.

Апробация работы. Результаты работы в качестве устных и стендовых докладов были представлены на: II и III Съездах Биохимического Общества РАН (Москва, 1997; С.-Петербург, 2002), Международном симпозиуме по Структуре, стабильности и фолдингу белков (Москва, 1998), II Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии»

(Дубна, 2001), Международном симпозиуме “Hydro 2000. The 6th UK Analytical Ultracentrifuge Users Meeting” (Glasgow, 2000), Международной конференции по биокатализу (Москва, 2000), Euroconference “Advanced in Analytical Ultracentrifugation and Hydrodynamics” (Autrance, France, 2002), EMBO workshop “Biological Implications of Macromolecular Crowding”. (Avila, Spain, 2003), Intermolecular Associations in 2D & 3D. The Biochemical Society, London.

(Nottingham, 2003), III Съезде биофизиков России, (Воронеж, 2004), 7th UK Ultracentrifuge Conference. A British Biophysical Society Meeting (Oxford, 2004), 11th, 14th and 15th International Symposium on Analytical Ultracentrifugation, (Potsdam, 1999, Lausanne, 2005, London, 2006).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, в постановке и решении конкретных задач, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов.

Седиментационные исследования, расчеты и объяснение результатов проведены лично автором. Соавторы принимали участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов. В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, в проведении эксперимента, в обсуждении и оформлении полученных результатов. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 обзоров, статей в российских и международных журналах и 9 статей в сборниках.

Глава 1. Седиментационный анализ взаимодействий белок–лиганд для ассоциирующей ферментной системы типа димер-тетрамер Нами [Чеботарева и др., 1990; Chebotareva et al., 1991] предложена новая методика, позволяющая контролировать положение равновесия между олигомерными формами фермента и рассчитывать степени насыщения индивидуальных форм фермента лигандом. Метод основан на одновременном использовании шлирен-оптической системы и абсорбционной сканирующей оптической системы аналитической ультрацентрифуги Spinco, модель Е. Метод использован для изучения связывания FMN с Phb в условиях существования равновесия димер тетрамер (в присутствии 1 мМ АМР, 17 °С). Доли димерной и тетрамерной форм определяли с помощью шлирен-системы.

Димерная и тетрамерная формы Phb представлены на шлиренседиментограмме в виде двух частично накладывающихся друг на друга пиков (рис. 1.1А). Площадь под пиком соответствует концентрации данной олигомерной формы. Для оценки относительных долей димерной и тетрамерной форм фермента шлирен-седиментограмму описывали эмпирическим уравнением суммы двух Гауссовых функций. Константу ассоциации равновесия 2D T рассчитывали по формуле: Kass = ( 1 – ) / 22 [P]0, где доля димерной формы, [P]0 – молярная концентрация фермента в расчете на димер. Для определения концентрации свободного FMN и количества FMN, связанного димерной и тетрамерной формами Phb, использовали абсорбционную оптическую систему (рис. 1.1Б). Выбранная длина волны (471 нм) соответствовала изобестической точке для спектров поглощения свободного и связанного флавина. Быстро движущаяся граница соответствует седиментации комплекса тетрамерной формы Phb с FMN, а медленно движущаяся граница – седиментации комплекса димерной формы. Phb с FMN.

Плато у мениска (A1), формирующееся после оседания комплексов фермента с лигандом, дает возможность рассчитать концентрацию свободного лиганда [L], по формуле: [L] = [L]0A1/A0, где [L]0 – общая концентрация FMN, A0 – соответствующее ей оптическое поглощение, определяемое независимо. Подобным образом вычисляется концентрация лиганда, связанного димерной формой фермента, [L]D, с использованием оптического поглощения (A2), соответствующего медленно движущейся границе: [L]D = [L]0A2/A0. Концентрация FMN, связанного тетрамерной формой, [L]T, вычислялась по формуле: [L]T = [L]0 – [L]D – [L].

Предложенный метод позволяет построить зависимость величины кажущейся константы ассоциации Kass от концентрации свободного FMN (рис.

1.2), а также функции насыщения димерной и тетрамерной форм Phb (рис. 1.3).

Рис. 1.2. Зависимость кажущейся Рис. 1.3. Функции насыщения димерной константы ассоциации рановесия димер (1) и тетрамерной (2) форм фосфорилазы тетрамер, Kass, от концентрации b FMN [Chebotareva et al., 1991] Условия свободного FMN (в присутствии 1 мМ АМР) [Chebotareva et al., 1991]. Условия те же, что и в подписи к рис. 1.1.

Степень насыщения димера FMN рассчитывали как отношение концентрации лиганда, связанного димерной формой фермента (эта величина определена с помощью абсорбционной оптической системы), к молярной концентрации димерной формы Phb (эта величина определена с помощью шлирен-седиментограммы). Аналогичным способом рассчитывалась степень насыщения тетрамера FMN. Рис. 1.3 показывает зависимости степени насыщения (Y) димера (1) и тетрамера (2) от концентрации свободного лиганда.

Эти зависимости имеют гиперболическую форму. Предполагалось, что лигандсвязывающие центры каждой олигомерной формы являются эквивалентными и независимыми. Константы диссоциации для комплексов димерной и тетрамерной форм Phb с FMN найдены равными 10,0 ± 0,5 и 79 ± 8 мкМ соответственно. Полученные значения констант диссоциации характеризуют сродство олигомерных форм Phb к FMN в условиях насыщения аллостерического активаторного центра АМР.

Интересно отметить, что АМР при относительно высоких концентрациях смещает равновесие димер-тетрамер в сторону димерной формы (рис 1.4).

Увеличение концентрации AMP от 1 мМ до 10 мМ приводит к 3-5-кратному снижению Kass. Согласно данным микрокалориметрии, равновесного диализа и рентгеноструктурного анализа при использовании высоких концентраций AMP связывается во втором аллостерическом центре (ингибиторном центре) с меньшим сродством. Таким образом, связывание AMP в ингибиторном центре приводит к ослаблению связей между димерами в тетрамерной форме. Такое действие AMP полностью аналогично действию флавинов.

Тот факт, что аллостерический активатор АМР при относительно низких концентрациях способствует ассоциации Phb, тогда, как связывание лигандов в аллостерическом ингибиторном центре (флавины, АМР при относительно противоположному эффекту, позволяет рассматривать Глава 2. Роль PLP как конформационного кофактора фосфорилазы Четвертичная структура холофермента, апофермента и фермента, реконструированного с аналогами PLP. Для характеристики роли кофактора, пиридоксаль-5’-фосфата (PLP), в поддержании нативной конформации Phb мы провели сравнительный анализ четвертичной структуры холофермента, апофермента и фермента, реконструированного с аналогами PLP, взаимодействия их с субстратом (гликогеном) и аллостерическим ингибитором (FMN).

Восстановление альдиминной связи при помощи боргидрида натрия (NaBH4) необратимо фиксирует PLP на ферменте с сохранением 60% исходной активности фосфорилазы. Отщепление PLP от Phb в мягких условиях приводит к образованию полностью неактивного апофермента, легко диссоциирующего на мономеры. Понижение температуры и повышение концентрации белка вызывает ассоциацию апофермента. Согласно данным седиментационного анализа в интервале температур 15-35 °С при концентрации до 1 мг/мл апо-Phb существует в виде мономера (коэффициент седиментации s20,w = 5,1 – 5,3 S), при 10 °С в виде димера (s20,w = 7,4 S) (таблица 2.1). Phb в отсутствие AMP представлена димерной формой (s020,w = 8,7 S) и не зависит от температуры.

Таблица 2.1. Седиментационный анализ олигомерного состояния апофосфорилазы b (0,05 М -глицерофосфатный буфер, рН 6,8).

Температура, Концентрация Коэффициент седиментации r – количество молей Phb, связанРис. 2.2. Изотермы связывания нативной Phb, ных 1 г гликогена, rmax – адсорбарофермента и фермента, реконструированного ционная емкость гликогена и [E] – с PLP, гликогеном со средней молекулярной равновесная концентрация фермассой 5,5106 Да. Данные представлены в мента. Адсорбционную емкость координатах {r, [E]}, где r – количество Phb (в гликогена. А - нативная Phb (1), апофермент (2) в 0,05 М -глицерофосфатном буфере, рН 6,8.

Б - нативная Phb (1), Phb, реконструированная с PLP (2), в 0, 05 М глицил-глициновом буфере, рН 6,8, 20 °С [Чеботарева и др., 1995].

5 раз ниже, чем сродство холофермента (рис. 2.2А) [Чеботарева и др., 1994; 1995].

Микроскопическая константы диссоциации, Kdiss, комплекса FMN-апофосфорилаза составляет 240 ± 70 мкМ, а для комплекса FMN-Phb – 6,8 ± 0,3 мкМ (20 °С, pH 6,8) (табл. 2.2) [Чеботарева и др. 1995]. Из сопоставления констант диссоциации апоформы и нативного фермента следует, что сродство к FMN у апофермента в раз ниже, чем у Phb. Приведенные данные указывают на то, что удаление кофактора приводит к определенным структурным перестройкам в молекуле Phb, в частности, в области контакта мономеров в димере, в области центра запасания гликогена и в области ингибиторного аллостерического центра.

Реконструкция Phb из апоформы и PLP приводит к восстановлению сродства фермента и к гликогену (рис. 2.2Б), и к FMN (табл. 2.2).

Таблица 2.2. Сродство реконструированных форм Phb к FMN (20 °С, 50 мМ глицилглициновый буфер, рН 6,8) [Чеботарева и др., 1995] Нативная Phb Phb, реконструированная с аналогом I 26,0 ± 1, Phb, реконструированная с аналогом II 140 ± Phb, реконструированная с аналогом III 260 ± *Данные получены методом скоростной седиментации.

Методом седиментационного анализа было проведено исследование переходов на уровне четвертичной структуры и сродства к гликогену и FMN для фермента, реконструированного с аналогами PLP по пятому положению, что позволило получить дополнительные данные о роли PLP в фосфорилазе как конформационного кофактора [Чеботарева и др., 1994; 1995].

заместители: –CH2CH2COOH (аналог I), -трансCH=CHCOOH (аналог II), –CCOOH (аналог III).

способности к ассоциации эти формы существенно отличались от нативной Phb и фермента, реконструированного с PLP (табл. 2.3). Известно, что в условиях насыщения аллостерического активаторного центра АМР, Phb представляет собой ассоциирующую систему типа димер тетрамер [Курганов и др., 1994]. При 17 °С константа ассоциации, Kass, для нативной Phb равна 2,4104 М-1 (табл. 2.3) [Chebotareva et al., 1991]. Фермент, реконструированный с PLP, не отличается по величине Kass от исходной формы. Для фермента, реконструированного с аналогами I, II и III, равновесие димертетрамер сильно сдвинуто в сторону тетрамерной формы (табл. 2.3) [Чеботарева и др., 1995]. Таким образом, фермент, реконструированный с аналогами I, II и III, существенно отличается от нативного по способности ассоциировать в тетрамер. Природа заместителя в 5-ом положении практически не влияет на способность Phb связывать гликоген [Чеботарева и др., 1994; 1995]. Совершенно иная картина наблюдается для связывания аллостерического ингибитора FMN. Как видно из табл. 2.2, сродство фермента, реконструированного с аналогами I, II и III, к FMN значительно ниже, чем сродство к этому эффектору в случае нативного фермента, причем для аналога III оно так же мало, как и для апофермента 240 ± 70 мкМ.

