МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (НГУ)

Кафедра общей информатики Михаил Станиславович Дьяков Программный пакет для генетического анализа сложных количественных признаков

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ

по направлению высшего профессионального образования 230100.68 ИНФОРМАТИКА И ВЫЧИСЛИТЕЛЬНАЯ ТЕХНИКА

ФАКУЛЬТЕТ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Тема диссертации утверждена распоряжением по НГУ №115 от «11» мая 2010 г.

Руководитель Осадчук Александр Владимирович к. б. н., зав. лаб. эндокринологической генетики ИЦиГ СО РАН Новосибирск, 2010 г.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (НГУ)

Кафедра общей информатики

УТВЕРЖДАЮ

Зав. кафедрой Пальчунов Д. Е.

………………….

(подпись, дата)

ЗАДАНИЕ

на магистерскую диссертацию студент Дьяков Михаил Станиславович факультета ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ Направление подготовки 230100.68 ИНФОРМАТИКА И ВЫЧИСЛИТЕЛЬНАЯ

ТЕХНИКА

Магистерская программа 552809 Технологии разработки программных систем Тема: Программный пакет для генетического анализа сложных количественных признаков Цель работы: Разработка программного пакета для генетического анализа сложных количественных признаков в расширенных диаллельных скрещиваниях рекомбинантных линий и гибридах второго поколения линий основателей на основе многолокусного подхода.

Руководитель Осадчук А. В.

к. б. н., зав. лаб., ИЦиГ СО РАН …………………………..

(подпись, дата) Содержание ВВЕДЕНИЕ

1 Предметная область

1.1 Многомерная регрессия

1.2 Метод диаллельных скрещиваний

1.3 Анализ сцепления модельных локусов с маркерами хромосом

2 Постановка задачи

2.1 Цель работы

2.2 Входные данные

3 Алгоритмы решения задачи

3.1 Построение модели

3.2 Кодирование решения

3.3 Определение качества решения линейной регрессии

3.4 Линейная многомерная регрессия

3.5 Метод квадратных корней

3.6 Перебор пространства решений

3.6.1 Обзор полученного метода

3.6.2 Описание метода

3.7 Установление сцепления модельных локусов с маркерами хромосом.................. 3.7.1 Трехлокусное сцепление, одномерный случай [13]

3.7.2 Трехлокусное сцепление, многомерный случай

3.7.3 Поиск всех точек сцепления

3.8 Тест на сходство предсказанного и наблюдаемого распределений значения признака в F2

3.9 Определение генотипа модельных локусов в F2

3.10 Поиск решений на основе объединенных экспериментальных данных................ 3.11 Перестановочный тест

3.12 Рекомендации по выбору модели

4 Описание программной системы

4.1 Компоненты программного пакета

4.2 Поиск решений на основе данных о диаллельных скрещиваниях

4.3 Поиск решений на основе объединенных экспериментальных данных................ 4.4 Отладка и тестирование

5 Тестирование

Заключение

Литература

ВВЕДЕНИЕ

Генетический анализ – это область генетики, которая занимается выяснением механизмов генетической детерминации признаков. Видное место в генетическом анализе отводится задачам формальной генетики, а именно формулированию и формализации моделей наследования и проверке генетических гипотез на конкретном эмпирическом материале. В мировой литературе этот раздел генетического анализа известен под названием сегрегационный анализ и анализ сцепления (segregation and linkage analysis). В рамках сегрегационного анализа решаются вопросы о том, сколько генов участвует в обеспечении наследственного полиморфизма анализируемого признака, каков характер их экспрессии, взаимодействуют ли они друг с другом и каковы значения конкретных генетических эффектов: аддитивных, доминантных и различного рода эпистатических, сегрегационного анализа является формулировка модели наследования анализируемого признака. Она не только приближает нас к пониманию природы генетической детерминации анализируемого признака, объясняя характер его наследования, но также является эффективным инструментом при оптимальном планировании дальнейших генетических экспериментов по картированию выделенных генов. После этого в процессе анализа сцепления генов проводится их картирование, т.е. определяется принадлежность этих генов к тем или иным хромосомам и конкретная локализация в них.

Задачи построения сегрегационных генетических моделей сложных количественных признаков, контролирующихся многолокусными генетическими системами с эпистатическими взаимодействиями, продолжают оставаться одной из актуальных и трудноразрешимых задач современной генетики количественных признаков. В настоящем исследовании разработан программный пакет, реализующий метод построения сегрегационных моделей наследования сложных количественных признаков в расширенных диаллельных скрещиваниях рекомбинантных линий и гибридах второго эндокринологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН.

Диаллельные скрещивания представляют собой потомков первого поколения, полученных от скрещивания инбредных рекомбинантных линий во всевозможных комбинациях. Диаллельный анализ позволяет получать достаточно точную оценку генотипических значений для каждой комбинации скрещиваний, поскольку в ней используются группы животных одинаковые по своему генотипу. Это свойство делает его привлекательным подходом в физиологической генетике, так как физиологические признаки часто характеризуются большой средовой изменчивостью. Кроме того, в отличие от других систем генетического анализа, комплекс диаллельных скрещиваний обеспечивает однозначное установление всех генотипов диаллельной матрицы скрещиваний при условии, что известны генотипы рекомбинантных линий. Эти два свойства диаллельных скрещиваний позволяют эффективно конструировать довольно сложные модели генетической детерминации исследуемых признаков с минимально необходимым для этих целей числом генетических локусов.

