МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени М.В.ЛОМОНОСОВА
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи
ДАРХАНОВА
Татьяна Андреевна
МИКРОМИЦЕТЫ БУРЯТИИ
И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Специальности: 03.02.12 - микология, 14.03.07 - химиотерапия и антибиотики
Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2010
Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и в секторе коллекции культур Государственного научного центра по антибиотикам доктор биологических наук Научные руководители Бибикова Маргарита Васильевна кандидат биологических наук Александровна Алина Витальевна доктор биологических наук
Официальные оппоненты Терехова Вера Александровна кандидат биологических наук Тренин Алексей Сергеевич
Ведущая организация Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН
Защита диссертации состоится 10 декабря 2010 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Биологическом факультете МГУ имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет (аудитория М-1).
Тел./факс: (495)939-39-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан 10 ноября 2010 года
Ученый секретарь диссертационного совета, М.А. Гусаковская кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Изучение биоразнообразия – одно из приоритетных направлений современной биологии. Сообщества почвообитающих грибов являются относительно мало изученным компонентом биоценозов (Hawksworth, Rossman, 1997; Gams 2007), всестороннее исследование которого имеет важное теоретическое и практическое значение (Zak, Visser, 1996;
Hawksworth, 2004). В настоящее время грибы рассматриваются как наиболее перспективные продуценты соединений с разнообразной биологической активностью (Brdy, 2005).
Проблемой медикаментозного лечения инфекционных заболеваний является постоянный рост устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым в медицинской практике антибиотикам (Brdy, 2005). В связи с этим ведется интенсивный поиск и создание новых препаратов, активных, прежде всего, в отношении клинических резистентных штаммов. В настоящее время проводятся исследования возможности создания препаратов с новыми механизмами действия, оказывающие влияние на системы кворум-сенсинг (QS) и вирулентность патогенных микроорганизмов (Hentzer et al., 2003). Развитие биотехнологии, основанной на использовании потенциала микроорганизмов в получении лекарственных препаратов, является стратегическим направлением современной мировой фармакологии (Newman, 2003).
При проведении поисковых исследований особое внимание уделяют микроорганизмам, выделенным из экстремальных местообитаний и из экологически чистых районов, мало исследованных к настоящему времени (Brdy, 2005; Пивкин, 2010). Республика Бурятия является регионом, почвенная микобиота которого на сегодняшний день крайне слабо изучена.
Цель и задачи исследования. Цель работы – изучение разнообразия почвообитающих микроскопических грибов Республики Бурятия и оценка их потенциала как продуцентов биологически активных веществ для фармакологии.
Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1) изучение видового состава и создание коллекции сапротрофных и нематофаговых микромицетов, выделяемых из почвы и смежных с нею субстратов;
2) определение спектра антимикробной активности соединений, продуцируемых изучаемыми штаммами грибов;
3) поиск продуцентов ингибиторов системы кворум-сенсинг, регулирующей факторы вирулентности бактерий;
4) оценка физико-химических и биологических свойств отобранных соединений.
Научная новизна. Полученные данные о видовом разнообразии сапротрофных и нематофаговых микромицетов имеют фундаментальное значение для дальнейших исследований микобиоты Бурятии. В результате проведенных исследований выявлено 88 видов почвенных микромицетов, принадлежащих к 33 родам. Показано, что 38 штаммов из 57 исследуемых (66%) являются продуцентами биологически активных соединений. Обнаружены продуценты антибиотиков, активных в отношении клинически важных возбудителей инфекционных заболеваний. Был получен продуцент циклоспорина с необычным соотношением компонентного состава. Выявлены 12 штаммов, продуцирующих ингибиторы сигнальной системы кворум-сенсинг грамотрицательных бактерий, среди которых штаммы Aspergillus ustus № 21, Penicillium chermesinum № 26 проявили наибольшую активность. Показана их способность к подавлению факторов вирулентности клинического штамма Pseudomonas aeruginosa 71.
продуцирующие соединения с фибринолитической и плазминоген-активаторной активностями.