Таблица 2.3. Влияние реконструкции на способность Phb к ассоциации, индуцируемой AMP (17°, 50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 6,8) Форма фермента Нативная Phb Phb, реконструированная с PLP Phb, реконструированная с аналогом I 2, Phb, реконструированная с аналогом II 7, Phb, реконструированная с аналогом III Преимущественно тетрамер *Данные получены методом скоростной седиментации.

Совокупность этих данных указывает на важную роль PLP в поддержании четвертичной структуры и определенной конформации фермента, необходимой для взаимодействия с субстратом и аллостерическими ингибиторами.

Термостабильность холофермента, апофермента и фермента, восстановленного боргидридом Na. Чтобы охарактеризовать роль PLP в поддержании нативной структуры фермента, был проведен сравнительный анализ термостабильности нативной Phb и ее апоформы методом ДСК. Обнаружено существенное смещение положения максимума на кривой зависимости избыточного теплопоглощения (Cp) oт температуры в сторону более низких Рис. 2.3. Зависимости избыточного теплопоглощения, Cp, от температуры для холо-Phb (1), апоPhb (2) и реконструированного с PLP (3) фермента содержащими в 5-положении остатки –CH2–CH2–COOH и -транс –CH=CH–COOH, полного восстановления {Cp; t}-профиля, характерного для холофермента, не происходит. Можно предположить, что основной причиной меньшей термостабильности апоформы Phb является то, что она легче переходит в мономерное состояние. Тем не менее, очевидно, что PLP оказывает общее стабилизирующее действие на нативную Phb.

Изучение термостабильности Phb, восстановленной NaBH4, дало дополнительное подтверждение участия PLP в стабилизации нативной конформации Phb.

Седиментационный анализ восстановленной NaBH4 Phb (0,92 мг/мл) при 53 °С показывает, что восстановленный фермент седиментирует как развернутый мономер (s20,w = 3,6 S, рис. 2.4), в то время как нативная Phb при той же концентрации белка и той же температуре представлена, в основном, димерной формой (см. гл. 3). Таким образом, при повышении температуры восстановленная Phb диссоциирует на мономеры легче, чем нативный фермент.

Меньшая термостабильность восстановленной NaBH4 Phb по сравнению с исходным ферментом была подтверждена также данными ДСК, согласно которым максимум на кривой зависимости Сp от t для восстановленной формы Phb находится при 54,2 °С, т.е. при более низкой температуре, чем для нативного фермента (56,8 °С) [Kurganov et al., 2000].

Стабильность холофермента и фермента, восстановленного боргидридом, по отношению к гуанидингидрохлориду (GuHCl). На уменьшение прочности связей между субъединицами в димере Phb после обработки фермента боргидридом указывают также результаты изучения денатурации Phb под действием GuHCl. Диссоциация на мономеры в случае Рис. 2.4. Седиментация восстановленной Phb (0,92 мг/мл) при 53 °С. роль конформационного кофактора, Скорость вращения ротора об/мин. Время седиментации – 26, фермента и регулируя сродство Phb к Глава 3. Тепловая и химическая (под действием GuHCl) денатурации Phb Седиментационный анализ диссоциации Phb при повышенной температуре. Использование аналитического ультрацентрифугирования для изучения тепловой денатурации олигомерных белков позволяет охарактеризовать олигомерное состояние белка и сделать заключение о наличии стадии диссоциации при переходе белка из нативного состояния в денатурированное. Седиментацию Phb при повышенных температурах изучали с использованием абсорбционной сканирующей оптической системы аналитической ультрацентрифуги Spinco, модель Е («Beckman»). Ячейки с раствором фермента помещали в ротор, предварительно нагретый до заданной температуры. С этого момента регистрировали время инкубации Phb при выбранной температуре. Первое сканирование проводили в процессе разгона ротора на малых скоростях его вращения (3000 об/мин) после 5 мин инкубации фермента. Коэффициент седиментации приводили к стандартным условиям (растворитель с плотностью и вязкостью воды при 20 °С), используя формулу:

где st – коэффициент седиментации при заданной температуре (t), t и 20 – значения вязкости воды при температуре t и 20 °С, sol/w – отношение вязкости растворителя к вязкости воды, v 20 – удельный парциальный объем фермента при 20 °С, 20,w – плотность воды при 20 °С, t,sol – плотность растворителя при температуре t; v t – удельный парциальный объем фермента при температуре t.

Седиментационные исследования, проведенные при 53 °С, показали, что после 5-минутной инкубации Phb приблизительно 50% фермента агрегирует и осаждается при малых скоростях вращения ротора (3000 об/мин). Это свидетельствует об относительно высокой молекулярной массе образовавшихся агрегатов. При дальнейшем разгоне ротора до максимальной скорости ( об/мин) осаждения каких-либо агрегированных форм не наблюдалось. На рис. 3. представлены седиментограммы, полученные в разные моменты времени после достижения скорости 60 000 об/мин для различных концентраций фермента: 0, (А), 0,46 (Б), 0,92 (В) и 2,5 мг/мл (Г). При относительно высоких концентрациях фермента (рис. 3.1Б-Г) на седиментограммах наблюдаются две границы. Если для медленно седиментирующей границы коэффициент седиментации (s20,w) мало изменялся при варьировании концентрации фермента (5,1 – 5,4 S), для быстро седиментирующей границы наблюдалось отчетливое снижение величины s20,w по мере уменьшения концентрации белка (от 7,9 S при [E]0 = 2,5 мг/мл до 6,9 S при [E]0 = 0,46 мг/мл). Для нативной димерной формы Phb при 20 °С значение s20,w составляет 8,2 S. Поэтому мы полагаем, что быстро движущаяся граница седиментации для Phb при 53 °С для достаточно высоких концентраций белка (рис. 3.1Г) соответствует димерной форме фермента. Снижение величины s20,w для быстрой границы с уменьшением величины [E]0 можно объяснить исходя из предположения о существовании быстро устанавливающегося равновесия между димерной (D) и мономерной (M) формами фермента. Увеличение доли мономерной формы при разбавлении раствора белка должно приводить к снижению величины s20,w, а вследствие быстрых переходов мономер-димер обе формы седиментируют единой границей со значением коэффициента седиментации, близким к средневесовому.

Учитывая, что апофосфорилаза b существует в виде мономера с коэффициентом седиментации, равным 5,1 S (см. табл. 2.1), можно считать, что медленно седиментирующая граница Phb при [E]0 = 0,46; 0,92 и 2,5 мг/мл соответствует мономерной форме фермента. Мы полагаем, что эта мономерная форма фермента седиментирует как отдельная граница в силу того, что она соответствует денатурированному состоянию фермента (Mden), не способному к ассоциации в димеры. При концентрации Phb, равной 0,3 мг/мл (рис. 3.1А), для основной границы седиментации s20,w = 5,5 S, что соответствует мономерной для денатурированного мономера приобретает сложный вид, указывающий на увеличение полидисперсности седиментирующего Использование метода ДСК для изучения тепловой денатурации белков позволяет охарактеризовать тепловой эффект при переходе белка из нативного состояния в денатурированное. В случае необратимо денатурирующих белков этот метод дает возможность оценить энергию активации процесса денатурации. Теоретические исследования, проведенные в работе [Sanches-Ruiz, 1992], показали, что в том случае, когда подвергающиеся необратимой денатурации, положение максимума на кривых зависимости избыточного теплопоглощения (Cp) от температуры смещается в сторону более высоких температур с ростом концентрации белка. Как свидетельствуют данные, представленные на рис. 3.2, увеличение концентрации Phb от 0,5 до 6 мг/мл приводит к повышению температуры, соответствующей максимальному значению Cp, от 56,6 до 57,4 °С.

Поглощение тепла при переходе Phb из нативного состояния в денатурированное, соответствует площади под кривой зависимости Cp от температуры и составляет 1290 кДж/моль субъединиц фермента. Таким Рис. 3.2. Зависимости избыточ- использовались при концентрациях близких к ного теплопоглощения (Cp) фос- насыщению, температура максимума {Cp, t} – форилазы b от температуры при профиля увеличивалась в следующем следующих концентрациях белка порядке: 57,4 °С для субстрата (20 мМ (мг/мл): 1 – 0,5; 2 – 1; 3 – 3; 4 – 6. глюкозо-1-фосфата), 58,1 °С для активатора ( 30 мМ Hepes-KOH буфер, pH 7,0.

ингибитора (100 мМ глюкозы), 59,1 °С для аллостерического ингибитора ( мМ глюкозо-6-фосфата) и 59,6 °С для аллостерического ингибитора (1 мМ FMN). Максимальный защитный эффект обнаружен для FMN. Следует отметить, что защитное действие AMP не связано с возможной ассоциацией димеров в тетрамеры, поскольку седиментационные исследования Phb (5, мг/мл) при температуре выше 45 °С не выявили тетрамерной формы Phb. Повидимому, защитное действие лигандов связано с их способностью препятствовать диссоциации димеров на мономеры. Это предположение подтверждают данные седиментационного анализа. Сравнение седиментационного поведения Phb (0,57 мг/мл) при 49 °С в отсутствие лигандов и в присутствии 1 мМ АМР показало, что в отсутствие АМР фермент существует в виде димера и мономера (s20,w = 7,9 и s20,w = 5,8 S, соответственно), а в присутствии 1 мМ АМР – в виде димерной формы (s20,w = 8,0 S). При объяснении эффекта специфических лигандов на тепловую денатурацию Phb следует учитывать, что процесс денатурации включает стадию обратимой диссоциации D 2M. Тот факт, что АМР и глюкозо-6-фосфат связываются в области контакта субъединиц, объясняет их способность препятствовать диссоциации на мономеры. Так как ингибиторный центр связывания FMN расположен в щели между двумя доменами субъединицы Phb, мономер, по-видимому, сохраняет способность связывать FMN.

Следует отметить, что апоформа Phb, которая существует в виде мономера, способна связывать FMN, но сродство флавина к апоформе гораздо меньше, чем к холоферменту. Защитное действие FMN, по-видимому, связано с FMN-индуцированными конформационными изменениями в мономерах, способствующими их ассоциации в димеры.

Таким образом, данные седиментационного анализа и ДСК свидетельствуют, что тепловая денатурация Phb происходит по диссоциативному механизму, включающему стадию обратимой диссоциации на мономеры с последующей денатурацией изолированных мономеров.

Диссоциативный характер денатурации Phb под действием гуанидингидрохлорида (GuHCl) подтвержден данными скоростной седиментации.