Возможность проверять гипотезы о характере наследования генетических признаков позволяет производить поиск наилучших гипотез – решений построенной сегрегационной модели. Разработанный пакет позволяет искать решения построенных моделей и определять положение решений на карте микросателлитных маркеров. Эти характеристики программного пакета открывают для экспериментатора возможность не только определить характер наследования количественного признака, но и выявить наиболее вероятные места генома, в которых находятся гены, ответственные за данный признак.

1 Предметная область 1.1 Многомерная регрессия Главная задача, которая решается с помощью регрессионного анализа, – создание математических моделей некоторых объектов или явлений на основе экспериментов или соотношения между показателями работы объекта или характеристиками наблюдаемого явления y1, y2,…,yl и обуславливающими их характеристиками x1, x2, …, xm. y1, y2, …, yl, называются зависимыми переменными, выходными характеристиками или откликами объекта, а x1, x2, …, xm – входными переменными, независимыми переменными или факторами. Любая модель отражает только некоторые характерные черты объекта и никогда не бывает его точной копией. Для одного и того же объекта можно создать множество моделей.

Выбор модели зависит от целей исследования. Выбор подходящей модели – это в значительной степени искусство, и при определении ее вида часто решающую роль играют опыт и знания исследователя. Модель всегда отражает данное явление с некоторым приближением.

Причина, по которой модель не отражает протекающее явление абсолютно точно, заключается в следующем: всегда есть величины, которые влияют на результаты, но не измеряются во время эксперимента. Часть из них имеет систематический характер и в силу этого может с течением времени вызвать изменения коэффициентов модели. Другая же часть меняется случайным образом, подчиняясь некоторому закону распределения.

Такие величины также называют случайными возмущениями. В силу их действия повторные опыты при одних и тех же значениях факторов будут давать различные значения зависимой переменной. Модель не может точно учесть влияние случайных возмущений в каждом отдельном измерении, она показывает лишь некоторые усредненные характеристики.

Следовательно, нет оснований говорить об «истинной» модели в полном смысле слова. Тем не менее, модели успешно используются на практике. Обычно под «истинным» значением понимают условное математическое ожидание зависимой переменной при заданных значениях факторов:

где Е – знак математического ожидания.

Равенство (3.1.1) называется регрессией (уравнением регрессии) и показывает изменение среднего значения отклика объекта при изменениях факторов. Фактически измеряемая выходная характеристика есть где - случайное возмущение. Чаще всего принимают, что действие на объект множества случайных возмущений эквивалентно действию одного-единственного возмущения с нормальным распределением, нулевым математическим ожиданием и дисперсией 2. Это предположение выполняется достаточно хорошо для многих практических задач, в которых все случайные возмущения оказывают воздействия, соизмеримые одно с другим.

Основанием этому служит центральная предельная теорема теории вероятностей.

Существует большое число различных регрессионных моделей, определяемых конкретным видом функции ( x1, x 2,..., x m ), где всегда присутствуют некоторые коэффициенты 1, 2,..., k, которые надо определять по экспериментальным данным. В зависимости от того, как эти коэффициенты входят в уравнение регрессии, модели делятся на линейные и нелинейные по параметрам.

Наряду с задачами, в которых все факторы могут меняться в заданных интервалах непрерывно, существуют задачи, в которых часть факторов имеет качественный характер и может принимать только определенные дискретные значения. В этом случае в модель вводят так называемые индикаторные переменные, показывающие, имеет ли некоторый фактор в определенном наблюдении заданное значение или нет. Фактор с качественными уровнями можно представить индикаторными переменными, принимающими только значения 0 и 1.

В задачах, широко решаемых при генетическом анализе, как правило, все факторы имеют качественный характер и принимают только определенные дискретные значения.

1.2 Метод диаллельных скрещиваний Видное место в генетическом анализе отводится задачам формальной генетики, а генетических гипотез на конкретном эмпирическом материале. Одной из систем скрещивания, используемых при генетическом анализе количественных признаков, являются диаллельные скрещивания, которые представляют собой потомков первого поколения, полученных от скрещивания инбредных рекомбинантных линий во всевозможных комбинациях (рис. 1). Полученные таким способом потомки – кроссы – можно представить в виде диаллельной квадратной матрицы, по главной диагонали которой стоят рекомбинантные линии, а нижняя и верхняя треугольные подматрицы содержат соответствующие реципрокные гибриды. Последние различаются между собой только соответствующей сменой материнского и отцовского генотипов. Кроссы на одной и той же строке или столбце диаллельной матрице имеют соответственно одинаковый материнский или отцовский генотип. В данной работе используется расширенная матрица диаллельных скрещиваний, в которой присутствуют всевозможные кроссы рекомбинантных инбредных линий и линий основателей.

Рисунок 1. Диаллельные кроссы рекомбинантных инбредных линий.

Классический диаллельный анализ позволяет разложить межкроссную вариацию на отдельные компоненты фенотипической изменчивости, зависящие преимущественно от тех или иных генетических эффектов. Однако он не дает информацию о числе генов, принимающих участие в генетической детерминации исследуемого признака, и величине конкретных генетических эффектов для этих генов. На основе разложения межкроссной изменчивости на отдельные её компоненты мы можем лишь качественно судить об относительном вкладе тех или иных генетических эффектов в наследственную детерминацию изучаемого признака. Для того чтобы преодолеть эти нерешенные проблемы классического подхода, в лаборатории эндокринологической генетики ИЦиГ СО РАН разработан метод построения статистических генетических моделей на основе многомерного регрессионного анализа диаллельных матриц.

