1

На правах рукописи

Гребенкина Татьяна Михайловна

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА PLANTAGO L.

В СВЯЗИ С УСЛОВИЯМИ ПРОИЗРАСТАНИЯ

03.02.08 – экология (биологические наук

и)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2013 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт экологии Волжского бассейна Российской академии наук

Научный руководитель: Розенцвет Ольга Анатольевна, доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Кулагин Андрей Алексеевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой экологии и природопользования ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет имени М. Акмуллы»

Степанов Сергей Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и физиологии растений биологического факультета ФГПОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Ведущая организация: ФГБУН Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук, г. Петрозаводск

Защита состоится 20 декабря 2013 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при ФГПОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу 410012, г.

Саратов, ул. Астраханская, 83, е-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Автореферат разослан « 18 » «ноября» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Невский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из направлений повышения качества жизни российских граждан, реализуемое Указом Президента РФ от 12.05.2009 года № 537 «О стратегии национальной безопасности Российской Федерации до года» является обеспечение населения высококачественными и доступными лекарственными препаратами. Возрастающая популярность эффективных и безопасных растительных препаратов требует постоянного расширения ассортимента лекарственных средств и развития их сырьевой базы (Курочкин, 1994; Коломиец, Ефимов, 2005; Смирнова, 2009).

Растения рода Plantago L. (подорожник) широко используются в производстве ряда лекарственных препаратов и являются ценным источником биологически активных соединений (БАС) (Maiti, 2000; Popov, 2008; Apexa, Saravanan, 2010). При высоком видовом разнообразии рода Plantago для изготовления лекарственных препаратов в России применяется только вид Plantago major L., что ограничивает сырьевую базу. Единственным БАС, по которому оцениваются лекарственные свойства P. major в Государственной Фармакопее Российской Федерации, является концентрация полисахаридов (ПС) (Димитрук, 2004).

Известно, что эффективность растительных лекарственных средств связана с наличием в сырье не только ПС, но и других БАС, представляющих собой продукты первичного и вторичного метаболизма, такие как, липиды, жирные кислоты (ЖК), хлорофиллы, алкалоиды, фенольные соединения, каротиноиды и т.д. (Муравьева, 2002; Яковлев, 2006).

В то же время эти соединения являются компонентами, поддерживающими жизненно важные функции клетки и организма, а их содержание в растениях зависит от условий произрастания (Стоник, Толстиков, 2008). Однако взаимосвязь между морфометрическими параметрами отдельных органов растений рода Plantago и содержанием БАС, отвечающих за основные обменные процессы клетки, систематически не изучена. Кроме того, для растений данного рода практически не исследована сезонная динамика содержания БАС, суточные вариации концентраций в естественных условиях произрастания в зависимости от ведущих абиотических (обеспеченность светом, теплом, влагой, минеральным питанием) и антропогенных факторов, а также координации процессов первичного и вторичного метаболизма.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выявление особенностей изменений морфометрических и физиолого-биохимических характеристик растений рода Plantago L. от условий произрастания, а также установление закономерностей влияния абиотических и антропогенных факторов на содержание БАС.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) изучение морфометрических характеристик пяти видов растений рода Plantagо, включая фармакопейный вид Plantago major, исследование состава и содержания БАС в разных частях растений;

2) анализ сезонных изменений морфометрических параметров и содержания БАС;

3) исследование суточной динамики содержания БАС на примере листьев растений Plantago media L.;

4) установление влияния «условно загрязненной» среды и географоклиматических условий на морфометрию отдельных органов и содержание БАС растений;

5) выявление взаимосвязи параметров роста Plantago media, физиологобиохимических характеристик клетки с абиотическими и антропогенными факторами среды произрастания.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование морфометрических и физиолого-биохимических характеристик пяти видов рода Plantago. Установлено сходство качественного и различия количественного состава БАС исследованных видов растений. Обнаружено, что содержание водорастворимых ПС в листьях вида Plantago uliginosa F. W. Schmidt существенно превышает аналогичный показатель фармакопейного вида Plantago major. На примере Plantago media выявлена сезонная и суточная динамика содержания БАС в отдельных органах растений в зависимости от условий, определяемых абиотическими и антропогенными факторами.

Теоретическая и практическая значимость. Разработан метод целенаправленного поиска перспективных источников БАС, основанный на филогенетическом родстве растений. Выявлена взаимосвязь морфометрических и структурно-функциональных характеристик растений в зависимости от периода вегетации и условий обитания. Полученные результаты являются основой для разработки практических рекомендаций по определению оптимального времени сбора лекарственных растений рода Plantago и выбора условий их произрастания.

Растения вида Plantago uliginosa рекомендованы в качестве перспективного источника водорастворимых ПС и других БАС для производства лекарственных препаратов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов:

фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011); VII съезде ОФР России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школе «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011); Международной научно-практической конференции «Медикобиологические процессы адаптации» (Сухум, 2012); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); XIII съезде Русского ботанического общества «Современная ботаника в России» (Тольятти, 2013); VIII Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ»

(Калининград, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из которых 4 в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

Личный вклад автора. Автор лично провел полевые и лабораторные исследования. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление проведены автором самостоятельно, по плану, согласованному с научным руководителем. Доля участия автора в совместных публикациях составляет 60-80%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 141 странице, содержит 17 таблиц и 36 рисунков. Состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы, включающего 220 источников, в том числе 61 иностранный.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность д.б.н. О.А. Розенцвет за огромную помощь в осмыслении аналитического материала, консультации и поддержку. Признательна также к.б.н. В.Н. Нестерову, к.б.н. Е.С. Богдановой, Л.М. Тарановой и Л.А. Кульдякиной за бескорыстную помощь в освоении новых методов исследования и содействии в их проведении; проф., д.б.н. С.В. Саксонову и к.б.н. Н.С. Ракову за консультативную помощь.

