«НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П1080 от 24 августа 2009 г. Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Забайкальский ...»

Федеральное агентство по образованию

УДК 612.1 591.11 612.42 591.144

ГРНТИ 34.39.27 34.41.01

Инв. № П1080

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ

ОТЧЕТ

о выполнении 1 этапа Государственного контракта

№ П1080 от 24 августа 2009 г.

Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Забайкальский государственный гуманитарно-педагогический университет им. Н.Г. Чернышевского" Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.3.1 Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук.

Проект: Закономерности и механизмы развития сдвигов в системе гемостаза, ДВС-синдром и морфология органов при метаболическом ацидозе Руководитель организации: Катанаев Иван Иванович Руководитель проекта: Альфонсова Елена Вадимовна Чита 2009 г.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

по Государственному контракту П1080 от 24 августа 2009 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд Организация-Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Забайкальский государственный гуманитарно-педагогический университет им. Н.Г. Чернышевского" Руководитель темы:

кандидат медицин- Альфонсова Е. В.

ских наук, доцент Исполнители темы:

кандидат медицин- Бочкарникова Н. В.

ских наук, доцент без ученой степени, Забродина Л. А.

без ученого звания без ученой степени, Козовников В. А.

без ученого звания без ученой степени, Скипор А. И.

без ученого звания Реферат Отчет 90 с., 1 ч., 10 рис., 12 фото, 7 табл., 89 источн., 0 прил.

Метаболический ацидоз, лактат-ацидоз, рН, гемостаз, агрегация тромбоцитов, дзета-потенциал тромбоцитов, ДВС-синдром, морфология, иммунная система, сердце, печень, желудок В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 1 этапу Государственного контракта № П1080 "Закономерности и механизмы развития сдвигов в системе гемостаза, ДВС-синдром и морфология органов при метаболическом ацидозе" (шифр "НК-193П") от 24 августа 2009 по направлению "Фундаментальная медицина и физиология" в рамках мероприятия 1.3.1 "Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук.", мероприятия 1.3 "Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук и целевыми аспирантами в научно-образовательных центрах", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий." федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы.

Цель работы - Исследование особенностей пато- и морфогенеза ДВС-синдрома в различных регионах сердечно-сосудистой системы, нарушений структурной организации органов и тканей в условиях ацидоза в эксперименте и клинике.

Совершенствование методов лечения ацидотических состояний.

Методы исследования:

1. Методы исследования системы гемостаза 2. Методы исследования морфологического материала:

Забор материала у лабораторных животных выполняли под гексеналовым наркозом в контроле, и после введения 3% раствора молочной кислоты на 0,85% растворе хлорида натрия.

Фиксация, проводка и заливка материала для микроскопического исследования тканей осуществлялось по унифицированным методикам (Г.А.Меркулов, 1969).

Методы окрашивания морфологического материала для световой микроскопии:

гематоксилин-эозином, гемотоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизон.

Электронная микроскопия.

Статистическая обработка материала проводилась на ПЭВМ Pentium 5 с использованием пакета программ Microsoft Excel для операционной системы WindowsХР. Достоверность различий показателей в группах оценивали по величине t – критерия Стьюдента.

Инструментарий: Материалы и оборудование Микроскоп МББ-1 2. Микроскоп Биомед 6. 3. Шкаф сушильный 4. Весы лабораторные ВЛР 2005. Цифровая камера DCМ500 для использования с микроскопом6. Весы технические аптечные ВА-4М 7. Аквадистиллятор ДЭ-4 8. Фотоколориметр КФК-2 9. рН-метр стационарный pH 21110.

Центрифуга лабораторная СМ-12 11. Баня лабораторная TW-2 12. Электрокоагулограф Н-34413. Микротом санный "МС-2" 14. Термостат ТССПУ и т.д.

ГОСТ 7.32 – 2001 «Отчет о научно-исследовательской работе»

Персональный компьютер. Программное обеспечение.

Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Методические рекомендации. –М.: НьюДиамед, 2001.

Виды выполненных работ:

Составлен аналитический обзор по разделам:

1.1.Краткое описание кислотно-основного баланса, буферных систем организма и рН.

1.2.Метаболический ацидоз при различных патологических состояниях 1.3. Механизмы развития ДВС – синдрома при ацидозе 1.4.Морфология органов при ацидозе Разработан план проведения исследований.

3. Выполнено экспериментальное исследование I этапа.

Лактат-ацидоз создавали в/в капельным введением 3% растора молочной кислоты и под контролем рН различных сдвигов рН от 7,2 до 6,8 в опытах на животных.

Изучены закономерности и раскрыты некоторые механизмы развития ДВСсиднрома в условиях экспериментального лактат-ацидоза в различных регионах сердечно-сосудистой системы Описаны элементы морфогенеза ДВС-синдрома в зависимости от глубины и продолжительности ацидоза 4. Составлен промежуточный отчет по 1 этапу работ.

Содержание

Список сокращений

1. Введение

2. Основная часть

2.1. Аналитический обзор.

2.1.1.Краткое описание кислотно-основного баланса, буферных систем организма и рН................. 2.1.2. Метаболический ацидоз при различных патологических состояниях

2.1.3.Механизмы развития ДВС-синдрома при ацидозе.

2.1.4. Морфология органов и тканей при ацидозе.

2.2. Выбор и обоснование оптимального варианта направления исследования.

2.3. План исследования

2.4. Экспериментальное исследование I этапа

2.4.1. Методика экспериментальной модели лактат-ацидоза

2.4.2. Методы исследования системы гемостаза

2.4.3. Методы исследования морфологического эквивалента ДВС – синдрома и структуры органов пищеварения

2.5. Результаты экспериментального исследования 1 этапа

2.5.1. Влияние экспериментального лактат-ацидоза на показатели сосудисто-тромбоцитарного, гемокоагуляционного гемостаза и фибринолиз в различных регионах сердечно-сосудистой системы

2.5.1.1.Влияние молочной кислоты на показатели свертывания крови и фибринолиз в органах пищеварения в опытах in vivo.