В отличие от других систем скрещиваний, используемых в генетическом анализе, диаллельные скрещивания имеют ряд принципиальных преимуществ. Во-первых, диаллельный анализ позволяет получить достаточно точную оценку генотипических значений для каждой комбинации скрещиваний, поскольку в ней используются группы животных, одинаковые по своему генотипу. Во-вторых, комплекс диаллельных скрещиваний обеспечивает однозначное установление всех генотипов диаллельной матрицы скрещиваний при условии, что известны генотипы рекомбинантных линий. Эти два свойства диаллельных скрещиваний позволяют эффективно конструировать довольно сложные модели генетической детерминации исследуемых признаков с минимально необходимым для этих целей числом генетических локусов – генов.

1.3 Анализ сцепления модельных локусов с маркерами хромосом После формулирования удачных гипотез о характере наследования локуса по рекомбинантным линиям актуальной становится задача точного определения положения локуса в исследуемом геноме. Произведенные в последние годы исследования предоставили такую возможность, обеспечив экспериментатора идеальными хромосомными микросателлитными маркерами, плотно картирующих весь геном.

Микросателлитные маркеры имеют значительно более высокий уровень полиморфизма, чем ранее использующиеся для этой цели мутантные аллели генов и полиморфизм по генам ферментов, и их применение позволяет с большой степенью достоверности найти хромосомную локализацию модельного локуса. Характеристика степени близости модельного локуса к определенному месту хромосомы носит название сцепленности и определяется через сходство характеров распределения аллелей модельного и фланкирующих его микросателлитных локусов, а также расстояния между маркерными микросателлитными локусами на генетической карте рекомбинантных линий.

Таким образом, построенная сегрегационная модель будет не только адекватно описывать межкроссную генотипическую изменчивость, но ее модельные локусы будут сцеплены с некоторыми картированными микросателлитными маркерами. Это позволит произвести отсев несцепленных адекватных гипотез и осуществить проверку полученных вариантов решений на новом блоке экспериментального материала – втором поколении скрещиваний линий основателей.

2 Постановка задачи 2.1 Цель работы Целью данной работы является построение программного пакета для генетического анализа сложных количественных признаков в расширенных диаллельных скрещиваниях рекомбинантных линий и гибридах второго поколения линий основателей на основе многолокусного подхода.

Данная задача делится на следующие части:

а) Построение многолокусной генетической сегрегационной модели с минимальным числом локусов, адекватно описывающих межкроссную генотипическую изменчивость в диаллельных скрещиваниях рекомбинантных линий и линий основателей.

б) Поиск групп модельных локусов, многомерная линейная взвешенная регрессия по которым является адекватной.

в) Поиск групп микросателлитных маркеров, которые сцеплены с адекватными решениями выбранной модели, т.е. определение мест генома, которым могут соответствовать локусы полученных решений.

г) Поиск решений, удовлетворяющих тесту на сходство предсказанного и наблюдаемого распределений значения признака в гибридах второго поколения линий основателей.

д) Поиск решений на основе объединенных экспериментальных данных (диаллельные скрещивания рекомбинантных и линий основателей, а также гибриды второго поколения линий основателей), многомерная линейная взвешенная регрессия по которым является адекватной.

е) Полногеномный композитный перестановочный тест.

ж) Выявление решений, значение композитного критерия для которых превышает определенный уровень (обычно выбирают 95 или 99 процентов), полученный на предыдущем этапе.

з) Анализ полученных решений.

2.2 Входные данные Входными данными для системы являются:

а) количество взаимодействующих локусов в модели;

б) количество рекомбинантных инбредных линий;

в) генетическая карта маркеров в диаллельных скрещиваниях;

г) генетическая карта маркеров в гибридах второго поколения линий основателей;

д) значения признака для диаллельных кроссов рекомбинантных инбредных линий и линий основателей;

е) значение признака для гибридов второго поколения линий основателей;

ж) параметры критериев адекватности;

з) параметры критериев сцепления.

3 Алгоритмы решения задачи 3.1 Построение модели количественного признака в диаллельных скрещиваниях используется метод построения статистических генетических моделей на основе многомерного регрессионного анализа диаллельных матриц. Аутосомный локус рассматривается как фактор, имеющий градации (уровня): 2 градации для гомозигот и 1 градацию для гетерозиготы.

Генотипическое значение анализируемого признака в модели представлено как результат суммарного влияния некоторого числа вышеуказанных факторов, который описывается линейным регрессионным уравнением. Это уравнение является линейной комбинацией генетических эффектов данных локусов или факторов. Каждый аутосомный локус имеет два главных эффекта: аддитивный и доминантный. При взаимодействии локусов между взаимодействии двух аутосомных локусов имеется 4 вида эффектов: гомо-гомозиготные, уравнения, выражающие генотипическое значение анализируемого признака как линейную регрессионную функцию от генотипа, впервые были введены ван-дер Вином [18] и описаны в классической монографии Мазера и Джинкса по биометрической генетике [6]. Эти уравнения использовались ими, главным образом, для описания компонент фенотипической изменчивости. В отличие от них, в нашей работе эти уравнения используются для адекватного описания генотипической изменчивости в диаллельных скрещиваниях на основе минимального числа генетических локусов.

