«РУКОВОДСТВО К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ХОЛЕРЫ Для врачей-бактериологов (биологов) и преподавателей Иркутск, 2012 ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ...»

– посейте агаровую культуру V. cholerae eltor в 4-5 мл МПБ (для постановки пробы Грейга) и на скошенный МПА.

МПА pH 7,0-7,2 с полимиксином 50 ед/мл 2 чашки Холерные диагностические бактериофаги классический и эльтор (цельный, 10 -1, 10 -2, 10 -3 до ДРТ) Сыворотка агглютинирующая холерная О1 1:50 4 мл Сыворотка агглютинирующая холерная О1 1:100 0,5 мл Сыворотка агглютинирующая холерная РО 1:50 4 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Инаба 1:50 4 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Огава 1:50 4 мл Сыворотка агглютинирующая холерная О139 1 : 10 4 мл Водяная баня Термостат Микроскоп с фазово-контрастным устройством 4.1. Определение принадлежности культуры к виду Учет РА. Определение серогруппы и сероварианта холерного вибриона.

4.2. Дифференция биоваров V. cholerae cholerae и V.cholerae eltor (приложение 4.6.3.) Учет пробы с диагностическими холерными фагами классическим и эльтор.

Учет пробы с полимиксином В.

Учет реакции Фогес-Проскауэра.

Постановка и учет реакции гемагглютинации.

4.3. Изучение эпидемической значимости V. cholerae Приготовление 3-часовой бульонной культуры.

Постановка пробы с фагами CTX+ и CTX– (приложение 4.6.5.).

Постановка пробы Грейга (приложение 4.6.5.).

Водяная баня Термостат Холодильник 5.1. Изучение эпидемической значимости V. cholerae eltor комплексным методом (продолжение) Учет результатов пробы Грейга.

Учет результатов пробы с фагами CTX+, CTX– и определение эпидемической значимости культуры по таблице (табл. 3).

Посев культуры на МПБ для определения чувствительности к антибиотикам.

5.2. Определение эпидемической значимости V.cholerae в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретическим учетом результатов.

Постановка ПЦР для выявления в исследуемом материале фрагмента гена ctxA V. cholerae (приложение 4.6.5.).

Тест-система для выявления ДНК V. cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции («ГенХол») Буфер для нанесения ПЦР-продуктов в гель 7,5 мкл Пластиковые микропробирки типа «Eppendorf»

объемом 200 мкл Дозатор автоматический одноканальный с переменным 1 шт.

объемом 50-200 мкл Дозатор автоматический одноканальный с переменным объемом 0,5-10 мкл Штатив «рабочее место» для пробирок 200 мкл 1 шт.

Амплификатор ДНК с нагреваемой крышкой Весы лабораторные электронные Источник питания для электрофореза в агарозном геле Камера для горизонтального электрофореза УФ – трансиллюминатор 6.1. Определение эпидемической значимости и идентификация V. cholerae методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в Проведение идентификации и оценка эпидемической значимости по комплексу генов ctxA, tcpA, wbeT, hlyA, wbfR в ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени» (приложение 4.6.5.).

Набор реагентов для выявления ДНК V. cholerae и идентификации патогенных штаммов V. cholerae в 4 шт.

биологическом материале и объектах окружающей 3 шт.

среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией («АмплиСенс Vibrio cholerae -FL»), в т. ч.

- пробирка ПЦР-смесь-1-FRT V.cholerae «Скрин»

- пробирка ПЦР-смесь-1-FRT V. cholerae «Тип»

Дозатор автоматический одноканальный с переменным 1 шт.

объемом 0,5-10 мкл Штатив «рабочее место» для пробирок 200 мкл 1 шт.

Амплификатор «Rotor-Gene» 3000 или «Rotor-Gene» 6.2. Изучение чувствительности V. cholerae eltor к антибиотикам (приложение 4.6.5.) Определение чувствительности холерного вибриона к антибиотикам методом диффузии в агаре с использованием 18-20-часовой агаровой культуры.

Определение чувствительности холерного вибриона к ампициллину методом серийных разведений в жидкой питательной среде с использованием 18-часовой агаровой культуры.

Агар Мюллер-Хинтона или среда АГВ по 25 мл 1 чашка в чашках диаметром 100 мл Бульон Мартена или Хоттингера pH 7,2-7,4 50 мл Раствор тетрациклина в бульоне 256 мкг/мл 5 мл Пробирка бактериологическая стерильная 20 шт.

Термостат 7.1. Изучение чувствительности V. cholerae eltor к антибиотикам (продолжение) Учет результатов изучения чувствительности культур к антибиотикам по зонам задержки роста вокруг дисков.

Учет результатов изучения чувствительности культур к ампициллину методом серийных разведений в жидкой среде. Определение МПК антибиотика в отношении изучаемых культур.

Оценка результатов по таблице 4.

7.2. Дифференциация некоторых представителей семейств Vibriоnaceae, Aeromonadaceae и Enterobacteriaceae, сходных по фенотипическим Изучение морфологии колоний на МПА V. cholerae неО1/неО139, Aeromonas, Plesiomonas.

Изучение морфологии микробных клеток в мазках, окрашенных по Граму.

Приготовление препарата «раздавленная капля» из агаровой культуры.

Определение оксидазной активности.

Посев культуры на среды:

Хью-Лейфсона Гисса с маннитом, инозитом, сахарозой, маннозой, арабинозой Биргер-Крушинской с лизином, орнитином и аргинином 18-часовая культура V. cholerae неО1/неО139 на пластинке МПА 18-часовая культура Aeromonas на пластинке МПА 1 чашка 18-часовая культура Plesiomonas на пластинке МПА 1 чашка Среда Биргер-Крушинской с аргинином 3 пробирки Среда Биргер-Крушинской с лизином 3 пробирки Среда Биргер-Крушинской с орнитином 3 пробирки Среда Биргер-Крушинской без аминокислоты (контроль) Термостат Линейка или кронциркуль 8.1. Дифференциация некоторых представителей семейств Vibriоnaceae, Aeromonadaceae и Enterobacteriaceae, сходных по фенотипическим Определение типа утилизации глюкозы по результатам изменения среды Хью-Лейфсона.

Учет изменения сред Гисса с маннитом, инозитом, сахарозой, маннозой и арабинозой.

Оценка декарбоксилазной и дигидролазной активности в средах Биргер-Крушинской Сравнение полученных результатов с таблицей 1.

2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Бактериологический анализ проводится с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям.

Объектами исследования могут быть испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника, желчный пузырь), различные предметы, загрязненные выделениями больного, вода, пищевые продукты, обитатели водоемов и другие объекты окружающей среды.

Забор, доставка и порядок исследования материала проводятся в соответствии с действующими методическими указаниями МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры» (2007 г.) и МУК 4.2.2870-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» (2011 г.).

Алгоритм лабораторной диагностики V. cholerae (рис. 5) основан на поэтапном использовании жидкой накопительной среды (1% ПВ, 1% ПВ с теллуритом калия) с последующим высевом из нее на плотные щелочные агары (мясо-пептонный, Мартена, Хоттингера) и селективные дифференциально-диагностические среды (TCBS, СЭДХ, Монсура, Седук и др.). Все среды, консерванты, используемые для транспортировки материала в лабораторию, ингибиторы посторонней микрофлоры применяются только проверенными на ростовые качества. На щелочном агаре колонии холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные с ровными краями, прозрачные в проходящем свете, светло-голубые под стереоскопическим микроскопом в косопроходящем свете с голубым или зеленоватым оттенком.

Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные; на среде Монсура – матовые, серовато-белого цвета с черным центром (окраска центра наиболее выражена через 24-48 ч).

Посевы материала на всех этапах выращиваются при 37°С в 1% ПВ в течение 6-8 ч, 1% ПВ с теллуритом калия – 12-18 ч, на щелочном агаре – 14-16 ч, плотных селективных средах – 18-24 ч.

Бактериологическое исследование на холеру материала от больных, лиц, обследуемых на вибриононосительство, проб воды и других объектов отличается только на первом этапе.

