Показателем экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина может служить его способность взаимодействовать с гидрофобным носителем фенилсефарозой [Polans et al., 1991]. В связи с этим мы исследовали связывание немиристоилированных форм мутантов рековерина RcE85Q и RcE121Q и рековерина дикого типа с фенилсефарозой. Исследуемые формы рековерина инкубировали в присутствии суспензии фенилсефарозы в диапазоне [Са2+]f от 10 нМ до 100 мкМ; степень связывания указанных форм рековерина с носителем определяли по количеству белка, оставшегося в растворе после осаждения фенилсефарозы.

Рис. 6. Связывание 45Са2+ с немиристоилированной формой мутанта RcE121Q.

Как было показано ранее [Senin et al., 2002], миристоилированный wt-рековерин Са2+зависимым образом взаимодействует с фенилсефарозой, тогда как миристоилированные мутанты RcE85Q и RcE121Q такой способностью не обладают. Это говорит о том, что оба мутанта в присутствии ионов кальция не экспонируют гидрофобные аминокислотные остатки, необходимые для взаимодействия с гидрофобной матрицей. Используя немиристоилированные формы рековерина, мы показали, что немиристоилированный wt-рековерин способен, подобно миристоилированной форме белка, Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фенилсефарозой (рис. 7). Оказалось, что немиристоилированный мутант RcE121Q, несмотря на отсутствие в нем функционального центра EF3, взаимодействует с фенилсефарозой аналогично wt-рековерину. При этом взаимодействие происходит в том же диапазоне [Са2+]f, что и при заполнении катионом нативного Са2+-связывающего центра EF2 в wt-рековерине. В отличие от мутанта RcE121Q, немиристоилированный RcE85Q, хотя и связывает ионы кальция за счет центра EF3, с фенилсефарозой не взаимодействует.

Рис. 7. Са2+-зависимое связывание немиристоилированных форм рековерина с фенилсефарозой.

За 100% принято общее количество рековерина в пробе. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 1,19 мкM, для RcE121Q – 1,48 мкM.

Следовательно, можно сделать вывод, что заполнение ионами кальция центра EF2, но не EF3, определяет способность рековерина взаимодействовать с фенилсефарозой и что координация ионов кальция именно в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина. Этот вывод в свою очередь предполагает, что координация ионов кальция в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для придания рековерину способности ингибировать родопсинкиназу. Правильность этого предположения подтвердили наши последующие эксперименты по исследованию способности немиристоилированных форм wt-рековерина и мутантов RcE85Q и RcE121Q ингибировать родопсинкиназу Ca2+-зависимым образом.

В этих экспериментах активность родопсинкиназы измеряли по включению радиоактивного фосфата [32Р]-АТФ в родопсин в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной фоторецепторные мембраны, очищенную родопсинкиназу и исследуемые формы рековерина. Концентрацию свободного кальция варьировали в диапазоне от 1 нМ до 100 мкМ. Как следует из рис. 8, немиристоилированный мутант RcE121Q, который содержит “испорченный” Са2+-связывающий центр EF3 и, соответственно, координирует ионы кальция только за счет Са2+-связывающего центра EF2 способен ингибировать родопсинкиназу Са2+зависимым образом. При этом величина K50 по Сa2+ для данного мутанта близка к таковой для wt-рековерина, хотя и несколько сдвинута в область более высоких концентраций ионов кальция. В то же время, немиристоилированный мутант RcE85Q, в котором “испорчен” Са2+связывающий центр EF2 и который координирует ионы кальция только за счет Са2+связывающего центра EF3, не способен ингибировать родопсинкиназу.

относительная активность родопсинкиназы, % Рис. 8. Са2+-зависимое ингибирование активности родопсинкиназы немиристоилированными формами wt-рековерина и мутантами RcE85Q и RcE121Q. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 0, мкM, для RcE121Q – 3 мкM.

Таким образом, описанные эксперименты прямо показывают, что именно связывание ионов кальция в Ca2+-связывающем центре EF2 обеспечивают взаимодействие рековерина с родопсинкиназой и ее ингибирование.

3. Выявление сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином.

Биохимические эксперименты на препаратах НСП in vitro продемонстрировали, что рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, взаимодействуя с родопсинкиназой [Klenchin et al., 1995, Senin et al., 2005]. Можно предположить два механизма ингибирования.

Согласно первому механизму, рековерин непосредственно действует на каталитическую активность родопсинкиназы, взаимодействуя с ее каталитическим доменом. Согласно второму, рековерин стерически препятствует формированию фермент-субстратного комплекса родопсинкиназы с фотоактивированным родопсином, не затрагивая активный центр фермента. В предыдущих работах показано, что родопсинкиназа в присутствии рековерина теряет способность фосфорилировать светоактивированный родопсин. При этом рековерин не оказывает влияния на процесс фосфорилирования родопсинкиназой 11-членного пептидного субстрата, гомологичного фрагменту родопсина, который содержит сайты фосфорилирования.

