ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ»

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах

рукописи

Кузнецов Алексей Витальевич

Изучение возможности совершенствования методики перекрёстной сшивки коллагена роговицы (клинико-экспериментальное исследование).

14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель:

доктор медицинских наук И.А. Бубнова Москва -

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение ГЛАВА 1. Обзор литературы 1.1. Современные представления о «перекрестном сшивании» (кросс- линкинг) коллагена роговицы 1.2. Клиническое применение «кросс-линкинга» ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 2.1. Характеристика клинического материала работы 2.2. Характеристика экспериментального материала работы 2.3. Офтальмологические методы обследования 2.4. Специальные методы исследования 2.5. Гистологические методы исследований 2.5.1. Трансмиссионная электронная микроскопия 2.6. Статистические методы обработки результатов 2.7. Условия проведения процедуры формирования «сшивок» коллагена роговицы 2.7.1. Условия проведения ФДТ в клинике 2.7.2. Условия проведения ФДТ в эксперименте 2.7.3. Характеристика фотосенсибилизатора «Водный раствор рибофлавина 0,1%»

2.7.4. Характеристика фотосенсибилизатора «Раствор рибофлавина на декстране 0,1%»

2.7.5. Теоретическое обоснование применения препарата фталоцианинового ряда «Фотосенс» в качестве фотосенсибилизтора при проведении процедуры «кросс-линкинг»

2.7.6. Характеристика фотосенсибилизатора «Фотосенс» ГЛАВА 3.1. Клинические результаты проведения процедуры «кросс-линкинг».

ГЛАВА 4.1. Изучение морфологической картины изменения роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами.

ГЛАВА 5.1. Оценка прижизненных морфологических изменений роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с помощью метода конфокальной микроскопии.

ГЛАВА 6.1. Оценка оптической плотности роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами ГЛАВА 7.1. Исследование биомеханических свойств роговицы кролика после проведения процедуры «кросс-линкинг» с применением различных фотосенсибилизаторов.

Заключение UVA - ультрафиолетовый свет А-спектра ФС - фотосенсибилизатор УФ - ультрафиолетовый свет ЖКЛ - жесткие контактные линзы ФДТ - фотодиамическая терапия ВГД - внутриглазное давление ФРС - фактор резистентности роговицы КГ - корнеальный гистерезис Дптр - диоптрий Мкм - микрометр Мм - милиметр Р-р - раствор

ВВЕДЕНИЕ

кератоконуса, так и осложнением оперативного вмешательства. Значимость проблемы лечения эктатических заболеваний роговицы в настоящее время возросла, так как наблюдается тенденция к увеличению этого вида глазной патологии. Возможно, это связано как с улучшением диагностического оборудования, так и с увеличением количества рефракционных операций, ухудшением экологической обстановки в целом, повышением радиационного фона в отдельных регионах и аллергизацией населения.

На сегодняшний день не существует единой точки зрения в отношении лечения эктатических состояний роговицы. С каждым годом появляются новые подходы к тактике ведения данной группы пациентов, которые предполагают использование контактных линз, применение различных хирургических методик (имплантация интрастромальных роговичных сегментов, послойная или сквозная пересадка роговицы) (Мамиконян В.Р.

2011, Калинников Ю.Ю., 2008, Tan B.U., 2006, Miranda D., 2003).

В последние годы, в процессе инновационных разработок в области биофизики, биохимии и медицины, появился новый метод лечения эктатических заболеваний роговицы, в основе которого лежит фотодинамический эффект, приводящий к «перекрестной сшивке» - кросслинкингу (сross-linking) коллагена и «уплотнению» или увеличению прочности роговицы.

кератоконуса были Wollensak G., Spoerl Е. и Seiler в 1990 году. В отличие от хирургических подходов, метод не требует дорогостоящих лазерных установок и прост в исполнении.

Для фотодинамического поперечного сшивания коллагена, в качестве фотосенсибилизатора, было предложено использовать рибофлавин (витамин В2), активирование которого происходит с помощью ультрафиолетового излучения в диапазоне длинн волн спектра А. Выбор был обусловлен нетоксичностью рибофлавина для роговичной ткани, доступностью препарата и сохранением прозрачности при нанесении на роговицу. Однако для формирования «сшивок» необходимо достаточно длительное излучение в УФ - диапазоне, которое не безразлично для состояния эндотелия.

Метод «кросс-линкинга» предполагает возникновение продуктов фотодинамической реакции во всем объеме той области роговицы, которая подвергается экспозиции возбуждающим излучением. Инстилляции рибофлавина, в классическом варианте процедуры, служат не только для фотохимического обеспечения реакции перекрестного сшивания коллагена, но и для создания своеобразного барьера, ограничивающего травмирующее воздействие на эндотелий. При прохождении УФ излучения через толщину стромы, по мере расходования квантов на фотодинамическую реакцию и на переизлучение рибофлавином, плотность возбуждающего излучения уменьшается. Правильный подбор спектральных характеристик и мощности фототоксического поражения эндотелия роговицы. При этом некоторыми авторами (Goldich Y., Terai N.) отмечается недостаточная эффективность процедуры. При её теоретической обоснованности (Rabinowitz Y.S.), клинический эффект не всегда достаточно хорошо выражен.

Очевидно, что если бы фотодинамическая реакция проходила не равномерно во всем объеме роговицы, а избирательно, в непосредственном окружении каждой молекулы структурного белка, то удалось бы избежать травмирующего воздействия при более высокой плотности возбуждающего излучения.