2.5.1.2. Влияние лактат-ацидоза на гемостаз в общей циркуляции и в портальной системе кровообращения

2.5.1.3. Выделение тканевых факторов гемостаза из интактного изолированного сердца, при аноксии и ацидозе.

2.5.1.4. Влияние лактат-ацидоза на агрегацию и дзета-потенциал тромбоцитов.

2.5.1.5 Инструментальные методы исследования системы гемостаза при лактат-ацидозе.............. 2.5.2. Механизмы развития морфологического эквивалента ДВС – синдрома.

3. Заключение.

4. Список использованных источников

Список сокращений АГГ – антигемофильный глобулин АДФ – аденозин-5'-дифосфат АКТГ – адренокортикотропный гормон АМФ – аденозин-5'-монофосфат АТФ – аденозин-5'-трифосфат ДВС – диссеминированное внутрисосудистое свертывание ИБС- ишемическая болезнь сердца ИК – искусственное кровообращение КФК – креатинфосфокиназа КЩР – кислотно-щелочное равновесие ЛА – лактат-ацидоз ЛДГ – лактатдегидрогеназа МК – молочная кислота МИАКШ – мини-инвазивное аорто-коронарное шунтирование НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (окисленная форма) НАДФН + Н+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленная форма) ПВК – пировиноградная кислота ПДФ – продукты деградации фибрина ПКС - пороки клапанов сердца ТГС – тромбогеморрагический синдром ФАД – флавинадениндинуклеотид (окисленная форма) ФАДН2 – флавинадениндинуклеотид (восстановленная форма) ШИК – реакция – гистохимическое исследование для выявления гликогена в тканях и соединений белка с углеводами рН – стандартный водородный показатель 1. Введение Проблема тромбозов в артериях, венах, микроциркуляторном русле на сегодняшний день является одной из самых актуальных в современной медицине [57-62]. Артериальные тромбозы в коронарных сосудах являются основной причиной инфаркта миокарда, они же вызывают почти 90% нарушений мозгового кровообращения. Окклюзия микроциркуляторного русла в виде различных вариантов внутрисосудистого микросвертывания крови не имеет точной статистической оценки, хотя встречается при многих заболеваниях, сопровождающихся гипертонией, интоксикацией, сепсисом, нарушениями иммунитета и т.д. [5, 59, 60]. Поэтому внутрисосудистое тромбообразование – один из важных патологических процессов, требующий постоянного внимания со стороны исследователей и практических врачей [5].

В настоящее время появились многочисленные работы, в которых система гемостаза перестает рассматриваться изолированно, как мультиферментный каскад кровотока, а ее анализ переводится в плоскость взаимосвязей с другими системами организма [68, 84, 86, 87]. Вместе с тем, до сих пор нет окончательной ясности развития патологических процессов в различных органах при нарушениях кислотно-основного равновесия организма.

Одним из важных повреждающих факторов метаболизма является молочная кислота (МК), накопление которой приводит к сдвигу рН крови ниже 7,3 и развитию лактат-ацидоза(ЛА), впервые описанного Huckabee (1961). Влияние ацидоза на показатели гемостаза изучались многими исследователями [13, 30, 49, 52-55, 86]. Благодаря этому были выявлены основные закономерности изменения функции тромбоцитов, свертывания крови, фибринолиза, антикоагулянтной активности, развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови ДВС синдрома. Однако механизмы развития морфологического эквивалента ДВС синдрома при ацидозе различной глубины и продолжительности во многом остаются неясными. Влияние ЛА и сдвига рН в кислую сторону на морфологию органов и тканей, в том числе и на структурную организацию органов и систем организма также остается до конца неизученным. В литературе встречаются единичные работы, которые свидетельствуют о морфологических изменениях в различных органах и тканях при метаболическом ацидозе [3, 52-55, 85, 89].

Цель проекта в целом. Исследование особенностей пато- и морфогенеза ДВС-синдрома в различных регионах сердечно-сосудистой системы, нарушений структурной организации органов и тканей в условиях ацидоза в эксперименте и клинике. Совершенствование методов лечения ацидотических состояний.

Цель исследования 1 этапа. Исследование особенностей пато- и морфогенеза ДВСсиндрома в различных регионах сердечно-сосудистой системы.

Объект исследования: Закономерности и механизмы развития ДВС-синдрома в условиях метаболического ацидоза Задачи экспериментального исследования 1 этапа:

1. Изучить изменения в системе гемостаза (сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, свертывание крови и фибринолиз) в различных регионах сердечно-сосудистой системы при экспериментальном лактат-ацидозе.

2. Сопоставить характер изменения показателей гемокоагуляционного гемостаза в различных регионах сердечно-сосудистой системы при ацидозе.

3. Исследовать механизм возникновения морфологического эквивалента ДВС-синдрома в связи с нарушением структуры эндотелия сосудов и попаданием в микроциркуляторное русло субклеточных фракций, которые обладают преимущественно тромбопластической активностью.

Научная новизна.

