Sci. USA 92, 6971-6975). Мы проверили, можно ли понизить ложную рекомбинацию РНК-фрагментов путем уменьшения количества обратной транскриптазы M-MLV в реакционной смеси по сравнению со стандартной, рекомендуемой фирмамипроизводителями (200 ед на 20 мкл среды). Для этого 5'- и 3'- фрагменты RQ135-1(-) РНК (рис. 6Б) либо ранее выделенный РНК-рекомбинант RQ187 (рис. 6А) отжигали с Рис. 7. Уменьшение частоты ложной рекомбинации в ходе обратной транскрипции при проведении реакции в геле.

Выход рекомбинантов определяли путем подсчета колоний ДНК, полученных в результате проведения и ОТ, и ПЦР в геле (верхний ряд), либо ОТ в жидкости, а ПЦР в геле (нижний ряд) с использованием праймеров А и Б (см. подпись к рис. 5). В качестве матрицы использовали либо смесь 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК, либо рекомбинантную РНК RQ187. Обратную транскрипцию проводили в присутствии 200 ед обратной транскриптазы M-MLV (USB). Колонии выявляли посредством гибридизации на мембране с флуоресцентно меченным олигодезоксинуклеотидом.

олигодезоксинуклеотидом, комплементарным 3'-фрагменту, а затем проводили ОТ с использованием 200 или 2 ед обратной транскриптазы. Оказалось, что 100-кратное понижение концентрации обратной транскриптазы снижает частоту ложной рекомбинации приблизительно в 100 раз (рис. 6Б), но при этом не существенно влияет на эффективность обратной транскрипции рекомбинантной РНК (рис. 6А).

Таким образом, уменьшая концентрацию обратной транскриптазы, можно понижать частоту ложной рекомбинации.

Снижение частоты ложной рекомбинации РНК при проведении обратной транскрипции в геле. Мы предположили, что проведение обратной транскрипции в геле поможет снизить частоту ложной рекомбинации из-за пространственного разделения участников рекомбинации.

Оказалось, что это действительно так. Частота ложной рекомбинации при обратной транскрипции фрагментов RQ135-1(-) РНК в геле составила примерно 10-5, а в жидкости 10-3 (рис. 7, ср. число колоний, образованных смесью РНК-фрагментов и продуктом их рекомбинации). Таким образом, проведение обратной транскрипции в геле позволяет снизить частоту ложной рекомбинации примерно в 100 раз.

Рис. 8. Зависимость фосфоролиза РНК Tth-ПНФазой от концентрации ионов Mg2+.

Результат электрофореза в 8% полиакриламидном геле 0,5 пмоль 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, отожженного в присутствии либо в отсутствие 2,5 пмоль олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-концу РНК, после инкубации с 2 пмоль Tth-ПНФазы и 1 мМ Naфосфатом при указанных концентрациях MgCl2 при 65°С. Каждая проба содержала 0,056 мМ ЭДТА. Гель окрашивали серебром.

3. Избирательное уничтожение РНК с помощью ложноотрицательных результатов (неспецифический синтез кДНК), так и ложноположительных результатов (ложная рекомбинация), можно было бы решить, уничтожив перед обратной транскрипцией посторонние РНК, но сохранив искомые.

Например, можно было бы избирательно уничтожить посторонние РНК с помощью 3'5'-экзорибонуклеазы, тем или иным способом защитив 3'-конец целевой РНК.

Ранее было показано, что 3'5' экзорибонуклеаза полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза) из клеток Escherichia coli разрушает поли(А)-последовательность на 3'-конце эукариотических мРНК, но не разрушает остальную часть мРНК, если реакцию проводят в условиях, когда вся РНК, за исключением поли(А)-последовательности, сохраняет вторичную структуру (Soreq et al. 1974. J. Mol. Biol. 88, 233-245). Однако данная экзорибонуклеаза не может быть использована для уничтожения любой РНК, так как она не активна в условиях, разрушающих вторичную структуру РНК. Мы предположили, что с этой целью можно использовать ПНФазы из термофильных организмов, так как они остаются активными при высокой температуре, дестабилизирующей вторичную структуру РНК. Однако способность ПНФаз из термофильных организмов осуществлять фосфоролиз РНК не была исследована.