Поэтому необходимо детальное изучение структурных изменений роговицы, параметров проведения процедуры, а также поиск способов уменьшения воздействия УФ - излучения и «протекции» эндотелия. Также интересен и поиск новых фотосенсибилизаторов, способных формировать «сшивки» коллагена различной степени выраженности.

Таким образом, остается актуальным вопрос появления новых фотосенсибилизаторов, изучение возможного влияния процедуры «кросслинкинг» на различные структуры глаза и изменений физических свойств роговицы после её проведения.

Целью настоящей работы явилось провести клиническую оценку традиционной методики «кросс-линкинг» при кератоконусе и экспериментально апробировать возможность применения другого фотосенсибилизатора.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие Задачи:

Изучить эффективность применения процедуры «кросс-линкинг», проводимой согласно стандартному протоколу, у пациентов с прогрессирующим кератоконусом.

Определить и теоретически обосновать возможность применения нового фотосенсибилизатора для проведения процедуры «кросс-линкинг».

Изучить в эксперименте морфологическую картину изменения роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами.

Выявить прижизненные изменения роговицы при помощи фотосенсибилизаторов у экспериментальных животных.

экспериментального животного после проведения процедуры «кросслинкинг» с различными фотосенсибилизаторами.

Исследовать изменения биомеханических свойств глаза после фотосенсибилизаторами в эксперименте.

Впервые теоретически обоснована и показана в эксперименте возможность использования фотосенсибилизатора фталоцианинового ряда как субстрата для проведения процедуры «кросс-линкинг» роговицы.

Впервые в эксперименте на основе данных денситометрии, конфокальной микроскопии, морфологических и биомеханических исследований изучено состояние роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с использованием фотосенсибилизатора фталоцианинового ряда.

Фотосенсибилизатор фталоцианинового ряда «Фотосенс» может быть использован для проведения процедуры «кросс-линкинг» в эксперименте.

Использование в качестве фотосенсибилизатора препаратов из группы фталоцианинов, на ранних сроках, приводит к снижению плотности кератоцитов в верхних и средних слоях стромы, и как следствие к реактивному повышению пролиферативной активности кератоцитов и более компактному расположению стромальных пластин на поздних сроках.

Теоретически обоснована и экспериментально апробирована возможность проведения процедуры «кросс-линкинга» с препаратом фталоцианинового ряда «Фотосенс» для лечения эктатических заболеваний глаз.

Доказана эффективность фотодинамического воздействия с препаратами на основе рибофлавина и фталоцианинов на коллаген роговицы в эксперименте.

Результаты работы доложены и обсуждены на IX съезде офтальмологов России (Москва, 2010); на научно-практических конференциях «Роль и место фармакотерапии в современной офтальмологической практике» (СанктПетербург, 2009); «Актуальные проблемы офтальмологии» (МНТК имени Фёдорова, Москва, 2009); «7th International symposium. Photodynamic therapy and photo diagnosis in clinical practice» (Italy, Brixen, 2008); «13th Congress of the European society for photobiology conjunction with the 2nd Conference of the European Platform for Photodynamic Medicine» (Poland, Wroclaw, 2009); «12th World Congress of the International Photodynamic Association» (USA, Seattle, 2009); «The International Symposium on Ocular Pharmacology and Therapeutics»

(Austria, Vienna, 2011).

Полученные результаты исследования внедрены и применяются в работе ФГБУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»

РАМН.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 – в журналах, входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий, определённых ВАК. Получен 1 патент РФ на изобретение: «Способ лечения кератоконуса» №2388436 от 10.05.2010.

1.1. Современные представления о «перекрестном сшивании»

(кросс-линкинг) коллагена роговицы В последние годы, в процессе инновационных разработок в области биофизики, биохимии и медицины, появился новый метод лечения эктатических заболеваний роговицы, в основе которого лежит фотодинамический эффект, приводящий к «перекрестной сшивке» - кросслинкингу (сross-linking) коллагена и «уплотнению» или увеличению прочности роговицы.

фармакологического факультета Мюнхенского университета Оскаром Раабом. Первое сообщение об этом явлении сделал профессор Н. Таррiner в 1904 г. Он же официально ввел термин «фотодинамическое действие» для обозначения реакций фотосинтеза в биологии [149]. Суть открытия заключалась в обнаружении у клеток свойства селективно накапливать и удерживать некоторые окрашенные вещества, как находящиеся в организме носителя (эндогенные фотосенсибилизаторы), так и поступающие в него сенсибилизированной ткани лазерным или нелазерным источником света с длиной волны, соответствующей спектру поглощения ФС, в ней происходят следующие процессы: молекула ФС, поглотив квант излучения, переходит в возбужденное триплетное состояние и затем вступает в фотохимические реакции [154]. Для реализации фотодинамического эффекта необходимо сочетание фотохимиотерапевтического и физического методов воздействия.

Отдельно взятые фотосенсибилизатор или низкоэнергетическое лазерное облучение практически не приводят к необходимому эффекту [113]. ФДТ на нынешнем этапе способ лечения с помощью химиотерапевтического агента (ФС), инициирующийся благодаря облучению патологического очага светом, длина волны которого соответствует пику поглощения данного ФС. Свет необходим для реализации фотохимического и/или цитотоксического потенциала ФС. При этом ФС представляет собой лекарственный препарат, обладающий тропизмом к быстро размножающимся клеткам. Таким образом, ФДТ даже не двухкомпонентный, а скорее трехкомпонентный метод лечения, где два компонента – ФС и свет являются экзогенными внешними факторами, а третьим обязательным компонентом фотодинамической реакции является эндогенный фактор – кислород [117; 144].