На I этапе бактериологического анализа испражнений и рвотных масс больного, содержимого кишечника и желчного пузыря трупа лиц, умерших от холеры, исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл засевается пипеткой в 50-100 мл 1% ПВ (I-ая среда накопления) и петлей на пластинку щелочного агара и одну из селективных сред. Поскольку в данном материале предполагается наличие большого количества возбудителя, целесообразно на этом этапе применить ускоренные методы исследования (МФА, РИВ и ПЦР со специфическими праймерами).

При исследовании материала от больных, подозрительных на заболевание холерой, не допускается использование 1% пептонной воды с теллуритом калия.

Материал от подозрительных на вибриононосительство засевается в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл - при групповых, объединяя в один флакон по 0,5-1 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в случаях проведения массовых обследований на вибриононосительство.

Материал, доставленный в 5 мл 1% пептонной воды, полностью используется для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1% пептонной воды во флаконе и доставки его не позже 2 ч после забора пробы, флакон помещаются в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевается в 50 мл 1% пептонной воды и ставится в термостат для культивирования (на 6 ч.) В отдельных случаях при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибиотики, он засевается в 200-300 мл 1% пептонной воды (предпочтительно в широкодонные колбы) и на 2 чашки щелочного агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируются при 37°С в течение 24 ч, а спустя 8-10 ч пребывания в термостате делаются высевы с поверхностного слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте исследования не целесообразно.

Рис. 5 Алгоритм лабораторной диагностики V. cholerae На II этапе (через 6 – 8 ч от начала исследования) с поверхности I-ой среды накопления производится пересев на пластинку щелочного агара, на одну из селективных сред, и в 5-8 мл 1% ПВ (II-ая среда накопления). При отрицательных результатах ускоренных методов исследования нативного материала их повторяют, исследуя I-ую среду накопления.

На III этапе (через 12-16 ч от начала исследования) проводится высев с поверхности II-ой среды накопления на пластину щелочного агара и изучается характер роста на чашках, засеянных нативным материалом, с целью отбора подозрительных на вибрион колоний и выделения чистой культуры. При отборе колоний обращают внимание на типичные и на атипичные колонии.

Размеры колоний на щелочном агаре через 10-12 ч инкубации не превышают 1 мм, а к 18-24 ч достигают 2-3 мм в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько замедлены, поэтому посевы просматриваются через 18-24 ч.

Отобранные агглютинирующиеся и неагглютинирующиеся холерными сыворотками О1 или О139 колонии отсевают для дальнейшей идентификации на одну из полиуглеводных сред (лактозо-сахарозную, Клиглера, Ресселя и др.) и пробирку МПБ для накопления микробной массы и определения чувствительности к антибиотикам.

При положительной реакции агглютинации с холерной О1 сывороткой в разведении 1:50 в слайд – агглютинации в этом же разведении ставится реакция иммобилизации, готовятся мазки для окраски по Граму и обработки флуоресцирующими иммуноглобулинами.

При положительных результатах в этих тестах выдается предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона О1, а в случае положительной реакции с сывороткой О139 - холерного вибриона О139 серогруппы.

На IV этапе (через 18-24 ч от начала исследования) если ранее не обнаружены подозрительные колонии производится их отбор (см. III этап) и посев на плотные среды. С положительными на V. cholerae культурами ставится развернутая реакция агглютинации со всеми холерными сыворотками и холерными фагами.

V этап (через 24-36 ч от начала исследования). Просматриваются полиуглеводные среды и отбираются культуры с типичным для вибрионов характером роста и изменений среды. На двууглеводных средах наблюдается характерное изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа. На основании положительных результатов агглютинации с холерными сыворотками О1, Инаба и/ или Огава выдается предварительный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона О1 соответствующего серовара. Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой О139 при отрицательном результате с сыворотками О1 серогруппы, выдается ответ о выделении холерного вибриона О139 серогруппы.

VI этап (через 36-48 ч от начала исследования). Учёт результатов идентификации и выдача окончательного ответа о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара. Для холерного вибриона О1 (Инаба, Огава или Гикошима) указывают эпидемическую значимость ориентировочно по тестам гемолитической активности, чувствительности к фагам CTX+ и CTX– и окончательно - по результатам ПЦР на присутствие в геноме выделенной культуры генов ctxA и tcpA. Эпидемическая значимость холерного вибриона О139 серогруппы определяется по тем же тестам (за исключением чувствительности к фагам CTX+ и CTX–). К окончанию этого этапа исследования должна быть определена антибиотикограмма выделенной культуры (приложение 4.6.6.). При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками (О1 и О139), выдается ответ об обнаружении холерного вибриона не О1/не О139 серогруппы.

При наличии агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность указанных вибрионов к другим серогруппам (О2-О83).

При исследовании воды (питьевой, поверхностных водоемов и др.) необходимо учитывать время доставки проб и выбирать наиболее подходящий вариант исследования.

Если вода поступила в лабораторию утром, к исследуемой пробе добавляется основной раствор пептона до 1% концентрации, определяется рН и при необходимости подщелачивается 10% раствором едкого натрия до рН 8,4±0,1. Анализ пробы (1000 мл) проводится в двух объемах по 500 мл, время инкубации 8-10 ч. В конце рабочего дня производится высев на II-ую среду накопления - 1% ПВ или 1% ПВ с теллуритом калия (в концентрации 1:100000 или 1:200000) в объеме мл. Время инкубации в среде без теллурита калия 6 ч, с теллуритом калия - 18-20 ч. Ход анализа, начиная со II этапа, аналогичен исследованию материала от больного.

При поступлении анализа воды в лабораторию во второй половине дня в исследуемую воду (в двух объемах по 500 мл) вносится основной раствор пептона до 1% концентрации и теллурит калия. При необходимости в воду добавляется 10% раствор едкого натрия (до рН 8,4±0,1). Через 18-24 ч культивирования при 37°С производится пересев в 10 мл 1% ПВ (II-ая среда обогащения). Время выращивания - 6 ч.

Возможен и другой вариант исследования - после установления щелочной реакции и добавления основного раствора пептона (I-ая среда обогащения) пробы сохраняются при комнатной температуре (не выше 25°С) до утра. Утром 5 мл с поверхностного слоя засевается в 100 мл 1% ПВ (II-ая среда обогащения) и в последующем производится высев на щелочной агар.

При исследовании воды можно применять метод концентрирования пробы путем фильтрования ее через мембранные фильтры № 2 или № 3, смывы с которых засеваются в накопительную среду и на пластинки агара. Осадок на фильтре исследуется в МФА, РНГА и в ПЦР.

Сточные воды перед исследованием подвергают фильтрации через бумажный или марлевый фильтр.

Исследование пищевых продуктов принципиально не отличается от исследования другого материала и проводится по обычной классической схеме. Твердые пищевые продукты измельчаются, растираются в ступке с физиологическим раствором и засеваются в количестве 10 г в 100 мл накопительной среды и петлей на агаровые среды.

Масло перед посевом подвергают размягчению на водяной бане или в термостате.

Молоко и молочные продукты в количестве 5 мл (г) засеваются в 50-100 мл 1% ПВ и петлей на агаровые среды или к 500 мл молока добавляется основной раствор пептона до 1%-ной концентрации.

У гидробионтов (рыба) исследуется кишечник и жабры (у амфибий только кишечник).

9.1. Исследование испражнений больного Приготовление мазков для бактериоскопии и изучение подвижности в препарате «раздавленная капля»

из нативного материала.

Посев пипеткой 0,5-1,0 мл испражнений в 50-100 мл 1% ПВ (I-ая среда накопления).

Посев бактериологической петлей нативного материала на чашку МПА и чашку селективной среды.

Использование ускоренных методов исследования нативного материала:

МФА (приложение 4.6.2.) РИВ (приложение 4.6.2.) РНГА с использованием холерного иммуноглобулинового диагностикума (приложение 4.6.2.).

По результатам исследования ускоренными методами выдача предварительного ответа.

II этап (через 6 ч от начала исследования) Посев пипеткой или бактериологической петлей (диаметр 5 мм) с поверхности I-ой среды накопления в 5- мл 1% ПВ (II-ая среда накопления).

Высев стандартной петлей с поверхности I-ой среды накопления на пластинки МПА и селективной среды.