Свойства полинуклеотидфосфорилазы Thermus thermophilus. В 1977 году был выделен препарат ПНФазы из T. thermophilus (Tth-ПНФазы), однако оказалось, Рис. 9. Уменьшение частоты ложной рекомбинации фрагментов РНК в результате избирательной деградации одного из фрагментов перед обратной транскрипцией.

(А) Результат электрофореза в 8% полиакриламидном геле отожженной смеси 5'- и 3'фрагментов RQ135-1(-)РНК и олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-концу 3'фрагмента, после инкубации в отсутствие (-) или в присутствии Tth-ПНФазы (+) при 65°С в течение 15 мин. Гель окрашивали серебром.

(Б) Продукты ОТ-ПЦР отожженной смеси 5'-, 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК и олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-фрагменту РНК, либо предынкубированных, либо не предынкубированных с Tth-ПНФазой при 65°С в течение мин перед ОТ-ПЦР. Гель окрашивали бромистым этидием. Стрелка указывает положение продукта рекомбинации фрагментов по механизму смены матриц.

что он полностью лишен фосфорилазной активности – вероятно, в результате его протеолитической деградации в процессе выделения (Hishinuma et al. 1977. Eur. J.

Biochem. 77, 575-583). Мы показали, что этот же фермент, очищенный из клеток E.

coli, содержащих плазмиду, несущую ген Tth-ПНФазы, обладает фосфорилазной активностью и позволяет полностью уничтожить при 65°С 3'-фрагмент RQ135-1(-) РНК, который обладает очень стабильной вторичной структурой. В то же время Tth-ПНФаза не разрушает РНК, 3'-конец которой гибридизован с комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом (рис. 8). Из этого следует, что исследуемый препарат действительно обладает 3'5'-экзонуклеазной активностью, а также то, что РНК можно специфически защитить олигонуклеотидом, комплементарным ее 3'-концу.

Mg2+ и некоторые другие двухвалентные катионы являются кофакторами TthПНФазы, однако при высокой температуре, необходимой для разрушения вторичной структуры, они могут также вызывать неэнзиматическую деградацию РНК. Мы эквимолярных концентрациях Mg2+ и ЭДТА (рис. 8). Это позволяет проводить энзиматическую деградацию РНК при очень низкой концентрации свободных ионов Mg2+, когда неэнзиматическая деградация минимальна. В последующих экспериментах концентрацию ионов Mg поддерживали на уровне 40 – 100 мкМ.

Рис. 10. Влияние модификаций 3'-конца на деградацию РНК Tth-ПНФазой.

(А) Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину, смеси 5'-фрагмента (нижняя полоса) и 3'-фрагмента (верхняя полоса) RQ135-1(-) РНК, в которой 5'-фрагмент окислен периодатом (3'oxi), а 3'-фрагмент не модифицирован (3'ОН).

Смесь не обрабатывали (Н/О) или обрабатывали Tth-ПНФазой (ее количества указаны в пмоль), либо не подвергая предварительным обработкам («исходная смесь»), либо предварительно обрабатывая анилином («после анилина»), в результате чего на 3'-конце 5'фрагмента оказывался фосфат (3'P), либо обрабатывая анилином, а затем фосфатазой («после фосфатазы»), снимающей фосфатную модификацию (3'ОН).

(Б) Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, либо модифицированного биотином на 3'-конце (3'БИО), либо без модификаций (3'OH), который был либо не обработан (–), либо обработан 2 пмоль Tth-ПНФазы (+), либо смешан со стрептавидином перед электрофорезом (Стр). Гели окрашивали серебром.

Снижение частоты ложной рекомбинации РНК путем уничтожения одного из субстратов Tth-ПНФазой. Рис. 9А демонстрирует, что если Tth-ПНФазой обработать отожженную смесь и 3'-фрагментов RQ135-1(-)РНК, а также 5'олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-концу 3'-фрагмента, то защищенный уничтожается. Таким образом, Tth-ПНФаза позволяет осуществлять селективную деградацию РНК.

Рис. 9Б демонстрирует, что такая обработка на 2-3 порядка снижает частоту ложной рекомбинации 5'- и 3'-фрагментов при обратной транскрипции.