В настоящей работе используется многомерная регрессионная модель вида:

где X mf – генотипическое значение признака для mf-го кросса диаллельной матрицы (m здесь обозначает номер отцовской рекомбинантной линии, f – материнской);

E1 – вклад главных (аддитивных и доминантных) генетических эффектов локусов;

взаимодействующих локусов;

– свободный член уравнения, который оказывается равным среднему значению признака по всевозможным рекомбинантным инбредным линиям в рамках выбранной модели.

где L – число локусов.

Каждая индикаторная переменная в этом линейном уравнении умножена на коэффициент эпистатическим генетическим эффектам. Кроме того, каждая индикаторная переменная является целочисленной функцией от значений генотипа рекомбинантных линий и может принимать значения: 1, 0 или -1:

перед коэффициентами, равными аддитивным и доминантным эффектам соответственно.

B(i, j )mf = A(i ) r A(i ) mf – индикаторные переменные перед коэффициентами, равными вышеуказанным эффектам взаимодействия между парами локусов, входящими в E 2 :

B(i, j )mf – перед гомо-гомозиготными эффектами; B(i, j )mf – перед гомо-гетерозиготными эффектами; B(i, j )mf – перед гетеро-гомозиготными эффектами; B(i, j )mf – перед гетерогетерозиготными эффектами.

3.2 Кодирование решения Генотип каждой рекомбинантной линии представляется в виде вектора:

Где S – число рекомбинантных линий, L – количество локусов.

Каждая из компонент вектора может принимать значения 1 или 0, т.е. каждый локус представлен двумя аллелями. Для определенности полагаем, что значение 0 будет указывать на аллель, соответствующую гену, унаследованному от материнской гомозиготы, и наоборот, значение 1 будет указывать на аллель, соответствующий гену отцовской линии. Таким образом, значения соответствующие генотипам материнской и отцовской линий, будут выражаться как S +1 = (0,0,K,0) и S + 2 = (1,1,K,1) соответственно.

Из имеющихся значений рассматриваемого множества из полученных от скрещивания рекомбинантных линий друг с другом и с линиямиоснователями во всевозможных сочетаниях с добавлением генотипов линий основателей и их нереципрокного гибрида F1, составляется систему линейных уравнений (всего не более (S + 2)2 уравнений). Фиксированием значений генотипов для рекомбинантных линий, однозначно определяются значения индикаторных переменных в этих уравнениях.

3.3 Определение качества решения линейной регрессии Методом множественной линейной взвешенной регрессии [9] определяются такие полученных в эксперименте значений фенотипов, т.е. минимизировали бы ошибку. Для этого решается система линейных уравнений и рассчитывается коэффициент множественной детерминации R 2. В качестве весов wmf берется количество особей, использованное для определения генотипических средних значений признака X mf.

Качество полученного решения проверяется с использованием критерия Фишера [9] сравнением остаточной дисперсии, не учтенной многомерной регрессией, со средовой вариансой. Если оценка адекватности регрессии больше некоторого уровня (часто берут уровень 95 процентов), то полученное решение адекватно описывает экспериментальный материал с точностью до средовой вариансы – отклонений, обусловленных случайными средовыми факторами. При этом коэффициент множественный детерминации R указывает на долю межкроссной наследственно обусловленной изменчивости, объясняемую с помощью многомерной регрессионной модели.

Если выбранное решение не подходит, выбираются другие значения генотипов у рекомбинантных линий и вычислительная процедура повторяется. Если окажется, что ни один из вариантов не описывает адекватно экспериментальные данные, то необходимо выбрать более сложную модель (большее число взаимодействующих локусов L).

Таким образом, при выборе оптимального решения мы приходим к перебору всех возможных вариантов генотипов у рекомбинантных линий. Исходя из того, что L векторстолбцов (1j, 2j,K, Sj ), j = 1K L должны быть различны и из того, что от перестановки номеров локусов решение не изменяется, общий размер пространства решений вычисляется по следующей формуле:

где S – число рекомбинантных линий, L – число локусов. Часто на практике, в генетических экспериментах это число является очень большим, например, нами было исследована задача с N 1,88 1014.

3.4 Линейная многомерная регрессия Вычислительная схема расчетов линейной многомерной регрессии, используемая в данной работе:

Пусть E – количество независимых индикаторных переменных в модели (количество коэффициентов генетических эффектов при индикаторных переменных).

N(S+2)2 – количество наблюдений (количество кроссов в диаллельной матрице), где S – число рекомбинантных линий.

{ yij }, i = 1,…, E+1, j = 1, …, N. – матрица исходных данных (первые E строк – матрица индикаторных переменных; E+1 строка – наблюдаемые значения исследуемого признака у кроссов).

Предполагаем, что наблюдаемые значения исследуемого признака у N кроссов y E +1, j связаны линейной зависимостью с индикаторными переменными - y1, j, y2, j,..., yE, j, т. е.:

Определим коэффициент множественной детерминации R2, расчетный критерий Фишера, адекватность регрессии, достоверность регрессии.

Для этого вычисляем:

средние значения для каждой случайной величины yi коэффициенты ковариационной матрицы коэффициенты парной корреляции уравнений:

…………………………………..

коэффициент множественной детерминации расчетный критерий Фишера квадрат ошибки (средовая варианса) [9, 10].