Впервые показано, что прохождение крови через печень изменяет ее гемокоагуляционные свойства, направленные на коррекцию процессов гемостаза. На показатели свертывания крови оказывает влияние не только изменение кислотно-основного равновесия, но и попадание субклеточных фракций в микроциркуляторное русло в результате разрушения цитоплазматических мембран эндотелиоцитов. Все это ведет к развитию ДВС-синдрома.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ДВС-синдром и его морфологический эквивалент развиваются не только под влиянием метаболического ацидоза, но также связаны с морфологическими нарушениями эндотелиоцитов, микровезикуляцией эндотелия, изменениями соединительнотканного матрикса и структуры клеток при ацидозе. Между глубиной и продолжительностью ацидоза и неспецифическими морфологическими изменениями в тканях имеется тесная взаимосвязь. При рН 7,2-7,0 наблюдается выраженная гиперкоагулемия, которая сменяется коагулопатией потребления, в результате снижения рН с 7,0 до 6,5. В кровеносном русле появляются продукты деградации фибрина, а уровень фибриногена снижается более чем в два раза. Ацидоз приводит к снижению дзета-потенциала тромбоцитов, к их взаимному склеиванию и оседанию в микроциркуляторном русле, что приводит к тромбоцитопении в общей циркуляции. В сосудах всех органов при рН 7,2 обнаруживаются преимущественно сладжи эритроцитов (80-90%). При дальнейшем сдвиге рН в кислую сторону, процентное соотношение сладжей и тромбов изменяется. Нарастание глубины и продолжительности ацидоза (рН 7,0-6,5, экспозиция 60-180 минут) ведет к увеличению частоты тромбирования артериальных и венозных сосудов (тромбы обнаруживаются в 90-100% случаев).

Полученные нами данные имеют не только теоретическое, но и практическое значение, так как могут быть использованы в клинической практике при оценке патологических процессов, возникающих при некомпенсированном ацидозе.

2.1. Аналитический обзор.

2.1.1.Краткое описание кислотно-основного баланса, буферных систем организма и рН.

Повреждение структуры клеток, межклеточного вещества, тканей и органов, сопровождающееся нарушением их жизнедеятельности, является, как правило, результатом расстройства метаболических регуляций. Ведущей причиной, вызывающей дистрофические нарушения, является снижение окислительных процессов и внутриклеточного дыхания, приводящие к накоплению в тканях протонов и к развитию ацидоза. Продукты анаэробного метаболизма, вызывающие ацидоз, представляют реальную опасность для организма, так как способны не только нарушать функцию, но и приводить к морфологическим изменениям в различных органах и тканях. Накопление молочной кислоты, известной в качестве крупного донора протонов, изменяет гемостатические и реологические свойства крови, усиливает гипоксию тканей и уменьшает функцию энергообразования в клетках, вследствие разобщения гликолиза и цикла Кребса, снижает ресинтез АТР и ведет к увеличению энтропии в организме. В этих условиях особое значение приобретает исследование взаимосвязи между ацидозом, гемостазом и изменением морфологии органов, для понимания динамики патологического процесса при различных заболеваниях [65].

Изменение концентрации ионов водорода в среде сопровождается многочисленными сдвигами: изменяется насыщение протонакцепторных группировок в молекулах органических веществ; сродство между субстратом и ферментом и активность образуемого ими комплекса; стабильность структур макромолекул (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов), величина онкотического давления; диссоциация и растворимость многих веществ; направленность и выраженность окислительно-восстановительных реакций, непременным участником которых является сам протон; стабильность золей, составляющих биологическую среду; возбудимость и специфические эффекты клеток [8].

Нормальная концентрация протонов в клетке составляет 100-104 миллионных долей моля (наномолей на литр – нМ/л), а во внеклеточной среде – около 40. Однако, концентрация водородных ионов оценивается не в этих единицах, по величине «водородного показателя» (рН), т.е. через отрицательный десятичный логарифм величины, выражающий концентрацию протонов в М/л чески несовместимы с жизнью. Изменение рН на одну единицу соответствует изменению концентрации водородных ионов в растворе в десять раз.

В строго нейтральном растворе при температуре 25 0 всего одна молекула из 10 миллионов молекул воды находится в ионизированном состоянии, т.е. 1 10-7 М.

Значение 7,0 для рН строго нейтрального раствора – это не случайно выбранная цифра; оно получено из численного значения ионного произведения воды при 25 0С. Растворы имеющие рН больше чем 7, являются щелочными, поскольку концентрация ОН - в таких растворах больше концентрации ионов Н+. И наоборот, растворы, имеющие рН меньше 7, - это кислые растворы [50].

Основным акцептором водорода, образующим с ним наиболее стойкую и сравнительно безопасно транспортируемую форму - воду, является кислород. Он доставляется из внешней среды с участием механизмов, контролирующих вентиляцию легких, кровообращение, обратимое связывание кислорода в эритроцитах, его диффузию через интерстициальное пространство к клеткам и активирование в митохондриях.

Кроме кислорода существуют несколько промежуточных акцепторов протоновдегидрогеназы, активные группы которых представлены никотинаденин-динуклеотидом (НАД), никотинаденин-динуклеотидфосфатом (НАДФ), флавинаденин-динуклеотидфосфатом (ФАД), содержащимися в гиалоплазме, в митохондриях и осуществляющими конвейерную передачу протона к акцепторам: к кислороду и для синтеза АТФ. При недостатке акцепторов эти же ферменты либо полностью насыщаются протонами и прекращают свои дегидрогеназные функции, либо переносят протоны на способные их принять субстраты смежных метаболических путей. Последние выполняют роль протоновых мешков или шунтов.

Наиболее изученным из протоновых мешков является лактатный, способный «раздуться» с 1 до 7 мМ/л, депонируя при этом около 100000 смертельных избытков протонов, или их 11-17 минутную продукцию. Роль протоновых шунтов могут выполнять a-глицерофосфатный, акетоглуторатный и аммиактранспортные глутамат-глутаминовые челноки. Превращения в них сопровождаются освобождением дегидрогеназ от водорода с реактивизацией их способности связывать протоны. Это особенно важно для внемитохондриальной НАД-дегидрогеназы, контролирующей участок окисления глицерина и углеводов, сопряженный с анаэробным синтезом АТФ. Все эти реакции подчинены основному принципу - максимально, насколько позволяет субстратный запас, разгрузить основной энергодающий метаболический путь.