Основные положения, выносимые на защиту.

Выявлена взаимосвязь между морфометрическими и физиологобиохимическими параметрами растений в зависимости от абиотических и антропогенных факторов местообитания.

Установлена суточная и сезонная динамика содержания БАС (полисахаридов, фенольных соединений, липидов, жирных кислот и аскорбиновой кислоты) Plantago media. в естественных и антропогенно нарушенных условиях произрастания.

3. Растения Plantago media, Plantago uliginosa, Plantago lanceolata L. и Plantago stepposa Kuprian, филогенетически родственные фармакопейному виду Plantago major, являются перспективным источником исследованных типов БАС.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность проблемы, определены цель и задачи исследования, охарактеризована научная новизна, научно-практическая значимость, представлены сведения об апробации работы и сформулированы основные положения, выносимые на защиту.

В главе приведены сведения о систематике и экологии растений сем.

классификации лекарственных растений; структурноPlantaginaceae;

функциональных компонентах, обладающих свойствами БАС. На основании анализа отечественной и иностранной литературы рассматриваются некоторые механизмы адаптации растений к условиям произрастания с участием БАС.

В качестве объектов исследования выбраны растения Plantago major, P.

uliginosa, P. media, P. stepposa, P. lanceolata, в систематическом плане представляющие род Plantago, сем. Plantaginaceae, пор. Scrophulariales, отд.

Magnoliophyta (Angiospermae) (Флора Европейской.., 1981).

Растительный материал отбирали в 4-х ценопопуляциях (ЦП) в летние месяцы 2010–2013 гг. ЦП-1 и ЦП-2 («условно чистая среда») локализованы в национальном парке «Самарская Лука» Самарской области (53°23'57''с.ш., 49°35'26'' в.д. и 53°23'57''с.ш., 49°35'26'' в.д. соответственно); ЦП-3 («условно загрязненная среда») – вблизи автомагистрали (3-5 м) в черте г. Тольятти (53°3123с.ш., 49°2445 в.д.); ЦП-4 – в Кемеровской области (54°32'60"с.ш., 85°24'00" в.д.). В образцах почвы, отобранных на глубине 15-20 см, определяли кислотность и влажность (Аринушкина, 1970). 10-12 типичных растений из каждой популяции разделяли на листья, генеративные побеги и корневую часть, измельчали, и из объединенной биомассы составляли три биологические пробы для каждого вида анализов.

Линейные измерения проводили с помощью линейки и штангенциркуля, измерения массы – на весах ВЛТ-200 и ЛВ 210-А (ЗАО «Сартогосм», Россия).

Площадь листовых пластинок вычисляли по формуле: S = 0,66ld, где l – длина листа, мм; d – его ширина, мм (Аникеев, 1961). Удельную поверхностную плотность листьев (УППЛ) вычисляли как соотношение сухой массы листьев (мг) к их площади (см2), коэффициент роста листа (Кроста) – как соотношение массы листа растения (мг) к его длине (мм). Отношение массы надземной (Мн.ч) и подземной частей (Мп.ч) рассчитывали по формуле: Мн.ч./Мп.ч.. Содержание воды в растительных тканях определяли после высушивания образцов до постоянной массы (Максимов, 1999); ПС – гравиметрическим методом после удаления неуглеводных компонентов (Ананьина, 2008), водорастворимых ПС (ВРПС), пектиновых веществ (ПВ), геммицеллюлозы А и Б (ГЦ А и ГЦ Б) – в соответствии с рекомендациями Н.К. Кочеткова (1970); АК – по методу ГФ (2008); фенольных соединений – гравиметрическим методом после удаления липофильных веществ и хлорофиллов (Краснов, 1987); фотосинтетических пигментов – спектрофотометрически после экстракции ацетоном (100%), при 662, 645 и нм. Концентрацию рассчитывали по методу Н.К. Lichtenthaler (1987). Перекисное окисление липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) после реакции с тиобарбитуровой кислотой на спектрофотометре «ПЭ– 3000 УФ» («ПромЭкоЛаб», Россия) при длине волны 532 нм. Липиды экстрагировали смесью хлороформ-метанол (1:2) (Bligh, Dyer, 1959), идентифицировали с использованием специфических реагентов и стандартов (Кейтс, 1975), разделяли методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинках с закрепленным слоем силикагеля («Хаапсалу», Эстония; «Сорбполимер», Россия) с использованием систем растворителей, описанных ранее (Розенцвет, 2006; Розенцвет и др., 2013). Анализ ЖК проводили после метанолиза в 5% растворе HCl в течение 1 ч на хроматографе «Кристалл 5000.1» («Хроматэк», Россия) в изотермическом режиме на капиллярной колонке Rtx-2330 («RESTEK», США) длиной 105 м, диаметром 0,25 мм. Толщина пленки фазы в колонке – 0,2 мкм. Температура колонки – 180°С, испарителя и детектора – 260°С. Скорость тока газа-носителя (гелий) – 2 мл/мин. ЖК идентифицировали, сравнивая относительное время удерживания полученных пиков со стандартной смесью «37 Comp. FAME Mix» («Supelko», США). Относительное содержание ЖК определяли в весовых процентах от общего их содержания в исследуемом образце.