немодифицированного 3'-фрагмента и 5'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, окисленного периодатом натрия с образованием диальдегидной группы на 3'-конце, инкубировали с Tth-ПНФазой либо сразу, либо после обработки анилином (в результате чего на 3'конце 5'-фрагмента оказывалась фосфатная группа), либо после дополнительной обработки фосфатазой (что восстанавливало 3'-гидроксил на 5'-фрагменте). Рис. 10А демонстрирует, что для защиты от деградации ПНФазой можно использовать не только олигонуклеотид, но и модификацию 3'-конца РНК, причем высокая устойчивость 3'-фосфорилированной РНК к Tth-ПНФазе не связана с химической модификацией полирибонуклеотидного остова в процессе обработки периодатом или Рис. 11. Защита от ПНФазы трех «вложенных» РНК, различающихся длиной 3'концевой части, олигонуклеотидом, комплементарным 3'-концу наименьшей из РНК.

Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле: (А) РНК, обработанных (+) или не обработанных (-) Tth-ПНФазой в отсутствие или в присутствии олигодезоксинуклеотида Rкомплементарного каждой из РНК в позиции 72-109; (Б) наиболее длинной (PvuII) РНК, олигодезоксинуклеотида R-38, либо не модифицированного (б/м), либо содержащего LNA-модифицированных звеньев, сгруппированных вблизи 5'-конца (LNA1), или распределенных по его длине (LNA2). Стрелками показано положение продуктов, устойчивых к деградации. Гели окрашивали серебром. (В) - Радиоавтограф 6% секвенирующего полиакриламидного геля после электрофореза в денатурирующих условиях [-32P]РНК (SmaI, EcoRI, PvuII). 1 - полноразмерная SmaI-РНК, 5 – EcoRI-РНК, частично деградированная слабой щелочью с целью получения 1-нуклеотидной «лесенки». 2–4 - продукты деградации SmaI-, EcoRI- и PvuII-РНК, соответственно, гибридизованных с олигодезоксинуклеотидом R-38.

анилином, так как РНК становится вновь подверженной фосфоролизу после удаления 3'-фосфата фосфатазой.

Если окисленную РНК обработать гидразидом биотина, что приводит к добавлению биотиновой группы на 3'-конец РНК, то РНК также становится устойчивой к действию ПНФазы (рис. 10Б). Наличие биотиновой группы на 3'-конце РНК полиакриламидном геле при образовании ее комплекса со стрептавидином.

комплементарным внутреннему участку РНК. Не всегда олигонуклеотид, комплементарный 3'-концу, может обеспечить избирательную защиту РНК. Например, большинство эукариотических мРНК имеют на 3'-конце поли(А)-последовательность.

В этом случае, избирательную защиту мог бы обеспечить олигонуклеотид, комплементарный внутреннему участку РНК. Чтобы проверить такую возможность, мы использовали точный 3'-фрагмент RQ135-1(-) РНК (SmaI) и его удлиненные на 28 нт (EcoRI) и 194 нт (PvuII) варианты, полученные путм транскрипции плазмиды, несущей кДНК 3'-фрагмента и линеаризованной, соответственно, по сайту рестрикции SmaI и нижележащим сайтам EcoRI и PvuII. Полученные РНК гибридизовали с олигодезоксинуклеотидом, комплементарным 3'-концевой последовательности наиболее короткой РНК (SmaI) и внутренним последовательностям более длинных РНК (EcoRI и PvuII), а затем инкубировали с Tth-ПНФазой. Видно, что олигонуклеотид защищает всю SmaI-РНК, но лишь часть EcoRI- и PvuII-РНК (рис. 11А), то есть TthПНФаза удаляет одноцепочечный участок, выступающий на 3'-конце. В результате образуется устойчивый продукт, который оказывается примерно на 8 нт длиннее, чем SmaI-РНК, что было показано с использованием электрофореза высокого разрешения (рис. 11В). Из рисунка 11А также следует, что, выход укороченных EcoRI- и PvuII-РНК существенно ниже 100%. Следовательно, олигонуклеотид, гибридизованный с внутренним участком, не может полностью остановить ПНФазу, начавшую деградацию РНК. Это, по-видимому, вызвано тем, что в ходе инкубации гибрид «дышит»: как только олигонуклеотид частично диссоциирует от РНК, он вытесняется связанной с РНК ПНФазой.