В компенсации сдвигов рН всегда участвует внеклеточное пространство. Именно сюда из клетки поступают недоокисленные продукты обмена. В процессе водообмена кислые продукты разносятся по всему организму и перераспределяются в зоны с малой собственной продукцией протонов. В этом отношении значительной катионадсорбционной способностью обладает основное вещество соединительной ткани и коллагеновая сеть. Буферные свойства соединительной ткани могут существенно изменяться.

В стабилизации кислотно-щелочного состояния и в транспорте конечных продуктов обмена к выделительным органам решающее значение придается буферным системам. Они называются еще и транспортными буферными, поскольку истинное назначение этих систем не в коррекции КЩР, которое недостижимо без участия выделительных систем, а именно в смягчении (буферировании) этих нарушений на этапе транспортировки. Тем самым подразумевается их зависимость от состояния гидродинамики и выделительных органов. Это необходимо для разгрузки магистральных путей метаболизма.

Благодаря многочисленным исследованиям [2, 9, 10, 67, 76, 80] было показано, что у всех живых организмов внутриклеточные и внеклеточные жидкости имеют характерную и постоянную величину рН, которая поддерживается с помощью различных биологических систем. Эволюционное развитие привело к формированию в организме нескольких систем, которые служат для сохранения кислотности жидкостей тела в пределах узкого диапазона, регуляция рН обнаруживается у всех исследованных до сих пор организмов. Это позволяет управлять клеточными биохимическими процессами, так как клеточные катаболические энзимы сильно подвержены изменению кислотно-основного равновесия. Например, увеличение рН от 7,1 до 7,2 активность ключевого фермента, регулирующего скорость гликолиза, фосфофруктокиназы изменяется в 20 раз [2].

Источником кислоты и щелочи в организме являются химические реакции, в результате которых продуцируются или поглощаются протоны. Нейтральные растворы содержат ионы равное количествоН+ (Н3О+) и ОН-. Для чистой воды при температуре 250 С, Таким образом, для нейтральных растворов, Концентрация [Н+] для нейтральной среды при температуре 370 С составляет 10-6,8 мольл-1. Концентрация [Н+] в кислых растворах выше, чем в нейтральных, т.е. приблизительно 10-6 ммоль/л. А в щелочных ниже, чем в нейтральных и составляет 10 -8ммоль/л. Кислоты являются донорами протонов, а основания их акцепторами.

Концентрация водородных ионов в большинстве растворов очень мала, поэтому для обозначения концентрации водородных ионов удобный способ представляет шкала рН. Термин рН определяется выражением:

где, [H+] в моль/л. Типичные значения внеклеточного рН в организме человека составляет 7,4 (в пределах 7,36 – 7,44), а внутриклеточного рН 7,0 – 7,2.

Сильные кислоты полностью ионизированы на Н+ или (Н3О+) и анион А+ в разбавленных водных растворах. Например, HCl при добавлении к нейтральному раствору воды полностью диссоциирует на H+ и Cl- ионы. Слабые кислоты только частично диссоциируют в нейтральном растворе. Например, при добавлении уксусной кислоты в нейтральный раствор воды, часть ее диссоциирует на H+ и СН3СОО- ионы, а основная часть присутствует в недиссоциированной форме как СН3СООН.

Растворы слабых кислот могут быть использованы для восстановления или буферирования изменений Н+ образующиеся при добавлении кислот и щелочей. В организме поддерживается относительное постоянство кислот и оснований в различных средах - в крови, тканевой жидкости, лимфе и цитозоле. Для понимания как работают буферные системы, рассматриваются растворы слабых кислот, НА, и их соли, А-. Равновесие между НА и А- может быть представлено следующим выражением:

где k1 и k2 являются константами.

Из закона действующих масс получается равновесие, или где K = k2/k1 есть константа диссоциации кислот.

В логарифмическом выражении (при основании 10) получается Уравнение (1.9) является уравнением Хендерсона – Хессельбаха, которое можно использовать для исследования буферных систем крови. В закрытой системе суммарное количество присутствующего буфера В является константой, т. е.

где В является константой. Таким образом, уравнение (1.9) может быть переписано как:

или где = [A-]/B является долей (частью) буфера присутствующего в его основной форме [А-].

При добавлении кислоты к буферной системе происходит снижение фракции буфера в форме [A-], и повышение фракции НА, потому что происходит реакция присоединения Н+ к А- с образованием НА. При этом рН раствора изменится только при добавлении к раствору значительных количеств ионов. Доказан факт, что буферные системы наиболее эффективно работают, если их константа диссоциации рК близка к рН раствора. Более подробно эти процессы описаны в руководствах [50].

Буферные системы в различных средах организма могут быть представлены следующим образом:

В крови:

В плазме крови: слабые кислотно/основные протеины; бикарбонаты; неорганические фосфаты.

В эритроцитах: гемоглобин; бикарбонаты; неорганические и органические фосфаты.

В тканевой жидкости: такие же как и в крови, за исключением, гемоглобина.

Во внутриклеточной жидкости: протеины; бикарбонаты; органические и неорганические фосфаты.

В моче: неорганический фосфат, бикарбонат, аммиак.

Фосфатный буфер.

В уравнении (1.13) приведена схема работы фосфатного буфера.

который имеет рК=6,8. В норме в крови [НРО42-]=1,04 ммоль/л и [Н2РО42-]=0,26 ммоль/л. Применяя уравнение Хендерсона-Нессельбаха (1.9): [A-]=1,04ммоль/л и [HA]=0,26ммоль/л мы имеем:

т.е., нормальный рН крови.

