САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА

Елена Владиславовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.),

ВОВЛЕЧЁННЫХ В ФОРМИРОВАНИЕ АРБУСКУЛЯРНОЙ

МИКОРИЗЫ

03.02.07 Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010 2

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) РАСХН, лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий, Санкт-Петербург, Пушкин и в Национальном институте сельскохозяйственных исследований Франции (Institut National de la Recherche Agronomique - INRA), Дижон Научные руководители: доктор биологических наук Борисов Алексей Юрьевич лаб. генетики растительно-микробных взаимодействий ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин профессор, доктор Джианиназзи-Пирсон Вивиен (Gianinazzi-Pearson Vivienne) институт INRA, Дижон, Франция

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук Миронова Людмила Николаевна Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич лаб. микробиологического мониторинга и биоремедиации почв ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин Ведущее учреждение: Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится “ ” 2010 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при СанктПетербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан “ ” 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.212.232. кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Симбиоз между растениями и грибами арбускулярной микоризы (АМ) является одним из наиболее древних и широко распространнных взаимовыгодных растительно-микробных взаимодействий. Его возникновение около миллионов лет назад, вероятно, явилось ключевым фактором, способствовавшим колонизации растениями суши (Remy et al., 1994). Более 80% видов наземных растений формируют АМ, что способствует улучшению их минерального питания (преимущественно фосфатного) и дополнительному поступлению воды в растение (Harrison et al., 2005). Была доказана роль АМ симбиоза в повышении устойчивости растений к биотическим (патогены корней) и абиотическим (наличие тяжлых металлов, засолнность почв, засуха) стрессовым факторам (Dumas-Gaudot et al., 2000; Gianinazzi et al., 2005). В свою очередь растение предоставляет грибу ассимилированный при фотосинтезе углерод, который он самостоятельно получает сапротрофным путм в недостаточном для нормальной жизнедеятельности количестве. Было подсчитано, что все растения земли передают АМ грибам около 5 миллиардов тонн углерода в год (Parniske et al., 2004). Таким образом, научная, агрономическая и экологическая значимость данных взаимовыгодных растительно-грибных взаимодействий огромна.

Большую роль в процессе определения генетических детерминант симбиоза играет получение и изучение симбиотических (SYM) мутантов растений с нарушениями развития АМ, что дат возможность исследовать симбиоз на конкретных этапах его формирования.

Клонирование SYM генов позволяет определить молекулярные основы мутаций и предположить функцию молекулярных продуктов изучаемых генов.

Другим приоритетным направлением генетики симбиоза является идентификация генов растений и АМ грибов, экспрессия которых существенно изменяется в процессе формирования и функционирования АМ симбиоза. Такие гены можно рассматривать в качестве молекулярных маркеров процессов (сигналинга, защитных реакций, метаболизма), происходящих в растении и грибе при симбиозе. Использование в исследованиях такого рода симбиотических мутантов растений с блоком развития АМ существенно увеличивает информативность подхода и позволяет связать происходящие изменения с конкретными стадиями развития симбиоза.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение роли поздних симбиотических генов гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании функционального АМ симбиоза. Были поставлены следующие задачи исследования:

1. изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию генов Glomus intraradices при формировании АМ симбиоза;

2. изучение экспрессии генов гороха (Pisum sativum L.), предположительно связанных с формированием АМ симбиоза, при микоризации корней растений дикого типа и мутантов RisNod24 (Pssym36), SGEFix--2 (Pssym33) и SGEFix--1 (Pssym40);

3. анализ экспрессии генов G.intraradices в растительных клетках, содержащих 4. разработка молекулярных маркеров и анализ сцепления генов PsSym36, PsSym40 и маркеров для локализации генов на генетической карте гороха с целью их последующего точного картирования и позиционного клонирования.

Научная новизна. Впервые проведено исследование влияния мутаций в симбиотических генах гороха посевного (Pisum sativum L.) PsSym36, PsSym33 и PsSym на экспрессию восьми генов P. sativum и десяти генов G. intraradices, предположительно вовлечнных в формирование функционального АМ симбиоза. Было показано, что блокирование развития арбускул в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) приводит к существенному снижению экспрессии большей части анализированных грибных и растительных генов, в то время как более высокие темпы микоризации корней мутанта SGEFix--1 (Pssym40) коррелируют с более высоким, чем у растений дикого типа, уровнем экспрессии изученных грибных генов. Мутации в генах PsSym33 и PsSym40 имеют менее выраженный эффект на экспрессию анализированных генов гороха, чем мутация в гене PsSym36. Использование метода микродиссекции клеток лазером позволило осуществить выделение РНК из клеток, содержащих арбускулы, и впервые продемонстрировать преимущественную экспрессию генов G. intraradices, кодирующих супероксиддисмутазу (SOD), стеароил-CoA-десатуразу (DESAT) и пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), в арбускулах.