Эти данные предполагают, что рековерин блокирует участок родопсинкиназы, необходимый для узнавания светоактивированного родопсина, не оказывая влияние на каталитическую активность фермента как такового. Рековерин ингибирует родопсинкиназу посредством взаимодействия с участком, удаленным от каталитического центра, следовательно, потенциальными сайтами связывания рековерина могут быть участки, находящиеся в регуляторных N- и C-концевых доменах родопсинкиназы.

Целью настоящего раздела работы было выяснение локализации участков родопсинкиназы, отвечающих за ее взаимодействие с рековерином. Для ответа на этот вопрос нами была получена рекомбинантная родопсинкиназа, а также рекомбинантные фрагменты фермента, соответствующие его N-концевому (RK1-183) и C-концевому (RK455-561) доменам, и изучено их взаимодействие с рековерином.

3.1. Клонирование, идентификация и экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы и фрагментов гена родопсинкиназы.

Исходная конструкция, предположительно содержащая полноразмерный ген родопсинкиназы, была любезно предоставлена доктором М. Ахтаром (Department of Biochemistry, University of Southampton, United Kingdom). На первом этапе работы нами было проведено секвенирование гена и показано, что предоставленная кДНК соответствует гену родопсинкиназы.

Для проведения экспрессии гена родопсинкиназы нами была выбрана система экспрессии под контролем РНК-полимеразы фага Т7, предложенная Студиером [Studier et al., 1986]. С этой целью ген родопсинкиназы клонировали в вектор рТ7-7, содержащий последовательность промотора фага Т7, и трансформировали полученной конструкцией клетки штамма E.coli BL21 (DE3), в хромосоме которых имеется последовательность гена Т7 РНКполимеразы под контролем lac-промотора. Наличие lac-промотра позволяет индуцировать экспрессию гена Т7 РНК-полимеразы и, как следствие, гена, клонированного в рТ7-7, добавлением в культуральную среду синтетического аналога лактозы изопропил--Dтиогалактозида (ИПТГ).

Электрофореграмма экстракта клеток E.coli BL21(DE3) после проведения аналитической экспрессии полноразмерного гена родопсинкиназы, представленная на рис. 9, демонстрирует наличие белка с кажущейся молекулярной массой ~ 67 кДа, соответствующего родопсинкиназе. Уровень экспрессии полноразмерной родопсинкиназы в клетках E.coli, как следует из электрофореграммы, оказался невысоким. Последующие попытки выделения рекомбинантного белка были безрезультатными из-за низкого уровня экспрессии. Вследствие этого для проведения экспериментов нами было принято решение получить рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, соответствующие ее доменам.

Рис. 9. Экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы. Экстракт клеток E.coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pТ7-7-RK, до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молекулярной массы.

Для получения рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы нами был выбран плазмидный вектор pGEX5x-1 (Amersham Biosciences), содержащий ген глутатион S-трансферазы (КФ 2.5.1.18) из Schistosoma japonicum. Данная экспрессионная система позволяет проводить экспрессию генов в виде химерных белков, слитых в рамке считывания с глутатион S– трансферазой (GST), что облегчает выделение белков из клеточного экстракта с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе [Smith, Johnson, 1988]. Нами были получены генетические конструкции, которые содержат фрагменты гена родопсинкиназы, кодирующие N-концевой домен (pGEX5x-1-N) и С-концевой домен (pGEX5x-1-С), слитые в рамке считывания с геном GST. Экспрессию генов химерных белков проводили в прокариотической системе с использованием штамма E. coli BL21. После индукции экспрессии генов с помощью ИПТГ образование белков анализировали с помощью SDSэлектрофореза экстрактов клеток (рис. 10). Данные, приведенные на рис. 10, указывают на образование рекомбинантных белков с молекулярной массой около 45 кДа и 38 кДа, что соответствует молекулярным массам белков, соответствующих N- и С- концевым доменам родопсинкиназы, экспрессирующимся в одной рамке считывания с GST (GST-N и GST-C).

