На правах рукописи

ХАХАЛИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ

В ГЕНАХ gyrA и gyrB, СВЯЗАННЫХ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ФТОРХИНОЛОНАМ

03.02.03 – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2014 2

Работа выполнена в Государственном казенном учреждении здравоохранения «Московский городской научно-практический Центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы» (ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ) Научные руководители:

кандидат медицинских наук Носова Елена Юрьевна доктор биологических наук Макарова Марина Витальевна

Официальные оппоненты:

Леви Диана Тимофеевна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный эксперт Управления экспертизы противобактериальных медицинских иммунобиологических препаратов.

Черноусова Лариса Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научноисследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук, заведующая отделом микробиологии.

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «_»2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул.

Адмирала Макарова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, http://www.gabrich.ru Автореферат разослан «_»2014 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Современная эпидемическая обстановка по туберкулёзу характеризуется увеличением количества больных, у которых выявляются штаммы Mycobacterium tuberculosis (МБТ) с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) как среди пациентов с хроническим течением процесса, так и у впервые выявленных лиц (Migliori G. et. al., 2009).

Фторхинолоны являются одними из основных препаратов в составе резервного ряда противотуберкулезных препаратов, используемых для химиотерапии больных туберкулёзом с множественной лекарственной устойчивостью (Chan E. et al., 2004;

Chiang C. et al., 2006; Yew W. et al., 2000). Однако их широкое использование для лечения различных неспецифических заболеваний привело к быстрому развитию к ним лекарственной устойчивости (ЛУ) M. tuberculosis (Wang J. et al., 2007). В связи с этим необходимо быстрое выявление возбудителя и определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) к этой группе препаратов.

Микробиологическое определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам с использованием плотной среды Левенштейна-Йенсена (Л-Й) длительное. Использование жидких сред в автоматизированных системах типа Вactec 960 позволяет сократить время исследования. Однако в настоящее время сертифицированных культуральных тестов для определения лекарственной чувствительности M.

tuberculosis к фторхинолонам в Вactec 960 нет, есть только рекомендованные критические концентрации (КК) к данным препаратам (Исаева Ю.Д. и др., 2012; Grace Lin S-Y. et al., 2009; Rsch-Gerdes S. et al., 2006).

В этом отношении молекулярно-генетические методы позволяют в течение двух суток выявлять ДНК M. tuberculosis непосредственно в диагностическом материале и определять мутации в генах-мишенях, связанных с развитием устойчивости M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (ПТП).

Мишенью действия фторхинолонов в M. tuberculosis является ДНК-гираза, которая состоит из двух субъединиц А и В, кодируемых генами gyrA и gyrB соответственно (Ginsburg A. et. al 2003; Lau R. et al. 2011; Shi R. et al. 2006; Takiff Н. et al.

1994). Регион, определяющий устойчивость к фторхинолонам (РОУФ) генов gyrA (320 п.н.) и gyrB (375 п.н.), является консервативной областью, где возникают нуклеотидные замены (мутации), связанные с устойчивостью M. tuberculosis к фторхинолонам. Преобладающее большинство мутаций (45-85%) сосредоточено в РОУФ гена gyrA. Замены в гене gyrB встречаются как самостоятельно, так и в сочетании с геном gyrA (Groll A. et al., 2009). Доля таких штаммов среди всех M. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, составляет около 7%, однако роль некоторых из них в развитии устойчивости до конца не ясна (Wang J. et al., 2007). Кроме того, не все мутации в генах gyrA и gyrB связаны с перекрёстной устойчивостью M. tuberculosis ко всей группе фторхинолонов.

Таким образом, одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB может дать дополнительную информацию о лекарственной чувствительности к фторхинолонам исследуемого штамма, а также повысить корреляцию молекулярно-генетических данных с микробиологическими результатами лекарственной чувствительности M.

tuberculosis к данным препаратам.