При отрицательном результате ускоренных методов исследования нативного материала повторная постановка их с I-ой средой накопления. Выдача предварительного ответа.

III этап (через 12 ч от начала исследования) Высев со II-ой среды накопления на пластинку МПА.

Просмотр в проходящем свете невооруженным глазом или под стереоскопическим микроскопом с косым освещением посевов нативного материала и отбор подозрительных на рост вибриона колоний.

При наличии подозрительных колоний (типичных и атипичных) постановка реакции слайд-агглютинации с холерной О1 сывороткой в разведении 1:50 При положительной реакции с видо- и вариантоспецифической холерными сыворотками выдача предварительного положительного ответа.

При отрицательной реакции с сывороткой О1 проверка подозрительных колоний в реакции слайдагглютинации с сывороткой О139 (приложение 4.6.2.).

Постановка реакции иммобилизации вибрионов (РИВ) (приложение 4.6.2.).

Посев подозрительных на рост вибриона колоний, агглютинирующихся и неагглютинирующихся холерными сыворотками О1 или О139 на одну из полиуглеводных сред (например, лактозо-сахарозную), косяк МПА и пробирку МПБ.

Проведение с колониями, агглютинирующимися на стекле холерными сыворотками, ускоренной идентификации (занятие 13). При наличии четких положительных результатов идентификации выдача предварительного ответа о выделении возбудителя холеры.

Каждому курсанту выдают для исследования испражнения, искусственно зараженные V. cholerae cholerae или V. chol- 1 пробирка erae eltor Холерные агглютинирующие сыворотки:

Люминесцирующая холерная сыворотка (в рабочем разведении) Эритроцитарный холерный антительный диагностикум 0,5 мл Пробирка бактериологическая стерильная 2 шт.

Термостат Микроскоп с фазово-контрастным устройством Микроскоп стереоскопический с косым освещением 10.1. Исследование испражнений больного - IV этап (через 24 ч от начала исследования) Отбор культуры на полиуглеводных средах с типичным для вибрионов характером роста.

Проверка культуры на принадлежность к роду Vibrio (окраска по Граму, подвижность, наличие оксидазной активности, характер роста на средах Хью – Лейфсона и с аминокислотами лизином, орнитином, аргинином.

Подтверждение принадлежности культуры к виду Vibrio choleraе, биоварам V. cholerae choleraе и V. cholerae eltor по полной схеме:

- постановка развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками О1, RO, Инаба, Огава;

- постановка пробы с холерными фагами классическим и эльтор (приложение 4.6.3.);

- определение ферментации сахарозы, маннозы, арабинозы (приложение 4.6.1.);

- определение чувствительности к полимиксину В (приложение 4.6.3.);

- постановка реакции гемагглютинации (приложение 4.6.3. );

- отсев культуры на косячок МПА и 0,3% ПЖА (для хранения);

- отсев культуры на среду Кларка для постановки реакции Фогес-Проскауэра (приложение 4.6.3.) Определение эпидзначимости культуры комплексным методом (приложение 4.6.5.):

- постановка пробы с фагами CTX+ и CTX -;

- отсев культуры для постановки пробы Грейга в МПБ.

Изучение чувствительности культуры к антибиотикам методом серийных разведений в жидкой питательной среде (приложение 4.6.6.).

Изучение культур, не агглютинирующихся на стекле холерными сыворотками, но оксидазоположительных:

- утилизацию глюкозы в среде Хью-Лейфсона (приложение 4.6.1.) ;

- декарбоксилирование аминокислот в среде Биргер – Крушинской(приложение 4.6.1.) ;

- постановка реакцию РИВ (приложение 4.6.2.);

При наличии в лаборатории сывороток О2 – О83 серогрупп и фагов ТЭПВ определение сероварианта и фаговара выделенной культуры в соответствующих пробах и реакциях.

Анализ пробы воды проводится в двух объемах по 450 мл. К 450 мл исследуемой воды добавление 50 мл основного раствора пептона (до 1% концентрации) и 11,1 мл или 5,6 мл 0,05% рабочего разведения теллурита калия (до концентрации 1:100000 и 1:200000 соответственно).

Определение pH. При необходимости подщелачивание 10% раствором едкого натрия до рН 8,4±0,1.

Инкубация при 37С в течение 14-18 ч.

Каждому курсанту выдают для исследования 900 мл воды, 2 флакона искусственно инфицированных V. cholerae не О1 по 450 мл Среда Биргер-Крушинской без аминокислоты (контроль) 1 пробирка Раствор тетрациклина в бульоне 256 мкг/мл 2,5 мл Фаги холерные диагностические классический и эльтор (в разведениях до ДРТ) Сыворотка агглютинирующая холерная О1 1:50 2 мл Сыворотка агглютинирующая холерная О1 1:100 0,5 мл Сыворотка агглютинирующая холерная РО 1:50 2 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Инаба 1:50 2 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Огава 1:50 2 мл Сыворотка агглютинирующая холерная О139 в рабочем разведении Пробирка бактериологическая стерильная 12 шт Индикаторные бумажки (для определения pH) 1 шт.

Термостат 11.1. Исследование испражнений больного Постановка пробы Грейга.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра.

Учет результатов окончательной идентификации выделенной культуры.

При подтверждении принадлежности культуры к роду Vibrio, виду choleraе выдача окончательного ответа: «холерный вибрион выделен».

При отрицательных тестах, детектирующих вид холерного вибриона, принадлежащего к О1, О139 серогруппам, выдача ответа: «холерный вибрион не выделен».

При выделении культуры, не агглютинирующейся холерными О1 и О139 сыворотками, но относящейся к роду Vibrio, принадлежащей к О2 – О83 сероварам, лизирующейся фагами ТЭПВ, выдайте ответ: «выделен вибрион не О1 не О139 серогруппы».

II этап (через 18 ч от начала исследования) Пересев с поверхности I-ой среды накопления в 10 мл 1% ПВ (II-ая среда накопления); инкубирование при 37°С в течение 6 ч.

Высев с поверхности I-ой среды накопления на пластинку МПА.

этап (через 24 ч от начала исследования) Высев с поверхности II-ой среды накопления на пластинку МПА.

Термостат Исследование посевов с I-ой и II-ой сред накопления:

Просмотр посевов, отбор подозрительных на рост вибриона типичных и атипичных колоний, проверка их в слайд-агглютинация с холерными сыворотками О1, Инаба, Огава и О139.

Отсев 2-3 колоний, агглютинирующихся и неагглютинирующихся холерными сыворотками, на полиуглеводную среду (например, лактозо-сахарозную), косячок МПА и МПБ. Инкубирование посевов при 37С.

12.2. Методы ускоренной диагностики холеры.

Исследование испражнений больного с типичной Применение флуоресцентно-серологических методов:

- Приготовление из нативного материала мазка, обработка его люминесцирующей холерной сывороткой и просмотр. Через 1,5-2 ч выдача предварительного ответа (приложение 4.6.2.).

- Посев нативного материала по 0,1 мл в 5-8 мл 1% ПВ и на 4 чашки МПА. Через 3, 4, 5, 6 ч инкубирования при 37С приготовление мазков с 1% ПВ и чашек (путем смыва физиологическим раствором) с обработкой люминесцирующей холерной сывороткой и их просмотр. Через 3–6 ч при нарастании количества специфически «окрашенных» вибрионов, определяемых в мазках, выдача ответа о наличии возбудителя холеры в исследуемом материале.

- Исследование нативного материала в РИВ под влиянием холерных сывороток О1 (разведение 1:100), Инаба и Огава (разведении 1:50). Через 15-20 мин выдать предварительный ответ (приложение 4.6.2.).

Исследование нативного материала в РА в 1% ПВ и в пробе с диагностическими холерными классическим и эльтор бактериофагами (приложение 4.6.2.):

- в разведенные в 1% ПВ в объеме 1 мл холерные сыворотки О1, Инаба, Огава (с 1:100 до титра) и контроль антигена (1 мл 1% ПВ) добавляются 2-3 капли исследуемого материала. Контроль сыворотки: 1 мл в разведении 1:100 (без исследуемого материала). Учет реакции агглютинации через 1 ч. При положительном результате виден агглютинативный рост с просветлением среды при отсутствии агглютинации в контрольной пробирке. При отрицательном результате - гомогенное помутнение среды (наблюдение в течение 3 часов).