Если добавить в буферный раствор содержащий эти концентрации НРО42- и Н2РО42-, скажем 0, ммоль/л Н+(т.е.сильной кислоты НСl), то в отсутствии фосфатного буфера, абсолютная концентрация Н+ изменится следующим образом:

В данном случае рН=3,9998 – это уровень рН несовместим с жизнью. Присутствие буферных систем совершенно меняет ситуацию: когда добавляют Н+, основное большинство протонов реагируют с НРО42- с образованием Н2РО42-. Таким образом, концентрация НРО42- понижается приблизительно на 0,1 ммоль/л до 0,94 ммоль/л и Н2РО42- возрастает на туже величину до 0, ммоль/л. Новое значение рН может быть рассчитано из уравнения Хендерсона-Хессельбаха (1.9):

([H+] – 61 нмоль/л). Таким образом, показано, что буферная система смягчает изменение уровня рН с 3,4 до 0,2 единиц. В этих расчетах все добавленные протоны вступили во взаимодействие с НРО42-. Конечно, нельзя сказать, что рН совсем не изменился. Однако, непрореагировавшая часть протонов очень мала, 21 нмоль/л (61-40 нмоль/л) из 100,000 нмоль/л, и ею можно пренебречь в расчетах рН по уравнению Хендерсона-Хессельбаха. Такое количество допустимо для эффективной работы буферной системы.

Бикарбонатная буферная система В уравнении (1.14) приведена схема работы бикарбонатного буфера.

Это более сложная буферная система, чем фосфатная, потому что здесь происходит взаимодействие двух реакций. Работа этой системы зависит от снижения концентрации СО 2 в крови посредством удаления через легкие или выделения НСО3- почками. На данный момент, мы проигнорируем снижение СО2 или удаление НСО3-.

Когда СО2 контактирует с водой определенное количество углекислого газа находится в растворенном состоянии, о чем свидетельствует уравнение:

Эта реакция протекает медленно в простых растворах, но скорость ее значительно возрастает при участии фермента карбоангидраза в эритроцитах. Согласно закону сохранения масс:

или угольная кислоты диссоциирует с образованием конечных продуктов Н+ и НСО3-.

Используя закон действующих масс можно получить:

где К1 является константой равновесия, и составляет около 10 -3.2 moll-1 (т.е. рК1 = 3.2). Физиологическое рН внеклеточной жидкости составляет 7.4, преобразуя уравнение (1.33) получается:

Ясно, что Н2СО3 сильная кислота, потому что она полностью диссоциирует в воде.

Мы можем получить отношение между рН и [CO2], если убрать [H2CO3] из уравнений (1.17) и (1.19), а затем их умножить:

где Кapparent = 10-2.9 x 10-3.2 moll-1 = 10-6.1, т.е. константа диссоциации Кapparent= 10-6,1ммоль/л. Уравнение (1.21) может быть преобразовано для уравнения (1.9) и даст уравнение Хендерсона – Хессельбаха для бикарбонатной буферной системы:

где рКарр= 6,1.

Концентрация растворенного СО2 пропорциональна парциальному давлению СО2 (РСО2).

Для артериальной крови РСО2 в норме соответствует уровню СО2 в альвеолах это 5,22кРа (или ммРт в традиционных единицах: 1 ммРт = 133 паскаля = 0,133 кРа). Константа отношения [CO2] в ммоль/л к РСО2 это константа растворимости. Это значение 0,225 ммоль/л kPa (или 0,03 ммоль/л ммРт). Таким образом, [CO2] будет 0,2255,33=1,2 ммоль/л. [HCO3-] в артериальной крови составляет 23,94 ммоль/л. (учитывая это значение рН из уравнения (1,22) будет 7,4). Концентрация угольной кислоты в крови очень мала: преобразовав уравнение (1.20) мы получим:

Эффективный рК этого буфера 6,1, это отличается более чем на одну единицу рН от нормального рН плазмы, и незначительно отличается от внутриклеточного рН эритроцитов, казалось бы, это не позволяет рассчитывать на хорошие буферные свойства Однако, если добавить 0,1 ммоль/л протонов в раствор содержащий бикарбонатный буфер в концентрации такой же как и в крови, то Н+ вступят во взаимодействие с НСО3- с образованием СО2.

Концентрация [НСО3-] понизится с 23,94 до 23,84 ммоль/л и [CO2] возрастет до 1,3 ммоль/л (не будем брать в расчет удаление СО2 легкими). Таким образом, новое значение рН будет т.е. буферное действие бикарбонатного буферной системы позволяет нивелировать изменения рН в 3,4 (7,4 – 3,9998) единиц до 0,04 (7,4 – 7,36) единиц. Несмотря на то, что рК буферной системы достаточно отличается от физиологического рН плазмы, хорошее буферное действие этой системы обусловлено высокой концентрацией в крови НСО3-, если бы концентрация бикарбонатной буферной системы в крови была, к примеру, в 10 раз меньше, то изменения рН оставили бы 0, единиц, т.е. рН =7,12.

В организме бикарбонатная буферная система работает гораздо эффективней, т.к. концентрация СО2 в крови поддерживается на постоянном уровне благодаря усилении вентиляции легких. Таким образом, окончательное значение рН, если [CO2] постоянна и равна 1,2 ммоль/л, будет т.е. понизится только на 0,002 единицы.

Буферное действие белков, в общем, и гемоглобина в частности.

Из всех белков наилучшими буферными свойства обладает гемоглобин, потому что его молекула содержит большое число кислотных и основных групп с константой диссоциации около физиологического уровня. Например, карбоксильные группы аминокислот диссоциируют следующим образом:

R COOH R COO H

Конечные аминогруппы:

Сульфгидрильные группы цистеина:

R SH R S H

Имидазольный буфер Имидазольные группы вносят особенно большой вклад в буферные свойства гемоглобина в крови. Когда [H+] повышается в крови, эти группы присоединяют Н +, тем самым, уменьшая изменения рН. (Заметим, что все эти группы должны быть на наружной поверхности белка, доступными для раствора, для буферного действия). Хотя концентрация гемоглобина в крови не высокая (150 г/л, с молекулярным весом 64458, получается концентрация 2,33 ммоль/л) его действие как буфера наиболее эффективно чем, скажем, фосфатного буфера, потому что он имеет больше буферных групп в молекуле. Различные буферные группы гемоглобина имеют различную константу диссоциации рК (от 6,5 до 7,8), таким образом, буферное действие гемоглобина (других белков) не может быть охарактеризовано с помощью уравнения Хендерона-Хессельбаха, как для предыдущих простых буферных систем. Однако, с помощью титрования раствора гемоглобина Hb кислотой, эмперическим измерением, может быть определена его буферная емкость. Для оксигемоглобина (HbO2) при физиологическом рН добавление в раствор 0,1 ммоль/л Н + содержащий 2, ммоль/л Hb (оксигенированный, Т=37оС, парциальное давление СО2 5,19 кРа или 39 ммРт) произойдет изменение рН на 0,0015 единиц.