регрессионный критерий Фишера для вычисления достоверности регрессии

ERROR E

адекватность регрессии, которая является статистической табличной функцией Fраспределения FDIST( Fрасч, E, DF), где DF – количество степеней свободы, использованное для вычисления средовой ошибки.

достоверность регрессии через FDIST( Fрегр, N, E-N), где DF – количество степеней свободы, использованное для вычисления средовой ошибки.

Данная функция в EXCEL называется FDIST. Ее интерполяцию с помощью полинома можно найти как в учебнике по статистическим методам, так и в виде функции, реализованной на различных языках программирования.

3.5 Метод квадратных корней Систему линейных алгебраических уравнений:

……………………………… решаем методом квадратных корней.

Вычислительная схема метода:

rii(1) = rii rli(1) ; i = 2,3,..., m;

В процессе счета может оказаться, что ведущий элемент rii(1) = 0. В случае положительно определенной матрицы это будет означать, что det A = 0. [9, 10] В этом случае i-й признак исключается, для него устанавливается rii(1) = 1, и вычисления продолжаются для всех остальных признаков.

3.6 Перебор пространства решений 3.6.1 Обзор полученного метода Поскольку при данной постановке задачи не существует методов, которые находили бы все решения задачи быстрее, чем полный перебор вариантов, было применено улучшение алгоритма перебора, которое позволяет гораздо раньше находить адекватные решения.

Данный алгоритм лучше всего можно описать как «стохастический поиск в ширину с приоритетами». Он основан на одновременном использовании двух методов: метода случайного поиска решений и метода поиска в ширину с приоритетами. Приоритеты определяются посредством ранжирования решений-кандидатов по качеству.

3.6.2 Описание метода Данный метод основывается на том принципе, что соседи более хорошего решения должны перебираться раньше соседей более плохого решения. Метод можно описать следующим образом:

Имеется контейнер, представляющий собой очередь с приоритетом, в котором содержатся непросчитанные решения. В качестве приоритета выступает коэффициент множественной детерминации R 2. Каждый раз из контейнера извлекается наилучшее решение, и просчитываются значения критерия для его соседей. Соседи, согласно их приоритетам, также кладутся в контейнер. Контейнер ограничен и поэтому решения, занимающие положение ниже определенного («объем контейнера»), удаляются. Также, для вывода алгоритма из локальных областей, на каждой итерации алгоритма в контейнер добавляются случайные решения.

Рассмотренные решения убираются из контейнера непросчитанных решений поиска в ширину и помечаются как просчитанные.

решениями, либо случайным образом.

3.7 Установление сцепления модельных локусов с маркерами хромосом 3.7.1 Трехлокусное сцепление, одномерный случай [14] Рассмотрим тестовый локус C и пару сцепленных маркерных локусов A и B (рис. 2).

За a обозначим количество различий (рекомбинаций) в генотипах локусов A и C в N рекомбинантных линиях. Аналогично определим b как количество рекомбинаций между B и C, и c как количество различий в генотипах между локусами A и B. Количество двойных рекомбинаций d (число линий, которые имеют различия между локусами A и C и B и C одновременно) можно определить как За n обозначим N – c.

Вероятность сцепления (L) представляет собой сумму вероятностей возникновения каждого из трех альтернативных порядков расположения генов:

где C – тестовый локус, A и B – сцепленные маркерные локусы. Таким образом, вероятность (на основе данных об SDP рекомбинантных линий) того, что локус C сцеплен с A и B, может быть получена на основе следующих Байесовских выражений:

P(L | a, b ) = [P(CAB )P(a, b | CAB ) + P( ACB )P(a, b | ACB ) + P( ABC )P(a, b | ABC )] P(a, b ), P(a, b ) = P(CAB )P(a, b | CAB ) + P ( ACB )P (a, b | ACB ) + P ( ABC )P(a, b | ABC ) + P (L )P (a, b | L ).

Хромосома, содержащая сцепленные маркерные локусы A и B, имеет длину l (выраженную в Морганидах) и состоит из трех частей (рис. 2). Длину сегмента между локусами A и B обозначим за mAB, расстояние от начала хромосомы до локуса A примем за mA, а расстояние от локуса B до конца хромосомы за mB. Таким образом, Априорная вероятность того, что тестовый локус C сцеплен с сегментом AB и расположен слева от маркерного локуса A, пропорциональна mA и равна где T – длина всего генома (например, для мыши T = 16 Морганид).

Аналогично определяются априорные вероятности того, что тестовый локус расположен между маркерными локусами или справа от локуса B:

Соответственно, априорная вероятность сцепления тестового локуса с маркерными равна Вероятность того, что тестовый локус не сцеплен с маркерными равна Считаем, что все хромосомы одинаковой длины и для мыши l = 0,8 Морганид.

Вероятность того, что тестовый локус C имеет a и b рекомбинаций со сцепленными маркерами A и B соответственно в наборе из N рекомбинантных инбредных линий и не сцеплен с ними равна (полиномиальное распределение) R ( x ) = 4 r ( x ) /[1 + 6 r ( x )] – частота одиночных рекомбинаций между локусами в мейозе, r ( x ) = 0.5 (e 2 x e 2 x )/ (e 2 x + e 2x ) – картирующая функция Косамби. R(mAB) можно считать равным рекомбинантному отношению c/N.

