«Усовершенствование диагностики копытной гнили овец с помощью молекулярно-генетических методов ...»

ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной

медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина»

на правах рукописи

Алексеева Светлана Викторовна

Усовершенствование диагностики копытной гнили овец

с помощью молекулярно-генетических методов

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

лауреат премии Совета Министров СССР, доктор ветеринарных наук, профессор Сидорчук А.А., доктор биологических наук, профессор Забережный А.Д.

Москва,

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений………………..………………………………………….. Введение……………………………...…………………………………………. 1. Обзор литературы…………….……………….…………………………… 1.1. Копытная гниль овец……………………………………………….. 1.1.1. Общие сведения, распространение, экономическое значение…………..……………………………… 1.1.2. Этиология…………………………………………………… 1.1.3. Патогенез……………………………………………………. 1.2. Dichelobacter nodosus……………………………………………….. 1.2.1. Номенклатура и таксономия………………………………. 1.2.2. Факторы вирулентности…………………………………… 1.3. Диагностика копытной гнили овец………………………………… 1.3.1. Эпизоотологические данные…………………………...….. 1.3.2. Клинический диагноз………………………………………. 1.3.3. Патологоанатомические признаки………………………… 1.3.4. Лабораторный диагноз………………………...…………. 1.3.5. Дифференциальный диагноз………………………...…….. 1.4. Заключение ……………………….………………………………… 2. Собственные исследования…………………………..…………………… 2.1.Материалы и методы исследований…………………………….….. 2.1.1. Материалы и оборудование……………………...………... 2.1.2. Методы исследования……………………………………… 2.2. Результаты…………………………………………………………… 2.2.1. Разработка метода ПЦР – амплификации фрагментов гена 16S рРНК для идентификации возбудителя копытной гнили овец D.nodosus…

2.2.2. Разработка метода ПЦР – амплификации вариабельного фрагмента гена fimA D.nodosus для типирования штаммов…………………………………………….. 2.2.3. Реактивирование, изучение жизнеспособности, сохранности морфологических, тинкториальных и культуральных свойств, а также молекулярно – генетическое исследование 27 штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко…………………………. 2.2.4. Разработка способов подготовки проб патологического материала для выявления ДНК D.nodosus методом ПЦР………. 2.2.5. Проведение филогенетического анализа 15-ти штаммов Dichelobacter nodosus по гену fimA……………………….……… 3. Обсуждение результатов исследования…..……………………………… 4. Выводы………………………………..…………………………………….. 5. Практическое использование научных результатов исследования… 6. Рекомендации по использованию научных выводов……………...…... 7. Список использованной литературы…………………………...………. 8. Приложения……………………….…………..……………………………. Список сокращений ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота МППБ – мясопептонный печеночный бульон (среда Китта-Тароцци) ОМП (outer membrane protein) - наружный белок мембраны ПА – питательный агар ПБ – питательный бульон ПЦР – полимеразная цепная реакция РА - реакция агглютинации РДП – реакция диффузной преципитации РИД – реакция иммунодиффузии РИФ – реакция иммунофлуоресценции РНГА - реакции непрямой гемагглютинации РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции РНК - рибонуклеиновая кислота РСК - реакция связывания комплемента 16S рРНК - рибосомная РНК прокариот с коэффициентом седиментации единиц Сведберга dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфат ELISA (ИФА) – иммуноферментный анализ IgG – иммуноглобулин G NCBI – Национальный Центр Биотехнологической Информации США PBS - фосфатный буфер PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов PFGE (Pulsed field gel electrophoresis) - электрофорез в пульсирующем поле

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Копытная гниль овец – это известная с 18-го столетия инфекционная болезнь, которая с тех времен и по сей день продолжает наносить ущерб овцеводческой отрасли во всём мире. Со временем специалистами был накоплен большой опыт по лечению и проведению противоэпизоотических мероприятий, но, несмотря на все усилия, копытная гниль до сих пор остается наиболее распространенной и экономически значимой среди других болезней овец (45, 213).

Причины сложности борьбы с копытной гнилью многогранны и кроются, прежде всего, в сложности взаимодействия триады составляющих:

возбудитель - окружающая среда – хозяин (82).

Другой проблемой, вплоть до наступления молекулярной эры, являлась бактериологическая диагностика возбудителя. Из-за культуральных особенностей Dichelobacter nodosus стандартная методика представляла собой трудный, длительный и не всегда эффективный процесс, что тормозило изучение этиопатогенеза болезни и как следствие, создание эффективных мер борьбы. Так, до сих пор, в австралийских лабораториях процент проб патологического материала из которых удается выделить первичные культуры D.nodosus, составляет всего 25-65% (115).

исследования во многих частях мира и, особенно, в Австралии, Новой Зеландии, Великобритании, Непале, Малайзии и Индии. В нашей стране период активного плодотворного изучения копытной гнили овец пришелся на 1970-90-е годы, центром которых был ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко. Наиболее значимыми результатами явились: создание коллекции штаммов D.nodosus в ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко; выпуск первой вакцины, а затем ассоциированной инактивированной вакцины «Овикон»; разработка методик бактериологического и серологического исследований, способов лечения и схем ликвидации, отраженных в методических указаниях по лабораторной диагностике копытной гнили овец и инструкции о мероприятиях по борьбе с копытной гнилью овец (18, 25).

Большинство развитых овцеводческих стран имеют программы по контролю и/или ликвидации копытной гнили овец при финансовой поддержке государства и производителей. Наиболее глобальный проект по изучению копытной гнили осуществляется под эгидой Австралийского Центра Международных Сельскохозяйственных Исследований (ACIAR) (75).

Проект состоит из нескольких программ и срок его действия намечен с по 2022 год. В результате совместных усилий между непальскими, австралийскими и британскими учеными при участии в проектах ACIAR уже ликвидирована злокачественная форма копытной гнили в Непале и Бутане. С учетом достигнутых успехов и инвестиций в 1,5 миллиона австралийских долларов за весь срок существования проекта, экономическая выгода составит 2,8 миллиона австралийских долларов. С научной точки зрения проект доказал преимущество применения фимбриальных одно двуштаммовых вакцин, специфичных (аутогенных) для данной местности.

Это означает, что для осуществления любых программ по ликвидации обязательно требуется знание серогрупповой принадлежности возбудителя и его вирулентности (т.к. промежуточные и авирулентные штаммы пока не нуждаются в контроле и ликвидации). Для осуществления этих целей в рамках проекта были показаны несомненные перспективы применения новых молекулярно-генетических методов для диагностики копытной гнили овец.

Так, кроме уже распространенной ПЦР, была успешно опробована ИФА, которая может использоваться с целью выявления переболевших животных бактерионосителей для предотвращения ввоза в благополучные местности.

В настоящее время разработка новых подходов к идентификации микроорганизмов связана с достижениями в области молекулярной генетики.

Молекулярно-генетические методы, от стандартных бактериологических, отличаются высокой чувствительностью, быстротой выполнения и сравнительно низкой трудоемкостью, а применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет получать положительные результаты при наличии в исследуемом материале единичных клеток возбудителя (157). Для диагностики копытной гнили овец молекулярно - генетические методы на сегодняшний день признаны наиболее точными и удобными для видовой идентификации и типирования возбудителя (117, 214, 154, 228).

Развитие ПЦР для амплификации видоспецифичных фрагментов 16S идентификации D.nodosus, укорачивая время лабораторной диагностики с 3 недель до одного дня (140). Ген рибосомальной РНК (рРНК) — один из наиболее консервативных генов, значительную его часть занимают области, имеющие практически одинаковый нуклеотидный состав у различных микроорганизмов. Однако ген содержит и видоспецифичные вариабельные участки, амплификация которых с помощью ПЦР служит для идентификации микроорганизмов (166, 202).

фимбриальной субъединицы D.nodosus – fimA, традиционный метод определения серогруппы - РА, был замещен более эффективными молекулярно - генетическими диагностическими методами, такими как ПЦР с использованием группоспецифичных праймеров и проведение филогенетического анализа полученных нуклеотидных последовательностей.

Главное преимущество этих разработок - быстрота, чувствительность, специфичность, устранение от трудоемких, длительных и не всегда успешных процедур выделения возбудителя (152, 228).

По мнению некоторых исследователей, борьба с копытной гнилью в дальнейшем также представляется проблематичной из-за вероятности появления изменений в геноме возбудителя. Доказана возможность трансформации in vitro штаммов D.nodosus из одной серологической группы в другую. Если в дальнейших исследованиях будет подтверждена такая конверсия в естественных условиях у пораженных копытной гнилью овец, серогруппоспецифичных вакцин и еще более упрочит понимание в необходимости проведения постоянных молекулярно-генетических исследований эпизоотических штаммов D.nodosus (211).

направлениями в современном исследовании копытной гнили будут:

изучение генетических основ вирулентности и на этой основе разработка ПЦР - систем для вытеснения ими стандартных тестов по определению вирулентности; создание и усовершенствование мультиплексных тест – патологического материала, желательно непосредственно «в поле»;

исследование возможностей для естественной трансформации генов D.nodosus; усовершенствование методики производства и применения аутогенных фимбриальных вакцин в различных регионах мира.

Для России актуальность разработки молекулярно-генетических методик несомненна. Российские лаборатории не обладают возможностями для видовой и серогрупповой диагностики копытной гнили овец, по многим причинам не проводится даже стандартное бактериологическое исследование. Болезнь до сих пор часто проходит под диагнозом некробактериоз. На фоне исторически достаточно сильной заболеваемости копытной гнилью в овцеводческих регионах, таких как Ставропольский край, Дагестан, Башкирия и других, нет возможностей для проведения эпизоотологического мониторинга болезни в стране. За весь период изучения болезни в России из молекулярных методов был разработан всего один – типирование с помощью ИФА (3). Он имел недостатки и распространения не получил, поэтому можно констатировать, что современные методы диагностики копытной гнили овец в нашей стране не применяют.

В связи с вышеописанными проблемами в диагностике копытной гнили овец, и, как следствие, в борьбе с этой болезнью, разработка молекулярногенетических методов выявления, идентификации и типирования D.nodosus является чрезвычайно необходимой.

характеристика штаммов Dichelobacter nodosus и разработка методик ПЦР для осуществления видовой идентификации и типирования возбудителя копытной гнили овец.

Задачи исследования:

1. Разработать методику ПЦР – анализа на основе амплификации гена 16S рРНК Dichelobacter nodosus для видовой идентификации возбудителя из культуры.

2. Разработать методику ПЦР – анализа на основе амплификации гена fimA для типирования штаммов возбудителя.

3. Охарактеризовать молекулярно - генетически штаммы Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко в сравнении с основными биологическими свойствами этих культур.

4. Разработать способы подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.

5. Оценить корреляцию данных филогенетического анализа Dichelobacter агглютинации).

Научная новизна.

Охарактеризованы биологические и молекулярно-генетические свойства 17 штаммов Dichelobacter nodosus.