Буферные мощность компонентов крови.

В предыдущих вычислениях мы рассказали, как различные буферные системы крови ограничивают изменения рН при добавлении в кровь определенного количества (0,1 ммоль/л) протонов. Результаты этих вычислений представлены в таблице 1.

Таблица 1. Изменение буферной силы компонентов крови при поступлении 0,1 ммоль/л Н+.

без выведения избыточного количества СО с выведения избыточного количества СО Другие белки крови и органический фосфат эритроцитов вносят небольшой вклад в общую буферную емкость крови. В крови все буферные системы работают совместно, для того чтобы максимально уменьшить изменения рН.

В течение короткого времени, до того как легкие удалят избыток СО2, наиболее важное буферное действие оказывает гемоглобин. Следующей по степени важности является бикарбонатная буферная система, а фосфатная буферная система вносит наименьший вклад.

Эффективность бикарбонатной буферной системы крови значительно повышается при поддержании [СО2] на постоянном уровне в артериальной крови. Контроль за содержанием СО2 в крови осуществляется органами выделения – легкими и почками. Ежедневно около 330 литров ки около 50 ммоль (максимум – 600 ммоль) Н+.

Для поддержания рН крови на постоянном уровне (около 7,4) альвеолярная вентиляция изменяется в зависимости от количества образовавшегося СО 2 в процессе метаболизма. Грубо говоря, концентрация СО2 в крови обратно пропорциональна альвеолярной вентиляции. Фактически легочная вентиляция может быть снижена до 0 или увеличена в 10 раз больше нормы, в зависимости от необходимости для удаления избыточной концентрации СО 2 и поддержания [CO2] на постоянном уровне. Изменения в крови [CO2] и рН влияют на дыхание, воздействуя на хеморецепторы мозга. Это происходит при прямом воздействии Н + на хемочувствительные нейроны головного мозга. Однако, СО2 тоже оказывает косвенный эффект через образование протонов при взаимодействии с водой. Фактически, повышение концентрации СО2 в артериальной крови оказывает большее влияние на легочную вентиляцию, чем артериальный рН, т.к. СО2 легче проходит через гематоэнцефалический барьер, чем Н+, где преобразуется в угольную кислоту, и образовавшиеся при этом Н+ стимулируют хеморецепторы. Нейроны посылают сигнал в дыхательный центр, в результате чего повышается темп и глубина дыхания. Повышение легочной вентиляции приводит к выделению большего количества СО2 из организма и снижению [CO2] и [H+] в артериальной крови [47].

С помощью альвеолярной вентиляции контролируется также уровень О2 в артериальной крови. Когда парциальное давление О2 артериальной крови падает ниже 11кРа (80 мм рт. ст.), возрастает активность хемочувствительных нейронов каротидных телец (в области сонной артерии) и аорты (в области дуги аорты), которые посылают импульсы в дыхательный центр, тем самым увеличивая темп и глубину дыхания. Высокая концентрация [CO2] и [H+] в крови также оказывает эффект на периферические хемочувствительные нейроны, но незначительно в сравнении с их влиянием на мозговые хеморецепторы.

Каким образом с помощью легочной вентиляции осуществляется коррекция [CO2] и [H+] в крови без значительного снижения поступления О 2 в ткани? Ответ на этот вопрос в том, что парциальное напряжения О2 в альвеолах в норме очень высоко и гарантирует 100% насыщение гемоглобина кислородом. Если альвеолярная вентиляция снижается на 50% от нормальной, гемоглобин, проходя через легкие насыщается кислородом на 90%, т.к. кривая диссоциации гемоглобина сдвинута в сторону насыщения О2. Итак изменение легочной вентиляции более влияет на выделение СО2, чем на изменение концентрации О2. В дополнении к этому, важное место в регуляции напряжения кислорода в крови, имеют местные рефлексы в легких, которые поддерживают баланс между вентиляцией и перфузией крови в различных полях легких [2, 30, 47] При физических нагрузках потребление О2 и продукция СО2 увеличивается в 20 и более раз, и альвеолярная вентиляция значительно повышается для выделения избыточного количества СО2 во избежание развития ацидоза. Однако, в данном случае, повышение легочной вентиляции в значительной степени осуществляется за счет других механизмов, и в меньшей степени за счет механизмов описанных выше. При физических упражнениях дыхание усиливается в результате поступления информации в дыхательный центр со стороны коры головного мозга, и от рецепторов суставов, мышц и сухожилий при движении конечностей.

С помощью только легочной вентиляции невозможно полностью скорректировать изменения рН крови. Почки также способствуют регуляции рН, благодаря экскреции Н + с мочой и реабсорбции НСО3- в клубочковый фильтрат. Роль почек в регуляции рН крови менее значима чем легких, но в течение более длительного времени (более трех дней) они могут полностью восстанавливать отклонения рН крови до нормальных значений [2].