Остальные три условные вероятности определяются как где Подставляя данные формулы в первоначальные, получаем:

3.7.2 Трехлокусное сцепление, многомерный случай Данный подход основан на работах [10, 15].

Группа локусов называется сцепленной, если она удовлетворяет многомерному критерию сцепления с некоторой группой микросателлитных маркерных локусов.

При определении вероятности сцепления группы локусов, можно считать, что сцепление по каждому локусу в отдельности происходит независимо. Поэтому вероятность в многомерном случае выражается следующим образом:

где k – размерность задачи (количество локусов), а P L | a, b, P( ACBi | ai, bi ), P( ABCi | ai, bi ) вычисляются для одномерного случая описанным выше способом.

3.7.3 Поиск всех точек сцепления Для каждого адекватного решения, найденного на первом этапе, определяются все возможные точки сцепления на генетической карте хромосом. Используемый метод основывается на поиске с возвратом (backtracking).

Допустим, что для первых i из k локусов уже установлено возможный вариант сцепления. Для i + 1 локуса подбирается возможное положение, и алгоритм рекурсивно повторяется для i + 2 локуса и т.д. Данная процедура продолжается до тех пор, пока не найдено возможное положение для всех k локусов. Если итоговая k-мерная точка удовлетворяет многомерному критерию сцепленности, то она добавляется в результирующий список.

На каждом этапе алгоритма, для ускорения поиска, применяются два отсечения, с использованием оценки снизу на суммарное количество двойных рекомбинаций и оценки сверху на многомерную вероятность сцепления. Первое отсечение основывается на том, что необходимый уровень многомерного сцепления не может быть достигнут при суммарном количестве двойных рекомбинаций больше определенного. Оценка сверху на вероятность многомерного сцепления также позволяет не рассматривать поддеревья поиска, в листьях которых пороговое значение критерия сцепленности заведомо не может достигаться.

Так как вероятность одномерного сцепления при фиксированном количестве рекомбинантных инбредных линий зависит только от трех параметров (количества соответствующих рекомбинаций a, b и с, описанных выше) и не зависит от внутренней структуры локусов или микросателлитных маркеров, полученное соотношение (5.7.1.1) можно вычислять только один раз для каждой комбинаций параметров. Далее эти значения можно хранить в виде таблицы, и, при необходимости, получать их мгновенно.

3.8 Тест на сходство предсказанного и наблюдаемого распределений значения признака в F На данном этапе определяется степень сходства предсказанного и наблюдаемого распределений значения признака в гибридах второго поколения линий основателей. На основе данных о теоретически предсказанных генотипических средних значений признака (регрессионный анализ, описанный в пунктах 5.1 – 5.3), а также вероятности возникновения генотипов, формируется случайный набор животных (значений признака).

Далее для каждого из наборов при помощи критерия 2 [9] определяется его уровень сходства с распределением признака у животных второго поколения линий основателей.

Если определенный процент этих наборов (задается параметрически) имеет одинаковое распределение с экспериментальным, то считаем, что данное решение удовлетворяется тесту на сходство предсказанного и наблюдаемого распределений значения признака.

3.9 Определение генотипа модельных локусов в F В связи с малым объемом экспериментальных данных, был разработан альтернативный классическому [13] подход определения генотипов модельных локусов.

Первоначально, как и в классическом подходе, вычисляются многомерные вероятности возникновения каждого генотипа модельных локусов у гибридов второго поколения линий основателей, учитывая их расположение на генетической карте микросателлитных маркеров. Далее, из рассмотрения исключаются генотипы, вероятность возникновения которых меньше пяти процентов. Из оставшихся выбирается тот, для которого генотипическое среднее значение количественного признака меньше всего (по абсолютному значению) отличается от значения признака для данной особи.

3.10 Поиск решений на основе объединенных экспериментальных данных После определения генотипа модельных локусов у гибридов второго поколения линий основателей в данной работе проводится анализ характера наследования рассматриваемого количественного признака в объединенных экспериментальных данных: расширенных диаллельных скрещиваниях и гибридах второго поколения линий основателей. На данном этапе происходит отсечение решений и соответствующих им точек сцепления, которые не описывают полный экспериментальный материал с точностью до средовых шумов.

К многомерной регрессионной модели, описанной в пунктах 5.1 – 5.3, добавляются данные о гибридах второго поколения линий основателей, базируясь на полученных генотипах. Значения индикаторных переменных представлены в таблице 1.

Таблица 1. Значения индикаторных переменных перед аддитивными и доминантными эффектами для генотипов у гибридов второго поколения линий основателей.

Вес каждого животного в многомерной взвешенной линейной регрессионной модели равен единице. Качество многомерной регрессии определяется так же, как в пункте 5.3.

3.11 Перестановочный тест Для определения достоверного порога интегральной статистики и выделения решений, которые невозможно получить случайным образом, производится полногеномный композитный перестановочный тест. Сначала, в диаллельных скрещиваниях делаются перестановки рекомбинантных линий (с соответствующими изменениями значений в матрице диаллельных кроссов) и отбираются адекватные решения на основе данных диаллельных скрещиваний. Далее происходит установление сцепления модельных локусов с маркерами хромосом. Полученные наборы решений анализируются на основе данных о гибридах второго поколения линий основателей, в которых также производятся перестановки значений экспериментальных признаков.