Диссоциация Phb (0,4 мг/мл) на мономеры показана при концентрациях (0,3-0,7) M GuHCl. При увеличении концентрации GuHCl от 0 до 0,7 М коэффициент седиментации фермента снижается от s20,w = 8,3 S до 5,0 S, что соответствует димерной и мономерной форме Phb. Помимо этого появляются денатурированные формы с s20,w = 3,4 S. При 1 М GuHCl происходит агрегация фермента.

Согласно предсказаниям теории краудинга, осмолиты в высоких концентрациях должны сдвигать равновесие N D (где N – нативный белок, а D – денатурированный) в сторону нативного белка. При исследовании влияния осмолитов на кинетику химической денатурации Phb гуанидингидрохлоридом показано защитное действие ТМАО, бетаина, пролина и глицина. В рамках теории активированного комплекса стабильность фермента характеризуется изменением свободной энергии активации ( G0# ) процесса денатурации, а стабилизирующий эффект – изменением величины G0# = G0,осм – G0# или G0# = – RTln(k/k0), где G0 и G0,осм – изменение свободной энергии активации, k0 и k – константы скорости инактивации Phb в 0,7 М GuHCl в отсутствие и в присутствии осмолита соответственно.

Мерой стабилизации белка является тангенс угла наклона прямой на графике зависимости ln(k/k0) от концентрации осмолита (рис. 3.3). Наиболее выраженный стабилизирующий эффект оказывают ТМАО и бетаин, наименее выражен эффект глицина (таблица 3.1) Рис. 3.3. Защитное действие осмолитов – ТМАО (1), бетаина (2), пролина (3), глицина (4) – при инактивации фосфорилазы b под действием 0,7 М GuHCl при 25 °С.

Исследование механизмов защиты белков при денатурации имеет фундаментальное значение для понимания фолдинга, стабильности и функций белков, а также представляет интерес для биотехнологии, эволюционной биологии и медицинской биохимии.

Глава 4. Взаимодействие киназы фосфорилазы с FAD Известно, что некоторые ферменты белок-гликогенового комплекса в скелетных мышцах связывают флавины. Нами было детально исследовано взаимодействие флавинов (рибофлавина, FMN и FAD) с Phb [Chebotareva et al., 2001; Курганов и др., 1994]. Все исследованные флавины имели высокое сродство к Phb и оказывали ингибирующее действие на фермент, причем наиболее сильным действием обладал FMN. Известно, что FMN оказывал сильное ингибирующее действие на гликогенсинтазу из скелетных мышц кролика [Судаков и Соловьева, 1989]. Поэтому представляло интерес изучить возможность взаимодействия флавинов с другими ферментами белокгликогенового комплекса, в частности, с PhK, ключевым регуляторным ферментом гликогенолиза. В качестве флавина нами был выбран FAD, поскольку он является преобладающей формой флавинов в животных тканях.

Изучение взаимодействия PhK с FAD методом седиментации. На рис. 4. представлены седиментограммы киназы фосфорилазы в присутствии FAD. Длина волны 450 нм соответствует максимуму поглощения FAD. Так как при этой длине волны поглощение фермента пренебрежимо мало, то седиментирующая граница (с Рис. 4.1. Связывание FAD с киназой распределения c(s) и составлял 17,1 S. После фосфорилазы. Седиментограммы приведения к стандартным условиям s20,w = 19, комплекса FAD-PhK. Направление S. Из представленных данных следует, что седиментации слева направо. Ско- фермент находится в мономерной форме. Для рость вращения ротора 48 000 сравнения показано также c(s) распределение об/мин, время седиментации 12, и 36 мин. Длина волны 450 нм. мМ Hepes, pH 6,8, 0,1 мМ Ca, мМ Mg2+, 20 °C. Концентрация формы (23 S) присутствуют димерная и более фермента 1,1 мг/мл, концентрация высокомолекулярные формы фермента. Меньший коэффициент седиментации мономерной FAD 9,7 мкМ.

FAD (19,4 S) по сравнению со значением 23 S свидетельствует об изменении конформации фермента при связывании FAD.

Влияние FAD на ассоциацию PhK в условиях молекулярного краудинга.

Поскольку высокие концентрации ТМАО, имитирующие условия краудинга в Рис. 4.3. Влияние FAD на ассоциацию киназы фосфорилазы, индуцируемую 1 М ТМАО в 40 мМ Hepes, pH скорости ассоциации PhK (w/w0) снижается с увеличением концентрации FAD.

В исследованиях по включению 32Р в фосфорилазу b в ходе киназной реакции в отсутствие и в присутствии различных концентраций FAD было показано (Макеевой В.Ф.), что FAD не оказывает влияния на ферментативную активность PhK по отношению к ее белковому субстрату – фосфорилазе b.

В заключение отметим, что методом скоростной седиментации было получено прямое доказательство связывания FAD с PhK. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что FAD влияет на олигомерное состояние фермента, сдвигая равновесие в сторону мономера, подавляет ассоциацию PhK в условиях краудинга в присутствии ТМАО, а также ингибирует образование комплекса PhK с гликогеном. Эти данные указывают на специфическое связывание флавина с PhK.

Поскольку FAD не оказывает влияния на активность PhK, можно полагать, что связывание этого лиганда происходит в пространственно обособленных центрах фермента. Согласно данным по влиянию FAD на взаимодействие PhK с гликогеном связывание FAD ферментом является кооперативным процессом (коэффициент Хилла равен 1,3) [Макеева и др., 2006]. Это указывает на существование положительных кооперативных взаимодействий между FAD-связывающими центрами в молекуле PhK. По-видимому, связывание FAD индуцирует конформационное состояние PhK, которое не способно взаимодействовать с гликогеном и образовывать высокомолекулярные ассоциаты в присутствии осмолита. Тот факт, что не только Phb и гликогенсинтаза, но и PhK способна связывать флавины, дает основание полагать, что комплекс ферментов метаболизма гликогена в составе белок-гликогеновых частиц может осуществлять функцию «депо» флавинов в скелетных мышцах.

Влияние молекулярного краудинга на реакцию взаимодействия ферментлиганд было показано нами на примере взаимодействия фосфорилазы b с FAD.

Флавины (рибофлавин, FMN и FAD) являются аллостерическими ингибиторами мышечной Phb и обладают высоким сродством к ферменту [Chebotareva et al., 2001;

Курганов и др., 1994]. Известно, что FAD является доминирующей формой среди флавинов в мышечной ткани. Влияние молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями осмолитов, ТМАО, бетаина и пролина, на взаимодействие Phb с FAD было изучено методом скоростной седиментации с использованием абсорбционной сканирующей системы. Концентрация свободного лиганда, [L], в смеси Phb с FAD определялась на седиментограммах по поглощению при 450 нм в области плато, формирующегося у мениска после оседания комплекса Phb с FAD. Поглощение фермента при 450 нм пренебрежимо мало. Степень насыщения, Y, была определена следующим соотношением: Y = ([L]tot [L])/[E]tot, где [L]tot и [E]tot – общие концентрации лиганда и фермента в растворе. В отсутствие осмолитов взаимодействие хорошо описывается гиперболической зависимостью функции насыщения, Y, от [L], и константой диссоциации (Kd) 17,8 (± 0.3) мкМ (рис. 5.1А). В отличие от идеальных условий в условиях молекулярного краудинга зависимость Y от [L] имеет S-образную форму (рис. 5.1Б). Кривая связывания Связывание лиганда (L) димерной молекулой Phb (Е) представлено на следующей схеме:

где K1 и K2 обозначают микроскопические константы диссоциации, описывающие связывание FAD с E и EL (или LE) соответственно. Величины этих параметров приведены в Таблице 5.1.

Таблица 5.1. Кажущиеся константы диссоциации взаимодействия FAD с фосфорилазой b На основе гиперболической зависимости функции насыщения Y (рис. 5.1А) от концентрации свободного лиганда([L]). бНаилучшая аппроксимация, соответствующая уравнению (5.1).

Рис. 5.2. Графики разностной ско- соответственно. Седиментацию фермента в отсутростной седиментации (50 000 ствие лиганда (ячейка 1) регистрировали при об/мин), показывающие влияние ( ) и в присутствии ( ) TMAO (1 M) [Chebotareva et al., 2005].

где (r1)t1 и (r2)t2 обозначают радиальные позиции границ (средние точки) в ячейках 1 и 2 в моменты времени t1 и t2 соответственно: (rm)1 и (rm)2 – соответствующие позиции менисков воздух-жидкость в двух ячейках. На основе постоянного интервала времени между сканами в двух ячейках (t1 t 1,5 мин), разность в коэффициентах седиментации (s1 s2) может быть получена из наклона зависимости [ln (r1)t1 (r2)t2] от 2t1. Как видно из рис. 5.2, связывание FAD не влияет на коэффициент седиментации Phb в отсутствие осмолита ( ). Отрицательный наклон графика, полученный в присутствии 1 M TMAO ( ), свидетельствует о несколько большем коэффициенте седиментации комплекса ферментFAD по сравнению с Phb, и, следовательно, более компактной/симметричной форме молекулы. Аналогичные результаты были получены в присутствии 0,6 М бетаина.

Способность других осмолитов влиять на связывание FAD с Phb показана на рис. 5.3, который сравнивает кривые насыщения, полученные в присутствии 1 M TMAO ( ), 1 M бетаина () и 1 М пролина ( ). Формы кривых насыщения, полученных в присутствии 1 M TMAO и 1 M бетаина, подобны.

Однако форма кривой, полученной в присутствии 1 M пролина, отличается от двух других. Важно отметить, что рис. 5.3 указывает на наличие конформационных изменений, индуцированных связыванием FAD с Phb в присутствии осмолитов.

Гиперболическая зависимость Y от [L] (рис. 5.1А) и горизонтальная прямая в отсутствие осмолита на рис. 5.2 указывают на существование двух эквивалентных и независимых центров. T-состояние (в отсутствие АМР), с Рис. 5.3. Влияние осмолитов на кривую насыщения для взаимодействия FAD с фосфорилазой b. где X – термодинамическая константа Линии представляют лучший изомеризации (отношение термодинамифитинг [Ур. (5.1)] результатов, ческих активностей) для T T* полученных в присутствии 1 M концентраций бетаина (), TMAO ( ) и пролина ( ).

– вторые вириальные коэффициенты, учитывающие совместный исключаемый объем между осмолитом и соответствующим изомером фермента. Так как величины этих двух коэффициентов связаны с размерами двух изомерных состояний, наименьший размер T* диктуется требованием, чтобы XM было больше, чем X для достижения смещения равновесия изомеризации в условиях краудинга в сторону T* – состояния. Рассмотрение тех же данных в терминах сольватации белка или осмофобного эффекта также привело бы к заключению, что T* – состояние является предпочтительным в присутствии осмолитов вследствие термодинамической эквивалентности всех трех трактовок [Wills, Winzor, 1993; Davies-Searle et al., 2001].