Нарушение механизмов, регулирующих величину рН, возникающее при различных патологических состояниях, может приводить к падению рН плазмы крови до величины 6,8 и ниже. Следует учитывать, что изменение рН влияет на многие структурные и функциональные свойства клетки, однако к изменения рН особенно чувствительна каталитическая активность ферментов. В связи с этим особое значение приобретает исследование значений внутриклеточного показателя концентрации водородных ионов. До последнего времени не было точного представления о рН цитоплазмы клеток. Однако благодаря исследованиям [5, 9, 10] этот вопрос успешно был решен.

Были исследованы гомогенаты тканей, однако этот метод не дает точных данных. Более точные данные были получены благодаря применению внутриклеточных рН индикаторов, ядерный магнитный резонанс и микроэлектроды, чувствительные к изменению рН. Посредством этих методов было показано, что в норме, внутриклеточный рН колеблется от 7,0 до 7,4. Например, при температуре 200С в мышце рН составляет 7,27, а при 370С равно 7,0. В настоящее время известны основные буферные системы клетки и механизмы регуляции кислотно-основного состояния внутриклеточной среды. Эти механизмы во многом аналогичны характеру поддержания рН внеклеточных жидкостей. Поэтому мы не будем подробно на них останавливаться.

Следует отметить, что при различных патологических состояниях рН внутриклеточной среды подвержено значительным колебаниям. Например, при ишемии скелетных мышц у кроликов в течение 4 часов рН снижается до 6,6 – 6,4 [2].

В компенсаторной стадии выявляются субнормальные значения рН (7,35-7,3), снижение содержания буферных оснований и бикарбоната с компенсаторной гиперкапнией. По мере нарастания декомпенсации увеличивается разрыв между сдвигом в содержании буферных оснований и углекислого газа с прогрессивным падением рН. При глубокой декомпенсации концентрация углекислого газа в крови оказывается нормальной или повышенной, рН снижается ниже 7,2. Нарушение механизмов в регуляции кислотно-основного равновесия при различных патологических состояниях может приводить к снижению рН до 6,8 и ниже, что приводит к необратимым последствиям и смерти.

Величина рН влияет на многие структурные и функциональные свойства клетки. Особенно чувствительна к сдвигам рН в кислую сторону каталитическая активность ферментов, так как оптимум рН для активности ферментов имеет строго определенные пределы. Таким образом, постоянство рН в клетках и жидкостях организма имеет исключительно важное значение для всех аспектов метаболизма и клеточной активности.

Несмотря на низкую концентрацию протонов в жидкостях организма, они оказывают существенное влияние на структуру и функции биологических мембран. Даже слабые сдвиги рН сильно влияют на скорость метаболических процессов и стабильность белков. Поэтому все живые организмы поддерживают постоянство этой величины на определенном уровне. Это, прежде всего, связано с химическими превращениями имидазольной группы гистидина и поддержания стабильности протонированного состояния имидазольной группы. РК имидазольной группы гистидина при 25о близка к 7 и зависит от того, какие аминокислоты соединяются с гистидином в молекуле белка [2]. Такой принцип регуляции рН получил название “альфа-статной регуляции “. Этот механизм состоит в поддержании постоянной величины имид. Величина имид для внутриклеточной жидкости составляет около 0,55, а для крови - около 0,85. При нормальных значениях рН имидазольные группы гистидина протонированы примерно наполовину. Поэтому эти группы могут обратимо присоединять или отщеплять протоны. Важную роль имидазольные группы гистидина играют при взаимодействии лактатдегидрогеназы с субстратами - пируватом и лактатом для поддержания окислительно-восстановительного равновесия при ограниченном доступе кислорода.

ЛДГ в анаэробных условиях присоединяет молекулу пирувата и восстанавливает ее до лактата, если имидазольная группа находится в полупротонированном состоянии. Остатки гистидина принимают участие в активных центрах многих ферментов и катализируют реакции в прямом и обратном направлениях. Поэтому их полное протонирование или депротонирование может препятствовать обратимости реакций. Поддержание рН на уровне обратимости химических реакций имеет одно из важных значений [2, 38, 47]. Структурная организация белков может изменяться в зависимости от рН вплоть до их денатурации. Например, ключевой фермент гликолиза фосфофруктокиназа скелетной мышцы зависит от структурных и кинетических параметров, вызываемых небольшими смещениями рН (от 0,1 до нескольких десятых единицы). При сдвиге рН в кислую сторону он утрачивает стабильность и распадается на неактивные димеры, что приводит к снижению гликолиза в клетке. Буферные свойства внутриклеточной жидкости определяются, главным образом гистидином [2, 47].

Буферные дипептидазы – карнозин, ансерин и офидин- содержат гистидин, это обусловлено их небольшой реакционной способностью и рК, близким к оптимальному рН цитозоля. Второй буферной системой является неорганический фосфат, но он участвует в фосфорилировании белков. Поддержание рН и имид в определенных биологических пределах создает благоприятные условия для ионизации промежуточных продуктов [2]. Заряженные частицы легче удерживаются в клетке, чем незаряженные (например, фосфорилирование глюкозы в гексокиназной реакции позволяет сохранить ее в клетках печени).

Известно, что в анаэробных условиях основным метаболическим «топливом» являются углеводы, в основном гликоген, который в небольших количествах находится во всех тканях, большая его часть депонируется в печени. В условиях гипоксии или аноксии (при недостатке кислорода) потребление глюкозы возрастает (эффект Пастора). Это связано с низкой эффективностью анаэробного гликолиза. При окислительном фосфорилировании выход АТР составляет около моль на 1моль окисленных глюкозильных групп гликогена, а в анаэробных условиях всего 3 моль АТР при гликогенолизе.

Накопление значительных количеств конечных продуктов обычно приводит к сдвигам рН, нарушениям метаболизма, неконтролируемым процессам и к закислению внутриклеточной среды.

Протон является одним из важнейших продуктов клеточного метаболизма, участвующих в аэробном обмене.