Свет в ФДТ выполняет функции точной доставки адресату – патологическому очагу – источника энергии фотобиохимической реакции, приводящей к образованию в нем цитотоксических агентов (активных форм кислорода). Кроме этого, при химиотерапии с использованием фотоактивируемых лекарственных агентов свет обеспечивает высвобождение лекарственного препарата, переводя его в биологически активную форму [74].

Для понимания механизмов «кросс-линкинга» рассмотрим также строение основного субстрата – стромы роговицы.

расположенными пластинками из коллагеновых фибрилл и составляет приблизительно 90% толщины роговицы. Передние отделы стромы содержат более тонкие и «рыхло» расположенные пластины, задняя строма более компактна и структурна. [92; 102; 114] Количество клеток в строме невелико, кератоциты рассеяны главным образом между пластинами. Нервные волокна и связанные с ними шванновские клетки располагаются в передней и средней третях стромы. Коллаген составляет примерно 71% сухого веса обеспечивающей основные функции роговицы: оптическую прозрачность и механическую устойчивость. [53; 64; 73; 77; 93; 103] Молекула коллагена имеет молекулярную массу около 300 тысяч, длину 300 нм и толщину 1,5 нм. Стержневидная структура состоит из трех а-цепей, формирующих правозакрученную тройную спираль таким образом, что один виток спирали a-цепи содержит три аминокислотных остатка. Три a-цепи в свою очередь объединяются в структуру, слегка закрученную в правую спираль. Каждая a-цепь характеризуется высоким содержанием глицина, низким содержанием серосодержащих аминокислот и отсутствием триптофана. Коллаген - один из немногих животных белков, содержащих остатки 3- и 4-гидроксипролина (НО—Pro), а также 5-гидроксилизина (НО— Lys); на них приходится около 21% от всех аминокислотных остатков.

Уникальная особенность коллагена многократно повторяющаяся спирализации a-цепей. Таким образом, коллаген это гликопротеин в зависимости от источника, содержащий на 1000 аминокислотных остатков от 2 до 80 углеводных остатков (в основном в виде моно- или дисахаридов), связанных О-гликозидной связью с НО-группой НО—Lys. Моносахариды представлены D-галактозой, которая связана с остатком аминокислоты bгликозидной связью. В дисахаридах D-глюкоза связана a-1:2 - связью с Dгалактозой. Стабилизация молекулы коллагена осуществляется благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям, а также водородными и ковалентными поперечными связями между a-цепями. Водородные связи образованы карбонильной группой и группами NH пептидной связи или НО группой НО—Pro; возможны также связи с участием Н2О. Ковалентные связи между a-цепями (естественные сшивки) образуются в результате альдольной конденсации остатков 2-амино-6-оксогексановой или 2-амино-5гидрокси-6-оксогексановой кислоты, которые образуются из остатков лизина или 5-гидроксилизина. Сшивки a-цепей соседних молекул коллагена осуществляются в результате образования альдиминов путем взаимодействия остатков 6-оксогексановых кислот с группой NH2 лизина или 5гидроксилизина. В коллагене обнаружены поперечные естественные сшивки, связывающие 3 или 4 a-цепи соседних молекул. [60; 66; 72; 96] В организме естественный предшественник коллагена – проколлаген синтезируется в основном в фибробластах, хондроцитах и других клетках параллельных пучков по типу «голова к хвосту». В параллельных рядах молекулы тропоколлагена сдвинуты относительно друг друга ступенчатым образом на одно и то же расстояние (64 нм). Этим объясняются характерные для фибрилл поперечные естественные сшивки, которые повторяются с таким же периодом.[66; 72; 78; 112] образовывать упорядоченные надмолекулярные агрегаты фибриллы (волокна), которые выполняют главные опорно-механические функции в различных типах соединительной ткани. Являясь одним из основных компонентов межклеточного матрикса и образуя комплексы с его компонентами (протеогликанами и др.), коллаген участвует в межклеточном взаимодействии, оказывает влияние на подвижность клеток, морфогенез (формообразование) органов и тканей в процессе развития и роста организма.

По мере старения организма естественных поперечных сшивок в волокнах становится все больше, что приводит к увеличению хрупкости хрящей и сухожилий, делает более ломкими кости, понижает прозрачность хрусталика глаз. [32; 33; 39; 84; 107; 128] Нарушение структуры и функции коллагена - ключевое звено ряда заболеваний, таких как синдром Морфана, синдром Элерса-Данлоса и кератоконус.

Для того чтобы понять, как упорядоченная пластинчатая структура кератоконусе, необходимо проанализировать строение роговицы в норме.