Степень разработанности темы исследования Большой вклад в изучение молекулярного развития ЛУ МБТ к фторхинолонам внесли зарубежные ученые. В работах Takiff H.E, Ginsburg A, Shi R. было показано, что устойчивость МБТ к фторхинолонам связана с появлением мутаций в генах gyrA и gyrB (Takiff H. et al., 1994; Ginsburg A. et al., 2003; Shi R. et al., 2006). В настоящее время охарактеризовано их значительное количество. В 85% штаммов, устойчивых к фторхинолонам, мутации сосредоточены в РОУФ гена gyrA (320 п.н.), содержащих полиморфные кодоны 88, 90, 91, 94 и 95. Кодон 95 содержит естественнообусловленный полиморфизм Ser95Thr, не влияющий на ЛЧ МБТ к фторхинолонам (Yew W. et al., 2002). Мутации в 90, 91 и 94 кодонах связаны с ЛУ ко всем препаратам группы фторхинолонов (An D. et al., 2009). Также описаны мутации вне РОУФ gyrA, вызывающие ЛУ к фторхинолонам (Devasia R. et. al, 2012). В последние годы в литературе широко обсуждается вопрос о влиянии мутаций в РОУФ гена gyrB (375 п.н.) на чувствительность МБТ к препаратам фторхинолонового ряда (Cui Z. et. al, 2011;

Pantel A. et. al., 2011). Замены в гене gyrB могут встречаться как самостоятельно, так и в сочетании с мутациями в гене gyrA и составляют около 7% среди всех устойчивых МБТ к фторхинолонам (Wang J. et al., 2007; Groll A. et al., 2009).

В России среди ученых, которые занимаются изучением этой проблемы, в области диагностики и эпидемиологии лекарственно-устойчивых форм возбудителя туберкулеза известны имена: Черноусова Л.Н., Грядунов Д.А., Антонова О.В., Мокроусов И.В. и другие. Однако работы данных авторов в основном посвящены выявлению мутаций в гене gyrA. В то же время остается мало изученным вопрос о роли мутаций в гене gyrB МБТ или в сочетании с заменами в gyrA в развитии устойчивости ко всем фторхинолонам или к отдельным из них, а также их связь с уровнем устойчивости.

Цель исследования Выявить мутации в генах gyrA и gyrB и определить их спектр с помощью биологических микрочипов и модифицированного метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для быстрого и точного определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам у больных туберкулезом легких.

Задачи исследования:

1. Разработать модификацию метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») и оценить эффективность его применения для выявления мутаций в гене gyrB ДНК M. tuberculosis из диагностического материала (мокроты).

2. Провести сравнительный анализ результатов молекулярно-генетического определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам в гене gyrA с помощью коммерческих тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDRsl» в диагностическом материале (мокроте).

3. Провести анализ мутаций в генах gyrA и gyrB M. tuberculosis с помощью «ТББИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах, выделенных из диагностического материала больных туберкулёзом легких.

4. Определить связь мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis с уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину с использованием модифицированных жидких сред Middlebrook 7Н9 в автоматизированной системе Вactec 960.

5. Изучить спектр мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у впервые выявленных больных туберкулезом легких и с хроническим течением процесса.

Научная новизна Впервые с помощью метода «M-SSCP», разработанного в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, определен вклад мутаций в гене gyrB в развитие лекарственной устойчивости M. tuberculosis к фторхинолонам (Патент на изобретение РФ № от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrВ»).

Впервые разработанный молекулярно-генетический метод «M-SSCP» в сочетании с коммерческой тест-системой «ТБ-БИОЧИП-2» позволил расширить анализируемый спектр мутаций в генах, ответственных за лекарственную устойчивость M. tuberculosis к фторхинолонам.

Установлена связь между типом мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis и уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину.

На большом количестве биологического материала показано процентное распределение мутаций в двух генах M. tuberculosis, выделенных у впервые выявленных больных и с хроническим течением процесса, что имеет большое эпидемиологическое значение.

Теоретическая и практическая значимость работы Получены новые данные, демонстрирующие, что одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB позволяет расширить анализируемый спектр мутаций и дать более полную информацию о лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам исследуемого штамма.

Установлено, что коммерческая тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» позволяет с высокой чувствительностью одновременно выявлять ДНК M. tuberculosis и определять как часто, так и редко встречающиеся мутации в гене gyrA. Применение ее для исследования диагностического материала позволит сократить время получения результата и тем самым своевременно скорректировать режим химиотерапии. Разработанный метод «M-SSCP» можно применять как скрининг-тест для быстрого выявления мутаций в гене gyrB M. tuberculosis.