Научно-практическая значимость. Отобраны штаммы, образующие антибиотики, соединения с фибринолитической и плазминоген-активаторной активностями, ингибиторы факторов вирулентности патогенных грамотрицательных бактерий. Полученные культуры представляют интерес для биотехнологии как продуценты биологически активных соединений. Редкие и практически значимые штаммы переданы в коллекцию Государственного Научного Центра по антибиотикам (ГНЦ по антибиотикам, г. Москва), во Всесоюзную Коллекцию Микроорганизмов при Институте Биохимии и Физиологии Микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН, г.
Пущино) и в коллекцию Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск).
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на Всероссийской конференции «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии»
(Улан-Удэ, 2006), на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008, 2010). Материалы работы были представлены на втором международном съезде микологов (Москва, 2005), на международной научно-практической конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), на междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010), на научном молодежном семинаре «Smithy of Ideas, 2010» (Вильнюс, Литва, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений, содержит таблиц и рисунка. Список литературы включает источника, из них на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В данной главе приведены литературные сведения об экологии, физиологии почвенных сапротрофных и нематофаговых микромицетов, об изучении их на территории Бурятии. Представлены литературные данные по скринингу новых антибиотиков и фармакологически активных соединений.
Рассмотрены литературные источники, посвященные изучению системы кворумсенсинг микроорганизмов.
Регион исследования. Республика Бурятия расположена в центре евроазиатского континента, в южной части Восточной Сибири, занимает значительную часть водосборного бассейна оз. Байкал. Территория Бурятии характеризуется значительной приподнятостью над уровнем моря и преимущественно горным рельефом (Бурятия..., 1997). Климат резкоконтинентальный. Среднегодовая температура воздуха колеблется в пределах от 0 °С до минус 3 °С. Средняя температура летом составляет плюс 18.5 °С, зимойминус 22 °С. Среднегодовое количество осадков варьирует от 265 до 416 мм в год (Цыбжитов, Цыбжитов, 2000).
Изучение видового разнообразия грибов. Материал был собран в августесентябре 2005 и 2006 гг в лесной зоне на территории Заиграевского и Прибайкальского районов Бурятии. Территория, где проводился сбор почвенных образцов, характеризуется дерновыми лесными почвами (Цыбжитов, Цыбжитов, 2000). Было собрано 110 образцов почвы и связанных с ней субстратов. В году было собрано 70 образцов: подстилка – 10, мох – 10, трухлявая древесина (осина, ель) – 30, старая трава – 10, копромы – 10. В 2006 году – 40 образцов по 10 образцов четырех типов субстрата: верхний горизонт почвы, мох, древесина и подстилка.
Выделение нематофаговых гифомицетов проводили на голодный агар в присутствии нематод Caenorabditis elegans, Panagrellus redivivus (Мехтиева, 1979). Выделение сапротрофных микромицетов проводили методом серийных почвенных разведений С. Ваксмана в модификации Д.Г. Звягинцева (Методы…, 1991) на среду Чапека и агаризованное пивное сусло. Для количественной характеристики микобиоты использовали показатели численности колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 грамм сухого материала.
Представленность видов оценивали по показателям пространственной частоты встречаемости и относительного обилия видов, по которым рассчитывали индексы разнообразия Шеннона (Н') и доминирования Симпсона (1/D), выравненность (Е).
Идентификацию проводили на питательных средах, рекомендуемых для конкретных групп грибов, с использованием определителей (Raper, Fennel, 1965;
Thom, Raper, 1968; Ellis, 1971, 1976; Pitt, 1979; Arx 1981; Ramirez 1982; Hoog et al.
2000; Domsch et al. 2007, и др.). Наименования видов унифицированы по базе данных CABI Bioscience Databases (http://www.indexfungorum.org).
Исследование биологической активности штаммов грибов.
Объектами исследования служили 57 штаммов грибов, относящихся к видам из 23 родов.
Погруженное культивирование грибных культур проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл со средой А-9 (Бибикова и др., 1991) на круговой качалке с частотой вращения от 3,3 с-1 до 4,3 с-1 при 24 С, в течение 7, 14 суток.
Выделение комплексов биологически активных веществ осуществляли из культуральной жидкости и биомассы мицелия, их отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут. Биологически активные вещества извлекали из мицелиальной массы ацетоном и из культуральной жидкости - этилацетатом.