Результаты экспериментов обрабатывали с помощью пакета офисных программ Statistica 6,0 for Windows, Statgraphics Centurion XV, Canoco 4,5 for Windows и Microsoft Excel 2007. Результаты представлены в виде средних величин и их стандартных ошибок. Достоверность отличий оценивали с помощью непараметрического критерия Стьюдента при уровне значимости P < 0,05.

3.1. Морфометрические и физиолого-биохимические характеристики Морфометрические характеристики Plantagо unliginosa, P. media, P.

stepposa, P. lanceolata изучали в сравнении с официнальным видом P. major.

Показано, что отношение Мн.ч/Мп.ч снижалось в ряду P. major > P. uliginosa > P.

lanceolata > P. media > P. stepposa. Листья растений P. stepposa и P. uliginosa имели бльшую длину, ширину и площадь по сравнению с остальными видами.

Однако показатель УППЛ был максимальным у P. stepposa и P. media. Листья у P.

uliginosa, P. major и P. lanceolata были больше оводнены, чем у P. stepposa и P.

media. Площадь листьев и Кроста уменьшались в ряду P. stepposa > P. uliginosa > P.

major > P. media > P. lanceolata.

В качестве физиолого-биохимических характеристик проанализированы содержание пигментов, ПС, липидов и их ЖК, аскорбиновой кислоты (АК) и фенольных соединений, выполняющих метаболическую и структурную функции.

Накопление ПС – одного из классов БАС, содержащихся в листьях растений фармакопейного вида P. major – в большей степени отмечено в надземной части растений: в листьях 355-695 мг/г сухой массы и в генеративных побегах – 264- мг/г, в подземной части – 515-833 мг/г (рисунок 1). По сравнению с P. major в листьях P. uliginosa ПС концентрировалось меньше в 1,2 раза, но больше, чем в растениях других исследуемых видов; в генеративных побегах P. media содержание этого компонента было достоверно равным, а в корнях больше в 1, раза, чем у фармакопейного вида.

Липиды (суммарные липиды) (СЛ), выделенные из нативных клеток, состоят из гликолипидов (ГЛ), фосфолипидов (ФЛ) и нейтральных липидов (НЛ).

Первые два типа – полярные – входят в состав липидного матрикса биологических мембран, последние являются источником энергетического и метаболического резерва клетки. Концентрация СЛ в листьях пяти видов растений варьировала от 5 до 7, в генеративных побегах – от 7 до 10, в корневой системе – от 4 до 11 мг/г сырой массы, что свидетельствует о видо- и органоспецифичности данного показателя (таблица 1). В листьях растений концентрация СЛ у P. media и P. major была достоверно равной; в генеративных побегах – уменьшалась в ряду P. lanceolata > P. uliginosa > P. stepposa > P. major > P. media; в корневой части – аккумулировались в бльшей степени у P. major, в меньшей – у P. uliginosa, P. media и P. stepposa.

Таблица 1 – Содержание липидов в отдельных органах представителей

ГЛ ФЛ НЛ СЛ

P. major P. uliginosa генеративные побеги 2,7±0,1 2,9±0,2 3,7±0,6 9,2±0, P. media P. lanceolata генеративные побеги 3,9±0,2 2,9±0,2 3,8±0,5 10,4±1, С изменением состава ЖК связывают участие мембран в адаптации растений к условиям обитания. Кроме обеспечения целостности мембран и оптимального уровня их текучести ЖК обуславливают включение и диффузное перемещение мембранных компонентов, активность мембранносвязанных ферментов, проницаемость и транспортные свойства. Доминирующими ЖК растений рода Plantago были С16:0, С18:2 и С18:3. Их содержание составляло в сумме 90-95%. Липиды листьев всех исследованных растений обогащены непредельными ЖК: С18:3 (47-56), С18:2 (12-17) и С18:1 (4-6% от фракции ЖК).

В генеративных побегах и корнях больше, чем в листьях содержалось С18:2 (от до 40 и от 37 до 50% соответственно). Практически для всех растений отмечена тенденция снижения концентрации С18:3 и соответственное увеличение относительного вклада С18:2 в ряду листья > генеративные побеги > корни.

В наибольшем количестве АК (витамин С) обнаружена в листьях и генеративных побегах P. media (1,8 и 1,9 мг/г сухой массы), что превышало эти показатели у P. major в 3,3 и 3,1 раза соответственно; в корневой части – у P.

lanceolata (выше в 1,6 раза).

Содержание хлорофиллов в листьях исследованных растений варьировало от 3,3 до 8,3 мг/г сухой массы и уменьшалось в ряду P. major > P. media > P.

lanceolata > P. uliginosa > P. stepposa.