Далее строится гистограмма распределения значений критерия, и отсеиваются решения, у которых значение статистики для натуральных данных меньше определенного уровня (обычно выбирают 95- или 99-процентный уровень).

3.12 Рекомендации по выбору модели Основой для выбора модели должна служить желаемая степень описания исходных данных и точность самих исходных данных. Поскольку исследователь желает добиться наибольшего результата с помощью данного программного пакета, он должен иметь возможность варьировать в некоторых пределах сложность выбираемой модели.

Работоспособность системы основана на предположении, что количество локусов в модели соответствует количеству взаимодействующих генов, т.е. воздействие остальных генов мало. Пользователь должен выбирать модель исходя из этого.

Тем не менее, существуют рекомендации при выборе модели:

а) Нужно выбирать как можно более простую модель, которая позволила бы достоверно, с выбранной точностью, описать исходные данные.

б) Чем больше взаимодействующих локусов в модели, тем с большей точностью она способна описать исходные данные.

в) Чем больше взаимодействующих локусов в модели, тем больше пространство решений (3.3.1), тем дольше она будет просчитываться.

г) При определении уровня сцепления на основе данных о количестве двойных позволяющий выделять решения, описывающие экспериментальные данные с точностью до средовых шумов.

Конечно, из пункта в) никак не следует, что в более сложной модели решения найдутся позже, а всего лишь то, что они могут найтись позже.

4 Описание программной системы Размещение программного пакета предполагается на современных персональных компьютерах и ноутбуках, потому система разрабатывалась с учетом многоядерности процессорных архитектур. За счет распараллеливания вычислений удалось добиться значительного повышения производительности.

4.1 Компоненты программного пакета Программный пакет состоит из трех основных компонентов (рис. 3):

а) подсистема для поиска решений на основе данных о диаллельных скрещиваниях рекомбинантных инбредных линий и линий основателей;

б) подсистема для анализа на основе полного набора экспериментальных данных;

в) графический интерфейс пользователя.

Также используются две внешние библиотеки:

а) OpenCSV для работы с данными, представленными в виде последовательности значений, разделенных символом-сепаратором (Coma Separated Values).

б) ZThread – кросс-платформенная библиотека, которая содержит объектноориентированные обертки (wrapper) над примитивами синхронизации, специфичными для конкретной ОС.

4.2 Поиск решений на основе данных о диаллельных скрещиваниях На иллюстрации (рис. 4) изображена одна итерация описанного в пункте 5. алгоритма: из очереди с приоритетом извлекаются несколько лучших решений, из их соседей, а также случайных решений, формируются группы, расчет критериев адекватности внутри которых производится параллельно при помощи набора переиспользуемых потоков (thread pool).

Рисунок 4. Одна итерация алгоритма поиска адекватных решений на основе данных о диаллельных скрещиваниях.

На графике (рис. 5) представлены данные о скорости счета на компьютере с 16ГБ оперативной памяти на базе 4х ядерного процессора Intel Core i7 в зависимости от количества используемых потоков.

Рисунок 5. Зависимость скорости счета от количества используемых потоков для разных моделей. Зеленым обозначена двухлокусная модель, красным – трехлокусная, синим – четырехлокусная.

4.3 Поиск решений на основе объединенных экспериментальных данных Решения, выявленные на первом этапе поиска, далее проходят через набор фильтров (рис. 6), в которых используются объединенные экспериментальные данные. Вычисления для каждого решения в отдельности происходит независимо в отдельном потоке, что позволяет увеличить производительность системы на многоядерных компьютерах и компьютерах с поддержкой технологии гипертрединга (hyperthreading). Потоки являются переиспользуемыми (threadpool), количество одновременно используемых потоков задается параметрически.

Рисунок 6. Последовательность фильтров, используемых для отсечения неподходящих решений в объединенных экспериментальных данных.

4.4 Отладка и тестирование С использованием пакета Microsoft Excel было полностью просчитано большое количество решений. Сравнение с результатами работы системы производилось по всем используемым критериям. Вычисленные значения совпадают с точностью до 11 знака после запятой, что подтверждает корректность работы программы.

Также при внесении изменений в проект производилось перетестирование всех написанных ранее модулей при помощи автоматических тестов.

5 Тестирование Для тестирования и проведения машинных экспериментов в качестве сложного количественного признака был использован вес мозжечка у мышей. В диаллельных скрещиваниях анализ проводился на основе данных о 185 кроссах (1095 животных), в гибридах второго поколения – о 184 животных. Экспериментальный материал содержал данные о 13 рекомбинантных инбредных линиях. Использовалась четырехлокусная модель – минимальная, адекватно, с точностью до средовых шумов, описывающая межкроссную генотипическую изменчивость в диаллельных скрещиваниях рекомбинантных линий.

В результате проведения 1000 итераций перестановочного теста, была получена гистограмма распределения композитного критерия, представленная на рисунке 7.

Рисунок 7. Гистограмма распределение композитного статистического критерия.

Вертикальная линия – значение критерия для решения-чемпиона.

Переход к альтернативному способу определения генотипов модельных локусов, а также использование многомерного трехлокусного картирования взамен двулокусного, позволил выделить группу похожих решений представленных в таблице 2.

Таблица 2. Группа решений, адекватно, с точностью до средовых шумов, описывающих два набора экспериментальных данных. Различия в локусах подчеркнуты.