Проведена видовая идентификация реактивированных штаммов Dichelobacter nodosus по гену 16S рРНК и их типирование по гену fimA.

Разработана новая методика пробоподготовки патологического материала, позволяющая выявлять и идентифицировать Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований на основе ПЦР амплификации фрагмента гена 16S рРНК.

Предложен новый фрагмент гена fimA, на основе которого проведен обнаружена корреляция генотипов с серотипами возбудителя.

Практическая значимость.

Охарактеризован молекулярно - генетически производственный штамм ПП 82/90 Dichelobacter nodosus, применяемый для производства вакцины «Овикон».

Проведена реактивация штаммов Dichelobacter nodosus после 20-ти летнего хранения в лиофилизированном виде, изучена их жизнеспособность, сохранение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств.

Разработана методика ПЦР, позволяющая с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя - Dichelobacter nodosus в лабораторных условиях без предварительного культивирования.

Разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификациии фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР» (Приложение А), утвержденные Научно - методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г. и предназначенные для использования в научно - исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению Dichelobacter nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий.

Личный вклад соискателя.

Личный вклад соискателя заключается в организации и проведении бактериологических, молекулярно-генетических исследований, а также анализе и обобщении результатов работы.

Апробация работы.

профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных (г.

Ставрополь, 2009 г.), Международной научно - практической конференции, посвященной 90-летию МГАВМиБ (г. Москва, 2009 г.) Результаты работы инфекционных болезней МГАВМиБ в 2008-2010 гг.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе в 3-х изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 260 источников (в т.ч. 213 иностранных) и приложения. Работа содержит таблиц и 37 рисунков.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Методика видовой идентификации Dichelobacter nodosus с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР в культуре или патологическом материале.

2. Методика типирования штаммов Dichelobacter nodosus с помощью амплификациии фрагмента гена fimA.

3. Реактивация и исследование биологических и молекулярно генетических свойств штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко.

4. Разработка способа подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.

5. Филогенетический анализ штаммов Dichelobacter nodosus на основе нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена fimA и сравнение с результатами серологического метода РА.

Автор выражает глубокую благодарность всему коллективу лаборатории молекулярной диагностики Института Вирусологии им.Д.И. Ивановского, НПО «Нарвак» (в лице Алипера Т.И.), коллективу кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней МГАВМиБ, сотрудникам ВИЭВ (в частности, Соколову М.Н.) и специалистам Ставропольской биофабрики (в частности, Геладзе В.Ш.) за всестороннюю помощь в выполнении диссертационной работы.

Буньковой Наталье, Панасюку С.Д., Соколовой Н.А., Ломакиной Н.Ф. и моим научным руководителям за Вашу безграничную поддержку.

1.1.1. Общие сведения, распространение, экономическое значение Копытная гниль – это широко распространенная во всем мире инфекционная болезнь овец, вызываемая бактерией Dichelobacter nodosus, помимо которой для распространения заболевания и осложнения патологического процесса необходимо наличие некоторых других микробов и определенных факторов окружающей среды (55, 189).

Ранее считалось, что копытной гнилью заболевают только овцы и козы, позже появились данные о поражении ею в более легкой форме крупного рогатого скота, а также свиней, оленей и муфлонов (84, 54, 99, 86, 50, 212).

Распространению болезни по всему миру способствовала широкая международная торговля овцами в конце 19-го - начале 20-го веков с целью ежегодников ФАО-ВОЗ-МЭБ за 1985-1989 гг., из 170 стран и территорий, зарегистрирована в 120 государствах, из них в 46 странах болезнь имела достаточно широкое распространение, от энзоотического проявления до масштабных эпизоотий (35).

В литературных источниках имеются сведения о наличии копытной гнили овец во многих странах с развитым овцеводством: Австралия, Великобритания, Канада, Дания, Франция, Голландия, Индия, Малайзия, Непал, Новая Зеландия, Португалия, Испания, США и др. (55, 95, 111, 131, 47,163, 180, 129, 171, 154, 152, 226).

В нашей стране о широком распространении копытной гнили в ряде овцеводческих зон, также имеются сообщения специалистов (9, 30, 38).

Заболеваемость конечностей овец копытной гнилью и некробактериозом (статистика ведется по 2-м нозоединицам вместе) варьирует в широких пределах в хозяйствах Центральной России от 3,5 до 52%, а в хозяйствах Ставропольского края от 3,6 до 38,1%. Уровень заболеваемости зависит от условий содержания, кормления и внешней среды (27).

распространенной в мире является серогруппа В (121, 154, 226). В Австралии она составляет 28,2% от общего количества серогрупп, в Великобритании - 40,4%, в Новой Зеландии - 56,2 %. (64, 121, 137). Торлей и Дэй, исследуя в 1986 году распространение серологических групп D.nodosus во Франции, Нидерландах, Бельгии, Италии, Сицилии и Сардинии, сообщали, что большинство штаммов принадлежало к серологической группе Н (32,7 %), далее - D (14,4 %) и C (13,5 %); и только 4-5 % штаммов принадлежали серологической группе A (208). В СССР из всех выделенных штаммов по данным Сидорчука А.А. группа В составляла 58,8%, Н – 11,8%, D,F,G – по 5,9% каждый (35).

В большинстве случаев болезнь поражает стадо массово и вызывает гнилостные изменения в межпальцевой области и области копытного рога, что сначала ведет к хромоте опирающейся конечности, снижению аппетита и подвижности, а в дальнейшем приводит к производственным потерям. В Австралии и Новой Зеландии, прежде всего, играет роль снижение шерстной продуктивности заболевших животных, в то время как в странах, не нацеленных на шерстное производство, более значительными являются снижение прироста ягнят или потери веса у взрослых животных, что способствует большим экономическим убыткам (197, 188).

При определенных обстоятельствах хроническая хромота может обусловливать сниженную репродуктивную способность и повышенную смертность ягнят, а также благоприятствует возникновению других болезней (222, 223).

Наряду со снижением производственных показателей экономические убытки возникают вследствие необходимости осуществления мер борьбы, включающих лечение и профилактику (5, 139). Так, например, в Великобритании убытки от копытной гнили ежегодно составляют миллиона фунтов стерлингов (это около 36 миллионов евро), причем 14 из них тратится только на профилактику. На одну взрослую овцу приходиться 1,32 фунта, на ягненка – 0,15 (160). В Новой Зеландии ежегодные затраты на лечение и убытки от недополучения продукции составляют около 6, миллионов евро (44).

В России современные данные по экономическому ущербу от копытной гнили отсутствуют. Но в СССР эта болезнь всегда была наиболее экономически значимой среди заболеваний овец (37).

До настоящего времени единая этиологическая концепция так и не сложилась. С этой точки зрения приходится говорить лишь о наиболее общепринятых теориях.

Так, наиболее признанными являются две концепции: D.nodosus, как единственный возбудитель типичной копытной гнили овец и синергическая.

Другие теории в современной научной литературе не рассматриваются и интересны лишь в историческом плане. Касаясь вышеназванных двух, с большой вероятностью можно предположить, что обе они верны и не противоречат друг другу, так как из-за полиэтиологического характера заболевания возможны различные варианты этиопатогенеза.

Первая часть исследователей считает D.nodosus ведущим возбудителем копытной гнили (10, 5, 7, 8, 14, 22, 34, 35, 88, 83, 138, 183, 199, 204, 208). При микроорганизмов, таких как Fusobacterium necrophorum, но считают что они играют роль сопутствующей микрофлоры, действующей после того как основной патологический процесс начал уже развиваться. Убежденность этих исследователей подтверждается тем, что экспериментально заболевание у овец удавалось вызвать только при заражении чистыми культурами D.nodosus, а использование D.nodosus в смеси с другими культурами существенно не влияло на тяжесть патологического процесса (5, 8, 14, 159, 55, 88, 67, 204). В пользу этой теории говорит и то, что профилактическими и лечебными свойствами обладают сыворотки, полученные лишь к этому микробу, а иммуногенностью - только вакцины из D.nodosus. Возбудитель некробактериоза лишь участвует в процессе деструкции ткани копытец (78). Кроме того, D.nodosus в отличие от способствующий колонизации копытного рога.

Такое же мнение в своих трудах высказывают отечественные ученые Архангельский А.А., Сидорчук А.А., Караваев Ю.Д. (5). Они считают D.nodosus главным и единственным возбудителем болезни. К таким выводам они пришли при совместном исследовании с И. Н. Семеновой более образцов патматериала бактериоскопически, среди которых очень редко регистрировали F.necrophorum, биопроба на лабораторных животных всегда была отрицательной. Вместе с тем авторы не склонны совсем отрицать роль F.necrophorum в проявлении смешанной инфекции копыт у овец, особенно в тех районах, где этот микроорганизм обитает постоянно. Эти данные удачно подтверждаются исследованиями Ш. Сукеева и др. в Киргизии, они установили только копытную гниль в 42,5% случаев, некробактериоз — в 8,7%, а в остальных случаях была смешанная инфекция (39).

Другая, малочисленная группа специалистов, придерживается концепции синергического действия двух анаэробных возбудителей – D.nodosus и F.necrophorum. Мнения расходятся лишь в отношении кого из возбудителей считать ведущим фактором. Большая часть этих исследователей считает D.nodosus первичным этиологическим агентом, "открывающим ворота" для F.necrophorum путем разрушения рогового слоя и кожно-рогового соединения (174, 52, 78, 91, 172, 99, 136, 209). Другая, меньшая часть, придает главное значение F.necrophorum, который, по их мнению, принимая участие в воспалительном процессе в коже межкопытной щели дает возможность D.nodosus внедряться в уже поврежденную ткань (148, 176).

Беверидж считал, что вначале ткани копыта заселяет D.nodosus, действующий в ассоциации с другими микроорганизмами (55). Он был не только ученым, открывшим возбудителя копытной гнили овец, но и первым, кто доказал ведущую роль D.nodosus в развитии этого заболевания. Однако, он полагал, что основной возбудитель действует в ассоциации со Spirochaeta penortha, а Fusobacterium necrophorum автор большого значения в развитии заболевания не придавал и считал его вторичным внедряющимся видом.

Эгертон и др. (99) экспериментально продемонстрировали, что один D.nodosus не вызывал копытную гниль у овец в сухих условиях окружающей среды. Они заключили, что только мацерированная кожа межпальцевой щели способна заселяться D.nodosus одновременно с F.necrophorum, вызывая гиперкератоз и паракератоз, образование трещин и улучшение условий для выживания и размножения анаэробных бактерий. На основании этих данных было предложено считать, что копытная гниль вызвается синэргической ассоциацией облигатного паразита D.nodosus вместе с F.necrophorum.

Последняя бактерия присутствует в нормальной микрофлоре желудочнокишечного тракта овец. Заболевание начинается только тогда, когда присутствие D.nodosus на копыте сопровождается наличием теплых и влажных условий среды, а также фекалий, способствующих колонизации кожи межпальцевой щели F.necrophorum (99). Далее, D.nodosus, обладая более слабыми воспалительными и деструктивными способностями, начинает расплавление тканей копыта и распространение поражений глубже.