[122] В задних двух третях роговицы человека пластины коллагена непрерывно идут от лимба к лимбу и имеют передне-заднее сплетение. [133] Пластины коллагеновых волокон передней стромы имеют преимущественно меридиональную структуру. В передней строме имеется обширное переднеезаднее сплетение, и часть пластин входят в лимб в области Боуменовой мембраны. Как считают исследователи, такая компоновка необходима для сохранения формы роговицы. [129; 135] При изучении электронной микроскопии роговицы в норме были выявлены частые случаи когда пластины коллагена расщеплялись на две более узкие и впоследствии соединялись с пластинами, идущими в другом направлении. [121; 124] Точки, в которых пластины разделяются, потенциально слабы, и для сохранения единства скреплены межволокнистыми связями. Кератоциты могут играть роль в стабилизации смежных пластин. Большинство кератоцитов лежат между пластинами коллагена и взаимодействуют друг с другом при помощи длительных процессов с коллагеном по обеим их сторонам. [130; 132] Различия в компонентах поверхности кератоцита, клеточной морфологии и клеточного матрикса взаимосвязаны при кератоконусе. [115; 136] Если «межволоконный клей» ослабляется, то пластины (связки коллагеновых волокон) имеют потенциал разрываться на части, и в случае превышения определённой силы напряжения образуются трещины на краях коллагенового волокна, которые могут распространяться и превращаться в разрыв, что приводит к локальному смещению пластин коллагена. Чаще всего это затрагивает центральную зону и нижние слои стромы роговицы (основная зона формирования конуса), так как именно в этой зоне в здоровой роговице межпластинчатая связь между волокнами минимальна. [126; 127; 129] Кератоконус – это не воспалительное, дистрофическое, двустороннее, прогрессирующее заболевание роговицы, которое характеризуется асимметричным истончением и конусовидным выпячиванием роговой оболочки, появлением неправильного астигматизма и, как следствие, значительным снижением зрения. [4; 26; 29; 40; 42; 48] По мере его прогрессирования возможно развитие острого кератоконуса, возникшего вследствие разрыва десцеметовой оболочки и пропитывания стромы роговицы влагой передней камеры. [82; 116] Этиология кератоконуса до сих пор окончательно неясна, и это во многом затрудняет возможности его патогенетического лечения. [26; 134] Предложены эндокринная, наследственная, обменная, иммунологическая, иммуногенетическая, аллергическая, экологическая и даже вирусная теории возникновения кератоконуса, а большинство исследователей склоняется к многофакторной теории, учитывающей всё перечисленное. [16; 22; 35; 43;

61] Заболевание возникает, чаще всего, в подростковом или молодом быстропрогрессирующим снижением остроты зрения, приводя, таким образом, к инвалидизации больных в трудоспособном возрасте [26; 61; 62].

сегодняшний день не существует. В современной литературе представлены разнообразные методы лечения заболевания.

Жесткие контактные линзы (ЖКЛ) ЖКЛ нельзя назвать методом лечения кератоконуса, более правильно кератоконусом удовлетворительной остроты зрения. ЖКЛ имеют сферическую форму, что позволяет «прижать» образовавшийся «конус» и, таким образом, искусственно воссоздать сферическую поверхность. ЖКЛ являются наиболее эффективным средством коррекции оптических нарушений обеспечивающим максимально возможный функциональный результат [2; 11]. Специальные сравнительные исследования показали, что острота зрения при применении контактной коррекции при I – III стадиях кератоконуса существенно выше по сравнению с данными, полученными после сквозной кератопластики. Аналогичная закономерность отмечена и при сравнительном изучении контрастной чувствительности на средних и высоких частотах. [2; 12; 14;]. Но использование этих линз не останавливает прогрессирование кератоконуса, кроме того, переносится далеко не всеми пациентами [6; 13].

К сожалению, при кератоконусе, в отличие от миопии и астигматизма, подобрать очки, удовлетворяющие пациента и дающие приемлемую остроту зрения, не удается. МКЛ облегают роговицу, повторяя ее конусовидную форму, что, понятно, также не дает улучшения остроты зрения [10; 90].

Эксимер-лазерная хирургия раннего кератоконуса Метод эксимер-лазерной хирургии раннего кератоконуса включает фототерапевтической кератэктомии (ФТК). Для проведения хирургии используется эксимерный лазер ЕС-5000 фирмы NIDEK. Диаметр ФРК составляет 6,0 мм. ФТК проводится с зоной абляции 8,0 мм. Зону абляции ФТК смещают в направлении места наибольшей эктазии - вершины конуса, топографию и локализацию вершины предварительно определяют с помощью компьютерной топографии. [22; 23; 25] Эксимер-лазерное воздействие на патологически измененные передние слои роговицы оказывает терапевтический эффект, стимулируя регенераторные процессы, в результате чего происходит формирование фиброцелюлярной мембраны, которая повышает биомеханические свойства роговицы и предотвращает прогрессирование кератоконуса. [3; 27; 28; 31] Однако данный метод послеоперационные осложнения.

Методика имплантации интрастромальных роговичных сегментов.

Интрастромальные роговичные кольца (сегменты) (Ferrara poly, Intacs) применяют с целью коррекции аметропий, а также для предотвращения прогрессирования при начальных стадиях кератоконуса [99]. В последние годы они стали достаточно активно использоваться хирургами в лечении при II – III стадиях заболевания. [18; 36; 49; 50] В последнее десятилетие были разработаны различные модели интрастромальных роговичных колец (сегментов) и предложены иные кроме полиметилметакрилата материалы для их изготовления. Внедрены в клиническую практику разнообразные методики их имплпнтации и способы расчёта рефракционного результата. [7;

19; 20; 21; 36; 38; 50; 83] Введение сегментов в толщу роговицы на средней периферии в зоне 5 – 7 мм приводит к изменению кривизны в центре, что обусловливает рефракционный эффект данного метода. [67; 76]. Из осложнений, которые могут возникнуть при применении интрастромальных роговичных колец, возможна гипокоррекция, когда при имплантации сегментов кривизна роговицы остаётся асимметричной и гиперкоррекция, когда роговица становится слишком плоской [55; 67; 68]. Помимо этого, спорным остается вопрос об остановке прогрессирования кератоконуса.