Распределение 1 0101101100100 0000101111000 аллелей 2 0101101100110 0000101111000 модельных локусов по 3 0101101100100 0010101111000 рекомбинантным 4 0101101100100 0000101111000 линиям Решение с наибольшим значением композитного статистического критерия обладает следующими свойствами (таблица 3):

Таблица 3. Решение и один из вариантов его сцепления.

Распределение аллелей модельных локусов по рекомбинантным линиям Хромосома сцепления Пары микросателлитных маркеров, с сцепление модельных локусов Позиция в центромеры, в cM) Количество рекомбинаций Заключение В рамках данной квалификационной работы был разработан программный пакет для анализа сложных количественных признаков в расширенных диаллельных скрещиваниях рекомбинантных линий и гибридах второго поколения линий основателей.

Разработанные в пакете аналитические процедуры в целом обладают мощными селективными свойствами. В частности, на примере анализа веса мозжечка у мышей на основе двух экспериментальных и комплиментарных наборов данных – расширенных диаллельных скрещиваний рекомбинантных линий и гибридов второго поколения линий основателей, из потенциально огромного множества возможных вариантов (приблизительно 1,88 1014 ) удалось выделить группу из 4х похожих решений. Данные варианты 4-локусных решений адекватно, с точностью до средовых шумов, описывают генотипическую изменчивость сложного количественного признака в двух экспериментальных базах данных. Кроме того, значения композитного статистического критерия для выявленных вариантов превосходят все значения, полученный в ходе выполнения перестановочных тестов, что свидетельствует о том, что данные варианты маловероятно получить путем случайного подбора параметров. Решения оказались также тесно сцепленным с 4-мя парами микросателлитных маркеров на генетической карте рекомбинантных линий, тем самым также установлены места локализации модельных локусов на генетической карте хромосом.

Разработанный программный пакет является мощным средством для генетической диссекции сложных количественных признаков, которые детерминируются системой генетических локусов с эпистатическими взаимодействиями. Следует отметить, что разработанный подход является оригинальным и не имеет аналогов в мировой литературе.

В будущем планируется проведение машинных экспериментов и расширение программного пакета за счет улучшения графического интерфейса пользователя.

Литература 1. Аксенович, Т. И. Статистические методы генетического анализа признаков человека.

2-е изд., перер. и доп. Новосибирск: НГУ, 2003. - 160 с.

2. Васильева, Л. А. Биологическая статистика. Учебное пособие. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2000. - 123 с.

3. Вучков, И. Прикладной линейный регрессионный анализ. М.: Финансы и статистика, 1987. – 239 с.

4. Глушков, В. М. Программное обеспечение ЭВМ МИР-1 и МИР-2. Том 2. Киев:

Наукова думка, 1976. - 371 с.

5. Дрейпер, Н. Прикладной регрессионный анализ. Пер. с англ. М.: Финансы и статистика, 1986. - 366 с.

6. Мазер, К. Биометрическая генетика. Пер. с англ. М.: Мир, 1985. - 464 с.

7. Мэйндональд, Дж. Вычислительные алгоритмы в прикладной статистике. Пер. с англ.

М.: Финансы и статистика, 1988. - 250 с.

8. П. Ф. Рокицкий. Введение в статистическую генетику. Минск, «Вышэйшая школа».

1974.

9. Кобзарь, А. И. Прикладная математическая статистика. Для инженеров и научных работников. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2006. - 816 с.

10. Осадчук, А. В. Генетическая диссекция сложных количественных признаков в диаллельных скрещиваниях рекомбинантных линий: мультигенный подход. Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (III Съезд ВОГИС), Москва, 2004, с. 18.

11. Фолконер, Д. С. Введение в генетику количественных признаков. М.: Агропромиздат, 1985. - 486 с.

12. Broman, Karl W. A Guide to QTL Mapping with R/qtl. New York: Springer-Verlag, 2009.

13. Haley, C. S. A simple regression method for mapping quantitative trait loci in line crosses using flanking markers. Heredity 69, 1992, pp. 315-324.

14. Neumann, P. E. Three-Locus Linkage Analysis Using Recombinant Inbred Strains and Bayes' Theorem. Genetics, Vol. 128: p. 631-638. 1991.

15. Osadchuk, A. V. A new look at the genetic dissection of complex quantitative traits in the extended RIX diallel cross: multilocus approach. P. 59.1-59.2. Complex Trait Consortium, 3rd Annual Conference, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA, 2004.

16. Osadchuk, A. V. Multiple-QTL approach with epistatic interactions to genetic dissection of quantitative traits in the composite experimental design consisting of extended RIX cross and F2 generation of their progenitors strains. 6th Annual Meeting of the Complex Trait Consortium, May 26-29, 2007, Braunschweig, Germany. Meeting Information and Abstract Book, p. 83.

17. Shirng-Wern, T. Quantitative trait mapping in a diallel cross of recombinant inbred lines.

DOI: 10.1007/s00335-004-2466-1, Volume 16, 344–355 (2005), Springer Science+Business Media, Inc. 18. Van der Veen, J. H. Test of non-allelic interaction and linkage for quantitative characters in generations derived from two diploid pure lines. Genetics, Vol. 30, No 3, 1959, pp. 201-232.

19. Zou, F. Quantitative Trait Locus Analysis Using Recombinant Inbred Intercrosses:

Theoretical and Empirical Considerations. DOI: 10.1534/genetics.104.035709, Genetics 170:

1299–1311 ( July 2005)