В условиях молекулярного краудинга происходит сдвиг реакции изомеризации Phb к более компактному состоянию димера с пониженным сродством к FAD [Chebotareva et al., 2005]. Таким образом, эти результаты подтверждают вывод о том, что инициированное осмолитом усиление ассоциации Phb (в присутствии АМР) частично компенсируется сдвигом равновесия в реакции изомеризации димера в условиях молекулярного краудинга в сторону более компактного изомера [Chebotareva et al., 2001].

Молекулярный краудинг может смещать положение равновесия обратимо ассоциирующего белка в сторону более высокомолекулярной формы, а степень воздействия на положение равновесия зависит от концентрации краудинг-агента. В нашей работе метод скоростной седиментации был использован для количественной оценки влияния молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями ТМАО, на ассоциацию Phb из скелетных мышц кролика, индуцированную 1 мМ АМР. Phb является устойчивым димером, состоящим из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой субъединицы 97 400 Да. Связывание аллостерического активатора АМР димером Phb индуцирует конформационный переход в Рис. 6.1. Седиментацион- формами Phb – это достаточно медленный процесс ное поведение Phb ( pH (при 15 °С), что позволяет в процессе седиментации Кажущееся распределение индивидуальным олигомерным формам Phb и коэффициента седимента- определить долю димера и тетрамера. На рис. 6. ции g(s*) от s*, рассчитан- представлены два хорошо разделенных пика ное по методу Стаффорда функции распределения коэффициента [Stafford, 1992]. Скорость вращения ротора об/мин.

Константа ассоциации, K2,4, рассчитана по формуле: K2,4 = (1 f2)/(2f22C), где C – молярная концентрация Phb. Значение K2,4 для Phb равно 3.0 104 M (рН 6,8, 1 мМ АМР, 15 °С).

Для количественной характеристики эффекта ТМАО на реакцию димеризации были построены зависимости логарифма кажущейся константы ассоциации, ln(K2,4)М, от молярной концентрации осмолита, М, (СМ), которые оказались линейными. Теория исключенного объема достаточно хорошо предсказывает линейную зависимость ln(K2,4)М от СМ:

(K2,4)М = K2,4(22/4) = K2,4 exp[(2B2,М – B4,М)СМ ] или в логарифмической форме где второй вириальный коэффициент (B2,М для димера и B4,М для тетрамера) выражается через совместный исключаемый объем (при отсутствие заряда на ТМАО). Молекула ТМАО рассматривается в виде сферы с радиусом, RM, 0. нм. Величину B2,М и B4,М можно вычислить, аппроксимируя димер и тетрамер Phb эллипсоидами вращения с соотношением полуосей 1,84 для димера и 1, для тетрамера. Значения 422 л/моль для B2,M и 833 л/моль для B4,M были получены из выражений, приведенных в работах [Ogston and Winzor, 1975;

Nichol et al., 1976].

величины ln[(K2,4)М/K2,4]/СМ, полученной экспериментально, с теоретической величиной, полученной Рис. 6.2. Зависимость степени Для объяснения полученных данных была введена ассоциации Phb от концен- обратимая стадия изомеризации димера, которая трации ТМАО. Кажущиеся константы димеризации предмодель описывается схемой:

ставлены графически в соответствии с уравнением (6.1).

Точки – экспериментальные тической оценкой величины Измеряемая константа димеризации (К2,4) наклона (2B2,M B4,M). должна быть записана в виде:

где Y – константа изомеризации, контролирующая T2 R2 переход в присутствии АМР, берется много меньше 1. Последствия от добавления концентрации CM инертного вещества (TMAO) являются двойственными.

Помимо эффекта термодинамической неидеальности на равновесие димертетрамер существует компенсирующий эффект на равновесие изомеризации, T R, который сдвигает равновесие в сторону более компактной, неассоциирующей Т-конформации в соответствии с выражением:

Комбинирование уравнений (6.1 – 6.3) даёт следующее выражение для зависимости измеряемой константы димеризации от концентрации TMAO:

ln [( K 2,4)М/ K 2,4] [(2B2R,M B4R,M) + 2(B2T,M B2R,M)]CM (6.4) Уменьшение предсказанного наклона от 11 л/моль для простой модели димер-тетрамер до значения 0,7 л/моль (, рис. 6.2) потребовало бы, чтобы B2R,M превышало B2T,M только на 5 л/моль (т.е., 1,2% от B2T,M). Относительное изменение объёма (1,2%) сравнимо с соответствующим значением (2,8%), полученным для дрожжевой гексокиназы [Jacobsen and Winzor., 1997].

Таким образом, незначительное увеличение степени ассоциации фосфорилазы b в присутствии ТМАО в сравнении с теоретическими предсказаниями означает, что эффект молекулярного краудинга на равновесие димер-тетрамер компенсируется сдвигом равновесия в реакции изомеризации димера T R в сторону более компактной, неассоциирующей Т-конформации.

Глава 7. Влияние молекулярного краудинга на ассоциацию PhK Киназа фосфорилазы (PhK; КФ 2.7.1.38) катализирует Ca2+, cAMP-зависимое фосфорилирование и активацию гликогенфосфорилазы b (Phb) и является одной из наиболее сложно структурно организованных протеинкиназ с молекулярной массой 1320 кДа. Молекула фермента представляет собой гексадекамер субъединичного состава ()4, в котором -субъединица является каталитической, а -, - и субъединицы регуляторными, причем -субъединица идентична кальцийсвязывающему белку кальмодулину. Ионы Ca2+ и Mg2+ стимулируют активность PhK, индуцируя изменения третичной и четвертичной структуры молекулы.

Олигомерное состояние Phk зависит от концентрации белка и концентрации ионов Ca2+ и Mg2+. В отсутствие Ca2+ и Mg2+ фермент существует в виде исходного гексадекамера (далее для простоты называемого мономером) и димера (с s20,w = 23 и 36,5 S соответственно), причем активной формой фермента является гексадекамер («мономер») [Cohen, 1973; Chebotareva et al., 2002]. Однако, при добавлении Ca2+ и Mg2+ появляются ассоциаты более высокого порядка. Седиментационные исследования в аналитической ультрацентрифуге Spinco, модель Е, оборудованной Рис. 7.1. Влияние ТМАО на ассоци- интегрирования пиков распределения [c(s); s] ацию PhK (0,41 мг/мл) в 40 мМ и приведены к стандартным значениям Hepes буфере, рН 6,8, содержащем (плотности и вязкости воды при 20 °C). В 0,1 мМ Ca2+ и 2 мМ Mg2+. Десять отсутствие TMAO фермент (0.3 г/л) первых седиментационных профи- представлен мономерной, димерной, лей в присутствии 0,6 М ТМАО (А) тримерной и тетрамерной формами с s20,w = и в отсутствие осмолита (Б) запиand 64,0 ± 2,2 S саны с интервалом 3 мин при 20 °С.

Скорость вращения ротора об/мин [Chebotareva et al., 2002].

средних значений s20,w = 38,0 ± 2.2, 61,0 ± 1,9, 106,0 ± 1,8, 131,0 ± 1,5, 148 ± 1, 218 ± 1 и 327 ± 1 S (рис. 7.2Б). Стоит отметить, что в соответствии с теорией молекулярного краудинга компактное состояние макромолекул является предпочтительным по сравнению с ассиметричным [Minton, 2000], что позволяет аппроксимировать ассоциаты сферой. Пик с s20,w = 327 S соответствует 53-меру PhK. Полученные результаты показывают, что TMAO стимулирует ассоциацию PhK.

радиальное разбавление, C – молярная концентрация фермента. Значение Kass было найдено Рис. 7.2. Ассоциация PhK (0,3 M в присутствии 1 M TMAO при прочих равных мг/мл) в условиях молеку- условиях. Полученный результат показывает, что лярного краудинга, создаваемо- TMAO сдвигает равновесие в сторону образования го присутствием 0,5 М ТМАО. димерной формы.

Дифференциальные распределе- Стимулирующее влияние ТМАО на ния коэффициента седиментаассоциацию PhK (в присутствии 0,1 мМ Ca2+ и ции c(s), полученные в отсутстMg2+) 0,5 М ТМАО (Б). 40 мМ Hepes, турбидиметрическим методом. Согласно рН 6,8, 0,1 мМ Ca2+, 10 мМ Mg2+ полученным данным при увеличении и 10 мМ NaCl; 15 °С. Скорость концентрации ТМАО в интервале 0,5-1,5 М вращения ротора 20 000 об/мин. наблюдается резкое увеличение начальной 2002]. Добавление 1 мМ ЭГТА вызывает разрушение ассоциатов, образованных в присутствии ТМАО, что указывает на обратимый характер процесса ассоциации.

Влияние ТМАО на ассоциацию PhK было изучено также методом динамического светорассеяния (DLS). Этот метод позволяет оценить гидродинамический радиус образующихся ассоциатов. Кривая 1 на рис. 7.3A показывает зависимость интенсивности светорассеяния раствора PhK (0,3 г/л) от времени после добавления ионов Ca2+ и Mg2+. Значительное возрастание интенсивности светорассеяния в присутствии 0,5 M TMAO (кривая 2) означает, что TMAO способствует ассоциации PhK. Как видно из рис. 7.3Б в присутствии 0,5 М ТМАО (кривая 2) образуются частицы большего размера. На рис. 7.3Б показаны только радиусы ассоциатов PhK. Радиус молекулы PhK равен 13 ± 1 нм.

Отличительной особенностью ассоциации PhK является тот факт, что размер первичных ассоциатов (мы называем их «стартовыми ассоциатами») существенно превышает размер молекулы PhK.

I, фотоотсчетов/сек Рис. 7.3. Влияние ТМАО на ассоциацию PhK (0,3 г/л). Зависимости интенсивности динамического светорассеяния (I) от времени (А) и гидродинамического радиуса от времени (Б), полученные в отсутствие ТМАО (1) и в присутствии 0,5 М ТМАО (2).

Гидродинамический радиус, Rh, стартовых ассоциатов, определенный экстраполяцией значений к начальному моменту времени в отсутствие и присутствии TMAO равен 82 ± 3 и 117 ± 4 нм, соответственно. Следует отметить, что DLS не позволяет определить промежуточные размеры частиц (между размером молекулы PhK и стартовым ассоциатом), поскольку концентрация промежуточных форм мала. Нарастание интенсивности светорассеяния в процессе ассоциации можно объяснить слипанием стартовых ассоциатов. Аналитическое ультрацентрифугирование позволяет регистрировать промежуточные формы.

Усиление ассоциации PhK в присутствии ТМАО можно объяснить в терминах термодинамической неидеальности, создаваемой осмолитами.

Согласно теории абсолютных скоростей реакций константу скорости второго порядка (k) характеризующую взаимодействие двух частиц (Pi + Pj Pi+j) можно записать следующими выражениями [Hall and Minton, 2003]:

где kB – константа Больцмана, T – абсолютная температура, K константа равновесия между начальными компонентами (Pi и Pj, концентрации ci и cj соответственно) и активированным комплексом (P, концентрация c). В условиях краудинга константа K рассматривается как кажущаяся константа равновесия:

где K 0 – истинная константа равновесия, i и j коэффициенты термодинамической активности для частиц Pi и Pj, и – коэффициент термодинамической активности активированного комплекса. Термодинамические активности (a) и концентрации (c) связаны следующими соотношениями: ai = ici, aj = jcj, и a = с.