Концентрировали на вакуум-выпарной установке (ИР - 1).
Определение антимикробной активности осуществляли методом диффузии в агар (Нетрусов, 2005) в отношении тест-культур: Staphylococcus aureus АТСС 29213, S. aureus 43300 (метициллинрезистентный штамм, MRSA), Bacillus subtilis ATCC 6633, B. сereus var. mycoides 537, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Aspergillus niger 137a, Candida albicans CBS 8836 и клинические изоляты C. albicans 616, C. krusei 600 M, C. krusei 32/1.
Изучение антигрибного комплекса штамма Tolypocladium inflatum № 2.
Идентификацию антибиотика проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Sylufol 254 UV (Kavalier, Чехия), в системе растворителей бензол - ацетон (2:1). Контролем служил комплекс циклоспоринов А, В, С штамма T. inflatum 106 (Бибикова и др., 1989). Применяли проявление в УФ-свете при длине волны 254 нм, парах йода и перманганате калия. Проводили биопроявление активных фракций, путем наложения пластинок на агаризованную среду, содержащую тест-культуру A. niger 137a. Работа выполнена совместно со с.н.с. И.А. Спиридоновой (ГНЦ по антибиотикам).
Качественный и количественный анализ комплекса циклоспоринов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Исследование выполнено совместно со с.н.с. А.Н. Даниленко (Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН).
Ингибирование системы кворум-сенсинг и факторов вирулентности бактерий. Кворум-сенсинг система грамотрицательной бактерии Chromobacterium violaceum регулирует образование фиолетового пигмента виолацеина. Для постановки эксперимента использовали природный штамм C. violacium 7 и мутантный штамм C. violacium CV026, неспособный синтезировать N-ацилгомосеринлактоны (AHL, сигнальные молекулы, аутоиндукторы). Ингибирование системы кворум-сенсинг анализировали по отсутствию пигментации тест-культур вокруг лунок с экстрактами исследуемых штаммов.
В дальнейшем исследовали способность отобранных штаммов (Aspergillus ustus №21, Penicillium chermesinum №26) ингибировать факторы вирулентности клинического изолята Pseudomonas aeruginosa 71. Ингибирование оценивали по способности тестируемых культур подавлять стафилолитическую активность протеазы Las A и образование пигмента пиоцианина. Использовали ацетоновые экстракты из мицелия.
Ингибирование стафилолитической активности Pseudomonas aeruginosa 71.
Суспензию клеточных стенок S. aureus АТСС 29213 смешивали с супернатантом P. aeruginosa 71. К полученной смеси добавляли испытуемые экстракты, контролем служила смесь без экстрактов. Измеряли оптическую плотность с помощью автоматизированной системы Bioscreen («Labsystems», Финляндия) при длине волны 600 нм. Степень стафилолитической активности протеазы Las A оценивали по снижению оптической плотности в контроле, ингибирование – по стабильности оптической плотности относительно контроля.
Способность исследуемых штаммов ингибировать стафилолитическую активность P. aeruginosa 71 оценивали также на твердой среде Мюллер-Хинтон агар (МХА). В питательную среду вносили исследуемые экстракты и суспензию клеточных стенок S. аureus АТСС 29213, затем на агаризованную среду наносили штрихом тест-культуру P. aeruginosa 71. Стафилолитическую активность оценивали по диаметру просветления агара вокруг тест-культуры, а ее ингибирование - по отсутствию зоны просветления (Kessler et al., 1997; Schaber et al., 2004).
Ингибирование образования пигмента пиоцианина Pseudomonas aeruginosa 71. Тест-культуру инкубировали в присутствии исследуемых экстрактов в жидкой среде Кинг А при 37°С в течение 20-24 ч. В контроле тесткультуру растили без добавления экстрактов. После инкубации P. aeruginosa пигмент, содержащийся в супернатанте, последовательно экстрагировали в хлороформ и соляную кислоту. Интенсивность окраски экстрагента (оптическую плотность) измеряли при длине волны 540 нм с помощью анализатора Bioscreen.
Уровень образования пиоцианина в экстрактах оценивали по изменению оптической плотности к контролю, принятому за 100 % (Schaber et al., 2004).
