АКАДЕМИЯ НАУК МОЛДОВЫ
ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
На правах рукописи
УДК: 616-005.1:575.113+
575.174.015.3+577.21
МОКАН ЕЛЕНА
ЭФФЕКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ
В ОПРЕДЕЛЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РИСКА
ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА
03.00.15 – ГЕНЕТИКААвтореферат диссертации
на соискание ученой степени доктора биологии КИШИНЕВ, 2012Работа выполнена в лаборатории Молекулярной Генетики Института Генетики и Физиологии растений Академии наук
Республики Молдова
Научный руководитель: БАРБАКАР Николае доктор хабилитат, профессор, 03.00.15 – Генетика
Научный консультант: ЛЫСЫЙ Леонид доктор хабилитат, профессор 03.00.04 – Биохимия
Официальные оппоненты:
ДУКА Мария, член-корреспондент АНМ, доктор хабилитат, профессор САКАРЭ Виктория, доктор, конференциар Члены специализированного ученого совета:
ЛУПАШКУ Галина, председатель, доктор хабилитат, конференциар КОТЕНКО Евгения, секретарь, доктор, конференциар ИСТРАТИ Валериу, доктор хабилитат, профессор ФОКША Валентин, доктор хабилитат, конференциар ЧЕМОРТАН Игорь, доктор, конференциар
Защита состоится 14 декабря 2012 г. в 900 часов на заседании специализированного научного Совета D 10.03.00.15-16 при Институте Генетики и Физиологии растений Академии Наук Молдовы по адресу: MD2002, ул. Лесная, 20, г. Кишинев, Республика Молдова. e-mail:
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научно-центральной библиотеке «А. Лупан» Академии наук Молдовы (ул. Академическая 5, MD 2028, г. Кишинев) и на вебстранице CNAA (www.cnaa.md).
Автореферат разослан 10 ноября 2012 г.
Ученый секретарь специализированного научного Совета КОТЕНКО Евгения доктор биологии Научный руководитель:
БАРБАКАР Николае доктор хабилитат биологии, профессор Научный консультант:
ЛЫСЫЙ Леонид доктор хабилитат медицины, профессор Автор МОКАН Елена © Mocan Elena,
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В соответствии с международными эпидемиологическими исследованиями в мире от инсульта ежегодно умирают около 6 млн. человек, из них 25% больных умирает в течение первого месяца и около 40% в первый год [1, 3, 14, 16]. В большинстве стран инсульт занимает 2–3 место в структуре общей смертности населения. Республика Молдова занимает одно из лидирующих мест по смертности от цереброваскулярных заболеваний среди стран Европы [1, 3]. Ишемический инсульт (ИИ), самая частая форма острых нарушений мозгового кровообращения (около 80-85%), обусловлен недостаточностью кровоснабжения определнного участка головного мозга по причине снижения мозгового кровотока, тромбоза или эмболии, связанных с заболеваниями сосудов, сердца и крови. По данным Национального Центра менеджмента в медицине, каждый год в стране регистрируются около 50 тысяч пациентов с диагнозом острого нарушения мозгового кровообращения. При общей распространенности сердечно-сосудистых заболеваний 145 случаев на 10 тысяч жителей, частота инсульта соответствует 31 случай [3]. Важнейшей задачей профилактической кардиоваскулярной медицины является идентификация факторов риска развития сосудистых нарушений, включающих атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, инсульт и их сочетанное проявление с учетом этнических, гендерных и других индивидуальных различий [3, 5, 8, 16]. Это позволит выявить вероятность развития, тяжесть течения заболевания, разработать профилактические мероприятия с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.
Описание ситуации в области и определение задач исследования. Последние 20 лет активно развиваются ассоциативные исследования о генетически детерминированной предрасположенности, как к инсульту, так и другим комплексным заболеваниям.
Ассоциативные методы базируются на двух методологических подходах: анализ генетических ассоциаций на основе выявленного полиморфизма генов-кандидатов болезни и широкомасштабный геномный ассоциативный анализ (GWAS) [5, 7, 10, 12, 16]. Развитие методов высокопроизводительного генотипирования привело к использованию сотен и тысяч полиморфных маркеров в рамках одного исследования. Так, в 2008 году был запущен грандиозный проект «1000 геномов», направленный на изучение генетической изменчивости при массовом секвенировании. В результате чего было обнаружено более 15 млн.