Содержание каротиноидов в листьях растений находилось в диапазоне от 1,1 до 2,3 мг/г сухой массы, которое можно представить рядом убывания: P. major = P. lanceolata > P. media > P. stepposa > P. uliginosa.

Фенольные соединения, проявляя антиоксидантные свойства наряду с каротиноидами и АК, накапливались больше в листьях всех видов растений, чем в генеративных побегах и корнях (88-166, 19- и 4-21 мг/г сухой массы соответственно;

рисунок 2). Наибольшее их накопление в надземной части растений выявлено у P.

uliginosa и P. media, что было выше, чем у вида P. major, на 10-30% соответственно, а в подземной – у P. uliginosa.

Сравнение с официнальным видом показало, что растения исследованных видов фенольных соединений в источников исследованных БАС: P. media и P. представителей рода Plantago L.

uliginosa – по содержанию ПС, P. media и P.

stepposa – липидов, P. media – АК и к. – корни, г.п. – генеративные хлорофиллов, P. uliginosa и P. lanceolata – побеги, л. – листья. По оси абсцисс – каротиноидов и фенольных соединений, из которых наиболее перспективным является вид P. uliginosa 3.2. Сезонная динамика морфометрических и физиолого-биохимических Учитывая, что на протяжении онтогенеза в тканях растения неоднократно меняются типы метаболизма в соответствии с заложенной в нем генетической программой, реализация которой в значительной степени зависит от внешних факторов (Мокроносов, 1981), на примере P. media изучены сезонные изменения морфометрических и физиолого-биохимических параметров. На участке, где произрастали растения ЦП-1, показатели абиотических факторов (температурный режим и освещенность) были выше, чем на участке, где произрастали растения ЦП-2, при этом кислотность почв на обоих участках была одинаковой (таблица 2).

В условиях Среднего Поволжья начало вегетации приходится на конец апреля, а период цветения обычно начинается в конце мая и заканчивается в середине августа. Исследования проводили с июня по август, когда растения находились в стадии зацветания, полного цветения и отцветания.

В июне длина листьев у растений, произрастающих на свету, превышала длину листьев растений, произрастающих в тени, на 5%, а в июле листья растений ЦП-2 были длиннее листьев ЦП-1 на 50% (таблица 3).

Таблица 2 – Абиотические факторы в местах произрастания растений P. media Растения ЦП-2 были более оводнены, имели бльшую скорость роста листа при меньшем показателе УППЛ и биомассе листьев. Следовательно, в течение летнего периода очевидны различия в размерах и массе отдельных частей растений, произрастающих в разных условиях.

Таблица 3 – Сезонные изменения морфометрических характеристик P. media Площадь листа, 18,6±1,7 22,7±1,6 18,6±1,8 22,3±2,2 37,2±3,7 32,2±2, cм Мсух.вещ., % 23,7±0,1 17,4±0,1 26,8±1,6 22,7±0,1 29,4±0,2 22,9±0, Длина генерат. 44,5±4,5 177,3±32 226,5±22,6 255,8±67,2 560±81,8 422,2±9, побега, мм Длина корня, 118,5±17,1 159,1±17,1 99,0±7,5 136,3±19,5 94,3±10,3 121,3±87, Содержание хлорофиллов у растений ЦП-2 было выше, чем у растений ЦП-1. В июне концентрация этого компонента была максимальной: 4,5 и 6,9 мг/г сухой массы у растений ЦП-1 и ЦП-2 соответственно. Отношение Хл а/Хл b не различалось у растений разных популяций и имело тенденцию к снижению в течение летнего периода (таблица 4).

Таблица 4 – Сезонная динамика содержания пигментов в листьях P. media Хл a+b, мг/г сухой 4,5±0,5 6,9±0,7 4,3±0,5 5,3±0,4 4,5±0,4 5,8±0, массы Хл a+b/Каротиноиды 3,1±0,0 5,0±0,0 3,7±0,3 3,7±0,0 3,7±0,0 3,7±0, В июне доля каротиноидов у растений ЦП-1 была выше, чем у растений ЦП-2. Вероятно, в условиях более высокой инсоляции на первый план выступает фотозащитная роль каротиноидов, тогда как в пигментном аппарате теневых растений каротиноиды выступают в качестве дополнительных светосборщиков (Стржалка, 2003).

физиологического состояния растений на уровне клетки является интенсивность образования продуктов ПОЛ (рисунок 3).

Содержание МДА в июне у растений ЦП-1 и ЦП-2 не имело достоверных отличий. В середине и конце летнего периода в листьях увеличивалось в 2-3 раза по сравнению с июнем, а в листьях ЦП-2 – вдвое к августу. динамика содержания Следовательно, процессы ПОЛ усиливались к малонового диальдегида в периоду отцветания, но у растений освещенных листьях P. media мест обитания они начинались раньше. По оси абсцисс – время сезона Содержание липидов в разных органах вегетации, месяц; по оси ординат – растений максимальным было в июне. концентрация, мкМ/г сырой массы Фракция ГЛ, основных структурных компонентов мембран тилакоидов, источника полиненасыщенных ЖК и углеводов, состояла из моногалактозилдиацилглицеринов (МГДГ), дигалактозилдиацилглицеринов (ДГДГ) и сульфохиновозилдиацилглицеринов (СХДГ). В листьях растений большее количество МГДГ и ДГДГ синтезировалось в июне, причем в растениях ЦП-1 их содержание было на 15% выше, чем в Рисунок 4 – Сезонная динамика содержания гликолипидов в листьях P.

media МГДГ-моногалактизилдиацилглицерины, ДГДГ- дигалактозилдиацилглицерины, СХДГсульфохиновозилдиацилглицерины. По оси абсцисс – месяц; по оси ординат – концентрация, мг/г сырой массы растениях ЦП-2 (рисунок 4). В июле содержание всех компонентов ГЛ снижалось, и практически нивелировались различия между растениями разных ЦП, но к августу состав ГЛ у растений ЦП-2 восстанавливался, что может свидетельствовать о структурных перестройках фотосинтетического аппарата в течение летнего периода.

