На правах рукописи

ХАПЧАЕВ Шамиль Юсуфович

ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО

ТРАНСПОРТА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ

АКТИВНОСТЬ РИЦИНА

03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета (МГУ) имени М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: Кандидат биологических наук Мойсенович Михаил Михайлович МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва

Научный консультант: Доктор биологических наук Егорова Светлана Григорьевна МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Воробьёв Иван Андреевич Гематологический Научный Центр РАМН, Москва Кандидат биологических наук Домогатский Сергей Петрович ФГУ Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс Росмедтехнологий, Москва

Ведущая организация: ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Защита состоится «21» апреля 2009 г. в 15 час 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы Горы, д.1, корп.12, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, ауд. M-1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «» _ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Рицин (R60) – токсин из семян клещевины – состоит из каталитической (А- или RTA) и лектиновой (В- или RTB) субъединиц. RTB связывается с клеточными рецепторами и обеспечивает эндоцитоз токсина. Активность RTA по отношению к 28S рРНК эукариот влечёт за собой необратимую остановку синтеза белка и приводит к гибели клетки [Rutenber et al., 1991].

Обязательным этапом интернализации токсинов является попадание в ранний эндосомальный компартмент, дальнейшая транспортировка из которого зависит от того, с каким рецептором произошло связывание. Показано, что из ранних эндосом незначительная часть токсина попадает в эндоплазматический ретикулум (ЭР) [Rapak et al., 1997], но это количество настолько мало, что не выявляется методами электронной микроскопии [Sandvig and van Deurs, 1996].

Устойчивость гибридом, продуцирующих антитела против эпитопов RTA, экранированных в нативном токсине, показывает необходимость разделения субъединиц токсина для транслокации в цитозоль [Венедиктова и др, 2005]. Но до настоящего времени выявить свободную RTA в клетке не удавалось.

Мы предположили, что восстановление дисульфидной связи и транслокация в цитозоль происходит в ранних эндосомах. У рицина не обнаружен механизм создания пор, аналогичный таковому у дифтерийного токсина, но некоторые факты создают предпосылки возможности подобного транспорта из данного компартмента. Так, бльшая часть интернализованного токсина находится в связанной форме с рецепторами люминальной поверхности мембраны ранних эндосом [Moisenovich et al., 2004]. Наличие гидрофобных участков способно приводить к образованию агрегатов токсинов при их высокой концентрации. Агрегаты токсина, взаимодействуя одновременно с несколькими рецепторами, могут приводить к изменениям структуры и нарушению целостности эндосомальных мембран. Гидрофобные участки белков могут взаимодействовать с мембранами и погружаться в них. Отрезок длиной в 12 аминокислотных остатков на С-конце RTA [Lamb et al., 1985], экранированный в цельном токсине, взаимодействует с бислойными мембранами лучше других гидрофобных доменов токсина. Оптимальными условиями для такого встраивания являются пониженные значения pH. В ранних эндосомах значение pH находится в таком диапазоне и составляет pH 5,5. Такому встраиванию способствует также высокий уровень содержания ненасыщенных липидов и малое количество сфинголипидов и холестерина в мембранах эндосомального компартмента, приводящий к повышенной лабильности данных мембран. Особенности функционирования эндосом приводят к постоянному отпочковыванию и слиянию везикул, что повышает вероятность нарушения целостности мембран, дестабилизированных агрегатами токсина.

Т.о., выяснение концентрации рицина, взаимодействующего с люминальной поверхностью эндосомальных мембран, является принципиальным для определения возможности транслокации RTA из данного компартмента.

Особый интерес к рицину и родственным ему белкам (РИБ2) вызван возможностью создавать на их основе препараты для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний. При разработке новых препаратов и совершенствовании существующих лекарственных средств на основе РИБ2 чрезвычайно важно минимизировать возможные побочные действия. В частности, необходимо учитывать тот факт, что РИБ2 являются макромолекулами и, по-видимому, могут оказывать различные воздействия на клетку-мишень. В связи с этим детальное изучение свойств разных представителей этого семейства токсинов, напрямую не связанных с ингибированием синтеза белка, представляет большой научно-практический интерес.