однонуклеотидных замен (SNP – single nucleotide polymorphism), 55% которых описаны впервые, 1 млн. коротких инсерций-делеций (Indel) и около 20 тыс. крупных вариаций числа копий генов (CNV – copy number variation). Было определено, что в среднем каждый человек является носителем 250-300 аллелей типа «потери функции» и 50-100 аллелей, вовлечены в наследственные заболевания [5, 7, 16, 23]. В настоящее время активно дискутируется проблема «недостающей наследственности» в этиологии комплексных болезней и небольшой эффект SNP в качестве маркеров заболеваний [7]. Кроме того, результаты о новых маркерах по GWAS плохо воспроизводятся и характеризуются противоречивыми данными вследствие выраженных межэтнических различий частот распределения аллелей и генотипов [7, 11, 16]. Исследования «случай-контроль» позволяют оценить риск развития заболевания у конкретного индивида, но известно, что вклад различных генов в формирование генетической предрасположенности к патологиям существенно различается в разных популяциях. При вычислении генетического риска для пациента требуется информация о распределении частот аллелей и генотипов для популяции, которой он принадлежит, что затрудняет использование данных, полученных для других популяций [5]. Таким образом, необходимость проведения аналогичных исследований для каждой крупной популяции не вызывает сомнений.
Все перечисленное послужило мотивацией для выполнения предложенного исследования генетической предрасположенности к ишемическому инсульту в популяции Республики Молдова. Рассмотренный нами паттерн маркеров ИИ включал как редкие полиморфные варианты с высокой пенетрантностью, так и широко распространенные аллели с низкой пенетрантностью. Среди редких полиморфных вариантов изучен вклад мутационных аллелей генов F2 (rs1799963), F5 (rs6025) и минорных аллелей генов GP1BA (rs2243093), PDE4D (rs152312). Из числа общих вариантов рассматривались распространенность инсерционноделеционного полиморфизма гена АСЕ (rs4646994), минорных аллелей локусов rs PDE4D, rs10507391/rs9551963 ALOX5AP и rs1799768 PAI-1 [27].
Цель работы: оценка эффективности полиморфных вариантов генов-кандидатов в качестве маркеров ишемического инсульта в популяции Республики Молдовы.
Задачи исследования:
1. Проанализировать распространенность полиморфных вариантов генов-кандидатов F2, F5, GP1BA, PAI-1, ACE, ALOX5AP и PDE4D в исследуемых выборках.
2. Определить ассоциации полиморфных вариантов генов, кодирующих компоненты системы свертывания, фибринолиза, эндотелиальной функции и воспаления, с ишемическим инсультом.
3. Исследовать взаимосвязь полиморфных вариантов генов-кандидатов с уровнем показателей артериального давления, метаболизма липидов и глюкозы в зависимости от возраста и 4. На основе изучения моделей взаимодействия генов F2, F5, GP1BA, PAI-1, АСЕ, ALOX5AP и оценить значимость ключевых генов в формировании наследственной предрасположенности к ишемическому инсульту.
5. Описать характер влияния курения, поведенческого фактора риска развития ишемического инсульта, на взаимодействие между генами-кандидатами.
Научная новизна: Впервые проведен комплексный анализ наследственной предрасположенности к ишемическому инсульту в популяции Республики Молдова. На основе результатов выявлены функционально значимые полиморфные локусы генов-кандидатов, гендерная гетерогенность полученных ассоциаций и описан вклад некоторых модификационных и немодификационных факторов.
Получены данные о частотах аллелей и генотипов полиморфных локусов генов:
rs1799963 F2, rs6025 F5, rs2243093 GP1BA, rs1799768 PAI-1, rs4646994 АСЕ, rs10507391 и rs9551963 ALOX5AP, rs2910829 и rs152312 PDE4D в популяции Республики Молдова.
Оценена степень генетической изменчивости при помощи показателей фактической гетерозиготности и соответствие закону Харди-Вайнберга.
Выявлена ассоциация полиморфизма гена АСЕ с ишемическим инсультом у мужчин до 56 лет и SNP локуса rs10507391 гена ALOX5AP у женщин.