В содержании ФЛ листьев изменения были связаны с фосфатидилхолинами (ФХ), фосфатидилглицеринами (ФГ), фосфатидилэтаноламинами (ФЭ) (рисунок 5).

Вклад ФХ в пул ФЛ листьев был максимальным в начале лета у растений ЦПи ЦП-2, снижаясь к июлю с 50% до 40 и 44% соответственно. Максимальное содержание ФГ коррелировало с показателем Кроста (r = 0, при p < 0,01), что может свидетельствовать об интенсивном формировании фотосинтетического аппарата растений, поскольку от данного типа липидов зависит организация гран Murata, 2009). Относительное содержание фосфолипидов в листьях P. media ФЭ в листьях растений ЦП-1 в течение лета снижалось на 10-15%, а в листьях ЦП-2 – ФГ– фосфотидилглицерин, Не менее интенсивные сезонные По оси абсцисс – месяц; по оси изменения происходили в составе НЛ. Так, в ординат – концентрация, мг/г сырой июле в листьях двух ЦП на 20% массы диацилглицеринов (ДАГ) на фоне снижения стеринов (Ст) (рисунок 6). В августе накапливалось содержание ТАГ, ЭС и Ст.

Содержание НЛ в генеративных побегах было выше по сравнению с листьями у ЦП- и ЦП-2. Выявлена высокая степень корреляции содержания НЛ с площадью листа (r = 0,94 при р < 0,05) у ЦП-1 и ЦП-2, что может быть связано с образованием запасных органелл – липидных глобул, размер которых увеличивался по мере роста динамика содержания листьев (Murphy, 2011).

наблюдалась в июле, когда отмечена ДАГ– диацилглицерины, ТАГ– наибольшая интенсивность процессов ПОЛ и меньшая оводненность листьев (рисунок 7 а). эфиры стеринов. По оси абсцисс – В отличие от АК содержание фенольных мг/г сырой массы соединений снижалось к этому времени почти на 30% (рисунок 7 б). В динамике содержания ПС отмечена стойкая тенденция к увеличению содержания их суммы и отдельных фракций к концу летнего периода (рисунок 7 в).

Рисунок 7 – Сезонная динамика содержания аскорбиновой кислоты (а), фенольных соединений (б) и полисахаридов (в) в листьях P. media обозначения см. на рис. 1. По оси абсцисс – месяц; по оси ординат – концентрация, мг/г сухой массы 3.3. Суточная динамика физиолого-биохимических характеристик листьев В естественных условиях произрастания растений постоянно меняются уровень освещенности, температура и другие условия. Приспособление растений при этом происходит в динамическом режиме, задаваемом периодом изменений (Кособрюхов и др., 2009). Исследования суточной динамики физиолого-биохимических характеристик проводили на примере листьев P. media. В утренние часы содержание воды в листьях P.

media было максимальным и снижалось к полудню: у растений ЦП-1 – с 81% до 72%, ЦП- – с 77% до 75% (рисунок 8). В вечернее время содержание воды в листьях растений ЦП-1 динамика содержания воды в повышалось до 76%, а в листьях растений ЦП-2 листьях P. media оставалось на прежнем уровне.

В растениях ЦП-1, которые произрастали на по оси ординат – концентрация, более освещенном участке, уровень ПОЛ по % сравнению с утренним временем увеличивался к 14 ч на 26% и снижался к вечеру до утренних значений (рисунок 9). Следовательно, более высокая температура и высокая интенсивность света, свойственные середине летнего дня, приводили к повышенному образованию в клетках активных форм кислорода и окислению органических молекул, включая липиды. У растений ЦП-2, произрастающих в затененном местообитании, водный баланс претерпевал динамика содержания МДА меньшие изменения, а уровень ПОЛ в утреннее и в листьях P. media дневное время не менялся. Характер изменения концентрации хлорофиллов a+b в течение дня у По оси абсцисс – время суток, ч;

обоих типов растений различался. В листьях по оси ординат – концентрация, растений ЦП-1 в дневное время содержание зеленых пигментов было минимальным, а в листьях ЦП-2 – максимальным (таблица 5). Известно, что изменение содержания хлорофиллов в листьях растений обычно сопровождается изменением числа пластид и их размеров (Любименко, 1963).