Мы предположили, что стабилизация гибрида может повысить защитный эффект олигонуклеотида. С этой целью использовали олигонуклеотиды, часть звеньев которых содержат рибозные кольца, фиксированные в 3'-эндо-конфигурации путем введения 2'-O,4'-C-метиленового мостика (LNA-модификация, от «locked nucleic acid»). Оказалось (рис. 11Б), что введение LNA-аналогов нуклеотидов в состав олигодезоксинуклеотида, комплементарного внутреннему участку РНК, действительно улучшает защиту РНК от действия ПНФазы. После деградации наблюдается примерно одинаковое количество укороченной РНК независимо от того, как распределены LNA-модифицированные звенья (сгруппированы у 5'-конца или распределены по длине олигонуклеотида). Полученные результаты демонстрируют, что РНК можно эффективно защитить от ПНФазы олигонуклеотидом, комплементарным внутреннему участку РНК. Помимо борьбы с артефактами обратной транскрипции, это можно использовать для выделения РНК определенного вида из сложных природных смесей, а также для получения РНК, укороченных с 3'конца на заданную величину.

4. Применение разработанных подходов для изучения истинной рекомбинации РНК, осуществляемой Q-репликазой Поскольку рекомбинация РНК – редкое событие, то для того, чтобы обнаружить продукты рекомбинации, их необходимо размножить. В нашей лаборатории была создана система для размножения рекомбинантных РНК, использующая QРис. 12. Применение селективной деградации РНК для наблюдения рекомбинации РНК, осуществляемой Q-репликазой in vitro.

(А) Колонии ДНК, выросшие из продуктов ОТ, осуществленной с использованием 20 ед обратной транскриптазы M-MLV, смеси 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК, предынкубированной в отсутствие (нижний ряд) или в присутствии (верхний ряд) Qрепликазы в течение 45 с, а затем с Tth-ПНФазой в условиях, обеспечивающих избирательную деградацию 5'-фрагмента.

(Б) Электрофоретический анализ в 8% полиакриламидном геле содержимого колоний (элюат). М - продукт ложной рекомбинации смеси 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК ( п.о.).

репликазу, которая в изотермических условиях экспоненциально размножает полноразмерные реплицирующиеся РНК, но не может размножать их фрагменты (Chetverin et al. 1997. Cell 88, 503-513). Такой подход позволил впервые наблюдать и изучать рекомбинацию РНК in vitro, но у него есть ряд ограничений. Во-первых, из-за узкой матричной специфичности Q-репликазы, определнные виды рекомбинантов обладают преимуществом при размножении; иными словами, продукты рекомбинации подвергаются селекции, что искажает результаты. Во-вторых, в этой системе нельзя изучать рекомбинацию молекул РНК, не являющихся матрицами для Q-репликазы.

размножения, такой как ОТ-ПЦР, позволяющий приблизительно с равной эффективностью размножать практически любые последовательности, заключенные между заданными праймер-специфичными участками. Однако до настоящего времени применению ОТ-ПЦР с этой целью препятствовала ложная рекомбинация РНК при обратной транскрипции, частота которой превышает частоту истинной рекомбинации.

Разработанные способы подавления ложной рекомбинации мы использовали для размножения с помощью ОТ-ПЦР продуктов рекомбинации между 5'- и 3'фрагментами RQ135-1(-) РНК, катализируемой Q-репликазой (Chetverin et al. 1997.

Cell 88, 503-513). Были выбраны два прима: 1) избирательная деградация 5'фрагмента перед ОТ с помощью Tth-ПНФазы и 2) осуществление ОТ при пониженной концентрации обратной транскриптазы. Фрагменты РНК - субстраты рекомбинации Рис. 13. Содержание разных типов рекомбинантных РНК при использовании различных способов их размножения.

Относительная частота (в %) встречаемости рекомбинантов двух типов, размноженных с помощью (А) ОТ-ПЦР в данной работе и (Б) Q-репликазы (Chetverin et al. 1997. Cell 88, 503-513). Фрагменты RQ135-1(-)РНК показаны частично. Последовательности гомологичных чужеродных довесков выделены жирным шрифтом. Стрелки соединяют нуклеотиды, между которыми произошла рекомбинация.