Целью работы было изучение динамики образования свободной RTA и её накопления в органеллах клеток, предобработанных рицином.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать тест-систему для выявления свободной RTA внутри клетки. Используя эту тест-систему, изучить динамику накопления RTA в клетке. Определить ассоциацию А-цепи с клеточными органеллами.

2. Определить концентрацию рицина в эндосомальном компартменте.

3. Сопоставить динамику накопления рицина в клетке с этапами её интоксикации.

4. Изучить эффекты рицина, непосредственно не связанные с остановкой синтеза белка.

Научная новизна работы. На основе полученных моноклональных антител создана уникальная тест-система для определения свободной RTA внутри клетки. Установлено, что время, через которое в клетке выявляется свободная RTA, согласуется со временем остановки синтеза белка в предобработанных цельным токсином клетках и составляет 4 часа. Показано влияние А-цепи на митогенную активность и запуск апоптоза.

Практическая значимость. Исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой и, особенно, механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов; существенно снизить или полностью исключить побочные эффекты, возникающие при их применении; значительно расширить область применения токсинов в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий. Разработанный метод инкапсуляции РИБ2 в полилактидную матрицу может быть использован для создания лекарственных препаратов пролонгированного цитотоксического действия.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международных конференциях: «Конференция биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова» (Россия, 2006), «Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology Annual Conference» (USA, 2007), «76th Congress of the European Atherosclerosis Society»

(Finland, 2007), «Объединенный иммунологический форум» (Россия, 2008), на межлабораторных семинарах НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО), на межлабораторных семинарах кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ, на межлабораторных семинарах в Биоцентре Университета им. Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия). Апробация диссертации проведена на заседании кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова 24 сентября 2008 г. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 137 страницах, иллюстрирована 38 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 245 источников.

Выявление свободной RTA внутри клеток Клетки крысиной глиомы С6, мышиных фибробластов 3T3 и трансфецированной карциномы человека A431-Rab4-GFP выращивали на покровных стеклах в 2 мл полной среды DMEM + 10% коровьей эмбриональной сыворотки в присутствии токсинов в различных концентрациях при 37°C в течение 24 часов; отмывали от компонентов среды и фиксировали 4,5% ПФА в течение 30 мин. Затем инкубировали с 0,1% Triton X-100 в течение 10 мин и отмывали 5 раз. Обрабатывали растворами антител в течение часа. Полученные препараты анализировали на микроскопе Zeiss Axiovert 200M LSM 510 Meta («Zeiss», Германия).

Определение концентрации R60 и RTA в лизатах клеток, предобработанных R60.

Клетки линий С6 и 3T3 выращивали на чашках Петри 3 суток, после чего добавляли 1 мкг/мл R60 и инкубировали при 37°С и 6% CO2 различные временные интервалы. Затем клетки отмывали от несвязавшегося токсина холодным раствором лактозы и механически снимали с пластика. Полученную взвесь центрифугировали (7 мин 1500 об/мин).

Супернатанты отбирали в новые пробирки, а осадок ресуспендировали в 350 мкл лизирующего раствора (0,1М NaCl, 10мМ Na2HPO4, 1% Triton X-100 и 1мМ PMSF, pH 7,4), инкубировали при 4°С 20 мин и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин [Iversen et al., 2001].

Тест-систему 1RK2/2RK1bi использовали для определения концентрации R60, а 1RAK4/1RAK6bi – для определения концентрации RTA. В качестве контролей использовали лизаты клеток соответствующих линий, не обработанных токсинами.

При построении калибровочных кривых использовали данные для R60 и RTA, разведенных на среде культивирования соответствующих линий клеток. Статистическую обработку результатов проводили в программе «Microsoft Excel 1997».