Методическая и практическая значимость. Методология и молекулярные инструменты, разработанные в данном исследовании, могут быть использованы в дальнейшем при изучении растительных и грибных генов, контролирующих формирование и функционирование АМ. Полученный растительный материал (популяции растений поколений F1 и F2), разработанные молекулярные маркеры, а также данные картирования могут существенно облегчить дальнейшую работу по локализации генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте для последующего точного картирования и позиционного клонирования данных генов. Полученные данные экспрессии растительных и грибных генов могут послужить базой для последующей работы по определению роли генов PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании симбиотических взаимоотношений растения с клубеньковыми бактериями и грибами арбускулярной микоризы. Результаты проведнных исследований могут быть использованы в курсах генетики развития и функционирования растительно-микробных систем профильных институтов и университетов.

Финансовая поддержка. Стипендия Департамента Науки, технологии и космоса Французского посольства в Москве, гранты РФФИ (07-04-01558, 07-04-01171).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме и школе молодых учных «The third Baltic sea region symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Saint-Petersburg, Russia, 2007), конференциях «Plant-Microbial Interactions 2008 Conference» (Krakow, Poland, 2008), «Forum des Jeunes Chercheurs» (Besancon, France, 2008), «International Conference on Mycorrhiza 2009 ICOM6» (Belo Horizonte, Brazil, 2009), 9-м конгрессе IPMB «Leading Biology through Plant Science» (St. Louis, USA, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов на международных научных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырх глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводов, списка литературы (259 наименований) и приложения.

Работа изложена на 191 странице, содержит 23 рисунка и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе были использованы формообразцы и линии гороха посевного Pisum sativum L. из коллекции Всероссийского научноисследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (SGE, SGEFix-- (Pssym40), SGEFix--2 (Pssym33)), Всероссийского института растениеводства им. Н.И.

Вавилова (К3034, К1693, К7128,К8274), Д.Дюка (cv Finale, RisNod24 (Pssym36); INRA, Дижон, Франция), Северного генного банка (NGB1238, NGB 851, NGB2715).

Изолят АМ гриба. В работе был использован гриб Glomus intraradices Schenck & Smith (BEG 141), предоставленный Международным банком Glomeromycota INRA, Дижон, Франция.

Штамм клубеньковых бактерий. Для инокуляции гороха был использован штамм Rhizobium leguminozarum bv. vicea CIAM1026 из коллекции ВНИИСХМ, Пушкин, Санкт-Петербург, Россия (Safronova, Novikova, 1996).

Условия вегетации растений.

Для экспериментов по анализу экспрессии генов семена проращивали в темноте на чашках Петри на смоченной дистиллированной водой фильтровальной бумаге. На 3-й день проростки были пересажены в 200 мл сосуды, содержащие смесь почвы и инокулюма, либо только почву (в зависимости от варианта опыта), по одному растению на сосуд. Растения выращивали в условиях климатической камеры (24/19 – температура день/ночь, 16ч – длина светого дня, 420 µmol m-2s-1, 70% - относительная влажность воздуха). Минеральное питание обеспечивалось модифицированным раствором Long Ashton (Hewitt, 1966), не содержащим соединений фосфора.

Для экспериментов по генетическому картированию растения выращивали в почве (pHKCl 5.5, P2O5 18.5 мг/100г почвы, K2O 4.3 мг/100г почвы) или стерильном песке (в зависимости от задач) в вегетационных домиках в климатических условиях Ленинградской области.

Методы исследования.

Анализ микоризации растений проводили на 21-е и 28-е сутки после инокуляции.

Корни окрашивали с помощью чрной туши (Sheaffer Manufacturing Co., USA) по методике Верхейлиг (Vierheilig et al., 1998). Активность щелочной фосфатазы в микоризованных корнях определяли по методике Тиссеран (Tisserant et al., 1993).

Параметры микоризации определяли по методике Тровло (Trouvelot et al., 1986).

Анализ экспрессии генов в корнях растений гороха. РНК выделяли из корней растений на 21-е и 28-е сутки после инокуляции G. intraradices по методике Логеманн (Logemann et al., 1987) с учтом модификаций Франкен и Градинер (Franken, Gradinger, 1994). ДНК удаляли, используя набор реактивов SV Total RNA Isolation System (Promega).