инкубировали с репликазой и нуклеозидтрифосфатами в течение короткого промежутка времени (45 с), чтобы исключить экспоненциальное размножение продуктов рекомбинации. После фенольной экстракции, РНК отжигали с олигодезоксинуклеотидом, комплементарным 3'-концу 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, а значит и рекомбинантной РНК того же знака, и подвергали фосфоролизу TthПНФазой. Tth-ПНФазу убирали фенольной депротеинизацией и проводили ОТ, используя 20 ед обратной транскриптазы M-MLV. ПЦР проводили в геле, а выросшие колонии ДНК выявляли посредством гибридизации на мембране с флуоресцентномеченным олигонуклеотидом, гомологичным чужеродным довескам фрагментов (рис. 12А). О том, что эти колонии образованы продуктами истинной рекомбинации РНК, говорит тот факт, что колоний нет в вариантах, где репликазу не добавляли.

Электрофоретическая подвижность материала колоний, элюированного из геля (рис. 12Б, дорожка отличается от подвижности ложного рекомбинанта, образованного из тех же фрагментов РНК обратной транскриптазой (рис. 12Б, дорожка М).

Клонирование и секвенирование содержимого колоний показало, что они не содержат рекомбинантов гомологичного типа, которые могли бы образоваться при рекомбинации по механизму смены матриц. Все обнаруженные рекомбинанты являются негомологичными (рис. 13А), как и рекомбинанты, размноженные Qрепликазой (рис. 13Б). В каждом случае можно выделить два типа рекомбинантов.

Первый тип представлен молекулами, включающими оба субстрата рекомбинации целиком, а второй тип – молекулами, включающими целый 5'-фрагмент, но укороченный с 5'-конца 3'-фрагмент. Однако относительное содержание этих типов в продуктах рекомбинации является диаметрально противоположным. Так, первый тип составляет более 80% продуктов рекомбинации, размноженных с помощью ОТ-ПЦР, но лишь чуть более 10% продуктов рекомбинации, размноженных Q-репликазой.

Таким образом, при использовании разных способов размножения частота встречаемости различных типов рекомбинантов существенно отличается. Повидимому, это отражает преимущественное размножение Q-репликазой рекомбинантов второго типа. Размножение же с помощью ОТ-ПЦР, особенно в формате молекулярных колоний, где отсутствует конкуренция между ампликонами, происходит практически в отсутствие селекции. Поэтому следует сделать вывод, что именно первый тип рекомбинантов, включающих оба субстрата рекомбинации целиком, является основным продуктом рекомбинации, катализируемой Qрепликазой.

5. Применение разработанных подходов для высокочувствительной и Определение вирусных РНК и ДНК в крови. Определение одиночных молекул вирусных РНК и ДНК в крови позволяет выявлять зараженную донорскую кровь на станциях переливания крови и таким образом препятствовать распространению опасных инфекций, а также отслеживать стадию заболевания и эффективность лечения инфицированных пациентов. На рис. 1Б показан результат одного из модельных экспериментов, в котором в лизат 100 мкл крови здорового донора добавили 150 молекул фрагмента РНК вируса СПИД (HIV-1) и 50 молекул фрагмента ДНК вируса гепатита B (HBV), затем суммарные нуклеиновые кислоты выделили с помощью разработанного нами метода и, после ОТ в жидкости, кДНК HIVи HBV обнаружили в виде молекулярных колоний. Результаты демонстрируют, что разработанные нами подходы позволяют специфически обнаруживать в клинических образцах 50% вирусной РНК-мишени и 100% ДНК-мишени. Это соответствует чувствительности, равной 2 молекулам РНК и 1 молекуле ДНК на фоне 50-100 мкг нуклеиновых кислот человека, содержащихся в 100 мкл крови, что более чем в триллион раз превышает массу искомой мишени.

Обнаружение маркера острого миелоидного лейкоза мРНК AML1-ETO в образцах пациентов. Разработанные подходы, включающие усовершенствованный метод выделения РНК, оптимизированную стадию обратной транскрипции и ПЦР в Рис. 14. Отсутствие мРНК AML1-ETO в крови и костном мозге пациента 1.

РНК, выделенную с помощью усовершенствованного метода из 90 мкл костного мозга (А) или цельной крови (Б), взятых в указанные даты, подвергли обратной транскрипции с 2 ед фермента SuperScript® и ПЦР в геле, либо без добавления (верхний ряд), либо с добавлением 135 молекул мРНК AML1-ETO (нижний ряд). Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами.