Константа скорости реакции k измеренная в присутствии краудинг-агента описывается следующим выражением:

где k0 – константа скорости в отсутствие краудинг-агента и – фактор неидеальности ( = ij/). Коэффициент термодинамической активности для вещества m-го типа определяется долей общего объема доступной этому веществу:

где total – общий объем и m – объем, доступный веществу m-го типа.

Очевидно, что m > 1, так как m < total. Поскольку размер активированного комплекса больше, чем размер частицы Pi или Pj, объем (объем доступный для активированного комплекса) меньше чем объем i или j (объемы, доступные для частиц Pi и Pj, соответственно). Поэтому (коэффициент термодинамической активности активированного комплекса) больше, чем i и j (коэффициенты термодинамической активности частиц Pi и Pj). Так как значения i > 1 и j > 1, произведение ij может быть больше, чем и k > k0. Это означает, что термодинамическая неидеальность создаваемая осмолитами, приводит к ускорению ассоциации макромолекул.

Такое рассмотрение позволяет объяснить увеличение скорости ассоциации PhK в присутствии TMAO. Эффект ТМАО на ассоциацию PhK согласуется с выводами теории исключенного объема. Принимая во внимание данные седиментации и светорассеяния, мы можем предположить, что ассоциаты PhK относительно малых размеров (от димера до тетрамера) образуются в результате линейного роста олигомеров фермента. Отдельные ассоциаты PhK большого размера с (s20,w = 189, 354 и 385 S), зарегистрированные в присутствии TMAO, могут быть образованы слипанием относительно небольших ассоциатов [Chebotareva et al., 2002].

Итак, стимулирующее влияние молекулярного краудинга на ассоциацию PhK было продемонстрировано тремя методами: методами скоростной седиментации, турбидиметрии и динамического светорассеяния. Способность PhK образовывать ассоциаты большого размера в среде с высокой концентрацией осмолитов позволяет предполагать, что в клетке благодаря эффекту макромолекулярного краудинга часть фермента может существовать в виде надмолекулярных структур. Кроме того, возможно, что “липкие” центры, ответственные за ассоциацию PhK, могут обеспечить взаимодействие фермента с микротрубочками или с интегральными белками связанными с мембранами [Brusharia, and Walsh, 1999].

Влияние пролина и -кристаллина на ассоциацию PhK. Исследование ассоциации PhK методом скоростной седиментации выявило образование очень крупных ассоциатов в условиях молекулярного краудинга. После преинкубации смеси, содержащей PhK и 1 М осмолит (ТМАО или бетаин), были зарегистрированы ассоциаты с s = 23 700 и 21 800 S соответственно при скорости вращения ротора 2000 об/мин. В отличие от ТМАО и бетаина высокие концентрации пролина (0,6-1,0) М не стимулировали образование таких высокомолекулярных ассоциатов в аналогичных условиях. На рис. 7. присутствуют только две границы (s20,w = 22,6 и 30,5 S) соответствующие мономерной и димерной формам PhK.

Дифференциальное распределение коэффициентов седиментации c(s), полученное в другой серии опытов в отсутствие пролина (рис. 7.5А) и в присутствии 0,6 M пролина (рис. 7.5Б) также свидетельствует о том, что добавление пролина в раствор PhK не приводит к появлению больших ассоциатов. Напротив, пролин подавляет ассоциацию PhK, по-видимому, благодаря его специфическому взаимодействию с PhK. В присутствии 0,6 М пролина положение равновесия смешается в сторону мономерной формы: s20,w = 23 ± 1,9 S (рис. 7.5А) и 19 ± 0,6 S (рис. 7.5Б). Снижение коэффициента седиментации с 23 до 19 S может быть следствием конформационных изменений молекулы PhK при связывании пролина.

Рис. 7.5. Влияние пролина на ассоциацию PhK (0.3 г/л). Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации c(s), полученные в отсутствие пролина (А) и в присутствии 0,6 М пролина (Б).

анализа данные, полученные методом динамического светорассеяния, подтверждают подавление Рис. 7.6. Влияние пролина на на ассоциацию PhK в присутствии 0,5 M TMAO.

ассоциацию PhK (0.3 г/л).

Зависимости гидродинамичесусловиях молекулярного краудинга без пролина кого радиуса (Rh) от времени, полученные при разных кон- (рис. 7.7A) и в присутствии 0,6 M пролина (рис.

центрациях пролина: 0 (1), 0,08 7Б), показывает, что положение равновесия в (2), 0,15 M (3). присутствии пролина сдвинуто в сторону олигомерных форм меньшего размера. Поскольку ассоциация PhK приводит к уменьшению удельной активности фермента, особый интерес представляло найти такие факторы в клетке, которые способны препятствовать ассоциации фермента. С этой целью нами было проверено влияние кристаллина, белка, обладающего шапероно-подобной активностью, на ассоциацию PhK в области, где образуются крупные ассоциаты (Rh > 82 нм).

Известно, что -кристаллин препятствует агрегации денатурированных белков и повышает устойчивость клетки к стрессам.

Молекулярная масса -кристаллинов может варьировать от 280 кДа до 10 МДа. Рис. 7.7В демонстрирует влияние -кристаллина на ассоциацию PhK в присутствии 0,5 M TMAO. На рис. 7.7В в присутствии -кристаллина видны только 2 главных пика с s20,w = 15.4 и 23.3 S. Таким образом, создаваемого присутствием 0,5 М ТМАО. Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации c(s), светорассеяния. Достаточно большие концентрации -кристаллина полностью подавляют стартовые ассоциаты (Rh = 100 ± 4 нм). Радиус кристаллина найден равным 10,5 ± 0,2 нм. Из рис.

Глава 8. Влияние молекулярного краудинга на взаимодействие киназы фосфорилазы с гликогеном и фосфорилазой b Для понимания механизма действия ферментов гликогенолиза было важно изучить как белок-белковые взаимодействия, так и взаимодействие ферментов с гликогеном в условиях, имитирующих условия в клетке. Так как молекулярный краудинг влияет не только на ассоциацию белков, но также на образование надмолекулярных структур, было изучено влияние высоких концентраций осмолитов (бетаина, ТМАО и пролина) на образование комплекса PhK с гликогеном. Методом седиментационного анализа мы показали, что ТМАО и бетаин усиливают взаимодействие PhK с гликогеном (рис. 8.1).

Рис. 8.1. Влияние TMAO и бетаина на связывание PhK с гликогеном (40 мM Hepes, pH 6,8, 0,1 мM CaCl2, 10 мM MgCl2; 20 °C). Зависимость доли сободного фермента от концентрации осмолита: бетаина (А) при общей концентрации PhK 0,25 мг/мл, гликогена 0.9 мг/мл; ТМАО (Б) при общей концентрации PhK 0,18 мг/мл, гликогена 0,08 мг/мл.

Данные получены методом скоростной седиментации.

Влияние бетаина на начальную скорость и степень взаимодействия PhK с гликогеном было изучено методом турбидиметрии. Бетаин увеличивает скорость и степень взаимодействия PhK с гликогеном (рис. 8.2A). Рис. 8.2Б демонстрирует увеличение относительной начальной скорости связывания PhK с гликогеном с ростом концентрации бетаина. Данные скоростной седиментации также свидетельствуют, что бетаин способствует взаимодействию PhK с гликогеном. В присутствии бетаина доля свободной PhK, зарегистрированная после осаждения гликогена и комплекса PhKгликоген, уменьшается при возрастании концентрации бетаина (рис. 8.1А).

Эффект пролина отличается от действия метиламинов. Прямое доказательство способности пролина подавлять образование комплекса белок-гликоген получено методом скоростной седиментации (рис. 8.3).

Рис. 8.2. Влияние бетаина на кинетику Рис. 8.3. Седиментационное поведевзаимодействия PhK с гликогеном ние PhK (0,33 мг/мл) в смеси с (pH 6,8; 0.1 мМ Ca2+ и 10 мМ Mg2+; 20 гликогеном (0,9 мг/мл) наблюдаемое °C). Образование комплекса иници- при разных концентрациях пролина:

ировали добавлением Ca2+ и Mg2+ к смеси 0 M (A), 0,3 M (Б), и 0.6 M (В) ( PhK (22 мкг/мл) с гликогеном (0,7 мг/мл).

(A) Временная зависимость поглощения концентрациях бетаина: 0 M (1), 0,05 M седиментации слева направо. Время (2), 0,1 M (3), 0,2 M (4), и 0,8 M (5). (Б) седиментации: 3, 11, 15, 20 мин (A);

Зависимость относительной скорости 8, 13, 18 мин (Б); 4, 12, 17 мин (В).

взаимодействия PhK с гликогеном (v/v0) от концентрации бетаина.

Поскольку гликоген и его комплекс с ферментом седиментируют значительно быстрее, чем свободный фермент, то концентрацию свободной PhK можно измерить после осаждения гликогена и комплекса PhK-гликоген.

Из данных, представленных на рис. 8.3, следует, что фракция свободного фермента увеличивается с возрастанием концентрации пролина от 45% без пролина до 67% в присутствии 0,3 M пролина и 100% в присутствии 0,6 M пролина. По данным турбидиметрии относительная начальная скорость образования комплекса падает с ростом концентрации пролина [Chebotareva et al., 2004].

Эффект ТМАО и бетаина на ассоциацию PhK и на ее взаимодействие с гликогеном соответствует главному выводу теории молекулярного краудинга, согласно которому эффект исключенного объема способствует ассоциации и образованию надмолекулярных структур. Подавление этих процессов пролином свидетельствует о другом механизме действия. Предполагается, что пролин специфически взаимодействует с PhK.

Влияние молекулярного краудинга на взаимодействие киназы фосфорилазы с фосфорилазой b. Исследование эффекта краудинга на взаимодействие PhK с гликогенфосфорилазой b (Phb) представляет особый интерес по нескольким причинам. Во-первых, физиологическим субстратом PhK является белок – Phb (M = 195 kDa); так что взаимодействие фермент-субстрат представляет собой взаимодействие белок-белок. Во-вторых, оба белка локализованы на высокомолекулярной матрице – на гликогеновых частицах и непосредственно взаимодействуют с гликогеном. Каждая субъединица димерной молекулы Phb содержит специифический центр связывания гликогена [Oikonomakos et al.

Graves, 1982]. Присутствие Phb способствует связыванию PhK с гликогеном [Андреева и др., 1999]. Рис. 8.4 показывает седиментационное поведение смеси PhK и Phb в отсутствие осмолитов (A) и в присутствии 0,6 M пролина (Б), 0,7 M бетаина (В), и 0,3 M TMAO (Г). Медленно седиментирующая граница соответствует Phb (s20,w = 8,79 S). Так как коэффициент седиментации PhK значительно больше, чем Phb, то PhK и ее комплекс с Phb седиментируют быстрее, чем Phb. Поэтому плато, образующееся в области мениска после оседания PhK и ее комплекса с Phb соответствует концентрации свободной Phb.