- Постановка пробы с холерными фагами классическим и эльтор двуслойным методом. Учет фаголизиса через 1,5-2 ч инкубирования. При положительных результатах РА, фаголизиса и данных микроскопии выдается окончательный ответ.

Постановка микрометодом РНГА и РТНГА с холерным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом (приложение 4.6.2.). Исследуемый материал предварительно прогревается в течение 20 мин при 100С. Через 2 ч выдача предварительного ответа.

Применение мультиплексного ПЦР-анализа нативного материала от больного холерой (занятие 5).

Посев исследуемых испражнений в 5-8 мл 1% ПВ и на пластинку МПА для выделения культуры и ее изучения.

Каждому курсанту выдаются испражнения больного, искусственно инфицированные холерным вибрионом 1 пробирка O1 серогруппы Диагностикум эритроцитарный холерный антительный Люминесцирующая холерная сыворотка в рабочем разведении Сыворотка агглютинирующая холерная О1 1:50 0,5 мл Сыворотка агглютинирующая холерная О1 1:100 0,5 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Огава 1:50 0,5 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Инаба 1:50 0,5 мл Холерные диагностические бактериофаги классический и эльтор (в разведениях до ДРТ) по 0,5 мл Автоматический дозатор Термостат 13.1. Ускоренная идентификация культуры по Просмотр чашек с посевом испражнений больного на МПА (предыдущее занятие), отбор подозрительных на рост вибрионов колоний.

Микроскопия мазков, постановка слайд-агглютинации и РИВ с подозрительными колониями, используя агглютинирующие холерные О1 и О139 сыворотки.

При положительной слайд-агглютинации отсев колонии в 3 мл МПБ и после 3 ч инкубации в термостате подлежат изучению следующие признаки:

- определение типа расщепления глюкозы;

- определение декарбоксилазной и дигидролазной активности;

- агглютинабельность в пределах титра с холерными сыворотками О1, Инаба и Огава, O139, разведенными 1% ПВ в объеме 1 мл (занятие 12);

- чувствительность к холерным фагам классическому и эльтор;

- ферментация сахарозы, маннозы, арабинозы с использованием среды в объеме 0,5-1 мл.

Во все пробирки добавляется по 1 капле изучаемой культуры.

Учет результатов через 4-6 ч инкубирования посевов при 37С. При наличии четких положительных признаков вида V. cholerae выдача окончательного ответа о выделении возбудителя холеры.

Среда Биргер-Крушинской с аргинином 1 пробирка Среда Биргер-Крушинской с орнитином 1 пробирка Среда Биргер-Крушинской (контроль) 1 пробирка Фаги холерные диагностические классический и эльтор (в разведениях до ДРТ) Сыворотка агглютинирующая холерная РО 1:50 2,0 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Инаба 1:50 2,0 мл Сыворотка агглютинирующая холерная Огава 1:50 2,0 мл Термостат Учет результатов изучения выделенной культуры.

По результатам изучения культуры выдача на анализ окончательного ответа.

3. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ

Кровь для серологических реакций берется из вены в количестве 1-5 мл. Кровь можно забрать из пальца микропипеткой в объеме 0,4 мл и внести в стерильный флакон с 1,6 мл физиологического раствора (1:5) или несколько капель крови нанести на лист простерилизованной писчей бумаги, поместить в пробирку, а в лаборатории вырезать кружочки бумаги с каплями, залить 0,9 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия (разведение 1:10), экстрагировать 3-4 ч при комнатной температуре, инактивировать при 56С в течение 30 мин и подвергнуть исследованию.

Агглютинины у больных холерой появляются на 5- день заболевания и максимального титра обычно достигают к 14-15 дню от начала заболевания. Затем их титр постепенно снижается. Агглютинины в сыворотке крови больного холерой определяются в объемной реакции агглютинации. В качестве антигена используется живая культура в S-форме, выделенная в очаге холеры или диагностикум - клетки холерного вибриона, убитые кипячением или формалином. Положительной считается РА на 3-4 креста в разведении 1:40 и выше. Диагностическое значение имеет четырехкратный и более высокий подъем титров антител при исследовании парных сывороток.

Противохолерные антитела можно быстро выявить методом фазово-контрастной микроскопии, используя в качестве индикаторного штамма культуру холерного вибриона, выделенную в данном очаге, или музейный штамм того же биовара и серовара. Кроме того, можно поставить реакцию нейтрализации антигена (РНАг) с холерным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом и РНГА с антигенным холерным эритроцитарным диагностикумом.

Вибриоцидные антитела (ВА) в крови больных холерой в титрах 10-1-10-3 обнаруживаются с 1-3 дня болезни. Вибриоцидины достигают максимального значения (10-4 – 10-8) к 10-12 дню, а к 30 дню болезни их титр снижается. У переболевших, вибриононосителей и вакцинированных титр вибриоцидных антител колеблется от 10-1 до 10-8. Для выявления вибриоцидных антител предложен ряд методов, основанных на том, что при наличии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке в присутствии комплемента происходит подавление роста холерного вибриона.

Наиболее простым является метод Финкельштейна (Finkelstain, 1962). Для постановки реакции исследуемая сыворотка инактивируется в водяной бане при 56°С в течение 30 минут. В ряд пробирок разливается по 0,9 мл. комплемента, разведенного 1:20 (можно использовать сухой комплемент или свежеполученную сыворотку морской свинки). Затем готовится серия десятикратных разведений исследуемой сыворотки в комплементе до 10 –8 – 10 –10. Титрование сыворотки производится на ледяной бане.

Во все пробирки с раститрованной сывороткой добавляется по 0,1 мл. взвеси холерного вибриона, содержащей 10 тыс. м. кл. в 1,0 мл. и они помещаются на один час в термостат при 37°С, сделав предварительно высев из пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для определения фактической концентрации живых вибрионов в суспензии (контроль разведения). Затем их снова переносят в кювету со льдом и из каждой пробирки отдельной пипеткой высевают по 0,1 мл. культуры на пластинки щелочного агара (рН 7,6). Чашки помещаются на 18-24 часа в термостат при 37°С и после этого проводится подсчет количества выросших колоний. Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента ( 0,9 мл. комплемента и 0,1 мл. культуры холерного вибриона); б) контроль сыворотки (0,8 мл. 0,9 % раствора хлорида натрия, 0,1 мл. сыворотки и 0,1 мл. культуры); в) контроль культуры (0,9 мл. 0,9 % раствора хлорида натрия и 0,1 мл. культуры).

Вибриоцидным титром считается максимальное разведение сыворотки, которое вызывает подавление роста не менее чем 50 % клеток холерного вибриона по сравнению с контролем культуры, что выявляется подсчетом выросших колоний на агаровых пластинках из опытных и контрольных пробирок.

Пример вычисления: при посеве из опытных пробирок с разведением сыворотки 10 –1, 10 –2, 10 –3, 10 –4, 10 –5, 10 –6, 10 –7 и т. д. на чашках соответственно выросло 0,0,5,10,15,30,38 и т. д. колоний. При высеве из пробирки контроля комплемента после инкубации при температуре (37,0 ± 0,5С) выросло 36 колоний, 50 % от этого числа составляет 18. Из пятой пробирки выросло 15 колоний, т. е. меньше 50 % от количества колоний в контроле (18), из следующей пробирки – 30, т. е.

более 50 % этого же показателя. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет10 –5, следовательно, вибриоцидный титр в данном примере составляет 10 –5.

Результат реакции выражается в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком (например, 10 –5 т.е. 5). Диагностическим считается индекс 3 и выше при условии нарастания титра антител в парных сыворотках.

Существуют и другие методы (И.В.Домарадский, Е.П. Ерохин 1971, М.С. Наумшина и др. 1973) Определение вибриоцидных антител этими методами основано на ферментации углеводов. О наличии или отсутствии вибриоцидных антител судят по разложению сахарозы, регистрируемому с помощью индикатора. В практических лабораториях для определения вибриоцидных антител применяется также микрометод Бененсона и др. (1968) с использованием диагностикума холерного эритроцитарного О-иммуноглобулинового.