гелях, мы применили для ретроспективного анализа минимальной остаточной болезни у прошедших химиотерапию больных острым миелоидным лейкозом, ассоциированным с хромосомной транслокацией t(8;21). Молекулярным маркером трансформированных лейкоцитах при транскрипции химерного гена, образованного в результате указанной транслокации. Были исследованы образцы крови и костного мозга двух пациентов, взятые через определенные промежутки времени.

Оказалось, что у пациента 1 маркерная РНК не выявляется в пробах крови и костного мозга, взятых с интервалом в шесть месяцев (рис. 14, верхний ряд). Когда к тем же образцам добавили по 135 молекул фрагмента мРНК AML1-ETO, то наблюдали рост специфических колоний кДНК, число которых составляло примерно 50% от числа добавленных молекул (рис. 14, нижний ряд). Отсюда следует, что чувствительность выявления маркера лейкоза – 2 молекулы РНК, такая же, как и чувствительность выявления вирусной РНК. Кроме того, этот контроль демонстрирует, что отрицательный результат был получен потому, что маркерная РНК отсутствует в образцах крови и костного мозга данного пациента, а не потому, что она не была выявлена, например, из-за подавления ОТ-ПЦР примесями или неспецифическим синтезом. Первые пробы костного мозга и крови пациента 2 также дали отрицательный результат (рис. 15).

Рис. 15. Изменение количества мРНК AML1-ETO в крови и костном мозге пациента 2.

РНК, выделенную с помощью усовершенствованного метода из образцов костного мозга (А) или цельной крови (Б), подвергли обратной транскрипции с 2 ед фермента SuperScript® II и ПЦР в геле. Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами. Указаны даты отбора и объемы анализируемых образцов.

Однако, в пробе, взятой через три месяца, было обнаружено небольшое количество мРНК AML1-ETO, а спустя еще четыре месяца титр этой РНК вырос более чем на порядок, что сопровождалось проявлением признаков заболевания.

Повторный курс химиотерапии снизил содержание маркерной РНК до нуля. Таким образом, маркерную РНК удалось обнаружить в образцах, взятых у пациента за четыре месяца до клинического рецидива. Если бы это было сделано вовремя, то наступление рецидива можно было бы предотвратить.

Чувствительность диагностики принято выражать в минимальной детектируемой доле лейкемических клеток от общего числа ядерных клеток. Чтобы сопоставить чувствительность нашей процедуры с чувствительностью диагностических процедур, используемых в настоящее время, мы перевели полученное нами абсолютное значение в общепринятую форму, допустив, что в одной лейкемической клетке содержится около 100 молекул мРНК AML1-ETO. При чувствительности 2 молекулы маркерной РНК в 90 мкл препарата можно обнаружить одну лейкемическую клетку в 4,5 мл клинического образца, если весь образец подвергнуть лизису и для анализа взять РНК, выделенную из 1/50 части лизата. Это соответствует чувствительности диагностики 10-7 – 10-8 (одна лейкемическая клетка на фоне 107 – 108 здоровых лейкоцитов в крови и костном мозге соответственно).

Исследования по программе «Европа против рака» показали, что чувствительность детекции лейкемических клеток типа t(8;21) на основе ОТ-ПЦР в реальном времени составляет 10-4. Таким образом, чувствительность разработанной процедуры на несколько порядков выше чувствительности существующих методов.

ВЫВОДЫ

2. Оптимизирована реакция обратной транскрипции (ОТ) в присутствии большого количества посторонних нуклеиновых кислот. Выход кДНК при использовании специфического праймера увеличен до 50% от количества РНК-матрицы.

3. Показано, что с помощью полинуклеотидфосфорилазы Thermus thermophilus (TthПНФазы) можно полностью разрушить РНК даже с прочной вторичной структурой. В олигонуклеотидом либо 3'-концевой модификацией.

4. Установлено, что частота ложной рекомбинации РНК при ОТ in vitro превышает на 1 нуклеотид и не зависит от того, обладает ли обратная транскриптаза активностью РНКазы Н.

5. Показано, что ложную рекомбинацию РНК при ОТ можно понизить в 100 или более раз с помощью каждого из следующих способов:

- избирательной деградации одного из субстратов рекомбинации Tth-ПНФазой;

- проведения обратной транскрипции в геле;

- понижения концентрации обратной транскриптазы.