Кроме того, D.nodosus способен длительное время персистировать в пораженных тканях копыта, таким образом сохраняя инфекцию (88).

Другая часть ученых – «синергистов» утверждает, что при наличии предрасполагающих для развития копытной гнили факторов окружающей среды F.necrophorum удается заселять мацерированную, гидратированную Stratum corneum кожи межпальцевой щели овец (88, 99). В последующем в этой области возникают диффузные поверхностные некрозы и эритемы, что приводит к Межпальцевому дерматиту овец (OID) (165). Далее D.nodosus заселяет места с незначительной концентрацией кислорода и образует там кератолитические протеазы, которые расплавляют клетки spinosum и Stratum granulosum. Это приводит к отделению дермы от эпидермиса. Процесс всегда начинается в аксиальной области копыта у границы кожи рога и распространяется в направлении пятки и подошвы. В тяжелых случаях поражения достигают абаксиальных стенок копыта, что может приводить к спаданию рогового башмака (99, 189).

Из непризнанных, стоит упомянуть концепцию польского исследователя Катича и сотр. (133, 134, 175, 135). По их мнению, D.nodosus не играет существенной роли в развитии копытной гнили, а заболевание вызывается широкой ассоциацией микроорганизмов, таких как F.necrophorum, бацилл, клостридий, коринебактерий, дифтероидов, эшерихий и т.п.

Изоляция в случаях VFR новой спирохеты, в отсутствии D.nodosus, прибавила другое понимание этиологии копытной гнили, что следует изучить в дальнейшем (120, 130).

Данные о патогенезе и локализации патологоморфологических изменений при копытной гнили овец противоречивы и до сих пор вызывают множество споров среди ученых. Бесспорным является лишь факт ведущей роли D.nodosus, без этого возбудителя воспроизвести копытную гниль не удавалось.

В основном, мнения исследователей расходятся в отношении очередности проникновения возбудителей в ткани копыта, механизмов патологического воздействия, а также значения сочленов возникшей ассоциации. После анализа литературных данных представляется возможным заключить, что, скорее всего, имеют место различные пути патогенеза в зависимости от конкретного случая заболевания.

В своих ранних исследованиях Беверидж считает, что воспалительный процесс при копытной гнили вызывает прогрессирующее накопление экссудата в межклеточных пространствах с образованием полостей, прогрессирующую клеточную атрофию и отслоение копытного рога от эпителия (55). В 1955 году Дин и Дженсен определили, что дегенеративные изменения происходят в слое Stratum granulosum и поверхностных слоях Stratum spinosum эпителия (80). По их мнению, в начальной стадии поражений была гидропическая дегенерация, некроз эпителиальных клеток, и формирование больших вакуолей с лейкоцитарной инфильтрацией. В развившихся поражениях был обширный колликвационный некроз эпителиальных клеток на краях поражения в слое Stratum granulosum и поверхностных клетках Stratum spinosum. В отличие от Бевериджа они предположили, что ответственным за отделение копытного рога от подлежащих эпителиальных слоев был некроз в этом регионе. Эти исследования не установили прямую связь между патологическими изменениями и наличием D.nodosus. Томас же считал, что только D.nodosus был способен вызывать злокачественную копытную гниль с последующим отделением копытного рога (204). Он в своих исследованиях продемонстрировал обилие D.nodosus в слое Stratum lucidum за линией отрыва эпидермиса, но D.nodosus не наблюдается в Stratum granulosum и Stratum spinosum, хотя у клеток в этих регионах была цитоплазматическая дегенерация (204). Такие изменения, как дегенерация, отслоение и колликвационное ращепление частично кератинированных клеток слоев Stratum lucidum и Stratum spinosum, а также образование пазух и некротических очагов в копытном роге, считалось, напрямую связаны с наличием D.nodosus и не были связаны с другими бактериями (204).

Причиной этих повреждений являлось ращепление кератолитическими протеазами D.nodosus (204, 205).

Тем не менее, результаты Эгертона и др. (99) ставят под сомнение эти выводы. Их исследование привело к выводу, что причиной отделения рога было разрушение эпидермиса из-за диффузного воспаления и клеточной инфильтрации и не было связано с непосредственным наличием бактерий или их кератолитической активности. Таким образом, они считают, что нет очевидного доказательства отделения копытного рога за счет прямого воздействия бактерий. Однако, исследования Стюарта и Парсонса (189), а также Хина (122) подтвердили результаты Томаса (204), предполагающие, что отделение копытного рога происходит за счет прямого влияния бактерий.

В своих гистологических исследованиях они выявили взаимосвязь D.nodosus с плоскостью раздела между зонами Stratum lucidum и Stratum granulosum.

Так как при разделении слоев эпидермиса не были затронуты кератиновые ткани и не было обнаружено кератолитической активности D.nodosus in vivo и in vitro, протеаз и т.п., можно предположить действие каких-либо других факторов (189). Общей особенностью копытной гнили является интенсивный воспалительный процесс, простирающийся от дермы в эпидермис. Иногда наблюдался фагоцитоз D.nodosus нейтрофилами в эпидермисе в местах скопления моноцитов и нейтрофилов (122).

По данным ряда исследователей при заболевании овец копытной гнилью наблюдаются некоторые изменения в периферической крови. Так Волкова (11) сообщала, что при поражении копыт у овец имеет место эритроцитоз, нейтрофилия и снижение содержания гемоглобина. У сильно пораженных овец наблюдается также повышение содержания в крови общего белка, одной из глобулиновых фракций, снижение содержания кальция, фосфора и липидов (1, 23, 158).

Первооткрыватель возбудителя копытной гнили овец Беверидж в 1941 дал ему имя Fusiformis nodosus, так как речь шла о больших бактериях в форме палочки с характерными терминальными вздутиями (55). В году на основе фенотипических критериев возбудителя присоединили к роду Bacteroides и переименовали в Bacteroides nodosus (156). Однако, в последовательности рРНК возбудителя обнаружились существенные отличия от других видов Bacteroides (132, 187). В 1990 году, после подробного изучения нуклеотидной последовательности 16S рРНК бактерию вынесли в отдельный род, с наименованием Dichelobacter nodosus (210, 141). На сегодня, вид Dichelobacter nodosus, единственный представитель рода Dichelobacter, входит в семейство Cardiobacteriaceae, порядок Cardiobacteriales, класс Gammaproteobacteria, тип Proteobacteria.

Эгертон в 1973 году, изучая кроличьи сыворотки в РА установил, что изоляты D.nodosus имеют связанный с телом бактерий соматический О – антиген (98). Это термостабильный липополисахарид, он не имеет серологических вариантов.

При проведении электронно-микроскопического исследования культур D.nodosus на поверхности бактерий было отмечено наличие своеобразных нитевидных отростков – фимбрий (пилей), длиной 5-10 мкм и диаметром 4-5 нм, располагающихся в основном полярно (76, 182, 195, 198).

Число фимбрий на одну клетку варьирует от единичных до нескольких сотен, что зависит от ряда факторов, в том числе и от свойств штамма. У бактерий, растущих на плотной среде, фимбрий бывает значительно больше, чем у клеток из жидкой среды (186). При пересевах культур на жидких средах способность штамма к пилеобразованию быстро теряется (87).

Фимбрии – важнейшая часть бактериальной клетки D.nodosus. Они активно участвуют в осуществлении патогенеза болезни. Прежде всего, это происходит из-за их адгезивных функций и явления «судорожной подвижности», с помощью которых возбудитель колонизирует ткани копыта и проникает в Stratum corneum (200, 87). С их помощью осуществляется выделение внеклеточных протеаз, второго фактора вирулентности, помогающего деструктировать ткани (200). В отношении доказательства необходимости фимбрий для выделения протеаз, были проведены исследования с помощью методов обратной генетики, показавшие, что мутантные D.nodosus с выключенным геном fimA протеаз не выделяли и становились авирулентными (200). Фимбрии обладают иммуногенными и иммунопротективными свойствами (211, 195). Вирулентные возбудители имеют большее количество фимбрий, авирулентные имеют мало или совсем не покрыты ими (61, 102, 87).

Являясь одним из основных факторов вирулентности, фимбрии IV типа D.nodosus обладают высокой иммуногенностью и являются основой для классификации его штаммов. Реакции агглютинации с пилями относятся к агглютинации K-типа (104). В настоящее время изоляты D.nodosus на основе агглютинации к антителам против их фимбрий разделены на десять серологических групп (A, B, C, D, E, F, G, H, I и M). Эти серологические группы по результатам перекрестных реакций разделены, по последним данным на 19 (Al, A2, Bl, B2, ВЗ, B4, Сl, С2, D, E1, E2, Fl, F2, Gl, G2, H1, H2, I, M) подгрупп, которые называются серовариантами (63, 64, 117). Хотя фимбрии D.nodosus и являются главными протективными антигенами, иммунитет после их введения имеет недостаток – он группоспецифичен, т.е.

осуществляет защиту только против соответствующей серогруппы возбудителя копытной гнили (гомологичную) (149). Внутри серогрупп сильной иммуноспецифичности между серовариантами нет, например, введение фимбриального антигена Bl позволяет защищать от штаммов Bl, B2, ВЗ, B4 (167).

Фимбрия представляет собой полипептид, состоящий из единственного белка - пилина, кодируемого хромосомным геном. Фимбрии D.nodosus были классифицированы как тип IV из-за наличия высоко консервативного амино концевого региона, полярного расположения, связи с «судорожной подвижностью» и наличия метилфенилаланинового остатка, как Н - концевой аминокислоты (196). Эллеман нашел, что антигенное разнообразие штаммов D.nodosus было следствием наличия различий в последовательности ДНК гена, кодирующего его фимбриальные субъединицы и названного fimA (101).

В одном из дальнейших исследованиях, секвенирование субъединиц фимбриальных белков основных серологических групп показало, что имеется более 35 различий аминокислотных последовательностей между серологическими группами и до 15 различий между серотипами (211, 149).

Основываясь на гомологии последовательностей, Маттик, Хоббс и другие исследователи классифицировали фимбрии D.nodosus на два различных класса, а именно, класс I и класс II (163, 149). У штаммов класса I (серологические группы A, B, C, E, F,G, I и М), после гена fimA следует ген fimB, который кодирует 29.5 кДа мембранный протеин неизвестной функции, но утверждается, что он играет роль в экспорте фимбриальных субъединиц к поверхности клетки. Штаммы серологических групп D и H принадлежат к классу II и дополнительно к fimA имеют три гена, расположенных ниже, это fimC, fimD и fimZ. Установлено, что ген fimD является функциональным гомологом fimB; у fimC есть сходство в нуклеотидной последовательности с traX из F-плазмиды, а fimZ может кодировать резервную фимбриальную субъединицу (105).