Сквозная или послойная пересадка роговицы - сквозная кератопластика (СКП) Самый радикальный способ лечения этого заболевания - пересадка роговицы. Операция проводится на последних - третьей или четвертой стадии, при этом приживление очень хорошее - примерно у 96 % пациентов удается обеспечить прозрачное приживление трансплантата и высокую послеоперационную остроту зрения. Оптическим недостатком СКП является послеоперационный роговичный астигматизм, нередко с косыми осями, который наблюдается уже в раннем послеоперационном периоде и достигает 3,0 - 6,0 диоптрий [1; 5; 9; 17; 24; 59]. Высокие значения роговичного астигматизма снижают функциональный результат сквозной кератопластики, и больные вынуждены вновь прибегать к контактной коррекции. Для уменьшения степени послеоперационной миопии и астигматизма в результате проведения сквозной кератопластики при кератоконусе, разработаны различные модификации данного хирургического вмешательства. [15; 37; 45; 52; 85] Ю.Б. Слонимским предложено использовать для трансплантации диск донорской роговицы меньшего диаметра по сравнению с диаметром иссеченной роговицы реципиента [44;

46; 47].

Всё более широкое применение в хирургии прогрессирующего кератоконуса, на стадиях ещё сохранной десцеметовой мембраны и эндотелиального слоя, находит передняя глубокая послойная кератопластика [56; 57; 65; 159]. Основным принципом глубокой послойной кератопластики является отслоение и сохранение чистой десцеметовой мембраны реципиента в качестве дна ложа для трансплантации. Это позволяет получить идеально гладкий интерфейс прилегающих поверхностей трансплантата и ложа, существенно повышая функциональные результаты послойной кератопластики. Данный принцип кератопластики был впервые реализован на практике М.М. Красновым и В.Р. Мамиконяном с соавторами [30].

Разработанный авторами метод заключается в использовании специального бора с алмазным напылением для стачивания глубоких слоев стромы. При этом формируется доступ к десцеметовой мембране, через который окружающий слой стромы механически отслаивают от десцеметовой мембраны шпателем и заменяют её донорским диском роговицы в полную толщину стромы. Операция была названа авторами полной стромопластикой (ПС) роговицы. Однако предложенная методика применялась авторами не при кератоконусе, а при язвах и стромальных помутнениях роговицы [30].

В последние годы В.Р. Мамиконяном с соавторами была разработана и апробирована в клинике новая модификация полной стромопластики роговицы. Основным достоинством данной модификации является то, что не требуется подбора донорского материала столь же высокого качества, как для сквозной кератопластики. При помощи стоматологического бора с напыпыленной мелкой алмазной крошкой, формируется доступ к десцеметовой мембране. После чего в сформированный карман имплантируется эллипсовидная пластина из метилметакрилата, выполняющая роль герметизирующей разрез «крышки». В область разреза под пластину, нагнетается окрашенный вискоматериал, под его давлением происходит отслоение десцеметовой мембраны. Традиционным способом удаляется вся толщина стромы, отделённая от десцеметовой мембраны, и в сформированное ложе помещается аллотрансплантат с предварительно удалённой десцеметовой мембраной, фиксирующийся обвивным непрерывным швом. Результаты экспериментально-клинического исследования показали, что данный способ может быть успешно реализован в клинических условиях. [34] Использование вышеперечисленных методов хирургического лечения кератоконуса позволяет получить высокие функциональные результаты только в начальной стадии заболевания, однако не решает проблему прогрессирования патологического процесса, что в конечном итоге требует принятия более радикальных мер.

Первые шаги поиска новых подходов к лечению эктазий роговицы начались в 1990-х, с попыток идентифицировать биологические клеи, которые активизировались при помощи высокой температуры или света, в результате приводящие к увеличению сопротивления коллагена стромы роговицы. (Caporossi et. al. Corneal Cross-linking, 2005) Было установлено, что в основе склеивания лежит фотодинамический эффект. Подобный механизм склерозирования и утолщения коллагеновых волокон был обнаружен в процессе состаривания роговицы и связан с активным гликозилированием тропоколлагеновых молекул, появляющихся в процессе старения организма.

Интересен и тот факт, что у молодых пациентов, больных диабетом, кератоконус не развивается из-за естественного эффекта «сшивки» глюкозы, которая увеличивала резистентность роговицы. Идея использовать этот подход для лечения кератоконуса была предложена в 1990 г. группой исследователей в Дрезденском техническом университете. [65; 81; 91] Биомеханические свойства роговицы зависят от особенностей коллагеновых волокон, межфибрилярных связей и их пространственноструктурного расположения. Функциональный цикл коллагена составляет приблизительно 2-3 года. «Сшивка» тормозит метаболические процессы в коллагене стромы, тем самым увеличивая биомеханическую стабильность роговицы. [54; 121; 137] Таким образом, в клиническую практику был внесен новый способ лечения, в основе которого лежит крос-линкинг (сшивка). Термин, использующийся в химии и биоинженерии для обозначения химикофизического воздействия на ткани, в результате которого происходит «уплотнение» или увеличение прочности структурных элементов данной ткани.