Показано, что гаплотип АС, в состав которого входят аллели А локуса rs10507391 и аллель С локуса rs9551963 гена ALOX5AP, является рисковым для развития ишемического инсульта. Носительство гаплотипа АС статистически значимо ассоциируется с изменением уровня триглицеридов, липопротеинов высокой плотности и возрастом у больных ишемическим инсультом.
Описаны межгенные взаимодействия и выявлено, что при курении меняется тип межгенного взаимодействия.
Решенная научная проблема: описано влияние исследуемых полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA, PAI-1, АСЕ, ALOX5AP, PDE4D и некоторых модификационных факторов риска (курение, показатели метаболизма липидов и глюкозы) на предрасположенность ишемическому инсульту в зависимости от возраста и пола в популяции Республики Молдова.
Теоретическая значимость. Представленные данные расширяют знание о распределении частот полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA, PAI-1, АСЕ, ALOX5AP и PDE4D в популяции Республики Молдова.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные молекулярногенетического анализа вносят вклад в понимание наследственной предрасположенности к ишемическому инсульту. Результаты исследования особенностей ассоциации генетических маркеров с инсультом в зависимости от пола могут быть использованы для медикогенетического консультирования. С целью раннего выявления лиц с высоким риском развития сосудистых заболеваний мозга и проведения донозологической профилактики рекомендуется выявлять носительство аллелей D гена ACE для мужчин и A локуса rs10507391 гена ALOX5AP для женщин.
Положения, выносимые на защиту 1. Предложен 4-локусный паттерн полиморфных локусов, состоящий из rs4646994 ACE (Ins>Del), rs9551963 ALOX5AP (A>C), rs2910829 PDE4D (G>A), rs1799768 PAI-1 (5G>4G), ассоциированный с высоким риском ишемического инсульта в популяции Республики Молдова.
2. Для мужчин молодого и среднего возраста D аллель и DD генотип гена ACE является маркером повышенного риска развития ишемического инсульта. У носителей DD генотипа выявлены повышенные концентрации триглицеридов и липопротеинов очень низкой плотности в сыворотке крови.
3. Однонуклеотидный полиморфизм rs10507391 гена ALOX5AP ассоциирован с ишемическим инсультом у женщин старше 56 лет.
4. Гаплотип АС, в состав которого входят аллели А локуса rs10507391 и С локуса rs гена ALOX5AP, ассоциирован с повышением уровня триглицеридов и понижением концентрации липопротеинов высокой плотности с возрастом и определяет повышение риска развития ишемического инсульта.
Внедрение научных результатов: результаты распределения частот полиморфных вариантов исследуемых генов используются при определении сердечно-сосудистого риска в молодой популяции РМ, а также могут быть использованы в ходе преподавания медицинской и клинической генетики, биохимии, патофизиологии, внутренних болезней в вузах медицинского и биологического профиля, а также в рамках курсов повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Материалы данного исследования были представлены на: IX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2004); IX Международной конференции молодых ученых (Кишинев, 2006); Международной Конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006); EMBO/EMBL Symposium “Human Variation: Cause and Consequence (Heidelberg, 2010); 9th CRG Annual Symposium «Medical Genome Sequencing: Understanding the Genomes of Disease» (Barcelona, 2010); XXIVth National Conference of the Romanian Society of Physiological Sciences. (Oradea, Baile Felix, 2010); XXV-a Conferin Naional a Societii Romne de Fiziologie (Trgu Mure, 2011); 12th International Congress of human genetics and the American Society of human genetics 61st annual meeting (Montreal, 2011); Second Advanced Summer School in Africa «Nutrition and Disease. Biochemical and Molecular Insights» (Cape Town, 2012); The 13th International meeting on Human Genome Variation and Complex Genome analysis (HGV2012) (Shanghai, 2012); The 3rd International Symposium on Adipobiology and Adipopharmacology (Bulgaria, 2012).
Публикации. Полученные результаты опубликованы в 21 научной работе (включая 7 в моноавторстве), из которых 5 статей и 16 тезисов докладов на национальных и международных форумах.