Синтез кДНК проводили согласно протоколу Вейдманн (Weidmann et al., 2004). Уровень экспрессии генов определяли методом абсолютного количественного ПЦР «в реальном времени», используя набор реактивов Absolute QPCR SYBR Green (ABgene, UK), в термоциклере ABI PRISM 7900 (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA). Определяли абсолютное количество транскриптов в трх биологических и трх технических повторностях. Полученные данные нормализовали относительно уровня экспрессии генов контроля G. intraradices TEF (фактор элонгации 1, - субъединица) и P. sativum GAPDH (глицеральдегид-фосфатдегидрогеназа).

Для анализа были выбраны следующие гены:

G. intraradices, кодирующие H+-АТФазу (H+-АТPase), щелочную фосфатазу (ALP), ингибитор диссоциации RHO/GDP (RHO), пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), субъединицу 2 протеасомы 26S (26S), регуляторную субъединицу протеасомы 26S (26SREG), стеароил-CoA-десатуразу (DESAT), тиоредоксин пероксидазу (THIO), супероксиддисмутазу (SOD) и белок неизвестной функции (VACU);

P. sativum, кодирующие H+-АТФазу (H+-АТPase), фосфатный транспортер (PT4), «голубой» медь связывающий белок (BCOP), белок устойчивости к болезням (DRP), ингибитор трипсина (TI), глутатион-S-трансферазу (GST), МАР киназу (MAPK) и серинпротеазу (SERPROT).

Анализ экспрессии генов в клетках, содержащих арбускулы. Экспрессию генов определяли в корнях мутанта SGEFix--1 (Pssym40) на 28-е сутки после инокуляции.

Корни фиксировали раствором Farmer’s fixative solution, окрашивали раствором эозина, заключали в парафин. Срезы толщиной 10µм делали на микротоме Jung RM 2065 (Leika).

Депарафинизацию образцов осуществляли раствором Histoclear II непосредственно перед микродиссекцией. Вырезание клеток осуществляли на Arcturus™Microdissection instrument (ARCTURUS NIKON inverse XT100). Для выделения РНК использовали набор реактивов PicoPure RNA Isolation kit (Arcturus), выделение проводили согласно протоколу производителя. Синтез кДНК осуществляли с использованием набора реактивов TargetAmp™2-Round aRNA amplification kit (Epicenter Biotechnologies, Madison,WI) согласно протоколу производителя. Уровень экспрессии генов определяли методом абсолютного количественного ПЦР «в реальном времени», как было описано ранее.

Разработка молекулярных маркеров и генетическое картирование. ДНК выделяли, используя CTAB буфер, согласно протоколу Роджерс и Бендич (Rogers, Bendich, 1985).

Для картирования в качестве молекулярных маркеров были использованы гены известной локализации на генетической карте гороха. Амплификацию проводили методом ПЦР с использованием праймеров, нуклеотидные последовательности которых были ранее опубликованы, либо проводили конструирование праймеров на основе консервативных участков гомологичных генов у разных видов растений. Для определения нуклеотидного полиморфизма между родителями продукты амплификации секвенировали, используя набор реактивов GenomeLab™ DTCS Quick Start kit (Beckman Coulter) и секвенатор CEQ™8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter) согласно протоколу производителя.

Статистическая обработка данных. Для обработки данных микоризации использовали критерий Стьюдента. Достоверность различий в уровне экспрессии генов (количество транскриптов) определяли методом однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа. Генетическое картирование проводили с помощью программы MapL98 (Prof. Yasui Ukai, Biometrics Laboratory, Graduate School of Agricultural Life Science, the University of Tokyo).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на формирование арбускулярной микоризы. Для анализа влияния мутаций в SYM генах гороха на уровень транскрипции отобранных генов растения и АМ гриба была изучена колонизация корней растений грибом. Параметры микоризации определяли на 21-е и 28-е сутки после инокуляции G. intraradices. Для визуализации АМ грибов использовали окрашивание чрной тушью, а для анализа функциональной активности симбиоза определяли активность щелочной фосфатазы. Мутация в гене PsSym36 приводила к блокированию процесса формирования арбускул, а также к снижению колонизации корней в целом (табл.