Для фотохимического поперечного сшивания коллагена, в качестве фотосенсибилизатора, было предложено использовать рибофлавин (витамин В2), активирование которого происходит с помощью ультрафиолетового излучения в диапазоне длин волн спектра А. Выбор был обусловлен нетоксичностью рибофлавина для роговичной ткани, доступностью препарата и сохранением прозрачности при нанесении на роговицу.

Рибофлавин обладает двумя пиками абсорбции для ультрафиолетового излучения - 370 нм и 430 нм. Однако воздействие на длинные волны 370 нм приводит к большему энергетическому эффекту, поскольку поглощается свыше 95% излучения. Параметры поглощения крайне важны с точки зрения предотвращения негативного воздействия ультрафиолетового излучения за пределами роговицы, в частности повреждения им глубжележащих структур глаза – хрусталика и сетчатки. [41] представлены в работах Kato, Uchida и Kawakishi. Исследователи показали, что биохимический эффект достигается с помощью специально смоделированного и дозированного ультрафиолетового света (А спектра).

Под его воздействием происходит фотохимическая реакция ионизации и распад молекул рибофлавина с выделением свободного атомарного кислорода. Азид натрия или 1.4-diazabicyclo (2,2,2) октан связывается со свободным атомарным кислородом, данная реакция сопровождается потерей тирозина и остатков гистидина в коллагене. Также под воздействием образованных свободных радикалов кислорода происходит перекрестное связывание в молекулах коллагена в единую трехмерную сеть, охватывающую практически всю строму роговицы. Сенсибилизированный рибофлавин ведёт к формированию дитирозина, который изменяет структуру тирозина, что приводит к формированию поперечных сшивок коллагена. При этом уплотняется ткань роговицы. [89; 152] Комбинированное действие ультрафиолетового излучения А спектра и рибофлавина.

1. Рибофлавин (витамин В2).

Наиболее подробно механизм коллагеновых сшивок в тканях роговицы описал в своих работах Wollensak G.

Биофизические аспекты кросс-линкинга освящены в работах Wollensak, Spoerl, Seiler. В экспериментальной работе на свиных глазах и донорской роговице человека, обработанных 0,1% рибофлавином и облученных ультрафиолетом А, доказано увеличение жёсткости на 328.9 % препаратов человеческой роговицы, и на 71.9 % препаратов роговицы свиней. [155] Грегором Волензаком (Gregor Wollensak) для определения термомеханических процессов, происходящих в роговице после облучения её ультрафиолетом А спектра с длиной волны 370 нм в комбинации с рибофлавином 0,1% на свиных глазах, был проведён следующий опыт. Из роговицы были вырезаны 30 пластинок размером 10х5мм. 10 из них были облучены ультрафиолетовым излучением с длиной волны 370 нм, плотностью обучения 3 мВт/см2 в течение 30 минут, после этого в образцах ткани отсепаровывали переднюю (группа 1а) и заднюю (группа 1б) строму.

Во второй группе пластинки роговицы подвергли химической «сшивке»

(кросс-линкинг) с использованием в качестве фотосенсибилизатора 0,1% глютаральдегида. Контрольная 3-я группа не подвергалась какому-либо воздействию. Все пластинки были помещены в воду и нагревались от 60 до 90 °C, причем температура поднималась на 1 градус каждую минуту. Для определения сморщивания каждые 20 секунд определяли длину пластинок, используя микрометр «Feinmesszeugfabrik Suhl». Характер сморщивания в разных группах оказался следующим: В группе 1а сморщивание началось при 67.5 °C и оказалось максимальным при 75.0 ± 1.2 °C. В группе 1б сморщивание началось при 63 °C и было максимальным при 71.2 ± 0.8 °C.

Во 2-й группе сморщивание началось при 77.5 °C и было максимальным при 89.7 ± 1.7 °C. В 3-й группе сморщивание началось при 62.5 °C и было максимальным при 70.3 ± 0.9 °C. После термической обработки препараты, подвергшиеся кросс-линкингу, приняли «грибовидную» форму при температуре 70 °C. А препараты передней и задней части стромы приняли цилиндрическую форму при температуре 75 °C. В процессе термической обработки строма потеряла свою прозрачность, а максимальное сморщивание привело к увеличению толщины верхних слоёв.

Гистологическое исследование препаратов «грибовидной» формы показало чёткое различие между сморщенной, передней частью роговицы, в которой произошел кросс-линкинг с сохранением двойного лучепреломления волокон коллагена и задней, сморщенной частью с гомогенезированными денатурированными волокнами коллагена и потерей их двунаправленности.

Тепловое сморщивание коллагена было вызвано денатурацией и раскручиванием тройной спирали, в связи с чем и происходит потеря двунаправленности волокон коллагена. При нагревании волокон до критической температуры коллагеновые волокна переходят из состояния высокоорганизованных, частично-кристалических (полупрозрачных) в состояние расплавленного геля с беспорядочно расположенными геалинизацией, в процессе которого происходит разрыв ковалентных связей между молекулами коллагена. Степень сморщивания также зависит от типа коллагена и содержания в нём гидроксипролина и пролина, являющегося относительно низким для коллагена роговицы I типа. [69; 146] ультрафиолетового излучения при прохождении через роговицу, т.к. большая его часть поглощается фотосенсибилизатором (рибофлавином). Меньший эффект «сшивки» коллагена в задних слоях стромы роговицы выгоден с точки зрения клинического использования, поскольку эндотелий должен быть защищён от ультрафиолетового излучения. Задняя часть стромы роговицы более важна для обеспечения оптических свойств роговицы.