Работа проведена совместно с к.б.н. Н.Э. Грамматиковой (ГНЦ по антибиотикам).
Метод оценки подавления образования биопленок Pseudomonas aeruginosa 71. Тест-культуру инкубировали в жидкой среде Мюллер-Хинтон в течение 24 часов при температуре 37°С, затем вносили исследуемые экстракты и инкубировали тест-культуру в присутствии экстрактов последующие 24 ч.
Образовавшиеся биопленки промывали буфером и окрашивали красителем кристаллвиолетом. Извлечение красителя из биопленок осуществляли смесью ацетон-этанол (1:4). Интенсивность окраски экстрагента (оптическую плотность) определяли при длине волны 540 нм с помощью спектрофотометра Graphicord UV-240 («Shimadzu», Япония). Плотность биопленок, полученных в присутствии исследуемых веществ, оценивали по отношению к контролю (интактной биопленке), принятому за 100% (Hu et al., 2006).
Изучение биологически активных компонентов штаммов Aspergillus ustus №21 и Penicillium chermesinum №26. Исследовали этилацетатный и ацетоновый экстракты отобранных штаммов. Разделение фракций проводили методом ТСХ на пластинах Silufol 254 UV, в системе петролейный эфир-ацетон (1:1). В среду Мюллер-Хинтон агар вносили аутоиндукторы и суспензию C. violaceum СV026.
Биопроявление компонентов фракций осуществляли наложением пластин на агаризованную среду. Присутствие активных фракций определяли по зоне отсутствия пигментации выросшей тест-культуры. Проводили определение УФ спектра активных фракций на спектрофотометре Graphicord UV-240.
Метод оценки гемолитической активности биологически активных соединений. Гемолитическую активность исследовали на 5% кровяном агаре.
Ацетоновые экстракты из мицелия вносили по 100 мкл в лунки. Инкубировали в термостате в течение 1 часа при 37 С. Активность оценивали по диаметру зон гемолиза вокруг лунки.
Метод оценки фибринолитической и активаторной активности соединений.
Нематофаговые гифомицеты растили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл жидкости, на качалке со скоростью вращения 200 об/мин. и температуре 23-27 °С в течение 14 суток. Способность лизировать фибрин и активировать плазминоген определяли в культуральной жидкости на искусственно созданной основе тромба (фибриновая пластина), с использованием тромбина и фибриногена бычьей крови (Astrup, Mullertz, 1952 цит. по: Шаркова, Максимов, 1999). Работа выполнена совместно со с.н.с. Т.С. Шарковой (МГУ имени М.В.Ломоносова).
1. Биоразнообразие сапротрофных и нематофаговых микромицетов При анализе 110 образцов почвы и связанных с ней субстратов, отобранных в лесной зоне республики Бурятия, обнаружено 88 видов микроскопических грибов, принадлежащих к 33 родам. К отделу Zygomycota относятся 6 видов:
Absidia coerulea Bainier, Mortierella alpina Peyronel, M. elongata Linnem, Mucor plumbeus Bonord., Mucor sp., Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. Представители отдела Ascomycota, формирующие плодовые тела, представлены двумя видами:
Chaetomium perlucidum Sergeeva и C. cochlioides Palliser. Основное разнообразие видов представлено анаморфными аскомицетами (80 видов): светлоокрашенные гифомицеты – Aspergillus cervinus Massee, A. fumigatus Fresen., A. nidulans (Eidam) G. Winter, A.ustus (Bainier) Thom,Church, A.versicolor (Vuill.) Tirab, Arthrobotrys cladodes Drechsler, A. oligospora Fresenius, A. oviformis Soprunov, A. superba Corda, Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., Epicoccum nigrum Link, Fusarium sambucinum Fuckel, Gamsylella gephyropaga (Drechsler) M. Scholler, Hagedorn, A.