Разработанные методические рекомендации «Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов», утвержденные Департаментом Здравоохранения города Москвы от 29.09.2008 года, применяются в клинической практике противотуберкулезных учреждений.

Полученные данные анализа мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью метода «M-SSCP» и секвенирования были использованы в разработке тест-системы «ТБТЕСТ», основанной на технологии гидрогелевых биочипов в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Работа поддержана государственным контрактом с Министерством образования и науки РФ № 16.522.11.2003 и программой фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»). В настоящее время данная тест-система проходит клинические испытания.

Методология и методы исследования Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с лекарственной устойчивостью M. tuberculosis к препаратам резервного ряда (фторхинолонам). Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлся респираторный материал (мокрота) и культуры M. tuberculosis, полученные от больных туберкулезом легких.

Исследование проводилось в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования Исследовано 390 проб ДНК МБТ, выделенных из 316 культур и 74 образцов мокроты, полученных от 154 больных с впервые выявленным туберкулезом легких и 162 больных с хроническим течением процесса. Все больные находились на лечении в филиалах и клиниках ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ. Специфичность метода «M-SSCP» оценивали, используя музейные штаммы нетуберкулезных микобактерий (M.avium АТСС35712, M. intracellulare АТСС35761, M. scrofulaceum АТСС35787), грамотрицательных (E. coli ATCC25922, P. aeruginosa ATCC27853) и грамположительных (S.aureus ATCC25923) микроорганизмов, а также культуры, выделенные из диагностического материала больных (K. pneumoniae, S. pneumoniae, S.

intermedius, S. agalactiae).

В качестве контроля использовали лабораторный штамм M. tuberculosis Н37Rv (ATCC 25618), чувствительный ко всем противотуберкулезным препаратам.

Микробиологические методы Определение ЛЧ МБТ к изониазиду и рифампицину в автоматизированной системе типа Bactec 960 с применением жидкой среды Middlebrook 7H9 (M7H9) проводили согласно методическому руководству Becton Dickinson (2002). – Режим доступа:

http://www.bd. com/ds/technicalCenter/clsi/clsi-960pza.pdf. Определение ЛЧ МБТ к OFX методом абсолютных концентраций на плотной среде Л-Й проводили согласно приказу №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской Федерации». Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) к левофлоксацину и моксифлоксацину в автоматизированной системе типа Bactec 960 с применением жидкой среды M7H9 проводили согласно рекомендациям S. Rusch-Gerdes и соавт. (2006).

Молекулярно-генетические методы Для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам в гене gyrA использовали тестсистемы «ТБ-БИОЧИП-2» и GenoType MTBDRsl.

Тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» («БИОЧИП – ИМБ», Россия). Выделение и экстракцию ДНК МБТ из мокроты и культур, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), электрофорез и гибридизацию на биологических микрочипах проводили согласно прилагаемому руководству «Руководство по применению набора реагентов для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и определения их лекарственной чувствительности к фторхинолонам на биологических микрочипах «ТББИОЧИП-2» (Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФРС 2010/08555, 03.10.2010).

Тест-система «GenoType MTBDRsl» (GenoType, Hain Lifescience, Германия). ПЦР и гибридизацию на стрипах проводили согласно прилагаемому протоколу (Genotype MTBDRplus: a Further step toward rapid identification of drug-resistant M. tuberculosis (2008).

Для выявления мутаций в гене gyrB ДНК МБТ из мокроты и культур использовали метод «M-SSCP» (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов M. tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrВ»).

В качестве референс-метода применяли секвенирование РОУФ генов gyrA и gyrB с помощью автоматического секвенатора GS Junior («Roche», Германия).

Статистическая обработка результатов и программное обеспечение Сбор и обработка информации о пациенте, учет данных микробиологических и молекулярно-генетических исследований осуществлялись с помощью лабораторной информационной системы «Алиса» (ЗАО «Фирма Гален»). Подбор олигонуклеотидных праймеров проводили с помощью компьютерной программы Oligo v.6.31. Специфичность выбранных праймеров оценивали с помощью базы данных BLAST WWW-сервиса в NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Чувствительность (способность обнаружить истинную устойчивость), специфичность (способность обнаружить истинную чувствительность) и достоверность их различия оценивали с помощью программы Epi-Info 3.3. При расчете характеристик методов и доли совпадений