Хотя разнообразие фимбрий D.nodosus хорошо описано, немногое известно о молекулярных механизмах, которые приводят к нему. Конверсия серологической группы, возможно, происходит в штаммах D.nodosus как средство ухода от иммунной реакции организма, но до 2003 года это не было продемонстрировано ни экспериментально, ни в природе (214). У других бактерий, обладающих IV типом фимбрий, таких как Neisseria gonorrhoeae и Moraxella bovis, вариации могут быть следствием ДНК - рекомбинации между различными спящими и рабочими фимбриальными генами или сайт специфическими рекомбинациями в пределах региона, кодирующего фимбриальную единицу (70, 179). Однако, так как D.nodosus не обладает ни спящими фимбриальными локусами, ни множественными копиями генов фимбриальных субъединиц, у него таким путем нет никаких возможностей для рекомбинации и получения антигенных вариаций.

Единственной возможностью возникновения антигенных вариантов D.nodosus могла быть натуральная трансформация (49). Согласно этому, Кеннан и другие в 2001 году показали, что многие штаммы D.nodosus имеют природную способность к трансформации (201). Впоследствии, в 2003 году, эти же исследователи окончательно продемонстрировали, что конверсия серологической группы могла происходить путем естественной трансформации и гомологичной рекомбинации. Авторы фактически продемонстрировали это, когда они использовали плазмиду, содержащую ген фимбриальной субъединицы fimA серологической группы G для успешной конверсии штамма серологической группы I в серологическую группу G. Эти наблюдения объяснили неудачу определенных пилевых вакцин бороться с копытной гнилью, т.к. было предположено, что слабовирулентные штаммы D.nodosus могли играть важную роль как резервуар альтернативных фимбриальных антигенов (211).

Другими механизмами для перемещения генов в D.nodosus могли быть трансдукция, обусловленная бактериофагами, что наблюдалось у многих микроорганизмов, включая Pseudomonas aeruginosa, и фагообразные структуры, наблюдавшиеся у D.nodosus (100, 126). Или еще, генетическое перемещение могло осуществляться некоторыми неизвестными распространенный феномен (142, 227). Изучение этого направления может дать новую информацию в дальнейшем.

О выделении D.nodosus внеклеточных протеолитических ферментов и их роли в патогенезе копытной гнили овец первым сообщил Томас в (205). Эти ферменты разрушали такие субстраты, как казеин, эластин, порошок копытного рога, желатин, фибрин, порошок шкур, коллаген I, коллаген III, -кератин (57, 119, 46, 203, 205). Названия этих протеиназ даны в соответствии с разрушаемыми ими субстратами: желатиназы, фибриназы, коллагеназы, казеиназы, эластазы (83, 99, 103, 118, 173, 194, 203, 204).

Различные характеристики этих ферментов - протеаз широко используются для дифференцировки изолятов D.nodosus (83, 61, 88, 46, 164, 194). Значение, как факторов вирулентности, определено у термостабильных протеаз, злокачественной копытной гнили (56, 61).

Гены протеазы были идентифицированы и определены нуклеотидные последовательности нескольких протеаз. Это гены bprV, aprV5, aprB5, aprV2, aprB2 (48, 143, 71). Вирулентные изоляты D.nodosus продуцируют четыре внеклеточные кислые сериновые протеазы (V1-V3,V5) и одну основную протеазу (bprV) (143, 43, 71). Авирулентные изоляты продуцируют пять кислых протеаз (В1-В5) и одну основную – bprВ (62, 161).

1.2.2.4. Генетические основы вирулентности За прошедшее десятилетие были проведены серьезные исследования с целью обнаружения значимых для определения вирулентности генетических регионов. Помимо генов, кодирующих фимбрии (fimA), основную протеазу (bprV) и кислую протеазу (aprV5), были обнаружены вирулентноассоциированные генетические регионы: связанный с вирулентностью локус (vrl) и связанный с вирулентностью протеин (vap).

Вирулентно-ассоциированные генетические регионы. В 1991 году Катцем и сотрудниками (124) в исследовании с помощью трех плазмид со встроенными генетическими регионами, вероятно связанными с вирулентностью, было подтверждено, что эти участки действительно часто вирулентностью белок (virulence-associated proteins, vap) и связанный с вирулентностью локус (virulence-related locus, vrl) (56, 81, 153). Было предположено, что vap - локус присутствует во множественных копиях, тогда как, vrl только один (73). Кажется, ген vrl более связан с вирулентностю, так как 87 % вирулентных и только 6 % авирулентных изолятов D.nodosus гибридизуются с пробами к этому локусу. Из-за того, что vap и vrl не всегда связаны со штаммами D.nodosus большей вирулентности, вероятнее предположить, что эти последовательности могут воздействовать на проявление вирулентности или прямо, кодируя фактор вирулентности, или косвенно, регулируя экспрессию генов, задействованных в патогенезе D.nodosus.

Происхождение этих генов точно не ясно, высказывалось мнение, что вирулентность D.nodosus возникла путем перегруппировок различных генетических регионов через дупликацию и делецию (144). Или, что оба связанных с вирулентностью региона, vap и vrl, возможно, появились в результате одинаковых сайт - специфичных вставок, закончившихся интеграцией нуклеотидной последовательности происходящей от фага или плазмиды (73).

Руд с сотрудниками (1996) исследовали 800 изолятов D.nodosus для того чтобы обнаружить хотя бы один штамм, несущий только один vrl локус, без vap, но потерпели неудачу (72). Эти исследования подтвердили гипотезу, что для встраивания vrl локуса в хромосому D.nodosus требуется vap кодируемая интеграза.

Диагностика копытной гнили в нашей стране базируется на оценке эпизоотологических данных, клинического проявления болезни, а в необходимых случаях, на результатах лабораторного исследования и биологической пробы. При лабораторной диагностике проводят бактериологическое исследование мазков-отпечатков из патологического материала в световой и люминесцентной микроскопии, а биопробу ставят путем заражения взрослых овец патологическим материалом в кожу межкопытной щели (5, 6, 18, 25). За рубежом биопробу обычно не проводят, а в лабораторной диагностике из классических методов используют микроскопию и культуральные исследования (35, 193). Бактериологическая диагностика копытной гнили хотя и описана, но очень сложна в связи с трудностью выделения и культивирования D.nodosus (113, 193). Другой важной проблемой является диагностика субклинических форм болезни для определения бактерионосительства у овец и коз (140). С целью получения идентификации возбудителя, определения его серологической группы и вирулентности зарубежными исследователями были предложены иммунологические тесты, ДНК - зонды и ПЦР (1, 60, 86, 125, 214).

При постановке диагноза важно знать, поступали ли овцы из хозяйств, где ранее регистрировались заболевания с признаками хромоты. Необходимо учитывать быстрое распространение заболевания среди взрослого поголовья, обычно связанное с предрасполагающими факторами (сырость, грязь, тепло, скученность животных, травматизм и т.д.) (5). Поэтому копытную гниль овец относят к группе так называемых факториальных болезней, т.е. тех, для развития которых необходимо наличие не только этиологического агента, но и ряда других факторов (причин). Для таких болезней рассмотрение эпизоотологических особенностей вспышки является важным звеном в постановке диагноза.

Из клинических признаков имеют значение длительная, массовая хромота и хроническое течение болезни при отсутствии падежа. В начале заболевания воспалительный процесс затрагивает лишь кожу межкопытной щели, затем наблюдают некроз, расплавление и отслоение стенок рогового башмака от основы кожи. Для выявления этих признаков нужно тщательно очистить копытца от грязи и обрезать лишний рог (5, 35).

Инкубационный период при копытной гнили овец составляет в естественных условиях 10-14 дней (74, 147). При экспериментальном заражении он значительно короче - 2-3 дня (23). В начале заболевания возникает беспокойство животных, зависание, повышение местной температуры и болезненность пораженной конечности. Патологический процесс начинается с кожи межкопытной щели в виде выпадения волос, воспаления. Через несколько дней наблюдаются эрозии кожи, она становится влажной (7, 24). Затем появляется экссудат, превращающийся в серо-белый гной со специфическим запахом. Болезненный процесс распространяется на эпидермис внутренних стенок обоих пальцев и подошвы, вплоть до пяточных частей. Развивается главный признак болезни - хромота. Некротический процесс распространяется дальше и вызывает образование затоков и карманов, полный распад роговой ткани со спаданием, в тяжелых случаях, рогового башмака (7, 16, 17, 209).

Заболевание приводит к нарушению двигательной функции, а хроническое течение - к истощению больных животных (5, 19). Могут одинаково поражаться как передние, так и задние конечности (215). Чаще бывают поражены одна - две, реже три, и, совсем редко - все четыре конечности (19, 29, 28).

Клинический диагноз в развившейся стадии копытной гнили без особых трудностей можно поставить на основе типичного внешнего вида сильно изрезанных или деформированных копытец, а также характерного тухлого запаха. На начальной стадии довольно трудно определить форму заболевания и, как правило, требуется тщательное обследование многих больных животных, количество которых зависит от превалентности стада (192). О присутствии D.nodosus можно судить также по мазкам-отпечаткам или культуральному исследованию.

Без лечения болезнь протекает хронически и может тянуться месяцами. Возможно самопроизвольное выздоровление, но у переболевших овец при неблагоприятных условиях могут возникнуть рецидивы, причем тяжесть поражения не зависит от кратности переболевания (15, 19, 23, 51).

Ткани выше копытного рога (кайма, венчик и т.д.), а также глубокие ткани (сухожилия, связки, суставы и пр.) при копытной гнили не поражаются, других изменений, кроме как в области копыт при данной болезни не наблюдается (5, 147).

Форма клинического проявления копытной гнили у овец определяется вирулентностью вызвавшего её штамма D.nodosus, условий окружающей среды, резистентностью организма хозяина (106, 88, 116, 174, 68, 188).

Взаимодействие этих факторов определяет тяжесть болезни, которая проявляется определенными клиническими признаками, варьирующими от доброкачественной до злокачественной форм копытной гнили (89, 93, 67). С описательными целями были приняты три клинических формы копытной гнили овец: доброкачественная, промежуточная и злокачественная (93, 189). Эти термины также используются для описания штаммов D.nodosus, которые выделяют при соответствующей клинической форме и имеют потенциал вызывать её у зараженных восприимчивых животных.

1.3.2.1. Доброкачественная форма копытной гнили Доброкачественную копытную гниль часто ошибочно называют доброкачественной форме является межпальцевый дерматит, который может сопровождаться небольшим отслоением копытного рога или проходить совсем без отслоения (88). Наблюдается слабая хромота, регресс болезни быстро наступает после соответствующего лечения или наступления сухих условий окружающей среды. При доброкачественной копытной гнили большое количество животных в стаде может поражаться только при наличии очень благоприятных условий для распространения возбудителя. Клинически эта форма определяется, если менее 1% заболевших животных стада имеют повреждения копытного рога (92).

Экономические потери при этой форме копытной гнили, как правило, минимальны (89, 189).