Фракция свободной Phb возрастает в 1,5 раза в присутствии 0,6 M пролина, 0, M бетаина, или 0,3 M TMAO. Таким образом, высокие концентрации пролина, бетаина и TMAO подавляют образование комплекса PhK-Phb.

Наблюдаемое в наших исследованиях влияние TMAO и бетаина на ассоциацию PhK и ее взаимодействие с гликогеном согласуется с основными положениями теории молекулярного краудинга о том, что краудинг благоприятствует олигомеризации белка и образованию надмолекулярных структур [Shearwin and Winzor, 1988; Cann et al., 1994; Shtilerman et al., 2002;

Zimmerman and Minton, 1993]. Подавление этих процессов пролином свидетельствует о его специфическом взаимодействии с PhK.

При интерпретации эффекта осмолитов на взаимодействие PhK-Phb необходимо принять во внимание тот факт, что краудинг может влиять на конформацию белка. Мы показали, что TMAO смещает равновесие реакции изомеризации димера Phb в сторону более компактной неактивной Tконформации [Chebotareva et al., 2001]. Возможно, что конформационный переход Phb препятствует ее взаимодействию с PhK. Однако, условия молекулярного краудинга могут также влиять на конформацию PhK.

Тот факт, что условия краудинга препятствуют образованию комплекса между PhK и ее субстратом, Phb, на первый взгляд, кажется физиологически нецелесообразным. Однако, известно, что гликоген сильно влияет на взаимодействие PhK с Phb. Мы показали, что условия краудинга, созлаваемые высокими концентрациями триметиламинов благоприятствуют связыванию PhK и Phb с гликогеном. Поскольку в живой клетке PhK и Phb входят в состав белок-гликогенового комплекса, то, вероятно, что в клетках специфические взаимодействия PhK и Phb с гликогеном позволяют преодолеть негативные последствия влияния молекулярного краудинга на белок-белковые взаимодействия.

Глава 9. Влияние молекулярного «ограничения»

Тип краудинга, называемый макромолекулярным ограничением (macromolecular confinement), относится к ситуации, когда макромолекулы оказываются включенными в небольшие клеточные компартменты или поры, сопоставимые по размерам с макромолекулами. Такие компартменты создаются, в частности, в структурах цитоскелета или в центральной полости шаперонинов типа GroEL [Zimmerman and Minton, 1993; Ellis, 2001; Martin, 2004]. Для имитации условий молекулярного «ограничения» используется золь-гель (sol-gel) метод инкапсулирования белка в гидратированные поры силикагелевого матрикса кремневой кислоты [Eggers and Valentine, 2001]. Такое ограничение стабилизирует более компактную структуру белка. Показано, что термостабильность белков (лизоцима, -лактоальбумина, апомиоглобина) в порах значительно возрастает [Eggers and Valentine, 2001]. Система обращенных гидратированных мицелл аэрозоля ОТ (АОТ) в октане также имитирует условия молекулярного «ограничения». Обращенные гидратированные мицеллы АОТ в октане характеризуются достаточно узким распределением по размерам, причем размеры внутренней полости мицеллы однозначно задаются степенью гидратации ПАВ, то есть отношением [H2O]/[ПАВ] = w0 [Eicke and Rehak, 1976]. Ферменты способны легко включаться в водную полость обращенных мицелл, сохраняя при этом каталитическую активность. Удивительным оказался тот факт, что гидратированные обращенные мицеллы способны вызывать диссоциацию олигомерных ферментов даже в тех случаях, когда они устойчивы в водном растворе. Это обстоятельство позволяет получать и исследовать в мягких, неденатурирующих условиях свойства индивидуальных олигомерных форм фермента. Объектом исследования в настоящей работе служила мышечная Phb.

В настоящей работе изучена возможность диссоциации и стабилизации отдельных олигомерных форм Phb в системе обращенных мицелл АОТ в октане методом скоростной седиментации в аналитической ультрацентрифуге Spinco, модель E, с использованием абсорбционной сканирующей системы.

Сканирование проводили при длинах волн 280 и 290 нм для белоксодержащих мицелл и 405 нм для пустых мицелл, прокрашенных 2,4-динитрофенолом. В качестве примера на рис. 9.1 представлены данные по седиментации Phb, включенной в обращенные мицеллы, при значениях [H2O]/[ПАВ], равных 24,7.

На седиментограммах помимо границы, соответствующей пустым мицеллам и характеризующейся наименьшим коэффициентом седиментации (s), присутствовали две границы, соответствующие седиментации белоксодержащих мицелл. Полученные значения s для пустых и белоксодержащих обращенных мицелл при различных степенях гидратации мицелл представлены на рис. 9.2.

Для того чтобы соотнести значения s с определенными олигомерными формами Phb, мы провели теоретические расчеты коэффициентов седиментации белоксодержащих обращенных мицелл с использованием уравнений, предложенных в работах [Levashov et al., 1981; Хмельницкий и др., 1982;

Kabanov et al., 1991]. Если размер внутренней полости мицеллы равен или превышает размеры молекулы белка, то включение фермента происходит без изменения гидродинамического радиуса мицеллы. В этих случаях теоретический коэффициент седиментации белоксодержащей мицеллы (s) рассчитывали (согласно концепции геометрического соответствия [Хмельницкий и др., 1982]) по формуле:

где Mr – молекулярная масса соответствующей олигомерной формы белка, – плотность растворителя; s0, M0 и v0 – коэффициент седиментации, молекулярная масса и удельный парциальный объем пустой мицеллы. Если размеры внутренней полости мицеллы меньше радиуса белковой глобулы, то мицелла формируется вокруг молекулы белка, но при этом сохраняется величина степени гидратации (модель индуцированного соответствия [Kabanov et al., 1991]). В этих случаях теоретический коэффициент седиментации рассчитывали по уточненной формуле:

где wopt – оптимальная степень гидратации, при которой радиус внутренней полости мицеллы равен радиусу белковой глобулы; sopt, Mopt и nopt – значения коэффициента седиментации, молекулярной массы и числа агрегации обращенной мицеллы при оптимальной степени гидратации соответственно и m – молекулярная масса воды. Для расчета таких параметров, как радиус белка и wopt, молекулу фосфорилазы аппроксимировали плотной сферой. Рассчитанные параметры r и wopt для различных олигомерных форм Phb представлены в таблице. Для димерной молекулы фосфорилазы wopt = 24,7, поэтому в области значений w0 > 24,7 для расчета теоретического коэффициента седиментации белоксодержащих обращенных мицелл использовали формулу (9.1), а при w0 < 24,7, где радиус димера превышает размер внутренней полости мицеллы, использовали формулу (9.2).

Таблица. 9.1. Значения параметров Mr, r и wopt для олигомерных форм фосфорилазы b Примечания. Значения r и wopt рассчитывали по эмпирическим формулам [Клячко и др., 1990]:

Результаты расчетов представлены на рис. 9.2 (кривая 2). Как видно из рис.

9.2, димерная форма фермента наблюдалась в интервале значений w0 от 10 до 30.

Для мономерной формы Phb wopt = 19,0. Коэффициент s мономерной формы при w0 < 19 рассчитывали по формуле (9.2). Мономерная форма (рис. 9.2, кривая 1) наблюдалась при значениях w0 в интервале от 10 до 16. Однако, доля этой формы мала и кроме нее присутствуют димеры и агрегаты с коэффициентами седиментации около 90 S. Появление агрегатов является, по-видимому, следствием повышенной способности мономерной формы Phb к агрегации, что хорошо известно для мономерной апофосфорилазы [Чеботарева и др., 1995]. По данным авторов работы [Barford and Johnson, 1992] у изолированной субъединицы до 54% участков образующих поверхность неполярны. Повидимому, при диссоциации димеров на субъединицы на поверхности глобулы появляются гидрофобные участки, способные взаимодействовать с мицеллярной оболочкой, что приводит в конечном счете к агрегации фермента. Как видно на рис. 9.2, при достаточно высоких значениях w0 в системе появляются олигомерные формы более крупного размера. Уровни значений s: 68-72 S (кривая 3), 80-84 S (кривая 4), 100-102 S (кривая 5) и 118 S (кривая 6) соответствуют, согласно проведенным расчетам, тримерной, тетрамерной, гексамерной и октамерной формам Phb. Тримерную форму фермента наблюдали в области значений w0 30-38, тетрамерную – в области значений w0 23-42, гексамерную – в области значений w0 41-50 и октамерную при w0 от 48 до 53.

Таким образом, изменение степени гидратации обращенных мицелл является инструментом, позволяющим целенаправленно менять олигомерное состояние Phb, которая в водном растворе представляет собой устойчивую димерную форму.

Условия молекулярного краудинга в клетке способствуют сборке мультиферментных комплексов. Надмолекулярные структуры, зарегистрированные нами в случае Phb, могут служить моделью упорядоченных надмолекулярных комплексов ферментов в клетке.

Заключение Согласно современным представлениям все биохимические процессы в живой клетке протекают в условиях молекулярного краудинга, оказывающего заметное влияние на скорость и равновесие различных реакций и стимулирующего образование более компактных структур. К таким процессам относятся белок-белковые взаимодействия, конформационные переходы биомакромолекул, фолдинг и агрегация белка, а также образование мультиферментных комплексов и надмолекулярных структур. Предполагается, что краудинг играет заметную роль в такой важной физиологической функции клетки, как поддержание постоянного объема клетки.

Область биологии, касающаяся функционирования биомакромолекул в условиях краудинга, т.е. в условиях, максимально приближенных к существующим в живых системах, несмотря на активный и все более возрастающий интерес к ней биохимиков, биофизиков и физиологов во всем мире, находится в настоящее время лишь на начальных этапах своего развития.

Это связано с двумя главными методическими трудностями, касающимися выбора нейтральных краудинг-агентов, пригодных для создания условий, имитирующих состояние краудинга в клетке, и ограниченностью экспериментальных методов, доступных в настоящее время для изучения поведения и функционирования биомакромолекул в этих условиях.

В настоящей работе впервые систематически изучены свойства ключевых ферментов гликогенолиза (фосфорилазы b и киназы фосфорилазы) в условиях молекулярного краудинга, имитируемого in vitro добавлением к реакционной смеси таких природных осмолитов, как ТМАО, бетаин и др. Были разработаны новые методические приемы седиментационного анализа, позволившие количественно оценить влияние краудинга на ассоциацию и изомеризацию изученных ключевых ферментов гликогенолиза. Установлено влияние краудинга на взаимодействия типа белок-лиганд и белок-белок, на реакцию изомеризации макромолекул и образование надмолекулярных структур.