Структура и объем работы. Материалы диссертационной работы изложены на страницах и включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, обобщение полученных результатов, общие выводы и рекомендации. Список литературы включает 178 источников. Диссертация иллюстрирована рисунками и 23 таблицами, содержит 8 приложений.
Ключевые слова: ишемический инсульт, генетическая предрасположенность, молекулярный маркер, полиморфизм ДНК, межгенные взаимодействия, ген-средовые взаимодействия.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В Введении обоснована актуальность предложенных к решению в диссертации проблем, определены цель и соответствующие ей задачи работы, отмечены научно-практическая значимость полученных результатов, выводы сформулированы в основных положениях, выносимых на защиту.
Глава 1. СОВРЕМЕННАЯ КОНЦЕПЦИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К
КОМПЛЕКСНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ – ИШЕМИЧЕСКИЙ ИНСУЛЬТ
В обзоре литературы рассматриваются современные представления о генетической структуре заболеваний человека, представленной различными типами полиморфизма ДНК.Изложены данные о генетической предрасположенности к инсульту, представлено описание исследованных полиморфных вариантов генов-кандидатов, кодирующих компоненты системы свертывания, фибринолиза, воспаления и вазоконстрикции [2, 4, 5, 10, 17, 21]. Описана комплексная оценка влияния генетических факторов и факторов среды на риск возникновения ишемической болезни и обозначены механизмы, посредством которых факторы внешней среды способны спровоцировать патологические изменения. Представлены мотивации для выполнения предложенного исследования о вкладе полиморфизма в развитие ишемического инсульта в популяции Республики Молдова. На основании изученных литературных источников были сформулированы цели и задачи диссертационной работы.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В качестве материала использовали 154 сыворотки крови и 248 препаратов геномной ДНК пациентов (159 человек) с ишемическим инсультом и индивидов (89 человек) без сопутствующих аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний популяции Республики Молдова. Методология включала применение клинико-функциональных, биохимических и молекулярно-генетических (ПЦР и ПЦР в реальном времени технологии TaqMan®).
Последовательности праймеров и зондов к каждому из полиморфных вариантов исследуемых генов были подобраны сотрудниками отдела Молекулярных основ генетики человека под руководством д.б.н., профессора Лимборской С. А. в Институте Молекулярной Генетики РАН.
Работа была проведена в рамках институционального проекта 06.407.006F; индивидуальных грантов 08-04-90902 РФФИ и CRDF/MRDA project MYSSP-1403 и стипендии WFS.
Описание количественных признаков проводилось при помощи вычисления среднего значения, а качественных признаков – вычисления частот. Сравнение групп по количественным признакам проводилась при помощи параметрического дисперсионного анализа, а сравнение групп по качественному признаку при вычислении показателей отношения шансов, чувствительности и специфичности и регрессионного логистического анализа [21].
Статистическая обработка данных выполнялась с помощью прикладных программ StatDirect, GraphPad InStat. Вероятностные гаплотипы определялись программами PLINK и Phase2.1. Тип и силы межгенного взаимодействия оценивались при помощи непараметрического кластерного анализа MDR [17].
Глава 3. АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ
С ИШЕМИЧЕСКИМ ИНСУЛЬТОМ
3.1. Анализ распространенности полиморфных вариантов генов-кандидатов В связи с тем, что распределение частот аллелей исследуемых полиморфных вариантов данных генов в популяции Республики Молдова рассматривалось впервые, для каждого локуса был проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов геновкандидатов ишемического инсульта для оценки степени генетической изменчивости. Для этого был определен уровень фактической гетерозиготности по каждому локусу и соответствие равновесному распределению Харди-Вайнберга (см. рис. 3.1).Установлены низкая распространенность мутантных аллелей генов F2, F5, минорных аллелей генов GP1BA, rs152312 PDE4D и максимальные показатели гетерозиготности полиморфных вариантов генов АСЕ, PAI-1, ALOX5AP и rs2910829 PDE4D. Определено, что распределение частот аллелей генов F2, F5, GP1BA, PAI-1, ALOX5AP, PDE4D соответствовало ожидаемым закону равновесия Харди-Вайнберга (р>0,05), тогда как в контрольной выборке для I/D полиморфизма гена АСЕ распределение частот аллелей и генотипов не соответствовало данному закону (р0,05).