1.3.2.2. Промежуточная форма копытной гнили Клинические симптомы и экономические потери при промежуточной форме копытной гнили по силе проявления находятся между вирулентной и доброкачественной формами (89, 189). Серьезные повреждения, с некрозом и отслоением копытного рога могут быть только у нескольких овец из стада.

Процент пораженных животных сильно варьирует в зависимости от климатических условий. Менее 10% больных овец имеют глубокие повреждения твердого копытного рога (92). У большего числа животных изменения ограничены кожей межпальцевой щели или повреждением мягкого рога пятки и подошвы (188, 191).

1.3.2.3. Злокачественная форма копытной гнили Злокачественная копытная гниль у овец вначале характеризуется воспалением кожи межкопытной щели, которое заканчивается разрывом кожно-рогового соединения по аксиальной линии одного или обоих пальцев. Далее патологический процесс переходит в эпидермис копыта, что заканчивается обширным отслоением передней и абаксиальной стенок копытного рога животного. На конечностях, пораженных в течение нескольких недель или месяцев, копытный рог становится длинным и расщепленным, вызывая сильную хромоту. Поражения при злокачественной форме имеют чрезвычайно сильный неприятный специфический запах. Обычно в стаде поражается большой процент животных, часто болезнью затронуты более одной конечности (55).

Клинически копытную гниль можно охарактеризовать как злокачественную при заболевании более 10% животных с отслоением копытного рога, по крайней мере, на одной конечности (92). При отсутствии необходимых мер борьбы болезнь принимает хроническое течение с большим количеством заболевших животных (55). Именно злокачественная копытная гниль приносит огромные убытки овцеводству, например, в Австралии (89, 189).

1.3.3. Патологоанатомические признаки Поскольку при копытной гнили внутренние органы и системы организма не поражаются, другие патологические изменения локализуются обычно в области копытец. Основа кожи подошвы, боковых внутренних стенок копытец одной, двух, реже трех конечностей в состоянии некротического распада. Роговая стенка отслоена, деформирована и частично распалась. Очаг поражения, особенно со стороны подошвы, представляет собой гнойно-некротическую язву с неровными изъеденными краями, покрытую остатками распадающегося рога. Венчик и вышележащие части конечности, как правило, не поражены (5).

В лабораторной диагностике решающим показателем является обнаружение в мазках из патологического материала специфических одиночных или парных грамотрицательных палочковидных бактерий D.nodosus с утолщениями по краям при наличии соответствующих обследуемых животных. Несомненным диагностическим критерием при микроскопии мазков из патологического материала является обнаружение «феномена Бевериджа» (5, 25, 35). Немного большую иммунофлюоресценции, впервые при копытной гнили примененный Робертсом и Волкером (177). В СССР была разработана непрямая РИФ с диагностической целью Архангельским и др. (5, 21, 25).

дифференцировать его от другой микрофлоры. Возбудитель грамотрицательная палочка с утолщением на одном или двух концах, прямая или слегка изогнутая, размером 6-8 0,6-1,0 мкм. Бактериальные клетки располагаются в поле зрения одиночно или попарно, соединяясь концами, при этом в месте соединения - утолщения отсутствуют. Отдельные бактериальные клетки были окружены тонкими грамотрицательными палочками, расположенными радиально (феномен Бевериджа). Феномен Бевериджа наблюдается только в патологическом материале и не более, чем в 10% исследованных проб. Культуры D.nodosus спор и капсул не образуют.

Описанная морфология характерна также и при выращивании возбудителя на плотной питательной среде (кроме феномена Бевериджа). В тоже время, при культивировании возбудителя копытной гнили на полужидкой и жидкой питательных средах, морфология изменяется: полиморфизм характеризуется изменением величины и формы бактериальных клеток, появлением вздутых, без утолщений палочек с неровной поверхностью (33).

Изоляция и культивирование возбудителя на питательных средах представляет определенные трудности из-за его потребностей в строго анаэробных условиях выращивания и дополнительных питательных веществах. Исследователями в нашей стране и за рубежом было предложено много вариантов сред. Наиболее применяемой из них стал ТАС - агар (TAS agar), содержащий агар, триптиказу, аргинин, серин, дрожжевой экстракт, пептон и порошок копытного рога (83, 169, 127, 184). Эта среда при дефибринированной крови лошади прекрасно подходит для выделения D.nodosus из патологического материала. В России для выращивания возбудителя копытной гнили доступна тиогликолевая среда, которую можно тиогликолевой среды с вышеназванными процентными добавками агара и дефибринированной крови лошади.

При создании соответствующих условий возбудитель выращивают на плотных средах в течение 3-5 суток. При этом наиболее характерные колонии (в частности первично-выделенные изоляты) выглядят следующий образом: круглые, плоские, бесцветные колонии, диаметром до 3 мм с шероховатыми поверхностью и краем, слегка вдавленные в среду и с выпуклым центром, второй тип колоний росинчатые, гладкие, выпуклые (5, 35, 206). Некоторые авторы различают также промежуточную форму колоний - гладко-шероховатую (77). На основании анализа исследований Скерман с соавт. классифицировали колонии D.nodosus на 3 типа:

- В - шероховатый, образующийся при посевах свежих изолятов;

- М - слизистый, промежуточный, образуемый слабовирулентными изолятами и штаммами, выделенными при межпальцевом дерматите;

- С - гладкой, авирулентная культура, возникающая при пассажах на жидкой среде (87).

Авторы считают, что все три типа колоний можно поддерживать на культивировании на жидких средах изменения В - типа в М и С чаще всего носят необратимый характер. Некоторые изменения морфологии колоний возможны в зависимости от состава среды, в частности концентрации агара (5, 77).

Выросшие колонии подвергаются визуальной оценке и из типичных для D.nodosus проводят микроскопическое исследование. Дальнейшее полужидких питательных средах того же состава с добавлением 0,1 - 0,15% агара (5).

Идентификация D.nodosus в мазках из поражений или в культуре свидетельствует о заболевании копытной гнилью (25, 115).

1.3.4.3. Биохимические и протеолитические свойства В биохимическом отношении возбудитель неактивен. Но он выделяет протеолитические ферменты, способные расщеплять желатин, казеин, кератин, свернутый сгусток молока, мясо. Образует сероводород. Не обладает сахаролитическими свойствами (53).

определяют на клинически здоровых овцах. Заражение проводят в скарифицированную кожу свода межкопытной щели, вкладывают тампон с культурой и накладывают повязку на 3-5 дней. За животным устанавливают наблюдение в течение 90 дней. Важно отметить, что даже в случае вирулентных штаммов такое заражение не всегда удается, поэтому овец перед проведением опыта рекомендуется несколько дней выдерживать на влажной подстилке для размягчения копытного рога. Появление хромоты у животного за период наблюдения позволяет судить о наличии вирулентного возбудителя. (25, 33, 35).

характеристиками, как морфология колоний, количество фимбрий на клетках, «судорожной подвижностью», протеолитической активностью и вирулентно-ассоциированные генетические регионы, которые описаны в соответствующем разделе выше (124, 72). Следует отметить, что абсолютной корреляции вирулентности ни с одной из этих характеристик вирулентности методы основанные на изучении протеолитической активности штамма. Таких методов было предложено множество, они считаются классическими и сейчас дополнены новыми молекулярногенетическими исследованиями, что позволило повысить точность определения вирулентности.

Один из известных методов определения вирулентности бактерий основан на способности переваривать нерастворимый эластин. Впервые тест на эластазу был разработан в Австралии для классификации штаммов D.nodosus на вирулентные, промежуточные и слабовирулентные патоварианты. Этот тест был разработан с целью определения хронических носителей вирулентных возбудителей (185). Спустя время, этот тест был переработан, и сейчас учет реакции проводится по времени, прошедшем от инокуляции изолята на пластинку эластинового агара до обнаружения эластолитической активности. Изоляты, которые производят эластазу в течение 7-11 дней, в основном вызывают тяжелые случаи злокачественной копытной гнили, в то время как изоляты с отсроченной активностью эластазы (21-28 дней) вызывают промежуточную или доброкачественную копытную гниль (146).

Позднее в 1988 году был предложен простой и чувствительный метод для обнаружения бактериальной эластазы путем использования растворимого эластина (221). В 1991 году Пириц с сотрудниками сравнили эффективность и чувствительность нерастворимых и растворимых эластиновых субстратов (используя культуры D.nodosus). Они показали, что растворимый эластин обеспечивает большую чувствительность, скорость и объективность, чем нерастворимый. Палмер в 1993 разработал желатиновый тест для определения вирулентности штаммов D.nodosus (164). Обширные исследования изолятов D.nodosus закончились обнаружением многих внеклеточных протеаз, включая кислые и основные (48).

В СССР М. А. Бектемировым (1978) был разработан метод определения протеолитических свойств в 20%-ном геле желатины. Учет ведут в течение 10 дней ежедневно, отмечая степень разжижения желатины.

Автор также отмечал, что при длительном субкультивировании штаммов на жидких и полужидких питательных средах их протеолитическая активность постепенно снижается (5).

Другая группа российских ученых для изучения протеолитических свойств штаммов использовала методику, предложенную Н. М. Масалским.

С её помощью была выявлена различная протеолитическая активность у штаммов D.nodosus (5).

Кроме вышеуказанных методик протеолитическую активность можно определять по отношению к молоку (его свертывание, а затем расплавление сгустка) и разжижению свернутой сыворотки крови лошади, разложению порошка копытного рога, по степени лизиса казеиновой среды (13, 33, 35, 83, 88).

Метод протеолиза сгустка молока или порошка копытного рога, для определения степени активности протеолитических ферментов D.nodosus, более сложен и менее удобен, чем желатиновый тест. В опытах И.Н.Семеновой (33) один из штаммов, дающий в разведении 1 : 32 протеолиз желатины, оказался вирулентным для овец, а штаммы с низкой протеолитической активностью были авирулентными.

устойчивость к действию повышенных температур. Штаммы, вырабатывающие термостабильные протеазы, считаются вирулентными.

Для измерения устойчивости протеаз к действию повышенной температуры был разработан «желатиновый тест», который регулярно применяется до сих пор (164). Протеазы оцениваются как термостабильные, если после нагревания сохраняется минимум 10% их первоначальной активности, и как термонестабильные, если сохраняются менее 4% протеаз (164). Хотя и была обнаружена определенная корреляция между изолятами с положительной протеазной активностью и их вирулентностью, было отмечено несоответствие между некоторыми клиническими диагнозами и лабораторными, количество ложноположительных результатов теста было - 25%. Это объяснялось вероятным вовлечением в процесс других факторов вирулентности (216, 220).

Поэтому, для подтверждения результатов желатинового теста, была разработана зимограммная реакция. При помощи нее произведенные бактерией протеиназы разгоняются в полиамидакриловом геле электрофорезом. Возникает зимограмма, на которой стабильные протеазы определенным образом отделяются от нестабильных, что в совокупности с результатами желатинового теста позволяет судить о вирулентности конкретного штамма (112, 164).