Уровень экспрессии генов GST-N и GST-C оказался достаточно высоким, но основная часть данных белков накапливалась в форме нерастворимых телец включения. Причиной образования нерастворимых белков может быть как очень высокий уровень экспрессии генов, так и восстановление дисульфидных связей в белках [Lobel et al., 2001]. Для увеличения образования растворимой формы белков нами был проведен ряд экспериментов по оптимизации условий экспрессии, направленных на уменьшение скорости трансляции по следующим параметрам: температуре роста клеток в диапазоне 20-37С, оптической плотности клеточной культуры в диапазоне А600 от 0,5 до 1 до индукции и времени индукции в диапазоне от 30 минут до 3 часов. Однако любые попытки увеличить выход растворимой формы белка на стадии биосинтеза в бактериальных клетках не привели к успеху – количества растворимого химерного белка не превышали 100 мкг на 1 литр среды, в результате чего выделение химерных белков из клеточного экстракта оказалось невозможным. По этой причине нами было принято решение о выделении рекомбинантных белков GST-N и GST-C из образующихся телец включения. Мы опробовали действие ряда детергентов: Тритона Х-100, Твина-80 и лаурилсаркозина натрия на примере выделения GST-N. При этом было установлено, что наибольшее количество экстрагируемого химерного белка GST-N получается при солюбилизации телец включения в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритона Х-100. Поэтому в дальнейшем мы использовали именно эти детергенты для выделения фрагментов родопсинкиназы, слитых в рамке считывания с GST.

Рис. 10. Экспрессия рекомбинантных генов GST-N и GST-C. Экстракт клеток E.coli BL21, трансформированных плазмидой pGEX5x-1-N (GST-N) и pGEX5x-1-С (GST-C), до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молекулярной массы.

С учетом полученных данных нами был разработан и оптимизирован метод получения и выделения химерных белков GST-N и GST-C, продуцируемых E. coli в виде нерастворимых телец включения. Метод состоит из следующих процедур: первая экстракция – удаление растворимых белков в нативных условиях, вторая экстракция – выделение нерастворимых белков в присутствии 1,5% лаурилсаркозина натрия и 2% Тритона Х-100 и последующая очистка химерных белков на иммобилизованном глутатионе. Фракции белков после каждой стадии выделения анализировали методом SDS-электрофореза (рис. 11).

3.2. Выявление доменов и сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином.

Следующим этапом нашей работы было установление доменов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином. С этой целью мы использовали следующую систему. К суспензии глутатионсефарозы, на которой предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок, содержащий GST, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе, равной 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ CaCl2. Затем белки элюировали с помощью 1% SDS и полученные фракции анализировали методом SDSэлектрофореза.

Рис. 11. Выделение и очистка рекомбинантных белков GST-N (А) и GST-C (Б). «М» – стандарты молекулярной массы, «ЭК» – экстракт клеток E.coli BL21, «Р» - фракция растворимых внутриклеточных белков, «Н» – фракция нерастворимых внутриклеточных белков, солюбилизированных в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритон Х-100, «Элюат» – фракция белков после хроматографической очистки на глутатионсефарозе, элюирование 10 мМ глутатионом.

Перед началом исследования взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином с использованием описанной системы, мы провели контрольные эксперименты по изучению взаимодействия GST с рековерином, из которых однозначно следует, что рекомбинантный белок GST сам по себе с рековерином не взаимодействует. Таким образом, данная система может быть использована для изучения взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином.

Результаты эксперимента по связыванию химерных белков GST-N и GST-C с рековерином представлены на рис. 12. Как видно из представленных данных, N-концевой домен родопсинкиназы в составе химерного белка взаимодействует с рековерином. Напротив, взаимодействия между С-концевым доменом родопсинкиназы и рековерином не наблюдается.

Для более точной локализации участка N-концевого домена родопсинкиназы, вовлеченного во взаимодействие с рековерином, мы провели исследования с использованием синтетических пептидных фрагментов родопсинкиназы RK11-26 и RK2-16. Смысл эксперимента заключался в выяснении способности данных пептидных фрагментов конкурировать с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы за связывание с рековерином. Выбор пептидов обусловлен нашими предварительными результатами, из которых следует, что фрагмент родопсинкиназы 23Asp-471Pro, полученный путем ограниченного протеолиза фарнезилированного белка в присутствии Asp-N-эндопротеиназы, теряет способность взаимодействовать с рековерином. Из этого следует, что во взаимодействие с рековерином вовлечен участок 1-23 регуляторного N-концевого домена родопсинкиназы.

Рис. 12. Взаимодействие химерных белков GST-N и GST-C с рековерином. «М» – стандарты молекулярной массы; «Rc» – очищенный препарат рековерина; «-Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в отсутствие рековерина в инкубационной смеси; «+Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в присутствии рековерина в инкубационной смеси.