В связи с тем, что исследуемые локусы rs10507391 (TA) и rs9551963 (CA) находятся в одном гаплоблоке А гена ALOX5AP при помощи программы Phase2.1 были определены вероятностные гаплотипы. На рисунке 3.2 представлены результаты распределения частот гаплотипов в исследуемых группах.
Таблица 3.3. Распределение частот аллелей полиморфизма гена ALOX5AP OR – отношение шансов; ДИ – доверительный интервал; 2 – критерий хи-квадрат для таблиц сопряженности 2х2; n – объем выборки; р – достигнутый уровень значимости.
Примечание: ИИ – группа больных ишемическим инсультом.
В расчетах показателей использована мультипликативная модель наследования (d.f.=1).
Так, частота гаплотипа ТС в группе контроля соответствовала 51,4%, тогда как в группе больных ИИ – 42,8%. Гаплотип ТА в группе контроля встречался с частотой 21,5%, а в группе больных ИИ – 25,6%, и, соответственно, гаплотип АА – 21,2% и 16,6%. Частота гаплотипа АС в группе больных была выше почти в 3 раза, чем в группе контроля, соответственно, 15,0% и 5,9% (рT) с низкой степенью воспроизводимости CVC=4/10 и 2=10, (р=0,0013). 3-х локусная модель из локусов rs10507391 ALOX5AP (T>A), rs9551963 ALOX5AP (A>C) и rs2910829 PDE4D (G>A) также не имела высокую воспроизводимость (CVC=5/10) при тестируемой сбалансированной точности 0,66, чувствительности 0,63 и специфичности 0,67.
(G>A) и rs1799768 PAI-1 (5G>4G) показали высокую воспроизводимость CVC=6/10 и 2=45, (р< 0,0001).
На рисунке 3.3 представлена дендрограмма, описывающая характер и силу межгенных взаимодействия при ишемическом инсульте. Выявленная программой MDR модель состоит из двух связанных между собой кластеров. Первый кластер включает модуль с дублирующим типом взаимодействия локусов rs1799768 PAI-1 (5G>4G) и rs4646994 ACE (Ins>Del), который, в свою очередь, сильно связан с локусом rs2910829 PDE4D (G>A) (синий цвет линий).
Второй кластер содержит сильно взаимодействующие между собой локусы гена ALOX5AP – rs9551963 (A>C) и rs10507391 (T>A) (красный цвет линий). В свою очередь, первый и второй кластеры также демонстрируют эффект дублирующего типа взаимодействия (зеленый цвет линий).
Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ И
КЛИНИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С УЧЕТОМ ПОЛА, ВОЗРАСТА И КУРЕНИЯ
4.1 Анализ клинических показателей С целью определения силы ассоциации выбранных генетических маркеров с общими факторами риска ИИ – гиперлипидемией, гипертонией, курением и полом у 154 человек – здоровых (30 мужчин и 33 женщины) и 91 больных (44 мужчины и 47 женщин) в сыворотке крови был проведен биохимический анализ основных параметров липидного метаболизма [3, 14, 18, 19]. У каждого участника исследования были измерены систолическое и диастолическое артериальное давление, вес и выявлен статус курения.С учетом возраста группа больных была разделена на молодую ( лет) возрастные группы. Как и следовало ожидать, в результате однофакторного дисперсионного анализа были выявлены значимые различия уровня показателей артериального давления, метаболизма липидов и глюкозы между исследуемыми группами здоровых и больных ИИ. При помощи метода логической регрессии был оценен вклад каждого из клинических показателей и выявлено, что такие факторы как курение, излишний вес, повышение систолического артериального давления и уровня триглицеридов вносят вклад в развитие ишемического инсульта с 2 = 169,9 и р < 0,0001 (см. табл. 4.1).
Таблица 4.1 Оценка эффективности клинических показателей курения. Лучшей из межгенных взаимодействий у курящих при ишемическом инсульте выделим 2-х локусную модель, в состав которой входили rs9551963 ALOX5AP (A>C) и rs2910829 PDE4D (G>A) с воспроизводимостью в 60% и 2=20,6 (рA) rs4646994 ACE (Ins>Del), rs1799768 PAI-1(5G>4G) на ишемический инсульт.
«