1). В корнях мутанта по гену PsSym33 было показано снижение интенсивности АМ колонизации на 21-е сутки после инокуляции, в то время как достоверных различий в параметрах микоризации между мутантом и диким типом на сроке 28 дней после инокуляции отмечено не было, что свидетельствует о замедленном развитии АМ в корнях данного мутанта (табл. 2). В корнях мутанта SGEFix--1 (Pssym40) было показано увеличение интенсивности микоризации и формирования арбускул по сравнению с растениями дикого типа как на 21-е, так и на 28-е сутки после инокуляции (табл. 2).

Показанные нарушения АМ фенотипа у мутантов по генам PsSym36, PsSym33 и PsSym соответствуют данным более ранних исследований (Gianinazzi-Pearson et al., 1992; Jacobi et al., 2003).

Таблица 1. Параметры микоризации растений дикого типа (wild type- wt) cv Finale и мутанта RisNod24 (Pssym36) на 28 сутки после инокуляции G. intraradices Finale (wt) RisNod24 (Pssym36) Finale (wt) RisNod24 (Pssym36) F – частота микоризации корневой системы; M – интенсивность АМ колонизации корневой системы; m – интенсивность АМ колонизации микоризованных фрагментов корня; A – содержание арбускул в корневой системе; a – содержание арбускул в микоризованных фрагментах корня.

Таблица 2. Параметры микоризации растений дикого типа (wild type- wt) SGE и мутантов SGEFix--2 (Pssym33), SGEFix--1 (Pssym40) на 28 сутки после инокуляции G. intraradices SGE (wt) SGEFix--2 (Pssym33) 99.1 ± 0.9 27.7 ± 3.0 27.9 ± 3.0 24.8 ± 1.9 7.0 ± 1. SGEFix--1 (Pssym40) 99.2 ± 0.8 29.3 ± 1.9 29.6 ± 2.1 25.1 ± 3.5 7.5 ± 1. SGE (wt) SGEFix--2 (Pssym33) 94.1 ± 2.8 11.6 ± 1.5 11.8 ± 1.6 23.2 ± 5.1 2.7 ± 0. SGEFix--1 (Pssym40) 95.7 ± 2.3 29.5 ± 4.2 30.5 ± 3.9 24.5 ± 3.7 7.3 ± 1. Обозначения как и к табл. 1.

Экспрессия генов Glomus intraradices при формировании АМ у мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix--2 (Pssym33) и SGEFix--1 (Pssym40). Исследования проводили на 21-е и 28-е сутки после инокуляции. Для анализа были выбраны гены G.

intraradices, связь экспрессии которых с формированием функционального АМ симбиоза была показана в более раннем исследовании (Seddas et al., 2009). Это гены G. intraradices, кодирующие белки, гипотетически вовлеченные в процессы транспорта, сигналинга, транскрипции, синтеза белков, первичного и вторичного метаболизма (список генов в разделе «Материалы и методы»). Проведнный анализ транскрипции показал, что мутация в гене PsSym36, приводящая к блокированию формирования симбиоза на стадии арбускул, оказывает также существенное влияние на экспрессию генов G. intraradices. Количество транскриптов большинства вовлечнных в анализ генов, было существенно ниже в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), чем у растений дикого типа (рис. 1). В свою очередь, мутация в гене PsSym40, результатом которой являются более высокие темпы микоризации и деградации арбускул, привела к существенному увеличению экспрессии части анализированных грибных генов (рис. 2). Мутация в гене PsSym33 оказала наименьший эффект на экспрессию грибных генов, что согласуется с менее выраженным отклонением параметров микоризации корней мутанта от дикого типа (табл. 2).

Так, в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), имеющего дефект развития арбускул, было показано существенное по сравнению с диким типом снижение экспрессии гена, кодирующего H+-АТФазу, функция которой, как известно, заключается в обеспечении активного транспорта веществ через мембрану. Отсутствие обмена метаболитами между симбионтами в корнях мутанта по гену PsSym36 также объясняет низкий уровень экспрессии гена DESAT, который играет роль в модификации метаболизма липидов в грибной клетке, а именно, в биосинтезе жирных кислот. В корнях же мутанта по гену PsSym40 было отмечено существенное по сравнению с растениями дикого типа увеличение количества транскриптов генов H+-АТPase и DESAT, что отражает более высокую метаболическую активность АМ в корнях этого мутанта.

RHO PEPISOM

DESAT THIO

SOD VACU

Рисунок 1. Экспрессия генов G. intraradices в микоризованных корнях растений дикого типа Finale ( ) и мутанта RisNod24 (Pssym36) ( ) на 21 и 28 сутки после инокуляции.