В сыворотках крови больных холерой, вибриононосителей и привитых холерной вакциной, содержащей субъединицу В холерного токсина можно выявлять антитела к энтеротоксину холерного вибриона. Титр антитоксинов нарастает медленно и достигает максимального значения к концу 2-ой недели заболевания.

Для определения токсиннейтрализующих антител в сыворотке больных, носителей и переболевших разработан ряд методов in vivo и in vitro. Наиболее трудоемкими являются методы с использованием животных.

В практической работе целесообразно ставить РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД) или с энтеротоксическим диагностикумом, изготовленным на новой основе для фиксации холерного энтеротоксина - на ганглиозидсодержащих липосомах – липосомальный холерный энтеротоксический диагностикум (ЛХЭД). Липосомальная диагностическая тест-система включает в себя помимо ЛХЭД ингридиенты для постановки реакции связывания коплемента (РСК). Диагностическим титром РНГА с ЭХЭД и РСК с ЛХЭД следует считать 1:160. Целесообразно исследовать парные сыворотки.

Для определения токсиннейтрализующих антител можно использовать реакцию преципитации в геле, встречный иммуноэлектрофорез и внутрикожную пробу Крейга на кроликах светлой масти.

15.1. Определение агглютининов в парных сыворотках крови больного в объемной РА Раститровать 1-ую и 2-ую инактивированные сыворотки двукратно в 1% ПВ в объеме 1 мл (с 1:10 до 1:640); приготовить пробирки с КС-контроль сыворотки в разведении 1:10 (1 мл), КА – контроль антигена 1% ПВ (1 мл).

В пробирки с раститрованными сыворотками и в КА вносится по 1 капле 3-часовой бульонной культуры холерного вибриона О1 или О139 серогруппы.

Пробирки проинкубировать при 37С в течение 1 ч после чего провести предварительный учет результатов, затем пробирки помещаются в холодильник (при 4±0,5С). На следующее утро проводится учет реакции.

15.2. Определение вибриоцидных антител в Исследование сыворотки крови больного.

Готовится суспензия агаровой культуры V. cholerae eltor, содержащая 104 м.кл./мл.

В восьми пробирках 10-кратно в объеме 0,9 мл (на льду, который помещается в любую емкость), раститровывается 2-ая инактивированная сыворотка в комплементе, разведенном 1:40. В девятую пробирку вносится 0,9 мл комплемента (контроль).

Во все пробирки, в том числе и контрольную, на холоду, добавляется по 0,1 мл суспензии холерного вибриона, содержащей 104 м. кл./мл. Смесь инкубируется при 37 С в течение 1 ч.

Штатив с пробирками через 1 ч инкубирования помещается на лед и из каждой пробирки содержимое отдельной стерильной пипеткой по 0,1 мл вносится на пластины щелочного агара.

Чашки помещаются на 18 – 24 ч в термостат ( 37 О С) после чего проводится подсчет количества выросших колоний.

Учет результатов. За титр ВА принимается максимальное разведение сыворотки, которое вызывает 50%-е подавление роста холерного вибриона по сравнению с контролем культуры.

15.3. Определение токсиннейтрализующих антител Занятие проводится в виде объяснения курсантам методики постановки пробы Крейга и демонстрации положительной и отрицательной реакции на кролике.

1-ая сыворотка, инактивированная при 56оС в течение 30 минут, в разведении 1:5 (кровь взята на 3 день 2,5 мл болезни) 2-ая сыворотка, инактивированная при 56оС в течение 30 минут, в разведении 1:5 (кровь взята на 10-ий день 3,0 мл болезни) 18-часовая агаровая культура V. cholerae eltor 1 пробирка Комплемент 1: Диагностикум холерный эритроцитарный О-иммуноглобу-линовый 0,6% ЭХЭД -эритроцитарный холерный энтеротоксический диагностикум ЛХЭД - энтеротоксический диагностикум на ганглиозидсодержащих липосомах Пробирка бактериологическая стерильная 0,5 мл 16.1. Определение агглютининов в парных сыворотках крови больного в объемной РА (продолжение) Учет результатов РА.

16.2. Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови больного Учет результатов:

- Исследования сыворотки крови больного методом Финкильштейна.

- По результатам реакции определение титра вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке.

Основной раствор пептона:

В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Если нужно, рН доводят до 8,0±0,1.

Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1 атм.

Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.

1% пептонная вода.

Готовится из основного раствора пептона путем разведения его в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,5±0,1 разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют 20 мин при давлении 0,7 атм.

Пептонная вода с теллуритом калия.

В 1% ПВ (рН 8,5±0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1% раствор теллурита калия (срок хранения 7 дней).

Срок хранения среды при 20-25°С 48 ч, 4°С – 10 дней.

1%-я пептонная вода, рН 8,5 ± 0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см.

среды обогащения) 2% раствор поваренной соли:

20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1000 мл дистиллированной воды; жидкость фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и автоклавируют 20 мин при 0,7 атм.

4.1.3. Плотные среды для выделения холерного вибриона Щелочной мясо-пептонный агар:

В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия, перемешивают и подщелачивают 20% раствором едкого натра до рН 7,6-7,8. Добавляют агар-агар и помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром в течение 30-40 мин, а затем при 1 атм. 20 мин. Если мясо-пептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.

После варки среду оставляют на 23 ч в автоклаве или помещают в термальную комнату при 43±2°С. Лучше время отстоя среды продлить до 18-20 ч. Отстоявшийся агар осторожно сифоном или через край медленно сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр.

Уточняют реакцию среды и при необходимости подкисляют (подщелачивать на этом этапе не рекомендуется). Агар разливают в посуду и стерилизуют при атм. 20 мин.

Элективная среда СЭДХ, сухая:

Среда обладает выраженным элективным свойством, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов.

Используется для выделения и дифференциации холерного вибриона (производства Ростовского противочумного НИИ) Состав, г/л Сухую среду в количестве, указанном на этикетке, размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды, ставят на 15-20 мин для набухания агара. Затем на небольшом огне доводят до кипения, кипятят 5 мин при постоянном помешивании до полного расплавления агара. Цвет готовой среды темно-синий.

Среду, не фильтруя и не стерилизуя, разливают в стерильные чашки Петри слоем 4,0 – 5,0 мм. Чашки со средой можно хранить в течение 5 суток в холодильнике при температуре 6 ± 2°С.

Учет результатов проводят через 20 – 24 часа инкубации в термостате при 37°С.

Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 1218 ч формируют на этих средах плоские, прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы, диаметром 1-2 мм; V. parahaemolyticus - мелкие голубоватые (цвета среды), с уплотненным центром; V.

alginolyticus - крупные желтые колонии, Pseudomonas, Aeromonas - голубые, Enterobacteriaceae - очень мелкие плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся.

Модифицированная агаровая среда TCBS изготавливается ГНЦПМ (отделением «питательных сред»), г. Оболенск.

Среда В.Ф. Седук и др. (модификация среды TCBS):

Все компоненты среды растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Смесь доводят до кипения, но не кипятят. Готовую среду без стерилизации разливают в чашки Петри, цвет среды зеленый. Характеристику среды см. 1.3.2.

Среда Монсура в модификации Т.Н. Донской, Л.Ф. Зыкина.

Среду стерилизуют текучим паром или при 110°С в течение 15 мин. Перед употреблением добавляют теллурит калия в концентрации 1:100000.

Готовая среда бесцветная, слегка мутная. Холерный вибрион вырастает на ней через 24 ч в виде сероватых слизистых колоний с темным центром. Через 48 ч центр колоний окрашивается в интенсивно черный цвет. По краю колоний - просветление среды.

4.1.4. Среды с углеводами для отбора колоний Лактозно-сахарозная среда:

Среду варят, фильтруют, разливают по 5-7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0, атм. 20 мин. После стерилизации среду скашивают, чтобы получить столбик и косяк.

Агаровую культуру сеют бактериологической петлей по скошенной поверхности затем в центр столбика.

Среда светлая, при кислотообразовании краснеет.