Rubner, Geomyces pannorum (Link) Sigler, Carmich., Clonostachys rosea f. сatenulata (J.C. Gilman et E.V. Abbott) Schroers, Gonatobotryum parasiticum (Thaxt.) Jane Walker et Minter, Paecilomyces marquandii (Massee) Hughes, Penicillium aculeatum Raper, Fennell, P. albidum Sopp, P. aurantiogriseum Westling, P. aurantiogriseum var. viridicatum, P. brevicompactum Dierckx, P. canescens Sopp, P. chermesinum Biourge, P. citrinum Sopp, P. glabrum (Wehmer) Westling, P. funiculosum Thom, P. nalgiovense Laxa, P. janczewskii Zalessky, P. paxilli Bainier, P. pinetorum Chr., Backus, P. purpurogenum Stoll, P. raistrickii Sm., P. restrictum Gilman, Abbott, P. roseopurpureum Dierckx, P. roqueforti Thom, P. rubrum Grassberger, P. simplicissimum (Oudem.) Thom., P. spinulosum Thom, P. thomii Maire, P. variabile Mey, P.velutinum Beyma, P.waksmanii Zalessky, Tolypocladium geodes W. Gams;
T. inflatum W. Gams, T. microsporum (Jaap) Bissett, Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf., Nirenberg, T. atroviride Karst., T. hamatum (Bonord.) Bainier, T. harzianum Rifai, T. koningii Oudem., T. spirale Bissett, T. viride Pers;
темноокрашенные гифомицеты – Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Cladosporium cladosporioides (Fresen.) Vries, C. herbarum (Pers.) Link, C. macrocarpum Preuss, Gilmaniella humicola Barron, Humicola grisea Traaen, Myrothecium roridum Tode, Thysanophora penicillioides (Roum.) Kendr., Ulocladium atrum Preuss, U. chartarum (Preuss) Simmons; целомицеты – Phoma eupyrena Sacc., P. glomerata (Corda) Wollenw., Hochapfel, P. leveillei Boerema, Bollen, P. medicaginis Malbr., Roum, P. putaminum Holls, Truncatella angustata (Pers.) Hughes. Ряд культур по морфологическим признакам удалось идентифицировать только до уровня рода:
Acremonium sp. Arthrobotrys sp.1, Cladosporium sp., Coniothyrium sp., Dactylella sp., Dactylaria sp.1, Dactylaria sp.2, Oidiodendron sp., Phialophora sp., Phoma sp.1, Phoma sp.2, Ulocladium sp. Также были выделены неспорулирующие культуры морфологических типов.
Наиболее богат видами род Penicillium (25 видов из 88, 28%), хотя его относительная доля несколько ниже, чем характерно для почв умеренных широт, доля рода Aspergillus (5 видов, что составляет 6%), напротив, более значительна (Сизова, 1953; Мишустин, Пушкинская 1960; Мирчинк, 1988; Christensen et al., 2000; Klich, 2002). Среди видов рода Penicillium наиболее часто и обильно встречались P. janczewskii, P. aurantiogriseum, P. funiculosum, P. rubrum, P. aculeatum. Высоким видовым разнообразием отличались роды Phoma и Trichoderma, представленные каждый 7 видами. Остальные, обнаруженные нами рода включали четыре и менее видов (рис. 1).
убиквистами - космополитами, рода Penicillium сближает Рис.1. Соотношение количества видов в родах этот регион с более южными почвенных микромицетов, обнаруженных в образцах, областями. Выявление собранных на территории Республики Бурятия.
характерного для тундровых и таежных местообитаний рода Tolypocladium, представленного тремя видами, и сравнительно низкое видовое богатство в целом, напротив, придает микобиоте северные черты (Bissett, 1983; Кирцидели, 1996). Это может объясняться климатическими условиями исследуемого региона, для которого характерны низкий уровень выпадения осадков и глубокое промерзание почвы. Интересной особенностью является обнаружение в лесной подстилке хозяйственно значимого вида Penicillium roquefortii, крайне редко встречаемого в европейской части России и микопаразитического гриба Gonatobotrys parasiticum.
Нематофаговые гифомицеты, требующие специальных методов выделения, обнаружены во всех исследованных видах субстрата с частотой встречаемости от 10 до 70 % и представлены 9 видами: Arthrobotrys cladodes, A. oligospora, A. oviformis, A. superba, Arthrobotrys sp.1, Dactylaria sp.1, Dactylaria sp.2, Dactylella sp., Gamsylella gephyropaga. Наибольшая частота встречаемости отмечена для штаммов A. oligospora (30-70%) и A. cladodes (30-60%).
«