Эксперимент проводили в соответствии со следующей схемой. К суспензии глутатионсефарозы, на которую предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок GSTN, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ CaCl2. Элюирование рековерина проводили одним из трех буферов, содержащих: (а) 1 мМ пептид RK11-26, (б) 1 мМ пептид RK2-16 или (в) 2 мМ Са2+ (в качестве контроля, чтобы исключить неспецифическое элюирование рековерина). Для определения количества рековерина, оставшегося связанным с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы после элюирования в каждом из трех экспериментов, препарат глутатионсефарозы обрабатывали буфером, содержащим 2 мМ ЭГТА.

На рис. 13 представлены результаты по Са2+-зависимому связыванию рековерина с Nконцевым доменом родопсинкиназы в присутствии и в отсутствие пептидных фрагментов родопсинкиназы RK2-16 и RK11-26.

Как следует из рис. 13, рековерин взаимодействует с N-концевым доменом родопсинкиназы в присутствии Са2+ (дорожка 3), тогда как при последующем элюировании буфером, содержащим ЭГТА, рековерин диссоциирует из комплекса с фрагментом родопсинкиназы (дорожка 4). Добавление синтетического пепетида, соответствующего амнокислотным остаткам 11-26 родопсинкиназы (RK11-26), полностью предотвращает взаимодействие рековерина с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 7), т.к. последующая обработка ЭГТА не приводит к дополнительному элюированию рековерина (дорожка 8). Однако добавление пептида RK2-16 практически не влияет на взаимодействие между рековерином и N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 5), о чем свидетельствует значительное количество рековерина во фракции белков после элюции ЭГТА (дорожка 6).

Рис. 13. Конкуренция между химерным белком GST-N и пептидами RK11-26 и RK2-16 за взаимодействие с рековерином.

Таким образом, на основании наблюдаемой в ходе эксперимента конкуренции между фрагментом N-концевого домена RK11-26 и целым N-концевым доменом родопсинкиназы за взаимодействие с рековерином можно заключить, что участок RK11-26 регуляторного Nконцевого домена родопсинкиназы вносит основной вклад во взаимодействие родопсинкиназы и рековерина.

ВЫВОДЫ

2. Повышение содержания холестерина в фоторецепторных мембранах приводит к уменьшению уровня фосфорилирования содержащегося в них родопсина вследствие усиления Са2+-зависимого ингибирования родопсинкиназы рековерином.

3. Связывание ионов кальция с Ca2+-связывающим центром рековерина EF2, но не EF3, обусловливает экспонирование неполярных боковых цепей гидрофобного “кармана” белка и тем самым – Ca2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы.

4. За взаимодействие родопсинкиназы с рековерином отвечает регуляторный Nконцевой домен фермента, причем основной вклад вносит ее фрагмент RK11-26.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

2. Чурюмова В.А., Ваганова С.А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Сенин И.И. Белковый дизайн Са2+-связывающего белка рековерина: создание искусственного кальций-связывающего участка в молекуле рековерина. Тезисы докладов 7-й Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 14-18 апреля, 2003, с. 3. Senin I.I., Hoppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergentresistant membrane rafts from rod outer segments. J. Biol. Chem. 2004; v. 279 (47); p.

48647-53.

4. Senin I.I., Hoeppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., and Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments. 8th European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells. Cambridge, UK, 30 July - August, 2004, p. 83.

5. Komolov K.E., Zinchenko D.V., Churumova V.A., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclusively controls interaction with rhodopsin kinase. Biol. Chem. 2005; v. 386 (3); p. 285Чурюмова В.А., Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П., Koch K.-W. Роль Са2+связывающих центров рековерина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы.

Тезисы докладов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6 – 9 июня, 2005, с. 220-222.

7. Чурюмова В.А., Сенин И.И., Hоeppner-Heitmann D., Тихомирова Н.К., Филиппов П.П., Koch K-W. Изучение влияния содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран на процесс фосфорилирования родопсина, катализируемый родопсинкиназой. Тезисы докладов XVIII международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7 – 10 февраля, 2006, с.70.

8. Weiergraber O.H., Senin I.I., Zernii E.Y., Churumova V.A., Kovaleva N.A., Nazipova A.A., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Philippov P.P., Granzin J., Koch K.-W. Tuning of a neuronal calcium sensor. J. Biol. Chem. 2006; v. 281 (49); p. 37594-37602.

9. Senin I.I., Churumova V.A., Philippov P.P., Koch K.-W. Membrane binding of the neuronal calcium sensor recoverin - modulatory role of the charged carboxy-terminus. BMC Biochem. 2007; v. 22; p. 24.

10. Komolov K.E., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M., Churumova V.A., Grigoriev I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin. 13th International conference on retinal proteins. Barcelona, June 15 – 19, 2008, p.