4.1.5. Среды для идентификации Среды Гисса:

К 100 мл 1% пептонной воды (рН 7,3±0,1) без селитры добавляют 0,5-1% необходимого углевода или спирта (l-арабиноза, d-манноза, d-сахароза, d-маннит, l-инозит, d-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6% раствора бромтимолового синего.

Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин; среду с l-арабинозной следует стерилизовать в течение 20 мин при 0,1-0,2 атм. Готовые среды с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют; с бромтимоловым синим - зеленого с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при щелочной синего.

Среды Гисса применяют при изучении ферментации углеводов и спиртов. Культуру выращивают в течение 18-20 ч на плотной или 3-4 ч на жидкой питательных средах и засевают в среды Гисса. Посевы инкубируют при 37°С и учет результатов через 6-18 ч.

Среда Хью-Лейфсона:

К воде добавляют пептон, хлористый натрий и агарагар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2-3 мин. Смесь подщелачивают 20%-ным раствором едкого натрия до рН 7,4±0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1%-ного водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4-5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый (рН 7,1±0,1). При кислой реакции среда желтеет.

Среда Хью-Лейфсона используется для определения типа расщепления глюкозы (окисления-ферментациитест).

Бульон Кларка:

Двузамещенный фосфат калия 5,0 г Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.

Среда Кодама:

В 1% пептонную воду добавляют 0,5% растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под давлением 0,5 атм. Для определения результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.

4.1.6. Среды для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот.

Среда пептонно-дрожжевая:

Дрожжевой экстракт 25,0 мл (сухой 3,0 г) Бромтимоловый синий 45,0 мл (0,045 г (соответствующая) Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4±0,1 затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоту не добавляют, эта порция служит контролем.

В остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во вторую - 1% орнитина, в трерью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в l-форме, если имеются d-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к.

микроорганизмы активны только в отношении l-форм.

После добавления аминокислот перед стерилизацией, в случае необходимости, реакцию среды исправляют 0,1 раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1-2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1-0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянистозеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной - синеет.

Мясопептонный бульон: мясная вода с 1% сухого пептона и 0,85% поваренной соли. Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают нужную реакцию среды, стерилизуют при 0,7 атм. 20 мин.

4.2.1. Для определения индолообразования Реактив Эрлиха:

Парадиметиламинобензальдегид 1,0 г Альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту, смешивают. Хранят в темном месте.

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают в термостате.

4.2.2. Для выявления образования сероводорода Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксусно-кислого свинца. Подсушивают на воздухе.

Полоски индикаторных бумажек на индол и сероводород помещают под пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования сероводорода в процессе выращивания бактерий полоска чернеет, при образовании индола – краснеет.

4.2.3. Для определения индофенолоксидазы:

Готовые коммерческие СИБ тест-полоски разных производителей.

4.3.1. Для сохранения дефибринированной крови С борной кислотой:

Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при 100°С по 20 мин в течение 3 дней, 100 мл дефибрилированной крови барана соединяют с 15 мл консерванта с борной кислотой.

4.4. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

КАЧЕСТВА ПЛОТНЫХ И ЖИДКИХ

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

cholerae не О1 Р-9741).

Используется 3-часовая агаровая культура тестштамма 3-го пассажа. Агар разливается за 30-40 мин до посева (без подсушивания). Из выросшей культуры готовится взвесь вибрионов в 0,9% растворе хлористого натрия (рН 7,2) в концентрации 1 млрд. м.к. в 1 мл (по стандарту мутности 5 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича), которая последовательно разводится, перенося по 0,5 мл в 4,5 мл 0,9% хлористого натрия до концентрации 1000 м.к. в 1 мл (разведение 103).

Для контроля щелочного агара 100 м.к. тест-культуры (0,1 мл из разведения 103) засевается на три свежерозлитых (по 25-30 мл) и тщательно подсушенных чашек проверяемой и контрольной сред. Посевной материал распределяется покачиванием. Посевы инкубируются при 37±1°С в течение 12 ч.

Проверяемые плотные питательные среды считаются пригодными для выделения возбудителя холеры, если после 12 ч на чашках вырастает не менее 30% от расчетной посевной дозы (100 м.к.) типичных по морфологии колоний диаметром не менее 1 мм и не менее 70% от количества выросших колоний на контрольной среде.

Основной раствор пептона производственного выпуска, подлежащий проверке и используемый в качестве контрольной среды, разводится до 1% концентрации, устанавливается рН 8,3±0,1 и разливают в 6 колб или флаконов по 100 мл (3 – для опытной и 3 – для контрольной). Во все объемы испытуемой и контрольной среды вносится по 100 м.к. тест-культуры (0,1 мл из разведения 103). Для контроля посевной дозы проводится высев посевной культуры на 3 агаровые пластинки. На одной чашке должно вырастать (в среднем) не менее 30 и не более 70 колоний.

Посевы инкубируются в течение 6 ч при 37±0,5°С с последующим высевом из поверхностного слоя каждого объекта бактериологической петлей № 5 (5мм) на агаровые пластинки контрольной среды. После выращивания посевов при 37±0,5°С в течение 12-14 ч учитываются результаты:

Проверяемый основной раствор пептона считается пригодным для выделения возбудителя холеры, если на всех агаровых пластинках вырастают не менее 10 типичных по морфологии колоний диаметром не менее 1 мм.

4.5. ПРОВЕРКА КА ЧЕСТВА ТЕЛЛУРИТА КАЛИЯ (ТК) Порядок приготовления и хранения 1%-й пептонной воды с теллуритом калия.

Приготовление рабочих растворов. Теллурит калия выпускается промышленностью в виде сухого порошка или 2%-го раствора. Каждая серия препарата, используемого для приготовления питательных сред при диагностике холеры, должна быть проверена на ингибирующие свойства в отношении холерного вибриона и кишечной палочки. В работе используют 0,025% (1:4000) раствор теллурита калия. Для его приготовления к 5 мл 2%-го раствора добавляют 395 мл стерильной дистиллированной воды. Из сухого препарата рабочий раствор готовят разведением 50,0 мг теллурита калия в 200 мл стерильной дистиллированной воды.

Хранение теллурита калия и его рабочих растворов.

Сухой порошок хранят в темном месте при комнатной температуре. Срок годности не ограничен.Концентрированный или 2%-й раствор теллурита калия хранят в темном месте в герметично закрытой посуде. Срок годности не более 4 лет.

Рабочий раствор теллурита калия хранят в холодильнике и используют в течение 7 дней после приготовления. Почернение или помутнение растворов свидетельствует об их непригодности.

Проверка годности теллурита калия проводится лабораториями, имеющими разрешение на работу с ПБА I и II групп.

4.6. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СВОЙСТВ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ

Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на индофенолоксидазу дают вибрионы, аэромонады, псевдомонады, плезиомонады, а отрицательную – все энтеробактерии семейства Enterobacteriaceae.

Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах (СЭДХ и TCBS).

Определение типа расщепления глюкозы (тест ХьюЛейфсона) В две пробирки со средой Хью-Лейфсона засеваются уколом в столбик изучаемой культурой. Поверхность среды в одной из пробирок покрывается 0,5-1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируются от 1 до 4 суток при температуре 37±0,5°С. Окисление определяется по желтой окраске среды только в аэробных, а ферментация - в аэробных и анаэробных условиях роста. Вибрионы расщепляют глюкозу по ферментативному типу.

Определение декарбоксилазной и дигидролазной активности Определение декарбоксилазной активности проводится на специальных средах Мюллера, Фалькоу, Биргер-Крушинской, Ряпис и др. (среда 199). В пробирки с лизином, орнитином, аргинином и контролем (среда без аминокислоты) засевается по полной бактериологической петле 18-часовой агаровой культуры. Посевы инкубируются при 37±0,5°С. Учет результатов производится ежедневно, при отрицательном результате - до 1-4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую сторону, а в дальнейшем при декарбоксилировании аминокислот накапливаются амины и происходит защелачивание среды.

Среда Мюллера фиолетового цвета, при кислой реакции желтеет, щелочной – изменяется до красно-фиолетового цвета. Среда Фалькоу имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции желтеет, при щелочной - синеет. Среда Биргер-Крушинской при положительной реакции изменяется в синий цвет, среда Ряпис и др. меняется от оранжевого до сиреневого.

Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде.

Для посева используется культура, выращенная в течение 12-20 ч на плотной или 3-4 часа в жидкой питательной средах. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируются при 37±0,5°С. Результаты учитываются через 6-18 ч.

Определение диастатической активности: могут быть использованы среда Гисса с крахмалом и среда Кодама. Культура засевается в среду и инкубируется при 37±0,5°С. Через 18 ч в пробирку со средой Кодама добавляется 2-3 капли раствора Люголя. При разложении крахмала среда не окрашивается.

Выявление способности к биолюминесценции Изучаемые штаммы засеваются в 1% пептонную воду или на пластинки щелочного агара, инкубируются при температуре 37±0,5°С в течение 18 ч. Выросшие культуры просматриваются в темной комнате. Свечение наблюдается после 5-10 мин адаптации в темноте.

Определение протеолитической активности Протеолитические свойства выявляют путем посева уколом в столбик желатины 18-часовой агаровой культуры. Посевы инкубируют в при температуре (37,0±0,5) 0С в течение 18 часов. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на 20 минут.

При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в контрольной пробирке) – затвердевает.

4.6.2. Серологические методы Слайд-агглютинация Слайд-агглютинация ставится на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и/или агаровую 12-18-часовую культуру и холерные сыворотки О серогруппы (Инаба, Огава в разведениях 1:50) и О (в разведении 1:10) Сыворотка О139 разводится в соответствии с указанием на этикетке. Реакция обязательно сопровождается контролями культуры в физиологическом растворе.

Развернутая реакция агглютинации.

Развернутая реакция агглютинации ставится и учитывается по общепринятой методике в соответствии с наставлением к диагностическим сывороткам в объеме 1 мл, начиная с разведения 1:100 до титра сыворотки, применяя в качестве антигена 1 млрд. суспензию холерных вибрионов в 0,9% растворе хлористого натрия. Для РА с RO сывороткой антиген готовится на дистиллированной воде.

Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить развернутую реакцию в 0,3% растворе NaCl. Диагностические сыворотки двукратно разводятся 0,3% раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра. Суспензия изучаемой культуры готовится в этом же растворе с концентрацией 3-5 млрд м.к./мл в объеме 8- мл. Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1-1,5 ч. В реакции используется поверхностный слой микробной взвеси, разведенной 0,3% раствором натрия хлорида до концентрации 1 млрд м.к./мл, добавляя её по 0,5 мл во все разведения сыворотки и контроль культуры (0,5 мл 0,3% раствора натрия хлорида + 0,5 мл взвеси культуры). Учет и оценка результатов аналогичны основному варианту развернутой реакции.

Флуоресцентно-серологический метод исследования (МФА) Чувствительность метода – 106 м.к. в 1 мл.

Из нативного материала (жидких испражнений и рвотных масс), пленки I-ой и II-ой накопительной среды готовят мазок, подсушивают его на воздухе и фиксируют 20 мин в 96° этиловом спирте без последующего обжигания. Мазок помещается в чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой и на мазок наносится капля люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. При исследовании сильно загрязненных материалов с целью гашения неспецифического свечения люминесцирующая сыворотка разводится бычьим альбумином, меченным родамином или нормальной лошадиной сывороткой.

Через 15-20 мин экспозиции при 37±0,5°С или комнатной температуре мазок промывается в течение 10 мин в забуференном физиологическом растворе или 5 мин в проточной водопроводной воде, прополаскивается в дистиллированной воде и высушивается на воздухе.

На мазок наносится небольшая капля забуференного глицерина (9 частей глицерина и 1 часть фосфатного буфера, рН 7,2-7,4) и накрывается покровным стеклом.

При просмотре препаратов в люминесцентном микроскопе пользуются нефлуоресцирующим иммерсионным маслом или диметилфтолатом. Положительно оценивается интенсивное желто-зеленое свечение по периферии клетки (++++ или +++).

Этот метод может быть использован и для идентификации подозрительных колоний на любом этапе исследования. Для выявления холерных вибрионов О серогруппы можно использовать непрямой метод иммунофлуоресценции.

Реакция иммобилизации вибрионов (РИВ) Чувствительность метода иммобилизации вибрионов под влиянием холерной О1-сыворотки – 4,3·105 м.к. в 1 мл.

На предметное стекло наносится 2 капли исследуемого материала (испражнений, верхнего слоя I-ой или II-ой среды обогащения). Первая капля накрывается покровным стеклом (контроль), ко второй -добавляется капля холерной О1-сыворотки в разведении 1:50, перемешивается и накрывается покровным стеклом.

Раздавленные капли просматриваются под микроскопом при увеличении 400-600х, используя фазово-контрастное устройство или конденсор темного поля.

При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов в первой капле наблюдается характерная подвижность, во второй – подвижность вибрионов прекращается немедленно или в течение 1-2 мин.

Для определения принадлежности холерного вибриона к серовару можно пользоваться сыворотками Инаба и Огава в разведении 1:50. Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15-20 мин от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1% пептонной воде.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой О139 серогруппы в разведении 1:5.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакция торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА) с диагностикумом холерным эритроцитарным О-иммуноглобулиновым в микрообъемах.

Материалом для исследования служат испражнения от больных клинической формой холеры, содержимое кишечника трупов лиц, умерших с подозрением на холеру, посевы I-ой или II-ой сред обогащения. Исследуемый материал обязательно инактивируют кипячением на водяной бане 20 мин и при необходимости фильтруют через бумажный фильтр.

При исследовании серологическим методом испражнений, рвотных масс, желчи от больных с подозрением на холеру используется II-ая пептонная вода.

При исследовании испражнений от лиц, контактировавших с больными, декретированных и других контингентов на вибриононосительство, а также объектов внешней среды используется II-ая пептонная вода для постановки РНГА в одной лунке. При получении положительных результатов ставятся РНГА и РТНГА в развернутых рядах.

Постановка РНГА. В 8 лунок микротитровальных пластинок вливается 2 капли (0,05 мл) 0,9% раствора хлористого натрия. Затем в первую лунку вливается 0,05 мл инактивированного исследуемого материала и титрируется по 0,05 мл во всех лунках, кроме последней.

Получается ряд последовательных двукратных разведений. Затем во все лунки добавляется по 0, мл диагностикума холерного эритроцитарного О-иммуноглобулинового 0,6% концентрации (дополнительно разведенного в 4 раза) и пластинки оставляются на 2 ч при комнатной температуре, после чего проводится учёт результата. Он считается положительным при равномерном выпадении эритроцитов на дно лунок. В отрицательных случаях эритроциты выпадают на дно лунок в виде «пуговки».

Проверка специфичности положительного результата РНГА осуществляется при помощи РТНГА.

Постановка РТНГА. В лунки микротитровальных пластинок вливается по 0,025 мл 0,9% раствора хлористого натрия. Затем в первую лунку вливается 0, мл исследуемого материала и титруется. Из последней лунки 0,025 мл удаляется. После этого во все лунки добавляется 0,025 мл сыворотки холерной О1 в разведении 1:50. Пластинки оставляются на 1 ч при комнатной температуре, затем во все лунки добавляется по 0,025 мл диагностикума холерного эритроцитарного О-иммуноглобулинового 0,6% концентрации и учет результатов проводится через 2 ч после добавления диагностикума. В РТНГА реакция должна быть отрицательной. Допускается положительный результат РТНГА в первых разведениях. При сравнении титров РТНГА и РНГА (в случае одновременной постановки реакций) положительный результат в РНГА должен быть на 4-5 лунок выше, чем в РТНГА.

4.6.3. Тесты дифференциации биоваров V. cholerae О Определение чувствительности к диагностическим холерным фагам В лабораторной диагностике холеры используются бактериофаги диагностические холерные классический и эльтор. При оценке результатов проб с фагами необходимо ориентироваться на диагностический рабочий титр (ДРТ), который обычно обозначаются на этикетках. Определение чувствительности к фагам проводится как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями до ДРТ в мясо-пептонном бульоне. Дифференциальный рабочий титр обычно не ниже 110-2.