Получение конъюгатов белков с флуорохромами Конъюгацию с флуоресцентными красителями проводили по методикам, рекомендованным производителями. Белки переводили в карбонатный буфер (pH 9,0), содержащий 1 М NaHCO3, 20 mM лактозу, и концентрировали до 2 мг/мл. Затем смешивали растворы белка и флуорохромы так, чтобы избыток красителя составлял 25-кратный молярный избыток. Инкубировали с перемешиванием 24 ч при комнатной температуре. С помощью гельфильтрации на колонке PD10 c сорбентом Sephadex G-25 очищали пробы от несвязавшегося красителя. Переводили белок в ФСБ (рН 7,4) и считали соотношение белок / краситель по известным формулам.

Соотношение количества FITC к количеству белка составило: для рицина – 4,2; для вискумина – 3,3. Количество групп Cy3, внесенных в одну молекулу белка, составляло:

для рицина – 2,1 группы, для вискумина – 2 группы, для антител серии RAK – 3 группы.

Анализ митогенной активности ингибиторов синтеза белка.

Клетки линии 3T3 выращивали на покровных стеклах в 40мм чашках Петри по описанной ранее методике [Rozengurt and Heppel, 1975]. К клеткам в лог-фазе добавляли рицин и циклогексимид (ЦГИ) в конечной концентрации 10-10М (для рицина) и 1мкг/мл (для ЦГИ). Через 3 часа после добавления токсинов в чашки Петри добавляли по 20 мкл стокового раствора колхицина (500 мкг/мл) (Fluka AG, Швейцария). Образцы фиксировали 4,5% параформальдегидом и анализировали на конфокальном микроскопе.

Оценка цитотоксических свойств РИБ2. SRB-тест.

Оценку действия цитотоксических агентов проводили путём связывания красителя сульфородамина В с белками по методике [Skehan et al., 1990] с модификациями [Worm et al., 2001].

Клетки в концентрации 10000 кл/мл в 100 мкл среды RPMI 1640, инкубировали в 96-луночных планшетах 24 часа. После этого добавляли по 100 мкл токсинов в концентрациях 10-18-10-10 М для РИБ2 и 0,001-10 мкг/мл для ЦГИ. Клетки с токсинами инкубировали 5 суток в CO2-инкубаторе в атмосфере, содержащей 6,1% СО2, при 37°С.

Из лунок удаляли 150 мкл среды культивирования. Планшет охлаждали и центрифугировали 7 мин при 300g и температуре 4°С. В лунки добавляли по 150 мкл 20% раствора ТХУ и инкубировали на льду 1 час. Клетки отмывали 5 раз 1% раствором ТХУ и высушивали. Добавляли по 70 мкл SRB в лунку и инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. После 4 отмывок 1% раствором ТХУ добавляли по 70 мкл 1М Триса для выхода SRB и 130 мкл дистиллированной воды. Измеряли оптическую плотность при 490 нм на спектрофотометре Multiskan ® PLUS – 314.

Инкапсуляция вискумина в полилактидную матрицу Инкапсуляцию вискумина в полилактидный носитель проводили на экспериментальной установке, подробно описанной ранее [Антонов и др., 2008] по алгоритму описанному в статье [Хапчаев и др, 2008]. После выхода токсина из матрицы его свойства анализировали с использованием стандартного МТТ-теста [Agapov et al., 1999].

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия Изображения были получены на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе (Axiovert 200M 510 Meta, Zeiss, Германия). Серии оптических срезов получали либо с одного из каналов, либо синхронно с двух. Установку размеров пинхола (pinhole) для получения изображений с высоким разрешением проводили согласно рекомендациям производителей системы. Для получения изображений использовали объективы Plan-Neofluar 40x/1,3 Oil Dic, Plan-Apochromat 63x/1,4 Oil Dic и Plan-Apochromat 100x/1,4 Oil. Настройки лазеров и анализирующих фильтров, рекомендованные производителем, подбирались индивидуального для каждого красителя. Диаметр пинхола – 1 диск Эйри (Airy unit), дающий оптимальное соотношение сигнала к шуму. Анализ проводили, используя программное обеспечение Zeiss LSM 510Meta Software release 3.2, ImageJ 1.39q, AutoQuant 9.3, Imaris 5.1 и Adobe Photoshop CS2.