Обнаружено влияние краудинга, создаваемого высокими концентрациями осмолитов (ТМАО и бетаина), на ассоциацию киназы фосфорилазы и ассоциацию фосфорилазы b. Показано, что ТМАО и бетаин стимулируют ассоциацию киназы фосфорилазы в присутствии Ca2+ и Mg2+ c образованием надмолекулярных структур (с коэффициентами седиментации 23 700 и S), включающих сотни молекул фермента. Установлено влияние краудинга на образование надмолекулярных структур при взаимодействии киназы фосфорилазы с высокомолекулярной матрицей – гликогеном – и на образование надмолекулярных структур при включении фосфорилазы b в гидратированные обращенные мицеллы. Влияние высоких концентраций ТМАО и бетаина на ассоциацию ферментов гликогенолиза, а также на взаимодействие этих ферментов с гликогеном согласуется с теоретически предсказанными эффектами молекулярного краудинга.

Обнаружено влияние краудинга на взаимодействие фосфорилазы b с аллостерическим эффектором (FAD). При взаимодействии фосфорилазы b с FAD в условиях краудинга происходит конформационный переход димерной молекулы, в результате которого появляются кооперативные взаимодействия флавин-связывающих центров фермента.

Поскольку константы связывания лигандов белками меняются в условиях краудинга, то можно ожидать, что краудинг будет оказывать влияние на взаимодействие лекарственных препаратов с белками-мишенями. Известно, что фосфорилаза является мишенью для испытания противодиабетических препаратов [Oikonomakos, 2002]. Проведенные нами исследования показывают, что эффекты краудинга должны учитываться при испытании новых лекарственных препаратов.

Оценивая возможную практическую значимость исследований протекания биохимических процессов в условиях краудинга для медицины, следует принимать также во внимание, что целый ряд заболеваний (таких как нейродегенеративные болезни) связаны с образованием нефункциональных белковых агрегатов, формирование которых стимулируется в условиях краудинга.

Защитный стабилизирующий эффект осмолитов при стрессах различной природы (при термическом, химическом или осмотическом стрессе), как правило, объясняется эффектом исключенного объема. В настоящей работе показано защитное действие молекулярного краудинга, создаваемого осмолитами (ТМАО, бетаином, пролином и глицином), при инактивации фосфорилазы b под действием гуанидингидрохлорида.

Приемы стабилизации белков, основанные на использовании эффектов краудинга, могут быть использованы при решении биотехнологических задач и при разработке методов хранения белковых препаратов медицинского назначения.

ВЫВОДЫ

1. Для ключевых ферментов гликогенолиза (фосфорилазы b и киназы фосфорилазы) молекулярный краудинг является фактором, оказывающим существенное влияние на взаимодействия типа белок-лиганд, белок-белок, конформационные переходы и образование надмолекулярных структур и, как следствие, на механизмы функционирования ферментов in vivo.

2. Обнаружено влияние молекулярного краудинга, создаваемого осмолитами – триметиламин-N-оксидом (ТМАО), бетаином или пролином – на аллостерические свойства фосфорилазы b. При взаимодействии фосфорилазы b с аллостерическим ингибитором, FAD, в условиях краудинга происходит конформационный переход димерной молекулы, в результате которого появляются кооперативные взаимодействия флавин-связывающих центров фермента.

3. Количественная оценка эффекта молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями ТМАО, на ассоциацию фосфорилазы b, индуцируемую АМР, позволила установить, что равновесие димер-тетрамер фосфорилазы b сдвигается в сторону тетрамерной формы в присутствии осмолита. Относительно небольшое увеличение степени ассоциации фосфорилазы b в присутствии осмолита по сравнению с эффектом, рассчитанным теоретически, означает, что влияние молекулярного краудинга на равновесие димер-тетрамер частично компенсируется сдвигом равновесия в реакции изомеризации димера T R (где T – неактивная, R – активная конформация димера) в сторону более компактной, неассоциирующей Т-конформации.

4. Предложена новая методика для седиментационного анализа взаимодействий белок-лиганд в случае ассоциирующей ферментной системы типа димертетрамер, в качестве которой выбрана фосфорилаза b, ассоциирующая в присутствии АМР. Одновременное использование двух оптических систем аналитической ультрацентрифуги (абсорбционной и шлирен-оптики) позволило количественно охарактеризовать влияние FMN, аллостерического ингибитора, на равновесие димер-тетрамер фосфорилазы b и оценить взаимодействие FMN с димерной и тетрамерной формами фермента.

5. Установлено стимулирующее влияние молекулярного краудинга, создаваемого высокими концентрациями TMAO и бетаина, на ассоциацию киназы фосфорилазы c образованием надмолекулярных структур. Пролин препятствует ассоциации вследствие специфического взаимодействия с ферментом. Обнаружено, что -кристаллин – белок, обладающий шапероноподобной активностью, – и пролин подавляют ассоциацию киназы фосфорилазы в условиях краудинга.

6. Выявлено, что связывание FAD с киназой фосфорилазы ингибирует ассоциацию фермента как в термодинамически идеальных условиях, так и в условиях молекулярного краудинга. Высказано предположение о роли белокгликогеновых частиц как «депо» флавинов.

7. Показано, что молекулярный краудинг усиливает образование надмолекулярных структур при взаимодействии киназы фосфорилазы с гликогеном, но препятствует взаимодействию киназы фосфорилазы с фосфорилазой b. Предполагается, что специфические взаимодействия киназы фосфорилазы и фосфорилазы b с гликогеном в живой клетке, которые усиливаются в условиях краудинга, компенсируют негативное влияние краудинга на взаимодействие киназы фосфорилазы со своим белковым субстратом.

8. Влияние молекулярного «ограничения» (разновидность краудинга) на олигомерное состояние фермента показано на примере фосфорилазы b, включенной в обращенные гидратированные мицеллы аэрозоля ОТ в октане.

Уменьшение размера полости мицелл приводит к диссоциации фермента в относительно мягких условиях, а увеличение размера полости – к образованию надмолекулярных структур, которые в условиях молекулярного краудинга имитируют образование надмолекулярных комплексов ферментов in vivo.

9. Показано, что наряду с непосредственным участием в катализе, пиридоксальфосфат выполняет роль конформационного кофактора фосфорилазы b, стабилизируя активную димерную структуру фермента и регулируя сродство фосфорилазы b к субстратам и эффекторам.

10. Выявлено защитное действие молекулярного краудинга, создаваемого гуанидингидрохлорида. Установлено, что термоденатурация и денатурация под действием гуанидингидрохлорида фосфорилазы b протекают по диссоциативному механизму, то есть включают стадию обратимой диссоциации активного димера на неактивные мономеры и следующую за ней стадию необратимой денатурации мономера.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ, Программы поддержки ведущих научных школ РФ, Программы «Молекулярная и клеточная биология»

Президиума РАН, INTAS, BBSRC Reserch Grant “Molecular crowding and thermodynamic non-ideality prediction for macromolecule-ligand interactions”.

Список цитируемой литературы 1. Zimmerman S.B. and Minton A.P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1993, 22, 27- 65.

2. Fulton A.B. How crowded is the cytoplasm? Cell, 1982, 30, 345-347.

3. Ellis R.J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated., Trends Biochem. Sci.

2001, 26, 597-604.

4. Minton A.P. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. J. Biol. Chem. 2001, 276, 10577-10580.

5. Ellis R.J. and Minton A.P. Join the crowd. Nature, 2003, 425, 27-28.

6. Bolen, D.W., Baskakov, I.V. The osmophobic effect: natural selection of a thermodynamic force in protein folding. J. Mol. Biol., 2001, 310, 955-963.

7. Yancey P.H., Clark M. E., Hand S.C., Bowlus R.D., Somero G.N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science, 1982, 217, 1214-1222.

8. Davis-Searles, P.R., Saunders, A.J., Erie, D.A., Winzor, D.J., and Pielak, G.J. Interpreting the effects of small uncharged solutes on protein-folding equilibria. Annu. Rev. Biophys.

Biomol. Struct., 2001, 30, 271-306.

9. Судаков С.Ю., Соловьева Г.А. Взаимодействие гликогенсинтазы скелетных мышц кроликас флавинмононуклеотидом. Биохимия, 1989, 54, 1478–1484.

10. Jacobsen M.P., Winzor D.J. Studies of ligand-mediated conformational changes in enzymes by difference sedimentation velocity in the Optima XL-A ultracentrifuge. Prog.

Colloid Polym. Sci., 1997, 107, 82-87.

11. Wills P.R., Winzor D.J. Thermodynamic analysis of “preferential solvation” in protein solutions Biopolymers, 1993, 33, 1627-1629.

12. Ogston AG, Winzor DJ. Treatment of thermodynamic nonideality in equilibrium studies of associating solutes. J. Phys. Chem. 1975, 79:2496– 13. Nichol LW, Jeffrey PD, Winzor DJ. 1976. Molecular covolumes of sphere and ellipsoid of revolution combinations. J. Phys. Chem., 80:648–649.

14. Johnson, L.N., Hajdu, J., Acharya, K.R., Stuart, D.I., McLaughlin, P.I., and Barford, D.

In:Allosteric Enzymes (Herve, G., ed.) Boca Raton: CRC Press. pp. 1989, 81-127.

15. Sanches-Ruiz J.M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry. Biophys. J., 1992, 61, 921-935.

16. Stafford W.F. Methods for obtaining sedimentation coefficient distributions. In: Analytical Ultracentrifugation in Theory and Experiment (Harding S.E., Rowe A.J., Horton J.C. eds), 1992, 359-393.

17. Minton A.P. Implication of macromolecular crowding for protein assembly. Curr. Opinion Struct. Biol., 2000, 10, 34-39.

18. Hall D., Minton A.P. Macromolecular Crowding: qualitative and semi-quantitative, quantitative challenges. Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1649, 127-139.

19. Brusharia RJ, Walsh D.A. Phosphorylase kinase: the complexity of its regulation is reflected in the complexity of its structure. Frontiers Biosci., 1999, 4, 618-641.

20. Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling. Biophys. J., 2000, 78, 1606-1619.

21. Oikonomakos NG, Acharya KR, Johnson LN. Rabbit muscle glycogen phosphorylase b.

The structural basis of activation and catalysis. In: Post-Translational Modifications of Proteins (Harding JJ, Crabbe MJC eds). CRC Press: Boca Raton, FL; 1992, pp. 81-151.

22. Chan K.F, Graves D.J. Rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase. Interactions between sub-units and influence of calmodulin on different complexes. J. Mol. Biol., 1982, 257:

5939-5947.

Shearwin KE, Winzor DJ. Effect of sucrose on the dimerization of -chymotrypsin:

23.

allowance for thermodynamic nonideality arising from the presence of a small insert solute. Biophys. Chem., 1988, 31, 287-294.

24. Cann J.R., Coombs R.O., Howlett G.R., Jacobsen M.P., Winzor, D.J. Effects of molecular crowding on protein self-association: a potential source of error in sedimentation coefficients obtained by zonal ultracentrifugation in a sucrose gradient. Biochemistry 1994, 33, 10185-10190.