Таблица 5 – Суточная динамика содержания пигментов в листьях P. media массы Хл/каротиноиды 3,5±0,1 3,1±0,2 2,8±0,3 3,6±0,2 3,5±0,2 3,5±0, Отношение Хл а/Хл b оставалось, как правило, стабильным в течение суток для затененных растений. Отмечено, что в листьях растений P. media, произрастающих в условиях Самарской области, показатель Хл а/Хл b был ниже, чем у растений этого вида, произрастающих в условиях Южного Тимана (от 2, до 2,9) (Головко и др., 2011).

Наибольшее содержание как суммарных, так и ГЛ, наблюдалось у обоих типов растений в утреннее время. При этом содержание ГЛ у растений ЦП-1 к ч снижалось и оставалось на этом же уровне до 21 ч, а у растений ЦП- снижалось в течение всего светового дня. Содержание ФЛ в листьях растений ЦП-1 уменьшалось к 14 ч (~20%), а в листьях растений ЦП-2 практически не менялось в течение дня (таблица 6).

Таблица 6. Суточная динамика содержаниялипидов в листьях растений P. media Время суток, ч Популяции

ГЛ ФЛ НЛ СЛ

Известно, что структурное состояние мембран зависит не только от количества липидов, но и от их соотношения (Крепс, 1981). Оказалось, что при общем снижении уровня ГЛ, относительный вклад отдельных компонентов был более стабильным. Так, содержание МГДГ во фракции ГЛ листьев растений ЦП- варьировало от 46 до 50%, в ЦП-2 – от 45 до 52%. При этом в листьях ЦП-2 вклад МГДГ в пул ГЛ был максимальным в 14 ч на фоне низкого уровня ДГДГ при стабильном вкладе СХДГ. В отличие от ГЛ, состав ФЛ претерпевал бльшие изменения в течение дня. Особенно четко эта зависимость прослеживается у растений ЦП-1 на показателе отношения ФХ/ФЭ, что может быть связано с изменением путей биосинтеза ФХ или бльшей их подверженности процессам ПОЛ (рисунок 10).

соотношения ФХ/ФЭ в листьях P. media ФХ – фосфатидилхолин, ФЭ – фосфатидилэтаноламин.

По оси абсцисс – время суток, ч; по оси ординат – значение соотношения В содержании практически всех компонентов НЛ отмечена высокая степень суточной вариабельности. Наиболее характерным было увеличение ДАГ и уменьшение концентрации Ст.

В середине дня также отмечено двукратное увеличение содержания АК и некоторое снижение концентрации ПС. Достоверных изменений содержания фенольных соединений не обнаружено (рисунок 11).

Рисунок 11 – Суточная динамика содержания аскорбиновой кислоты (а), фенольных соединений (б) и полисахаридов (в) в листьях P. media обозначения см. на рис. 1. По оси абсцисс – время суток, ч; по оси ординат – концентрация, мг/г сухой массы 3.4. Изменение морфометрических и физиолого-биохимических характеристик Plantago media под влиянием условий произрастания Влияние «условно загрязненной среды» на исследуемые характеристики изучено при сравнении растений, собранных в городских условиях (ЦП-3) и в «условно чистой среде» в условиях национального парка (ЦП-1,-2) в течение трех летних месяцев. Площадь листьев, длина побегов и корней растений ЦП-3 были больше по сравнению с растениями ЦП-1,-2. В июле надземная биомасса растений ЦП-3 накапливалась более интенсивно (рисунок 12).

Состав и количество ГЛ у растений ЦП-3 не отличался от растений ЦП-1,-2, т.е. городские условия не оказывали существенного влияния на состав липидов, отвечающих за формирование мембран фотосинтетического аппарата.

Рисунок 12 – Соотношение биомассы надземной и подземной частей P. media По оси абсцисс – месяц; по оси ординат – значение соотношения В составе ФЛ более высоким был вклад ФХ: 40-60% от фракции ФЛ – у растений ЦП-3 и 40-50% – у ЦП-1,-2. Более интенсивные изменения показаны в концентрации ФЭ у растений ЦП-3 (5-30%) по сравнению с растениями ЦП-1,- (12-18%).

Уровень ПОЛ у растений ЦП-3 был выше, чем у растений ЦП-1,-2, в течение всего периода (рисунок 13). Если сравнить этот показатель с содержанием ФЛ, то очевидна их взаимосвязь, особенно четко прослеживаемая у растений, произрастающих на свету, и у растений, произрастающих в «условно загрязненной среде»: увеличение уровня ПОЛ обратно пропорционально содержанию ФЛ.

Рисунок 13 – Содержание малонового диальдегида (прямой порядок оси ординат) и фосфолипидов (обратный порядок оси ординат) в листьях P. media По оси абсцисс – ценопопуляции; по оси ординат: прямой порядок – концентрация, мкМ/г сырой массы; обратный порядок – концентрация, мг/г сырой массы В городских условиях наблюдалась более низкая концентрация фотосинтетических пигментов при достоверно одинаковой концентрации каротиноидов в течение летнего периода (таблица 7).