Тест-система для выявления свободной RTA в клетке.

Для детекции свободной A-субъединицы использовали тест-системы моноклональных антител (монАт) серии RAK, дискриминирующей RTA от цельного токсина [Венедиктова и др., 2005]. Вероятнее всего, эпитопы, распознаваемые данными антителами, находятся на поверхности области RTA, экранированной В-субъединицей в составе цельного токсина.

Для разработки тест-системы, способной выявить свободную RTA в клетке, использовали методы прямой или непрямой иммунофлуоресценции. Показано, что конъюгаты монАт-флуорохром сохраняют способность выявлять RTA (Рисунок 1).

ОП Рисунок 1. Сохранение 1RAK6-Cy3 способности выявлять RTA.

Конъюгация с Cy3 не изменила свойств монАт 1RAK6. После конъюгации антитела распознают свободную RTA также как и немодифицированные монАт.

Для выявления свободной RTA в клетках использовали метод непрямой иммунофлуоресценции. При использовании прямой иммунофлуоресценции соотношение сигнал/шум оказалось очень низким. Кроме того, было обнаружено неспецифическое взаимодействие конъюгатов с митохондриями. Были выявлены отдельные скопления, содержащие свободную RTA (См. Рисунок 2). Детектируемые объекты распределены по всей цитоплазме и имеют линейные размеры не менее 0,5 мкм, что свидетельствует о том, что это агрегаты из нескольких молекул, либо единичные молекулы RTA.

Рисунок 2. Детекция RTA внутри клетки.

Распределение 1RAK6-AMI-Alexa 546 в клетках глиомы С6. A – изображение клетки в проходящем свете; Б – флу оресцентный сигнал от конъюгатов 1RAK6-AMI-Alexa 546, изображение полу чено путем совмещения всех оптических слоев («allmax»); В – наложение А и Б. Линейка – 10 мкм.

количество детектируемых объектов Рисунок 3. Накопление свободной RTA в клетках глиомы С Увеличение количества детектируемых объектов во времени. Каждая временная точка – у среднённые значения от подсчета 50 клеток. Динамика накопления RTA на других клеточных линиях была аналогичной, и различалась только абсолютными значениями.

Изменение количества RTA в клетке, происходящее во времени, оценивали по количеству детектируемых флуоресцентных объектов. Для этого на изображении, полученном при регистрации флуоресценции от флуорохрома, выделяли объекты, размеры которых превосходили 20 пикселей. После этого подсчитывали количество подобных объектов на 1 клетку. Свободная RTA не детектируется в клетках через час после внесения рицина в среду культивирования. После 2 часов инкубации RTA выявлялась на клетках линий 3T3 и C6. Через 4 часа количество детектируемой свободной RTA возрастает и достигает максимальных значений через 16 часов (См. Рисунок 3).

Использование в ТИФА тест-системы 1RAK4/1RAK6-bi позволило выявить Асубъединицы рицина в клеточных лизатах после введения цельного токсина в среду инкубации. Расчёт показал, что на одну клетку приходится от 300 до 450 молекул RTA. Это значит, что детектируемые микроскопическими методами объекты представляют собой единичные молекулы или скопления из 2-3 молекул.

Объём, занимаемый рицином внутри клетки.

Для того, чтобы определить общий объём компартмента, в котором детектируется рицин, было получено 30 наборов оптических срезов с разрешением, при котором реальные размеры пикселя составляют 60 нм. Расстояние между двумя соседними оптическими слоями составило 100 нм. Реальное оптическое разрешение больше данных величин, но такое «избыточное» разрешение необходимо для корректной обработки изображений.

Необработанные данные имели реальное разрешение около 220 нм, однако апертура использованного объектива – 1,4 после математической обработки (деконволюции [Wallace et al., 2001]) позволяет получить виртуальное разрешение 140 нм. После уточнения размеров везикул с помощью деконволюции в программе AutoQuant 9.3. был проанализирован общий объём флуоресцирующих объектов. Для этого обработанные изображения анализировали с использованием программного обеспечения Imaris 5.1. Средний анализируемый объём составляет 540±120 мкм3 до обработки и 215±40 мкм3 после.