Данные по эффективности разработанной к протеазам ИФА сильно различаются. После изучения Кортом и сотр. (1993) аминокислотной последовательности нескольких из протеаз они получили к ним моноклональные антитела и включили в иммуноферментный анализ (ELISA).

По их данным этот тест улучшал процесс дифференцирования штаммов на вирулентные, промежуточные и слабовирулентные, поскольку экономил время и был пригоден к идентификации D.nodosus прямо из патологического материала (190). Немного позднее было сообщено, что попытки разработки моноклональных антител для ELISA, специфичных к вирулентным и невирулентным штаммам на основе обнаружения протеаз, не привели к получению достоверных корреляций со стандартными тестами (43).

Разработка дот - блот гибридизации с использованием генетических проб к вирулентно-специфичным участкам Кэтцем и др. (124) закончилась разделением штаммов D.nodosus на вирулентные и авирулентные. Однако, авирулентные изоляты не гибридизировались с этими пробами, делая их малопригодными для диагностики копытной гнили. Отбор дополнительных генетических проб, основанных на скрининге девяти вирулентных и девяти авирулентных штаммов серологических групп A-I, позволил провести точное дифференцирование штаммов D.nodosus на вирулентные, промежуточные и авирулентные и превратил это исследование в надежный метод для диагностики копытной гнили (145). Генетические исследования, не будучи серогруппоспецифичными, были эффективны для изолятов всех серологических групп. Лиу и др. (1994) составили общую методику с использованием иммуноблоттинга, эластазного и желатинового тестов и обнаружили их хорошую корреляцию с клиническим проявлением копытной гнили (42, 145).

Используя специфические к вирулентным участкам праймеры (Vf2 и Vr2), полученные из pV470-13, и пару праймеров к авирулентным участкам (Bf and Br), полученную из pB645-335, была разработана ПЦР для улучшения дифференцирования изолятов D.nodosus, вызывающих злокачественную, промежуточную и доброкачественную копытную гниль. Вирулентно- и авирулентноспецифичные праймеры, используемые в комбинации для ПЦР, сделали бы исследование быстрым, чувствительным и специфичным тестом промежуточные и авирулентные и должны сделать результаты доступными в течение 5-6 часов после доставки полевых образцов в лабораторию (144). На сегодняшний день данные о широком применении вышеописанного метода ПЦР отсутствуют. Возможно, в дальнейшем при изучении расшифрованного генома D.nodosus методом обратной генетики с помощью выключения генов будут найдены новые связанные с вирулентностью участки. Поэтому данное направление диагностических исследований может стать перспективным.

Серологические исследования при копытной гнили овец применяются с несколькими целями: для ретроспективной оценки вспышки, оценки поствакцинального иммунитета и типирования штаммов.

Диагностическая ценность серологических исследований сывороток крови больных копытной гнилью овец невелика. Как указывают в своих ранних работах Эгертон с соавторами, уровень антител у овец в РА возрастает к 3-4 неделе заболевания, но не более 4-х кратного увеличения титров (96, 97). В нашей стране после проведенных исследований ученые пришли к выводу, что рекомендовать РА, РНГА, РДП нельзя, т.к. титры антител к О- и К-антигенам у больных животных повышаются не существенно, а РСК вообще оказалась недостаточно чувствительной (5, 9, 31, 32).

Как указано выше, РА, РИД и РНГА нельзя рекомендовать для диагностики болезни, но для оценки поствакцинального иммунитета и эффективности вакцин эти реакции имеют большое значение (5).

Кроме того, на основе данных об иммунологической памяти разработан метод ретроспективной диагностики (т.н. «анамнестический тест») копытной гнили в сыворотке крови переболевших овец. ELISA облегчила диагностику копытной гнили при отсутствии выраженных поражений после выздоровления и невозможности клинического определения носителей. Введение обследуемым овцам небольших количеств ОМП или пилевого антигена при переболевании копытной гнилью позволяет резко увеличить титры антител к этим антигенам в организме спустя продолжительный период времени. Причем амплитуда повышения титров позволяет судить о степени переболевания. Полученные антитела из сывороток крови используются для постановки ELISA, что позволяет оценить статус животных – болели или нет (168, 219).

Поскольку возбудитель копытной гнили выделяет очень специфический фермент - протеазу и как было установлено в организме больных овец вырабатываются антитела к ней класса IgG (96), была разработана и получила распространение методика обнаружения антител к протеазе в сыворотке крови больных овец, такая как реакция угнетения протеазы и её варианты (5).

Определение серологических вариантов. Антигенное разнообразие штаммов D.nodosus было известно еще с тех пор как D.nodosus впервые идентифицировал Беверидж (55). Эгертон (98) был первым, кто обнаружил поверхностные (K) антигены, используя реакцию агглютинации на стекле, основанную на взаимодействии пилевых антигенов и специфических антител, содержащихся в кроличей антисыворотке. Используя К-антиген, который как теперь известно, идентичен фимбриям, Эгертон и Стьюарт классифицировали D.nodosus первоначально на три серологических группы, а именно, A, B и C (98, 195). Одновременно было установлено, что иммунологический ответ на вакцинацию был серогруппоспецифичен (94, классифицировали штаммы D.nodosus, выделенные от австралийских овец, на девять (A-I) серологических групп и 18 серовариантов (64, 66). Изоляты одной серологической группы подразделялись на сероварианты, если наблюдалось достаточное различие между ними.

Альтернативной серогрупповой системой является британская, которая была предложена Деем с сотрудниками (1986), чтобы приспособить другие девять серотипов J-R. В британской системе нет подразделения серогрупп на сероварианты (79).

Однако, три британских серотипа и три американских серотипа, оказалось, были антигенно не связаны ни с одной из девяти австралийских серологических групп (63, 114). Впоследствии, Гимайа с сотрудниками сообщили, что 66 из 1063 штаммов D.nodosus, изолированных из пораженных копытной гнилью овец и коз в Непале, не могли быть классифицированы ни в одну из ранее известных девяти серологических групп (109). Эти изоляты агглютинировались антисывороткой против серотипа М британской классификационной системы. Различный антигенный характер этих изолятов в дальнейшем был подтвержден при определении нуклеотидной последовательности ДНК. Поэтому, эти изоляты вместе с выделенными ранее и классифицированными как серовариант М, были переклассифицированы, как серологическая группа М (63).

Следует отметить, что штаммы, которые не получается серотипировать в РА, являются или малопилатными, или непилатными, чем косвенно можно отнести их к слабовирулентным или авирулентным (224).

Серотипирование, хотя и полезно для эпизоотологического исследования копытной гнили овец, не дифференцирует штаммы D.nodosus на вирулентные, промежуточные и слабовирулентные (64). Единственное преимущество этой системы классификации - прямая зависимость между серологическими группами и защитой после вакцинации (195, 207).

1.3.4.6. Молекулярно-генетические исследования Ранее, процесс постановки диагноза на копытную гниль и определения серогрупповой принадлежности требовал выделения бактерии и очистки серологическими методами (РИФ, РНИФ, а также РА на стекле и в пробирке с использованием кроличьих антисывороток полученных к фимбриям D.nodosus). Обычно процесс занимал 3-4 недели, а специфичность реакций агглютинации осложнялась перекрестной активностью фимбриальных антител и другими внешними факторами. На раннем этапе, как и серологические, молекулярно-генетические методы в отсутствии выделения культуры возбудителя не были способны типировать смеси штаммов D.nodosus, а также не могли проводить их анализ прямо из патологического материала (214).

Начало молекулярно-генетическим исследованиям D.nodosus было положено в 1984 - 1986 годах Андерсоном и Эллеманом с их сотрудниками.

Ученые работали параллельно, но задачи ставили одинаковые – изучение разнообразия фимбриальных генов и разработка на основе полученных данных генно-инженерных фимбрий. По сравнению с современными, методы были достаточно сложны, трудоемки и ненадежны – требовалось создание библиотеки клонов и скрининг на наличие позитивных среди них (с использованием твердофазного радиоиммунного анализа). Тем не менее, клонирования и получения рекомбинантных пилей (69, 162).

В России примерно в те же годы группой ученых (Артюшин С.К., Артюшина И.А., Забережный А.Д., Панасюк С.Д. и др.) проводились работы с аналогичными целями. Результатом явилось создание банка генов D.nodosus и попытки клонирования в E.coli гена пилина, которые также как и бактериальной системы. Были получены положительные результаты при типировании генов фимбриальных белков 18 штаммов в ИФА стандартными серогрупп/вариантов: А, В1, В2, В4, С, D, E, F, G и Н (2, 3, 4).

Примерно в то же время, Ла Фонтейн и Руд теми же методами исследовали другой ген - 16S рРНК. По результатам определения его нуклеотидной последовательности и сравнения с аналогичными последовательностями других бактерий было сделано и опубликовано важное открытие – возбудитель не принадлежит к роду Bacteroides. Наиболее близко он стоял к классу Gammaproteobacteria, в результате был перенесен в свой собственный род и переименован (141).

Вышеописанные исследования положили начало быстрому прогрессу в диагностике копытной гнили за последние двадцать лет. С появлением молекулярных технологий нового поколения, таких как иммуноблоттинг (олиготипирование с помощью генетических проб), ПЦР и ИФА, улучшился процесс видовой, серогрупповой дифференцировки, а также определения вирулентности штаммов D.nodosus (124, 140, 141, 218).

Ла Фонтейн с сотрудниками в 1993 году (140) впервые разработали олигонуклеотиды, комплиментарные к вариабельным участкам гена 16S гибридизации. Среди них были найдены три варианта, чувствительные и олигонуклеотиды были применены в ПЦР для прямой идентификации D.nodosus из патологического материала и показана возможность его применения без необходимости культивирования микроорганизма (140).

Чувствительность обнаружения D.nodosus была улучшена на несколько порядков. Исследование может выявить даже единичную клетку D.nodosus прямо из патологического материала поражений больных копытной гнилью животных и до сих пор широко применяется для диагностики.

Большое значение для разработки диагностических методов имели исследования Мозеса с сотрудниками (41) гена omp1 D.nodosus. Ими было изучено разнообразие его 4-х вариантов (A,B,C,D), разработаны праймеры, получены рекомбинантные белки наружной клеточной стенки и антитела к ним путем иммунизации овец.

Однако все эти методы были мало полезны в эпизоотологическом плане, т.к. лишены возможности определять серогрупповую специфичность.

Чтобы преодолеть это, Закария с группой ученых в 1998 году в Малайзии, использовали PFGE для дифференцировки штаммов D.nodosus с высокой точностью (152). PFGE - связующие профили позволяли дифференцировать 12 штаммов D.nodosus на восемь генотипов и было показано, что все полевые штаммы отличались от референтных. Из-за возможности применения для дифференцирования штаммов, а также обнаружения источника вспышки, эта методика могла бы использоваться для осуществления мониторинга патологических свойств штаммов D.nodosus для эффективной диагностики и контроля за болезнью.

Эти трудности были преодолены с развитием методов типирования для D.nodosus, основанных на ПЦР и определении нуклеотидной последовательности (123, 227).