Таблица 7 – Содержание фотосинтетических пигментов в листьях P. media Хл а+b, мг/г 4,5±0,5 6,9±0,7 4,0±0,4 4,3±0,5 5,3±0,4 3,6±0,6 4,5±0,4 5,8±0,4 3,8±0, сухой массы Хл a /b 1,4±0,0 1,4±0,0 1,4±0,2 1,4±0,1 1,3±0,0 1,7±0,0 1,3±0,0 1,2±0,0 1,5±0, Хл/Каротиноды 3,1±0,0 5,0±0,0 3,8±0,2 3,7±0,3 3,7±0,0 4,4±0,2 3,7±0,0 3,7±0,1 3,9±0, Низкий уровень содержания хлорофиллов, но увеличение их соотношения в растениях ЦП-3 по сравнению с растениями ЦП-1,-2 может быть вызвано приспособлением пигментного аппарата листьев к условиям обитания (Максимова, 2007; Терлеева, 2011).

В ЦП-3 содержание АК и ПС было на 30% ниже, чем в ЦП-1,-2, в то время как содержание фенольных соединений – выше на 20% (рисунок 14).

Рисунок 14 – Содержание аскорбиновой кислоты (а), фенольных соединений (б), полисахаридов (в) в листьях P. media обозначения см. на рис. 1. По оси абсцисс – места произрастания; по оси ординат – концентрация, мг/г сухой массы Учитывая, что P. media имеет широкий ареал, были проанализированы растения из разных географических районов в одинаковой фазе онтогенеза. В результате были установлены отличия: содержание липидов в листьях и корневой части растений, произрастающих в Кемеровской области, было в 2 раза больше, чем в растениях Самарской области; отмечен более высокий вклад МГДГ (на 12%) и низкий ДГДГ (на 12%) в пул ГЛ; больший вклад ФХ (на 7%) во фракцию ФЛ и высокое содержание С18:3 (на 10%) в пуле ЖК. В растениях, произрастающих в Самарской области, наблюдали более высокую концентрацию АК (на 15% выше, чем в растениях из Кемеровской области), а фенольных соединений и ПС – ниже в 1,5 и 3,8 раза соответственно. Отношение Хл а/Хл b в листьях растений P. media, произрастающих в условиях Кемеровской области – 2,5 – также как и в растениях, произрастающих в условиях Южного Тимана, было выше, чем у растений Самарской области.

3.5. Взаимосвязь условий обитания и структурно-функциональных свойств Как видно из представленных данных, исследованные растения рода Plantago отличаются видо- и органоспецифичностью в отношении морфометрических параметров и структурно-функциональных компонентов, используемых в качестве БАС. На примере листьев P. media установлено, что на количественные показатели этих характеристик оказывают влияние факторы среды произрастания, интегрированные в фотопериод (суточная динамика), вегетационный период (сезонная динамика) и пространственную разобщенность (географо-климатические условия). Использование метода канонического анализа соответствий (CCA, или Сanonical Сorrespondence Аnalysis) позволило наглядно продемонстрировать взаимосвязь между компонентами, поддерживающими жизненно важные функции клетки и организма и используемыми в качестве БАС, с параметрами роста (рисунок 15).

морфометрических и структурно-функциональных характеристик P. media обозначения: ГЛ – гликолипиды, Кар – каротиноиды, НЛ – нейтральные липиды, ПОЛ – перекисное окисление липидов, УППЛ – удельная поверхностная площадь листа, ФЛ – фосфолипиды, Хл – хлорофиллы, Lп. – длина генеративного побега, Lк. – длина корня, Lл. – длина листа, Sл – площадь листа, АК – аскорбиновая кислота, ВР ПС – водорастворимые полисахариды, ПВ ПС – пектиновые вещества полисахаридов, Ф – фенольные соединения.

Так, аккумуляция вторичных метаболитов – фенольных соединений и каротиноидов, тесно связана с концентрацией продуктов первичного синтеза – ФЛ и ГЛ, что в свою очередь, сопряжено с показателем УППЛ; накопление ВР ПС и ПВ зависит от линейных размеров и биомассы листьев, уровня ПОЛ;

концентрация хлорофиллов, связанная с Кроста, зависит от степени оводненности листьев; содержание АК обратно пропорционально накоплению фенольных соединений и каротиноидов.

Аналогичным методом установлена связь некоторых средневзвешенных биохимических и морфометрических параметров с градиентом факторов среды и их комбинации. Например, повышенные температура и интенсивность света приводили к накоплению в листьях НЛ и каротиноидов; с повышением влажности почвы увеличивалась оводненность листьев, Кроста и длина корня.

Выявленные закономерности могут быть полезными для оптимизации времени сбора целевых БАС в лекарственном сырье, а также оценке их потенциала в зависимости от погодных или климатических условий.

ВЫВОДЫ

На основе комплексного исследования морфометрических и физиологобиохимических характеристик пяти видов рода Plantagо L. установлено сходство качественного и различия количественного состава биологически активных соединений. Обнаружено, что содержание водорастворимых полисахаридов в листьях P. uliginosa превышает на 30% аналогичный показатель фармакопейного вида P. major. Содержание аскорбиновой кислоты в надземной части P. media и корнях P. lanceolata в 2-3 раза выше, чем у P. major. Общее содержание липидов, хлорофиллов и каротиноидов в листьях четырех исследованных видов рода Plantagо, как правило, находится на более низком уровне, чем у P. major.