6. С помощью разработанных способов подавления ложной рекомбинации РНК при ОТ удалось размножить практически в отсутствие селекции и изучить продукты включающий оба субстрата рекомбинации целиком, выявляемый при размножении с помощью Q-репликазы как минорный, на самом деле является основным.

молекулярных колоний продемонстрирована возможность специфического выявления РНК-онкомаркера или вирусной РНК с чувствительностью две молекулы РНК-мишени в 100 мкл цельной крови.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах Статьи в научных журналах:

1. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Кравченко А.В., Четверин А.Б. 2009.

Применение наноколоний для выявления минимальной остаточной болезни при лейкозе t(8;21). Молекуляр. Биология. 43, 180-189.

2. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Ugarov V.I., Uzlova E.A., Chetverin A.B. 2008.

Factors influencing RNA degradation by Thermus thermophilus polynucleotide phosphorylase. FEBS J. 275, 2214-2226.

3. Четверина Е.В., Кравченко А.В., Фалалеева М.В., Четверин А.Б. 2007. Экспрессгибридизация молекулярных колоний с флуоресцентными зондами. Биоорган.

химия. 33, 456-463.

4. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Chetverin A.B. 2004. Simultaneous assay of DNA and RNA targets in the whole blood using novel isolation procedure and molecular colony amplification. Anal. Biochem. 334, 376-381.

Тезисы конференций:

1. Четверина Е.В., Фалалеева М.В., Саматов Т.Р., Четверин А.Б. 2008.

Количественная диагностика с помощью наноколоний. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 12мая 2008 г. С. 303.

2. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Ugarov V.I., Uzlova E.A., Chetverin A.B. 2007.

Polynucleotide phosphorylase from Thermus thermophilus as a tool for studies on RNA recombination. Abstracts of the International Conference "Protein Biosynthesis, Structure and Function". Pushchino, Russia, June 9-13, 2007. P. 31.

3. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Samatov T.R., Kravchenko A.V., Zabolotneva Y.A., Chetverin A.B. 2007. Diagnostic potential of the molecular colony technique. Abstracts of the International Conference "Protein Biosynthesis, Structure and Function".

Pushchino, Russia, June 9-13, 2007. P. 29.

4. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Кравченко А.В., Заболотнева Ю.А., Саматов Т.Р., Бобрынина В.О., Масчан М.А., Четверин А.Б. 2006. Выявление минимальной остаточной болезни при лейкозах посредством детекции одиночных молекул химерных РНК-онкомаркеров. Сборник докладов научно-практическая конференция «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники в 2002-2006 гг.».

Москва, 21-22 декабря 2006 г. С. 238-243.

5. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Chetverin A.B. 2006. Detecting single DNA and RNA molecules in the whole blood. Abstracts of the International Conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine". Novosibirsk, September 3-7, 2006. P. 110.

6. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Chetverin A.B. 2006. Precise diagnostics of viral target using simultaneous isolation of DNA and RNA from human whole blood and molecular colony amplification. EU/EMBO-course "Advanced Techniques in Molecular Medicine".

Uppsala, Sweden, June 13-20, 2006. P. 7.

7. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2005. Сравнение РНК-зависимых ДНК полимераз при помощи метода молекулярных колоний. Сборник тезисов международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 18-22 апреля 2005 г. С. 58.

8. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2005. Универсальный метод выделения нуклеиновых кислот из цельной крови для точной диагностики «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».

Москва, 7-10 февраля 2005 г. С. 96.

9. Русинова А.В., Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2005. Разработка диагностики лейкемии t(8;21) с помощью метода молекулярных колоний. Тезисы XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии». Москва, 7-10 февраля 2005 г. С. 23.

10. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2004. Обнаружение одиночных молекул вирусных нуклеиновых кислот в цельной крови. Сборник тезисов III «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, Научноисследовательский центр ММА им. И.М.Сеченова, 20-24 января 2004 г. С. 172-173.

Заявки на получение патентов:

1. Четверин А.Б., Четверина Е.В., Фалалеева М.В., Угаров В.И., Узлова Е.А. 2008.

Способ деградации структурированных полирибонуклеотидов и препарат полинуклеотидфосфорилазы. Заявка на получение патента РФ 2008120324.

2. Четверин А.Б., Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Алексеев Я.И. 2008. Способ повышения специфичности обратной транскрипции. Заявка на получение патента РФ 2008138626.