25. Shtilerman M.D., Ding T.T., Lansbury P.T., Jr. Molecular crowding accelerates fibrillization of alpha-synuclein: could an increase in the cytoplasmic protein concentration induce Parkinson's disease? Biochemistry, 2002, 41, 3855-3860.

26. Martin J. Chaperonin function – effects of crowding and confinement. J. Mol. Recognition 2004, 425, 27-28.

27. Eggers D.K., Valentine, J.V. Molecular confinement influences protein structure and enhances thermal protein stability. Protein Science, 2001, 10, 250-261.

28. Eicke H.-F., and Rehak, J. Helv. Chim. Acta. 1976, 59. p. 2883-2891.

29. Levashov AV, Khmelnitsky YL, Klyachko NL, Chernyak VYa, Martinek K.

Ultracentrifugation of reversed micelles in organic solvent: new approach to determination of molecular weight and effective size of proteins. Anal Biochem. 1981, 118, 42-46.

30. Хмельницкий Ю.А., Левашов А.В., Клячко Н.Л., Черняк В.Я., Мартинек К.

Ферменты, включенные в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. Биохимия, 1982, 47, с. 86-99.

31. Kabanov AV, Klyachko NL, Nametkin SN, Merker S, Zaroza AV, Bunik VI, Ivanov MV, Levashov AV. Engineering of functional supramacromolecular complexes of proteins (enzymes) using reversed micelles as matrix microreactors. Protein Eng. 1991, 4, 1009Клячко П.Л., Пшежецкий А.В., Кабанов А.В., Вакула С.В., Мартинек К., Левашов А.В. Катализ ферментами в агрегатах поверхностно-активных веществ.

Оптимальная конструкция матрицы ПАВ. Биол. мембраны. 1990, 7, с. 467-472.

33. Johnson, L.N., Hajdu, J., Acharya, K.R., Stuart, D.I., McLaughlin, P.I., and Barford, D. In:

Allosteric Enzymes (Herve, G., ed.) Boca Raton: CRC Press. pp. 1989, 81-127.

34. Oikonomakos N.G. Glycogen phosphorylase as a molecular target for type 2 diabetes therapy. Curr Protein Pept Sci., 2002, 3, 561-586.

35. Barford D., Johnson L.N. The molecular mechanism for the tetrameric association of glycogen phosphorylase promoted by protein phosphorylation. Protein Sci. 1992, 1, 472

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзоры 1. Чеботарева Н.А. Курганов Б.И. Адсорбция ферментов структурными белками мышц. Успехи биологической химии, 1989, т. 30, с. 46-67.

2. Курганов Б.И., Клинов С.В., Чеботарева Н.А. Взаимодействие мышечной гликогенфосфорилазы с флавинами. Успехи биологической химии, 1994, т. 34, с.

3. Chebotareva N.A., Klinov S.V., Kurganov B.I. Regulation of muscle glycogen phosphorylase by physiological effectors. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 2001, v. 18, p. 265-297.

4. Ливанова Н.Б., Чеботарева Н.А., Еронина Т.Б., Курганов Б.И. Пиридоксаль-5’фосфат как каталитический и конформационный кофактор мышечной гликогенфосфорилазы b. Биохимия, 2002, т. 67, № 10, с. 1317-1327.

5. Чеботарева Н.А., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б. Биохимические эффекты молекулярного краудинга. Биохимия, 2004, т. 69, № 11, с. 1522-1536.

Статьи в рецензируемых журналах 6. Чеботарева Н.А., Курганов Б.И., Любарев А.Е., Давыдов Д.Р. Новый подход к изучению связывания специфического лиганда ассоциирующей ферментной гликогенфосфорилазой Б. Доклады АН СССР, 1990, т. 313, №1, с. 235-237.

7. Kurganov B.I., Tsetlin L.G., Chernov N.N., Chebotareva N.A., Yakovleva I.M., Veresotskaya, Rudakova I.P. Water-insoluble esters of dihydroriboflavin as inhibitors of enzyme reactions. Journal of Chemical and Biochemical Kinetics, 1991, v. 1, №1, p. 39Chebotareva NA, Kurganov BI, Lyubarev AE, Davydov DR, Pekel ND. Interaction of flavin mononucleotide with dimeric and tetrameric forms of muscle phosphorylase b.

Biochimie. 1991, v. 73, № 11, p. 1339-1343.

9. Еронина Т.Б., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б., Бушуева М.В., Чеботарева Н.А., Поглазов Б.Ф. Кинетика ассоциации мышечной гликогенфосфорилазы Б, индуцируемой аллостерическим активатором. Доклады АН СССР, 1991, т. 319. с.

10. Еронина Т.Б., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б., Чеботарева Н.А., Пекель Н.Д., Поглазов Б.Ф. Сравнительное изучение связывания флавинадениндинуклеотида мышечной гликогенфосфорилазой Б и белок-гликогеновыми частицами. Доклады АН СССР. 1992, т. 325. с. 167-170.

11. Eronina, T.B., Livanova, N.B., Teplova, M.V., Chebotareva, N.A., Kurganov, B.I. Selfassociation of muscle glycogen phosphorylase induced by the allosteric activator. Journal of Biochemical Organization, 1992, v.1, № 2, 160-163.

12. Kurganov, B.I., Schors, E.I., Livanova, N.B., Chebotareva, N.A., Eronina, T.B., Andreeva, I.E., Makeeva, V.P., Pekel, N.D. Effect of flavins on the rate of proteolytic digestion of muscle glycogen phosphorylase b. Biochimie, 1993, v. 75, № 6, p. 481-485.

13. Курганов Б.И., Щорс Е.И., Ливанова Н.Б., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А. Медленные конформационные переходы в мышечной гликогенфосфорилазе b, индуцируемые специфическими лигандами. Биохимия, 1994, т. 59, № 4, 559-665.

14. Еронина Т.Б., Ливанова Н.Б., Чеботарева Н.А., Курганов Б.И., Луо С., Грейвс Д.Дж.

пептидиларгининдезиминазой на аллостерические свойства фермента и димертетрамерные переходы. Молекулярная биология, 1994, т. 28, № 6, с. 1368-1380.

15. Чеботарева Н.А., Сугробова Н.П., Познанская А.А., Буланова Л.Н., Любарев гликогенфосфорилазы Б, реконструированной с пиридоксаль-5’-фосфатом и его аналогами, с флавинмононуклеотидом и гликогеном. Доклады РАН, 1994, т.

335, с. 255-257.

16. Kurganov, B.I., Klinov, S.V., Schors, E.I., Chebotareva, N.A. Slow step in activation of muscle glycogen phosphorylase b by adenosine 5'–monophosphate. Biochemistry and Molecular Biology International, 1995, v. 36, № 1, p. 155-161.

17. Курганов Б.И., Щорс Е.И., Чеботарева Н.А., Клинов С.В. Медленная активация мышечной гликогенфосфорилазы b при инкубации фермента с аденозин–5'монофосфатом. Биохимия, 1995, т. 60, № 1, 88-104.

18. Чеботарева Н.А., Сугробова Н.П., Буланова Л.Н., Познанская А.А., Курганов Б.И., Гунар В.И. Реконструкция мышечнои гликогенфосфорилазы b из апофермента и пиридоксаль-5'-фосфата и его аналогов. Взаимодействие апофосфорилазы и реконструированного фермента со специфическими лигандами. Биохимия, 1995, т.

60, № 12, с. 2030-2039.

19. Chebotareva, N.A., Sugrobova, N.P., Bulanova, L.N., Poznanskaya, A.A., Kurganov, B.I., Gunar, V.I. Interaction of muscle glycogen phosphorylase b reconstituted from apoenzyme and analogs of pyridoxal-5'-phosphate with specific ligands. Biochemistry and Molecular Biology International, 1996, v. 38, № 5, p. 1033-1040.

20. Eronina, T.B., Livanova, N.B., Chebotareva, N.A., Kurganov, B.I., Luo, S., Graves, D.J.

Deimination of glycogen phosphorylase b by peptidylarginine deiminase. Influence on the kinetic characteristics and dimer-tetramer transition. Biochimie, 1996, v. 78, p. 253-258.

21. Курганов Б.И., Мицкевич Л.Г., Федуркина Н.В., Чеботарева Н.А. Кинетика диссоциации неактивных тетрамеров мышечной гликогенфосфорилазы на активные димеры. Биохимия, 1996, т. 61, № 5, с. 901-907.

22. Бурлакова, А.А., Курганов Б.И., Чеботарева Н.А., Дебабов В.Г. Стабилизация олигомерных форм уридинфосфорилазы из Escherichia coli K 12 в гидратированных обращенных мицеллах поверхностноактивного вещества в органическом растворителе. Биологические мембраны, 1996, т. 13, № 5, с. 504-511.

23. Kurganov, B.I., Burlakova, A.A., Chebotareva, N.A., Debabov, V.G. Behavoir of uridine phosphorylase from Escherichia coli K-12 in hydrated reversed micelles of surfactant in organic solvent. Biochemistry and Molecular Biology International, 1997, v. 41, № 3, p.

547-554.

24. Корнилаев Б.А., Курганов Б.И., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Ливанова Н.Б., Орлов гликогенфосфорилазы b. Молекулярная биология, 1997, т. 31, № 1, с. 98-107.

25. Chebotareva, N.A., Lyubarev, A.E., Kurganov, B.I. Study of self-association of muscle glycogen phosphorylase b by sedimentation equilibrium method. Biochem. Soc. Trans., 1998, v. 26, № 4, p. 766-769.

26. Чеботарева Н.А., Любарев А.Е., Курганов Б.И., Калмыков П.В., Магретова Н.Н., Черняк В.Я., Поглазов Б.Ф. Изучение ассоциации мышечной гликогенфосфорилазы b методами равновесной седиментации. Доклады РАН, 1998, т. 358, № 4, с. 552-554.

27. Andreeva I.E., Makeeva V.F., Kurganov B.I., Chebotareva N.A., Livanova N.B. A tentative mechanism of the ternary complex formation between phosphorylase kinase, glycogen phosphorylase b and glycogen. FEBS Lett. 1999, v. 445, № 1, p. 173-176.

28. Андреева И.Е., Макеева В.Ф., Курганов Б.И., Чеботарева Н.А., Ливанова Н.Б.

Кинетика взаимодействия киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика с гликогеном. Биохимия, 1999, т. 64, № 2, с. 159-68.

29. Kurganov B.I., Chebotareva N.A. Sedimentation analysis of muscle glycogen phosphorylase b entrapped in hydrated reversed micelles of aerosol OT in octane.

Biochemistry and Molecular Biology International, 1999, v. 47, № 2, p. 319-26.

30. Chebotareva N.A., Kurganov B.I., Burlakova A.A. Sedimentation velocity analysis of oligomeric enzymes in hydrated reversed micelles of surfactants in organic solvents.

Progr. Colloid Polym. Sci. 1999, v. 113, p. 129-134.

гликогенфосфорилазы b в системе обращенных мицелл аэрозоля от в октане.

Биологические мембраны, 2000, т. 14, № 1, с. 67-73.