Следующим шагом в развитии методов диагностики явилась работа Джона с сотрудниками в 1999 году (123). Они провели идентификацию и группировку D.nodosus с использованием ПЦР и нашли, что ПЦР значительно улучшал точность в идентификации и даже типировании D.nodosus прямо из пораженных копытной гнилью материалов. В работе использовался один прямой праймер на консервативный участок 5' - конца гена FimA и 8 обратных праймеров, специфичных к 8-ми серогруппам.

В том же году, в продолжение исследований Мозеса, Гимайер и Эгертон использовали ПЦР - фрагмент рестрикции (PCR-RFLP) белков наружной мембраны дифференцирования его штаммов. В Непале они продемонстрировали его возможности для определения источника инфекции (41, 110, 111).

Эти инструменты полезны для эффективных программ наблюдения, поскольку они определяют штаммы, вызывающие болезнь (эпидемически значимые) и тем самым позволяют избавиться от них.

Ключевой работой по генотипированию штаммов различных серогрупп на основе гена FimA явилась работа Зоу и Хикфорда (226). Они предложили подразделяют штаммы на 3 группы, а затем определяется нуклеотидная последовательность полученных амплификатов, сейчас это наиболее используемый подход (59).

Так как на одной конечности часто находят несколько штаммов D.nodosus, что было показано в предыдущем исследовании, чрезвычайно требовалась методика, которая позволяла бы генотипировать смешанные штаммы D.nodosus прямо из патологического материала пораженных конечностей. Поэтому, Зоу и сотрудники в 2001 году, на основе предыдущего, разработали более быстрый и точный метод типирования для D.nodosus с использованием множественной ПЦР - амплификации и последующей обратной дот-блот гибридизации (228). Так как при обоих исследований, результаты могут быть получены уже через 2 дня после взятия патологического материала.

В настоящее время, простая и быстрая ПЦР для различных серологических групп на основе группоспецифичных праймеров разработана множественная ПЦР («Multiplex-PCR») может определять до 5-ти серогрупп в одной пробирке одновременно (сокращая необходимое количество пробирок до 2-3-х в зависимости от набора праймеров) и дифференцировать специфичность. Метод пока не может надежно работать прямо из патологического материала и требует первичных культуральных посевов без выделения отдельных колоний или, для надежности, с отбором похожих на D.nodosus, так что результаты обычно готовы через 4 дня.

определенных полевых условиях, например, когда отары перемещаются по высокогорным пастбищам вдалеке от человека. В этом случае проводить бактериологическое исследование уже бесполезно, так как большее количество поражений у этих животных заживает естественным путем еще до окончания пастбищного сезона. Необходим тест для идентификации злокачественной копытной гнили (VFR), независимо от клинических симптомов и бактериологического исследования. С этой целью были оценены несколько антигенов D.nodosus и определено, что фимбриальный антиген вызвает более специфический иммунный ответ, чем OMP (168, 217).

Основываясь на этих открытиях, Дангуел с сотрудниками в 2001 году разработали анамнестическую ELISA на основе пилей, ценную как дополнительный диагностический метод для подтверждения вспышек копытной гнили при отсутствии поражений и в случаях бесполезности бактериологического исследования. Таким образом, стало возможно обнаружение латентных носителей при проведении мер борьбы (168).

Молекулярно-генетические исследования вирулентности штаммов D.nodosus на основе обнаружения генов протеаз и вирулентноассоциированных участков рассматривались выше в разделе 2.3.4.4.

И, наконец, большие надежды исследователи копытной гнили овец возлагают на проект «Геном D.nodosus», результатом которого явилось прочтение всего генома возбудителя штамма VCS1703A, циркулярная предварительным данным содержит 1299 генов. Целью этого проекта является идентификация каждого гена в геноме. Особое внимание уделяется раскрытию генетических механизмов биогенеза фимбрий и определению генов, ведущих к проявлению вирулентности у полевых изолятов, что позволит революционировать эпизоотологические исследования копытной гнили. На основе полученных данных, возможно, удастся разработать вакцины, которые смогут не только контролировать, но и повсеместно ликвидировать копытную гниль овец (107, 108).

1.3.4.7. Молекулярная эпизоотология копытной гнили овец Описанные в предыдущей главе исследования позволили показать генетическое разнообразие D.nodosus. С помощью различных методик, используемых в этих исследованиях, было продемонстрировано, что D.nodosus является чрезвычайно генетически разнообразным микроорганизмом, в вариабельных ли регионах фимбрий, белках наружной мембраны или целой хромосомной ДНК.

Первой работой по молекулярной эпизоотологии D.nodosus считается исследование Закарии с сотрудниками, проведенное в Малайзии (152). Хотя было изучено малое количество изолятов - 12, метод PFGE позволил разделить их на 8 молекулярных типов, что подтвердило широкую вариабельность возбудителя. Еще долгие годы после этого ни одна из методик молекулярной эпизоотологии не была применена к большому количеству изолятов, собранных с разнообразных географических областей, и при этом они не были применены к большой группе эпизоотологически связанных изолятов, чтобы определить их ценность для изучения вспышки болезни с ретроспективной точки зрения и анализа рисков на будущее.

Совсем недавно было проведено обширное исследование в Австралии с целью отработки метода PFGE для применения в изучении молекулярной эпизоотологии D.nodosus. Метод PFGE позволил разделить 796 исследуемых изолятов из 303 ферм на 82 клональные группы и был признан наиболее распознающим (213). Полученные данные позволили по новому взглянуть на появление возбудителя, пути распространения вспышек в прошлом, связь эпизоотологических событий и наметить дальнейшие исследования его молекулярной эпизоотологии.

Необходимо принять во внимание, что копытная гниль не единственная болезнь овец, сопровождающаяся поражением копытец и хромотой. Из других заразных заболеваний это могут быть: контагиозный пустулезный стоматит (эктима), ящур, оспа, блутанг, дерматофилез, вольфартиоз. Из неинфекционных заболеваний необходимо, прежде всего, дифференцировать абсцессы копыт, межпальцевую флегмону, а также ряд симптомокомплексов имеющих различные названия: гнойное воспаление межпальцевой железы, пожнивную хромоту, наминки, травмы, ламинит, асептическую сепарацию рога, воспаление синуса копыт, межпальцевую фиброму, язвенный дерматит, асептический пододерматит и т.д. (35).

В последние годы ученые просят ветеринарных врачей обращать особое внимание на два заболевания, имеющих чрезвычайно похожую на копытную гниль симптоматику и часто путаемых с нею. Это контагиозный пальцевый дерматит овец (Сontagious ovine digital dermatitis, CODD).

Возбудителем является Treponema и заболевание начинается с язвы и потери волос в области венчика копытца. Кровотечение и потеря копытного рога происходит с абаксиальной стенки, а не подошвы. О заболевании известно немного, выделяют трепонему и иногда D.nodosus (155).

Второе заболевание – овечий межпальцевый дерматит Interdigital dermatitis, OID, scald), ограничен кожей межпальцевой щели и очень похож на изменения, вызванные авирулентными штаммами D.nodosus (доброкачественная копытная гниль), отличием служит умеренное отделение копытного рога в месте соединения кожи и рога к задней части межпальцевого пространства (165). Возбудитель болезни - F.necrophorum.

Поражения ограничены кожей межпальцевой щели и особенно часто наблюдаются у подрастающих ягнят весной и осенью, хотя может встречаться и у овец любого возраста в течение года, особенно при длительном содержании на влажной подстилке или траве. При данном заболевании хромота может быть сильнее по сравнению со злокачественной копытной гнилью, не смотря на кажущуюся более легкую степень поражений.

Копытная гниль - высококонтагиозная инфекционная болезнь копытец жвачных животных, вызванная Dichelobacter nodosus или синергичным действием бактерий определенных видов, ведущим патогеном из которых является D.nodosus. Инфекция специфична для овец и коз, хотя сообщалось также о заболевании других видов животных. D.nodosus является строго анаэробной, грамотрицательной, палочковидной бактерией, с типичными утолщениями на концах, часто покрытой большим количеством фимбрий.

История изучения копытной гнили овец и ее возбудителя интересна, но достаточно коротка по сравнению со многими другими болезнями. Это произошло из-за чрезвычайной сложности выделения и культивирования возбудителя, многообразия его серологических вариантов, особенностей патогенеза. Однако доказано, что для борьбы с болезнью совершенно необходимо применение вакцинных препаратов, а ликвидация возможна только с помощью аутогенных одно-двуштаммовых вакцин. Эти задачи невыполнимы без проведения эпизоотологического мониторинга на эпизоотических штаммов возбудителя. Из-за сложностей проведения бактериологического исследования D.nodosus, за последние 20 лет в зарубежных странах процесс диагностики и разработки биологических препаратов для борьбы с болезнью был направлен на уход от использования молекулярно-генетических методов. В последние годы были достигнуты иммунологии, разработке улучшенных диагностических методов для последовательности гена фимбриальной субъединицы типа IV D.nodosus традиционные методы определения серогрупп/вариантов, такие как РА, были замещены более быстродействующими, чувствительными и специфичными диагностическими средствами - ПЦР с использованием видовых (на основе гена 16S рРНК) и группоспецифичных праймеров (на основе гена fimA).

Широко применяется секвенирование. Разработаны ELISA, иммуноблоттинг и PFGE. Во многих странах удалось резко снизить убытки причиняемые болезнью, а в Непале и Бутане – ликвидировать болезнь.

К большому сожалению, в России при высокой заболеваемости в овцеводческих регионах, за последние 20 лет не проводилось никаких значимых исследований в области улучшения диагностики копытной гнили овец. За этот период было утеряно много знаний и сейчас очень важно их восстановить. В России до сих пор нет ни одного молекулярно-генетического метода исследования D.nodosus. На основе изучения мирового опыта у нас есть возможность разработать новые современные диагностикумы, провести эпизоотологический мониторинг болезни, что поможет усовершенствовать средства специфической профилактики и включить их в программы по борьбе с копытной гнилью в нашей стране.

В России сейчас необходимо на основе полученного ранее опыта продолжить исследования двадцатилетней давности и вывести их на современный уровень. Главным преимуществом этих разработок будет быстрота, специфичность и устранение от отнимающих много времени процедур бактериологического выделения возбудителя, что позволит укоротить время лабораторной диагностики с 3 - 4 недель до одного дня и снизить процент ложноотрицательных результатов от неудач при культуральных исследованиях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и инфекционных болезней Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина», ПЦР и секвенирование проводились в лаборатории молекулярной диагностики Государственного учреждения "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского», а реактивация коллекции штаммов D.nodosus – в лаборатории микробиологии Всероссийского научноисследовательского института экспериментальной ветеринарии им.

Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).

В работе использовались 27 штаммов Dichelobacter (Bacteroides) nodosus из коллекции бактерий Лаборатории инфекционных болезней овец ВИЭВ им.