Ранее показано, что рицин равномерно распределён практически во всём объёме ранних эндосом, положительных по Rab4-ГТФазе [Moisenovich et al., 2004]. Т.о. объём компартмента, содержащего токсин составляет не более 215 мкм3.

количество молекул рицина на Рисунок 4. Накопление рицина в клетке.

среднее количество белка в клетке. В течение 4 часов количество рицина в клетке достигает 17000 молекул и остаётся на этом уровне длительное время (См. Рисунок 4).

Показано, что средняя концентрация токсина в везикулярном компартменте, содержащем токсин, составляет не менее 1,31*10-7 М после деконволюции и не менее 5,25*10-8 М в случае необработанных данных. Столь высокая концентрация может приводить к образованию агрегатов из молекул токсина и значительному нарушению целостности мембран, что способно инициировать транслокацию A-цепи в цитозоль.

клетке рицина. Столь малые количества и распределение А-цепи по клетке (отдельные молекулы или кластеры, содержащие несколько молекул), а также отсутствие чувствительных методов детекции, вероятно, и являются причиной того, что раньше обнаружить свободную цепь внутри клетки не удавалось.

свидетельствовать о возможности транслокации RTA из этих компартментов. Ранее показано, что большая часть рицина накапливается в ранне-эндосомальном компартменте [Moisenovich et al., 2004].

Анализ взаимного распределения свободной A-субъединицы рицина и цельного токсина проводили на клетках линий 3T3 и C6. Для этого клетки обрабатывали токсином, конъюгированным с флуоресцентным красителем FITC, после чего выявляли свободную RTA и определяли уровень совместного распределения (колокализации).

Рисунок 5. Отсутствие колокализации R60-FITC и RTA.

Совместное распределение R60-FITC (зелёные кластеры) и 1RAK6-AMIAlexa 546 (красные объекты) на клетках глиомы С6 через 4 часа инкубации с токсином. Перед фиксацией клетки отмыли раствором лактозы для того, чтобы убрать несвязавшийся рицин. Правый рисунок – оптический срез клетки, левый – диаграмма колокализации.

После 4 часовой инкубации с конъюгатом R60-FITC видно, что сигналы от рицина и его А-цепи находятся в непосредственной близости, но в большинстве своем легко различимы. Представлено изображение одной из 50 обработанных клеток (См. Рисунок 5). В левой части рисунка представлена диаграмма, отражающая распределение пикселей обоих цветов. По оси абсцисс отложена интенсивность флуоресценции канала, детектирующего сигнал от RTA (Ch3-T1), а по оси ординат – интенсивность флуоресценции R60-FITC (Ch2-T2). Уровень сигнала, считаемый шумом (Threshold), выставлен на 50 для обоих каналов. Данная величина представлена на рисунке белой линией. Пересечение 2 линий Threshold обоих каналов делят диаграмму на 4 части, обозначенные номерами 1, 2, 3 и участок без обозначения. Колокализованными являются только пиксели, попавшие в зону 3 на данной диаграмме. В зонах 1 и 2 находятся пиксели только от одного из каналов, а в зоне без обозначения – пиксели без флуоресцентного сигнала; на правом рисунке – это чёрный фон.

Коэффициенты колокализации рассчитываются как соотношение колокализованных пикселей к общему количеству детектируемых в данном канале пикселей и могут быть числами от 0 (нет колокализации) до 1. Расчёт проводят для каждого канала по формулам:

Пиксели, с интенсивностью менее уровня Threshold, в подсчёте не участвуют. Интенсивность пикселей роли не играет. Средние значения коэффициентов колокализации для двух каналов равны 0,075±0,009 и 0,329±0,059. Это значит, что 7,5% RTA расположено в тех же компартментах, где и цельный рицин, т.е. большая часть новообразованной RTA практически сразу транслоцируется из органелл, где накапливается рицин.