Для постановки реакции в чашки разливается щелочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 мин при 37°С дно чашек делится на квадраты по количеству образцов фагов и 10-кратных разведений фага. В пробирку с 5 мл 0,5-0,7% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45°С, добавляется 0,1-0,2 мл 3-4-часовой бульонной культуры, тщательно смешивается и выливается на поверхность агара. Чашки оставляются при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 мин.

В центр квадратов наносятся штампом-репликатором, стандартной петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой по капле фагов в соответствующих разведениях. После подсыхания капель чашки переворачиваются вверх дном и помещаются в термостат при температуре 37±0,5°С. Учет результатов через 2-4 ч и 18-20 ч. Наличие лизиса в виде одного «стерильного»

пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат.

Определение чувствительности к полимиксину В расплавленный и остуженный до 45°С питательный агар (рН 7,2±0,1) добавляется полимиксин В из расчета 50 единиц на 1 мл среды. После тщательного перемешивания среда разливается в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки наносится обычной бактериологической петлей или штампом – репликатором или 18 часовая бульонная культура. Учет результатов после инкубирования посевов при 37°С в течение 18 ч.

Холерный вибрион биовара cholerae не растёт на полимиксиновом агаре, биовара eltor - по-разному.

Постановка реакции гемагглютинации На предметное стекло, помещенное в чашку Петри наносится капля физиологического раствора и суспендируется петлей 18-часовая агаровая культура. Затем добавляется капля 2,5% взвеси куриных эритроцитов, трижды отмытых физиологическим раствором. Стекло покачивается до смешивания взвеси эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение 1 мин наступает склеивание эритроцитов. Реакция сопровождается двумя контролями: а) в каплю физиологического раствора добавляется капля 2,5% взвеси эритроцитов;

б) в капле физиологического раствора суспендируется испытуемая культура. Контроли должны быть отрицательными. Для постановки пробы могут быть использованы эритроциты морской свинки.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол) Испытуемая культура засевается в глюкозо-фосфатный бульон Кларка и инкубируется при температуре 37 ± 0,5°С в течение 1-3 суток. Затем к 1 мл культуры добавляется 0,6 мл 6% спиртового раствора a-нафтола и 0,4 мл 40% раствора едкого калия. Пробирки встряхиваются и помещаются в термостат на 1 ч. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или ярко-красный цвет.

4.6.4. Тесты межвидовой дифференциации патогенных для человека вибрионов Определение галофильности вибрионов Суточная агаровая культура исследуемого штамма засеваюется в 1% пептонную воду с 3% NaCl. Через 3-4 ч инкубации при 37°С делают перенос строго по капле выросшей культуры в пептонную воду без NaCl, с 7 и 10% NaCl. Через 18-20 ч инкубации оценивается рост культур по помутнению среды. Галофильные вибрионы не растут на средах, не содержащих NaCl.

К негалофильным относятся V. cholerae, V. cholerae не О1 группы, V. mimicus, V. metshnikovii для роста которых достаточны следовые количества соли в среде.

4.6.5. Оценка эпидемической значимости холерных Определение гемолитической активности (по Грейгу) К 1 мл 18-24-часовой культуры, выращенной в 4- мл мясо-пептонного бульона или сердечно-мозгового инфуза, добавляется 1 мл 1% взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в физиологическом растворе.

Смесь микробов и эритроцитов осторожно перемешивается встряхиванием и помещается на 2 ч в термостат при температуре 37±0,5°С, а затем в холодильник до следующего дня. Предварительный учет результатов проводится через 2 ч, окончательный – на следующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (1 мл бульона+1 мл взвеси эритроцитов) гемолиз отсутствует. Чистоту опыта следует контролировать путем высева «смеси» на агаровую среду.

Для постановки пробы Грейга может быть использована дефибринированная кровь барана, консервированная борной кислотой. Консервированные эритроциты сохраняют свои свойства в течение 3-х месяцев. Перед постановкой пробы на гемолиз дефибринированную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. оборотов/мин в течение 15 мин, надосадочная жидкость удаляется, а осевшие эритроциты отмываются физиологическим раствором 23 раза с промежуточным центрифугированием до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из отмытых эритроцитов готовится 1% взвесь в физиологическом растворе, которую можно хранить при 4°С 23 дня и использовать для постановки пробы Грейга описанным выше способом.

Определение эпидзначимости холерных вибрионов эльтор комплексным методом Определение производится с помощью диагностических холерных бактериофагов эльтор CTX+ и CTX - в соответствии с наставлением к препаратам и гемолитической активности.

Методику определения гемолитической активности см. выше.

Для постановки пробы с фагом используют метод агаровых слоев. Испытуемая культура в объеме 0,5 мл добавляется пипеткой в пробирку с 5,0 мл 0,5-0,7% агара Мартена рН 7,6±0,2, расплавленного и охлажденного до 45 ± 0,2°С. После перемешивания все содержимое выливается на подсушенную поверхность агара Мартена (рН 7,6 ± 0,2) в чашки Петри. После застывания слоя агара с культурой на его поверхность наносятся цельные фаги CTX+ и CTX -. После высыхания капель фагов чашки переворачивают агаром вверх и инкубируют при 37±0,5°С.

По лизису фагами и гемолитической активности в пробе Грейга исследуемые штаммы могут быть отнесены к эпидемически опасным (I группа, вариант 1) и эпидемически неопасным (III группа, вариант 6, 7, 8) вариантам или требующим дополнительных исследований для заключения об их эпидемичности (группа II, варианты 2, 3, 4, 5) (табл. 3).

Определение эпидемической значимости V. cholerae в ПЦР с электрофоретическим учетом результатов Для оценки эпидемической значимости выделенной культуры V. cholerae или обнаружения ДНК токсигенного штамма в исследуемом материале применяется «Тест-система для выявления ДНК V. cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции (ГенХол)».

Применение данной тест-системы обеспечивает выявление фрагмента гена субъединицы А холерного токсина ctxA размером 564 п.н.

Обеззараживание исследуемого материала и выделение ДНК При исследовании чистой культуры V. cholerae готовится бактериальная взвесь 18-часовой агаровой культуры в 0,9% растворе натрия хлорида по стандартному образцу мутности 5 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. Далее проводятся 10-кратные разведения до концентрации взвеси 1х107 м.к./мл. Для обеззараживания добавляется мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и взвесь прогревается при 56 0С в течение 30 мин. Экстракция ДНК из обеззараженной взвеси осуществляется посредством прогревания на водяной бане при 100 0С в течение мин или с использованием стандартного набора для выделения ДНК в соответствии с инструкцией производителя.

Постановка ПЦР В отдельной пробирке готовится общая амплификационная смесь (исследуемое количество проб и две контрольных пробы) из расчета нижеуказанного количества компонентов на одну пробу:

Дистиллированная вода – 6,75 мкл 10хПЦР буфер – 2,5 мкл дНТФ – 2,5 мкл MgCl2 – 1,0 мкл Праймер ctx2 – 1,0 мкл Праймер сtx3 – 1,0 мкл Taq- полимераза – 0,25 мкл Смесь перемешивается пипетированием и распределяется по 15 мкл в промаркированные пробирки.

Далее в пробирку отрицательного контроля вносится 10 мкл дистиллированной воды, в пробирку положительного контроля – 10 мкл контрольной ДНК, в остальные пробирки – по 10 мкл исследуемых проб.

При использовании амплификатора, не имеющего режима нагревания крышки, в пробирки перед добавлением ДНК вносится по 30 мкл минерального масла для предотвращения испарения амплификационной смеси.

Амплификация проводится в термоциклере по следующей программе:

стартовая денатурация 94С - 5 мин далее 35 циклов:

95оС - 30 сек 60оС - 30 сек 72оС - 30 сек заключительная элонгация 72 оС - 7 мин.

Учет и оценка результатов амплификации По окончании программы амплификации анализируемые образцы в объеме 10-12 мкл смешиваются с 2-2, мкл раствора для нанесения проб и вносятся в лунки агарозного геля плотностью 1,5%. Электрофорез проводится в 1ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряженности 10 В/см в течение 30-40 мин. Затем гель просматривается в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе и результат видеодокументируется.