Таким образом, проведенное исследование наглядно продемонстрировало наличие «сшивки» коллагена в задних слоях роговицы. Ограничение «сшивок» в задних слоях стромы и эндотелии оказалось клинически благоприятным, т.к повышение жёсткости происходит в передних слоях роговицы, которые являются наиболее важными для стабилизации эктатических поражений. [120; 123; 138; 146] Подробное изучение биомеханических изменений после проведения кросс-линкинга роговицы в эксперименте провели Gregor Wollensak, Eberhard Spoerl, Theo Seiler. На донорской роговице человека и свиньи проведено сравнительное исследование изменения биомеханических параметров после проведения кросс-линкинга.

В первой группе роговицу человека разрезали на 2 равные полосы, мм шириной, 14 мм длиной, включая по 1 мм склеры с обеих сторон, толщина роговицы была 550 нм. Во второй группе из каждого диска роговицы свиньи были вырезаны полоски толщиной 5 мм, 14 мм длинной, включая по 1 мм склеры с обеих сторон, толщина роговицы 850 нм. В двух группах после механического удаления эпителия 10 препаратов были обработаны следующим образом: с интервалом в 5 минут на роговицу инстиллировали раствор фотосенсибилизатора (10 мг Рибофлавина-5фосфата, разведённого в 10 мл 20% декстрана-T-500). Остальные, контрольные, образцы были подвергнуты обработке 20% раствором декстрана. После этого все образцы облучали при помощи специально смоделировано двойного диода ультрафиолетовым светом А спектра с длиной волны 370 нм и плотностью излучения 3 mW/cm2 в течение минут на расстоянии 1 см (что было эквивалентно световой дозе 5.4 J/cm2).

Экспоненциальные параметры облучения были такими же, какие используют в клинике для остановки процесса прогрессирования кератоконуса. [156] После этого роговичные полосы были закреплены в контролируемом микрокомпьютером тестере при помощи зажимов в горизонтальной плоскости на расстоянии 8 мм. Для учёта диапазона физиологической нагрузки, была выставлена начальная нагрузка в 5х10 Pa (1 Pa =1 N/m), изза разницы в толщине для человеческой роговицы требовалась сила 10 mN и 20 mN – для роговицы свиньи. Нагрузку увеличивали линейно с частотой вращения 1.5 mm min. Нагрузка выросла до 2х105 Pa. Значение нагрузкирастяжения было установлено по экспоненциальной функции =А ехр (В х ) при помощи статистической программы SPSS (SPSS GmbH Software, Munich). Модуль Юнга (Е) был подсчитан для 4 %, 6 % и 8 % растяжения как градиент графика нагрузки-растяжения (Е=d/d = А х В ехр (В х ).

Сравнили показатели нагрузки необходимые для растяжения на 4 %, 6 % и % обработанных и необработанных полос (отдельно человеческих и свиных глаз).

На рис. 1 приведены графики нагрузки-растяжения. На графиках показано типичное экспоненциальное повышение биовискоэластичной плотности.

Рис. 1. А: Изменения нагрузки-растяжения обработанных и не обработанных препаратов роговицы человека. Б: Изменения нагрузки-растяжения обработанных и не обработанных препаратов роговицы свиньи.

В экспериментальной группе на свиных образцах роговицы напряжение при 6%-ом растяжении было - 57.3±17.3 х 10 Pa, в контрольной 98.5 ±29.77 х 10 Pa, что соответствует увеличению на 71,9 % (P =.014) (рис.

2). В препаратах человеческой роговицы, напряжение при 6%-ом растяжении было 227.3±95.7 х 10 Pa в экспериментальной группе и 53.0±11.5 х 10 Pa в контрольной, что соответствует увеличению на 328,9% (Р=.012) (рис. 2).

Рис. 2. Значения нагрузки для 4 %, 6 %, 8 % растяжения, и подсчёт модуля Юнга в скобках.

В контрольной группе разница в объеме напряжения-растяжения была статистически не достоверна (Р=.87). А в экспериментальной она являлась достоверной (Р=.01). Повышение биомеханической жёсткости можно наглядно оценить на рис. 3.

Рис. 3. Препараты роговицы свиньи. А: не обработанная полоска роговицы.

Б: полоска, обработанная по методу кросс-линкинг Для подсчёта модуля Юнга, значения нагрузки-растяжения были вставлены в экспоненциальную функцию = А ехр (В х ). Первым производным данной функции на дефинитной кривой был модуль Юнга Е=d/d = АхВ ехр(Вх).

При растяжении роговицы свиньи на 6 %, модуль Юнга был 1,5х Ра (Па) в контрольной группе и 2,7х106 Ра (Па) в экспериментальной (повышающий фактор 1.8). При растяжении препаратов роговицы человека на 6 %, модуль Юнга был 1,3х106 Ра (Па) в контрольной группе и 5,9х106 Ра (Па) в экспериментальных (повышающий фактор 4,5). По данным ультразвуковой пахиметрии средняя толщина роговицы свиньи составила 850±70 нм, человека - 550±40 нм.