Я.И.Коваленко, выделенных в 1970-80-е гг. на территории бывшего СССР (И.Н. Семенова, А.А. Сидорчук, А.М. Бектемиров). Также в исследованиях Ставропольской биофабрикой для производства вакцины «Овикон» и депонированный во ВГНКИ. Все исследуемые штаммы хранились в лиофилизированном виде в запаянных (под вакуумом) ампулах. В качестве защитной среды использовалось обезжиренное молоко. Ампулы хранились в холодильнике при температуре 8-10°С. Отобранные для работы ампулы не имели повреждений и сохранили вакуум.

Проведение серологического типирования этих штаммов проводилось Сидорчуком А.А. и Семеновой И.Н. в 1987 году в лаборатории инфекционных болезней овец ВИЭВ им. Я.И.Коваленко с помощью К антисывороток фирмы Coopers Animal Health N.Z. ltd. в перекрестной РА на стекле по методике фирмы - изготовителя (33, 35). Набор сывороток содержал 10 серогрупп/вариантов: А, В1, В2, В4, С, D, E, F, G и Н. В результате исследования были определены серогруппы/варианты у большинства имеющихся штаммов, некоторые определены неточно или не типированы. Штаммы С, Войтик, Знамя труда, Львов и Яг в том эксперименте не участвовали, т.к. были выделены позднее (таблица 1).

Повторно типирование штаммов возбудителя копытной гнили овец проводили с помощью иммуноферментного метода в 1988 году, применяя вышеназванный набор сывороток (3).

Штаммы бактерий, применявшиеся для определения специфичности ПЦР Staphylococcus aureus Clostridium perfringens Clostridium septicum Pseudomonas aeuroginosa Corynebacterium pyogenes Streptococcus zooepidermicus Fusobacterium necrophorum Fusobacterium nucleatum Для определения специфичности разработанной ПЦР и как тесткультуры при проведении бактериологических исследований применялись несколько штаммов различных видов бактерий, которые также находились в лиофилизированном состоянии в ампулах (таблица 2).

2.1.1.2. Нуклеотидные последовательности референтных штаммов Для составления консенсусных последовательностей, элайнментов нуклеотидных последовательностей с целью генотипирования и проведения филогенетического анализа исследуемых нами штаммов были использованы использовались нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК, для генотипирования и построения филогенетических дендрограмм были использованы нуклеотидные последовательности гена fimA этих штаммов.

Перечень референтных штаммов D.nodosus из базы данных GenBank В качестве основной питательной среды для реактивации штаммов D.nodosus, изучения их жизнеспособности, морфологических, тинкториальных и культуральных свойств была использована тиогликолевая среда (Хаймедиа, Индия, кат. № М009-500), приготовленная в соответствии с инструкцией. Перед посевами среду регенерировали кипячением в течение 20 мин.

В качестве контрольных сред использовали агар (ПА) и бульон (ПБ) на основе сухих питательных сред (Becton Dickinson, США, кат. № 213000, 234000), мясо – пептонный печеночный бульон (МППБ, среда Китта – Тароцци) (Хаймедиа, Индия, кат. № M928), среду Сабуро (Хаймедиа, Индия, кат. № M063).

Для изучения культуральных свойств и получения клеток D.nodosus с целью проведения молекулярно-генетических исследований использовали также 2,5% кровяной агар на тиогликолевой основе, содержащий 10% дефибринированной крови лошади.

Синтез всех использованных в работе олигонуклеотидов заказывали в ООО НПФ «Синтол», г. Москва. Для синтеза были выбраны специфические праймеры, предложенные Ла Фонтейном для амплификации фрагмента гена 16S рРНК и Зу – для амплификации фрагмента гена fimA D.nodosus (140, 226). Всего в работе было использовано 7 праймеров (таблицы 4 и 5).

Праймеры для амплификации фрагмента гена 16S рРНК D.nodosus Направление Название Нуклеотидная последовательность

CGGGGTTATGTAGCTTGC

TCGGTACCGAGTATTTСTACCCAACACCT

Праймеры для амплификации фрагмента гена FimA D.nodosus Обратный FimA-R Обратный FimA-R

GCTATTCCACAATACCAAAACTACAT 67 DиH

Прямой FimA-DH-F

GTACCGAAGTACACCTTTGATTG 63 DиH

Обратный FimA-DH-R Указанные в таблице 5 праймеры предназначены для амплификации двух третей С - концевого вариабельного участка гена FimA D.nodosus. Два прямых праймера связываются специфично по классам, а три обратных специфичны для определенного набора серогрупп/серовариантов.

Три - реагент («Tri Reagent», Molecular Reasearch Center, Ins.Cincinnati, США); трис основной, дезоксинуклеотидтрифосфаты, ЭДТА (Promega, США); хлорид калия, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид натрия, гидроксид натрия, легкоплавкая агароза, диэтилпирокарбонат, силика (Sigma, США); уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изопропиловый спирт – ректификат, ацетон, фосфатный буфер (PBS), SDS (Химмед, Россия);

глицерин (Merck, Германия); тритон Х-100 (ICN, США); масло минеральное (ESSO, Германия); метиловый оранжевый (Реахим, Россия); бромистый этидий (Serva, Германия); гуанидинтиоцианат (PeqLab, Германия).

Маркер молекулярной массы от 100 до 1400 п.о. (GeneRulertm 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas, Литва). Фермент Taq-полимераза (Promega, США). Набор для выделения ДНК из геля (Promega, DNA Purification System, Wizard, США). Набор для секвенирования ДНК Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США).

«Набор – I» для выделения ДНК из тест-системы для индикации и дифференциации M. bovis и M. tuberculosis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) («Ветбиохим», г. Москва).

В работе использовали: автоматический секвенатор ABI PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США), монитор и компьютер (DELL), вортекс “Fisons” (UK), твердотельный термостат “Гном” (ДНК-Технология, Россия), источник питания “Эльф” (ДНК-Технология, Россия), настольная микроцентрифуга “Eppendorf” (Eppendorf, Германия), центрифуга с охлаждением RC2-B (Sorvall), прибор для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле (Хеликон, Россия), вакуумный насос (Gast), снегоделательная машина AF100 (Scotsman), низкотемпературный холодильник (Nuare), амплификатор «Терцик» (ДНК-Технология, Россия), термостат воздушный ТС-1/80 (СПУ, Россия), трансиллюминатор, холодный шкаф “Bromma” (LKB), механические пипетки переменного объема (Eppendorf, Германия), автоклав настольный Sanyo, холодильник (Stinol), система для очистки воды Milli Q (Millipore, США), электронные настольные весы 1219МР (Sartorius), магнитная мешалка ММ-5 (СССР), PH-метр 420A+ (Thermo Orion, США), спектрофотометр Biophotometr (Eppendorf, Германия), фотокамера для фотографирования гелей (Olympus C5060 Wide Zoom), микроскоп «Биомед – 6» (Биомед, Россия), анаэростат АЭ-01(Ники МЛТ, Россия), дистиллятор ДЭ-10/789 (Россия).

Ампулы со штаммами бактерий вскрывали в условиях бокса или ламинарного бокса в асептических условиях, у пламени спиртовки и делали посевы. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 3 – 4 -х дней до появления видимого роста. При необходимости проводили повторные пассажи. Одновременно делали посевы на ПА, ПБ, среду Китта-Тароцци и агар Сабуро для контроля отсутствия контаминации, а также делали мазки, окрашивали по методу Грама и микроскопировали.

При наличии характерного роста колоний культуры с жидкой среды пересевали на кровяной тиогликолевый агар в чашки Петри, помещали в анаэростат, в котором создавали анаэробные условия, инкубировали при 37°С в течение 4 – 6-ти дней. Оценка роста проводилась визуально, морфологические и тинкториальные свойства бактерий - микроскопией мазков, окрашенных по методу Грама.

2.1.2.2. Взятие проб диагностического материала для молекулярно - генетического исследования При экстракции ДНК D.nodosus необходимо получить достаточное количество бактериальных клеток возбудителя для проведения ПЦР. В случае изучения штаммов D.nodosus этим материалом была среда с бактериальной массой или смывы культуры клеток с плотной среды, а также лиофильно высушенные штаммы в ампулах. Патологическим материалом являлись пораженные ткани копытец. Нами применялись несколько методов взятия диагностических проб:

1) получение бактериальных клеток D.nodosus с плотной питательной среды. Для получения бактериальных клеток с плотной питательной среды с кровяного тиогликолевого агара колонии культуры D.nodosus смывали 2-мя мл 0,9% NaCl (или PBS) и помещали в микропробирки, центрифугировали минут при 13200g, отбирали надосадок, осадок ресуспендировали в PBS или 0,9% NaCl (количество зависело от выбора способа выделения ДНК, 200- мкл). При необходимости, шаги по отмыванию бактерий повторяли;

питательной среды. Для взятия проб культуры из полужидкой питательной среды пастеровской пипеткой набирали материал в количестве около 1 мл.

Его помещали в микропробирки и для осаждения агара кратковременно (15секунд) центрифугировали при 12000-13200g, набирали 450 мкл надосадка и переносили в свежие микропробирки для дальнейшего выделения ДНК. В случае слабого накопления бактериальной массы D.nodosus в культуральной пробирке, после взятия пробы и проведения вышеописанного шага по удалению агара можно сконцентрировать возбудителя путем осаждения выполнения этой задачи необходимо было брать большее количество первичных проб, так чтобы в результате получать из них одну. Для этого, центрифугировали 10 минут при 13200g для осаждения клеток, далее добавляли 2-3 мл 0,9% NaCl (или PBS), перемешивали на смесителе типа необходимости, шаги по отмыванию бактерий повторяли до получения ресуспендировали в PBS или 0,9% NaCl в таком количестве, чтобы после слива проб из нескольких микропробирок в одну конечный объем становился 200-500 мкл в зависимости от выбранного способа выделения ДНК;

3) лиофилизированные штаммы бактерий, запаянные в ампулы или флаконы. Для этого в асептично вскрытую ампулу вносили 200-500 мкл PBS или 0,9% NaCl, растворяли образец и переносили в микропробирку для дальнейшего выделения ДНК;

4) взятие патологического материала посмертно проводилось с пораженных копытец в микропробирки с соблюдением правил асептики. На каждое животное использовали новую пару стерильных перчаток. После вынужденного убоя больных животных пораженные копытца отрезали по запястный сустав и в течение 24 часов доставляли в лабораторию во льду.

Перед взятием проб копыто хорошо отмывалось от грязи водой. Пробы брали с мест наибольшей локализации возбудителя – кожи межкопытной щели, а также линии отделения копытного рога и основы кожи копыта. Кусочки патологического материала вырезали профламбированными инструментами и помещали в раствор PBS или 0,9% NaCl, растирали в ступке около минут до получения гомогенной суспезии. Для исследования брали только суспензию (без твердых частичек копытного рога) в количестве 2-3 мл, добавляли лизоцим в количестве 4 мг/мл и держали при 4°С 2 часа (не менее) для лизиса бактериальных клеток. Для дальнейшего проведения выделения ДНК брали 200-500 мкл жидкости;