Выявлена взаимосвязь между содержанием биологически активных соединений и периодом вегетации растений P. media. В течение летнего периода монотонно возрастает содержание полисахаридов, уменьшается содержание фенольных соединений, а зависимость содержания аскорбиновой кислоты имеет экстремальный характер с максимумом в самый жаркий период времени. С увеличением времени вегетации растений возрастает интенсивность процессов перекисного окисления липидов, что ведет к снижению общего содержания фосфолипидов. Максимальное содержание гликолипидов соответствует началу лета и коррелирует с константой роста листьев, а нейтральных липидов – концу лета одновременно с ростом площади листа. Содержание хлорофиллов, гликолипидов и состав жирных кислот суммарных липидов остается на относительно неизменном уровне.

На основании исследования суточной динамики физиолого-биохимических показателей в листьях P. media установлено, что в полуденное время на 15-30% снижается общее содержание хлорофиллов, липидов, полисахаридов и существенно увеличивается концентрация аскорбиновой кислоты. Эти изменения происходят на фоне 15% снижения содержания воды с одновременным повышением уровня перекисного окисления липидов.

При сравнении морфометрических и структурно-функциональных характеристик растений P. media, произрастающих в разных световых и температурных условиях, выявлено, что с увеличением интенсивности света и температуры повышается уровень перекисного окисления липидов (на 30%), показатель удельной поверхностной плотности листьев (на 15-27%) за счет снижения содержания воды. Одновременно наблюдается снижение общего содержания хлорофиллов и полярных липидов (на 15-25%).

Найдено, что растения, произрастающие в «условно загрязненной»

урбосреде, как правило, характеризуются более развитыми листьями и корневой системой, а также пониженной концентрацией исследуемых биологически активных компонентов по сравнению с растениями из «условно чистых»

местообитаний.

Полученные результаты являются основой для разработки практических рекомендаций по определению оптимального времени сбора лекарственных растений рода Plantago и выбора условий их произрастания. Растения вида Plantago uliginosa рекомендованы в качестве перспективного источника водорастворимых полисахаридов и других биологически активных соединений для производства лекарственных препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*-публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ 1. Гребенкина Т.М., Розенцвет О.А., Нестеров В.Н. Влияние городских условий на морфологические и физиолого-биохимические показатели Plantago media L. // Материалы Всерос. симпоз. «Экология мегаполисов фундаментальные основы и инновационные технологии». – М., 2011. – С. 48.

2. Гребенкина Т.М., Нестеров В.Н., Розенцвет О.А., Богданова Е.С. Суточная динамика содержания липидов в листьях Plantago media L. // VII съезд ОФР России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и междунар. науч. шк. «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции»: материалы докл. Часть I. – Н.

Новгород. 2011. – С. 199-200.

3.* Гребенкина Т.М., Нестеров В.Н., Розенцвет О.А., Богданова Е.С. Липиды листьев Plantago media (L.) // Изв. Самар. НЦ РАН. – 2011. – Т. 13, № 5. – С. 130-133.

4. Гребенкина Т.М. Влияние городской среды на структурное и функциональное состояние лекарственных растений // Медико-биологические процессы адаптации: материалы междунар. науч.-практ. конф. – Сухум, 2012. – С. 43-44.

5.* Гребенкина Т.М., Розенцвет О.А., Нестеров В.Н., Богданова Е.С.

Изменение состава липидов и пигментов Plantago media (PLANTAGINACEAE) в течение светлого времени суток // Растительные ресурсы. – 2012. – № 4. – С. 565-578.

6.* Розенцвет О.А., Гребенкина Т.М., Нестеров В.Н., Богданова Е.С.

Специфичность распределения биологически активных соединений в разных органах Plantago media // Аграрная Россия. – 2012. – № 9. – С. 19-23.

7.* Розенцвет О.А., Нестеров В.Н., Богданова Е.С., Гребенкина Т.М., Головко Т.К. Влияние кратковременных и продолжительных колебаний факторов среды на состав липидов Plantago media L. в условиях Южного Тимана // // Изв. Самар. НЦ РАН. – 2012.Т. – Т. 14, № 1 (3). – С. 791-799.

8. Гребенкина Т.М., Нестеров В.Н., Богданова Е.С., Саксонов С.В., Розенцвет О.А. Сезонная динамика морфометрических параметров и мембранных глицеролипидов Рlantago media (Рlantaginaceae) // Самарская лука: проблемы региональной и глобальной экологии. – 2012. – Т. 22, № 1. – С. 24-38.

9. Гребенкина Т.М., Розенцвет О.А., Нестеров В.Н., Богданова Е.С. Динамика морфометрических и физиолого-биохимических показателей Рlantago medi. // Материалы Всерос. науч. конф. с междунар. участием «Инновационные направления современной физиологии растений». – М., 2013. – С. 141-142.

10. Гребенкина Т.М., Розенцвет О.А. Физиолого-биохимические и морфометрические и свойства растений рода Plantago L. // Материалы XIII съезда Русского ботанического общества «Современная ботаника в России». – Тольятти, 2013. – С. 75-77.

11. Розенцвет О.А., Гребенкина Т.М. Физиолого-биохимические свойства Plantago media // Материалы VIII Всерос. конф. «Химия и технология растительных веществ». – Калининград, 2013. – С. 191.

12. Гребенкина Т.М., Нестеров В.Н., Богданова Е.С., Розенцвет О.А.

Структурно-функциональное состояние растений Plantago media в условиях городской среды // Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии.

– 2013. – Т.22, № 4. – С. 21-26.