Таким образом, исследователи обнаружили значительное увеличение биомеханической жесткости в препаратах роговицы человека, что подтверждает повышающий фактор равный 4,5. Биомеханическая жёсткость также увеличилась и на свиных глазах, но повышающий фактор оказался меньше и составил 1,8. Это можно объяснить тем, что процесс перекрёстного сшивания коллагена роговицы протекает в передних 2/3 стромы на толщине не превышающей 300мкм. Для свиной роговицы это всего 35 % от общей толщины (800 мкм), в то время как для роговицы человека процесс занимает 55 % толщины (550 мкм). [63; 105; 125; 140] Повышение биомеханической жёсткости, после процедуры поперечного сшивания коллагена роговицы, возможно, является производным увеличения диаметра коллагенового волокна, обусловленного процессом поперечного сшивания, происходящим в нём [95; 147].

Для подтверждения биомеханических данных были проведены гистологические исследования.

По данным доктора Вилша (Wilsch M.), Споэрла (Spoerl E.) и Сейлера (Seiler T.) в результате кросс-линкинга с использованием 0,1 % раствора рибофлавина и ультрафиолетового излучения происходит увеличение диаметра коллагеновых волокон передних слоёв стромы на 12.2 % (3.96 нм) и задних слоев стромы на 4.6 % (1.63 нм) по сравнению с контрольной группой [70; 158].

Для гистологического изучения влияния кросс-линкинга на развитие апоптоза кератоцитов Воленсак (Wollensak G.) и Вилш (Wilsch M.) провели экспериментальную работу на роговице кроликов. Для трансмиссивной электронной микроскопии маленькие кусочки центральной зоны роговицы были фиксированы в 4 %-м тероксиде осмия (4% osmium teroxide), дегитратированы и фиксированы в «Epon» смоле. Сделаны ультратонкие срезы толщиной 50-70 Нм и оценены под электронным микроскопом «Morgagni» под увеличением 3500-34000х. По данным световой и электронной микроскопии через 4 часа после кросс-линкинга в 6 роговицах кроликов в строме на глубине 50 нм были выявлены единичные разрозненные кератоциты в апоптозе. Через 24 часа после манипуляции в случаях обнаружили массовую потерю кератоцитов с почти бесклеточной зоной.

При электронной микроскопии регистрировали некротизированные клетки на разной глубине стромы роговицы (100-170 нм), глубина нахождения зависела от увеличения мощности поверхностного ультрафиолетового излучения (0,75 - 1,88 - 4,0 mW/cm). Все эти изменения присутствовали только в той части роговицы, которая подверглась кросслинкингу и имела резкую зону перехода к нормальной строме роговицы, не подвергавшейся воздействию УФ. В результате этого исследования используя закон Lambert-Beer и коэффициент абсорбции (53 cm1) для роговицы, обработанной раствором рибофлавина и облучённой ультрафиолетом А спектра, был вычислен цитотоксический порог излучения находящийся в диапазоне 0.5–0.7 mW/cm2. [139; 141; 157] 1.2. Клиническое применение «кросс-линкинга».

На основании обширной экспериментальной базы во многих странах мира было с успехом начато внедрение процедуры «кросс-линкинга» в клиническую практику. Многочисленные исследования подтвердили безопасность и эффективность данного метода. [71; 80; 108; 131; 142; 151] Однако в литературе встречаются описанные случаи дальнейшего прогрессирования заболевания после применения процедуры «кросслинкинг» у пациентов с кератоконусом. [86] Сравнение результатов до и после процедуры показало, что количество эндотелиальных клеток (2730 клеток/мм до процедуры, клетки/мм через 6 месяцев после, и 2640 клеток/мм через 12 месяцев) практически не изменилось. [80] статистически достоверных изменений в количестве эндотелиальных клеток до и через 1 месяц после процедуры (до процедуры 2780±197, через 2 месяца 2713±116; P=0.14). Процедура характеризовалась хорошей переносимостью, отсутствием осложнений в раннем и позднем послеоперационных периодах.

[100] Изучение роговицы показало, что средняя толщина роговой оболочки в центре до процедуры была 458.5±21.5 мкм (с разбросом значений от 448 до 467 мкм), а после деэпитализации стала 415.7±20.6 мкм (диапазон от 400 до 468 мкм). Никаких статистически достоверных изменений толщины роговицы в центральной зоне во время облучения выявлено не было (P>0.05).

[100] Помимо этого рядом авторов было проведено исследование толщины сетчатки с целью выявления повреждающего действия ультрафиолетового излучения на задний отрезок глаза. В результате толщина сетчатки до процедуры составила 203 мкм, через 6 месяцев - 202 мкм, а через 12 месяцев 205 мкм. Исследование позволило прийти к выводу, что «кросс-линкинг» с применением рибофлавина и облучением ультрафиолетовым светом безопасная процедура, которая не повреждает эндотелий и не наносит повреждений сетчатке, если выполняется согласно протоколу, предложенному авторами. [80] В 2010 году Vinciguerra P. с соавторами изучали роговичный гистерезис (CH), фактор резистентности роговицы (CRF), первую и вторую пиковую амплитуду, компенсированное ВГД и давление по Гольдману после проведенного «кросс-линкинга». При помощи Pentacam (Oculus Inc.) была измерена самая тонкая точка роговицы. Также была выполнена зеркальная микроскопия и посчитаны эндотелиальные клетки. Исследования производились интраоперационно, после удаления эпителия, после насыщения роговицы рибофлавином, после облучения ультрафиолетом. Так же в послеоперационный период, после восстановления эпителия, и на сроках 1, 6, и 12 месяцев. В результате статистически достоверное уменьшение самой тонкой точки роговицы 462±23.24 мкм наблюдалось интраоперационно, после окончания процедуры и через 1 и 6 месяцев