При основном обмене человек весом 70 кг потребляет 700 ммоль О 2 в час, при этом образуется за сутки около 150 г ионов Н+. Это количество протонов расходуется в процессах окислительного фосфорилирования, так как расход ионов Н+ тесно коррелируется с ресинтезом АТР и окислением восстановленных компонентов электрон-транспортной системы. Благодаря такому балансу величина рН при аэробном метаболизме остается неизменной [9, 10]. При анаэробном метаболизме работа этой тщательно сбалансированной системы нарушается. На стехиометрию образование протонов значительную роль оказывает величина рН, концентрация свободных ионов Mg2+ и наличие глюкозы или гликогена. Эти процессы тканеспецифичны, а также зависят от функционального состояния различных органов. Следует так же учитывать, что при сдвиге рН крови в щелочную сторону гликолиз, приводящий к образованию АТР из АDР и фосфата (Pi) не приводит к накоплению ионов Н+:

Глюкоза + 2ADP3–+ 2HPO42– 2лактата1–+ 2Н2О+ 2АТР4–.

При значительных сдвигах рН в кислую сторону, реакция протекает с накоплением протонов:

Глюкоза + 2ADP3–+2Н2РО42– 2лактат1–+ 2НАТР3–+ 2Н+ +2Н2О.

Кроме того, накопление протонов связано с ионами Mg2+, величиной рН и природой сбраживаемого субстрата – глюкозы и гликогена. Поскольку величина рН, концентрация ионов Mg2+ и содержание глюкозы и гликогена в клетках различных органов неодинаково, то процессы накопления протонов в результате фосфорилирования будут тканеспецифичными. Если концентрацию ионов Mg2+ принять постоянной, то при понижении рН выход Н + на 1 моль сбраживаемой глюкозы будет нарастать. В результате сбраживания гликогена до лактата (стехиометрия этого процесса иная, так как отсутствует гексокиназная реакция, гликоген является фосфорилированным соединением) сопровождается потреблением ионов Н+ при рН, близком к нейтральному.

Гидролиз АТР при расходовании энергии для различных нужд клетки, до ADP, Pi и ионов Н+ имеет свою закономерность. Повышение рН увеличивает продукцию Н+ при гидролизе АТР и уменьшает при гликолизе. Эти закономерности имеют фундаментальное значение, так как они сопряжены между собой, поэтому их нужно рассматривать не изолированно друг от друга, поскольку один процесс идет с образованием ионов Н+, а другой с их потреблением.

Восстановление метаболического гомеостаза после гипоксии, аноксии и ацидоза осуществляется несколькими путями:

окисление лактата в местах его образования;

превращение в гликоген (глюконеогенез);

перенос в печень, почки и превращение в гликоген (цикл Кори).

2.1.2. Метаболический ацидоз при различных патологических состояниях В литературе последних лет значительное место занимают вопросы изучения лактатацидоза. Впервые он был описан W.E.Huckabee в 1961 году как синдром, характеризующийся резким увеличением концентрации молочной кислоты в крови (до 26 ммоль/л). С этого времени постоянно растет число исследований, посвященных ЛА. К настоящему времени известны обзоры по различным аспектам ЛА [4, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16,17, 32, 33, 56]. Этот интерес, не угасающий в течение многих лет, объясняется до конца неизученным патогенезом ЛА, его неожиданным развитием и малой эффективностью терапии. Если дыхательные нарушения можно компенсировать адекватной искусственной вентиляцией, то проблема коррекции метаболического ацидоза и, в частности, лактат-ацидоза, остается до сих пор нерешенной окончательно, и дискутируется в многочисленных работах [8, 12, 43, 45, 56, 70].

Определение ЛА, казалось бы, ясно: это нарушение кислотно-основного равновесия, вызванное накоплением в организме молочной кислоты. Однако количественные критерии этого состояния оцениваются по-разному. Так, [12, 14] считают, что диагноз ЛА может быть установлен, если концентрация МК превышает 7 ммоль/л, при этом состояние с содержанием МК ниже ммоль/л следует называть гиперлактацидемией; [126] – если количество МК 5 и более ммоль/л;

[67] – если уровень МК выше нормального (1,3 ммоль/л) и рН (с коррекцией к рСО2 40 мм.рт.ст.) ниже 7,36 в артериальной крови. Применительно к практике анестезиологии и реаниматологии целесообразно относить к лактат-ацидозу состояния, сопровождающиеся значительным (более ммоль/л) увеличением МК [85].

Применяя метод прямого измерения интрамиокардиального рН во время сердечнолегочной реанимации, было установлено, что даже короткий период остановки сердца, вызванный фибрилляцией, характеризуется глубоким ацидозом миокарда – после 5 минут остановки сердца, когда рН артериальной крови все еще остается нормальным, а смешанной венозной составляет 7,26, интрамиокардиальный рН снижается до 6,95 [6].

В настоящее время распространена клиническая [67] классификация молочнокислого ацидоза, согласно которой, различают 2 типа ЛА: А – при клинически выраженной гипоксии и В – не связанной с гипоксией. Лактат-ацидоз типа В делят на группы: В1 (возникает на фоне различных заболеваний), В2 (связан с введением различных веществ), В3 (наследственные формы ЛА), В (смешанные формы).

Установлено, что основные факторы риска вызывают в организме два интегративных альтернативных состояния метаболической системы регуляции кислотно-основного равновесия – компенсированные метаболический ацидоз и метаболический алкалоз, которые являются эндогенным фактором риска развития хронических распространенных заболеваний человека [31]. Компенсированный метаболический ацидоз лежит в основе таких заболеваний, как сахарный диабет, гипертоническая болезнь, заболевания почек, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, атеросклероз и пародонтит [64, 69, 70].

Метаболический ацидоз развивается при травмах [49], кровотечениях [15, 30, 35], отравлениях [29, 33, 43], сахарном диабете [12, 15, 16], при острых инфекционных заболеваниях [17], пересадке органов [49], острой миокардиальной недостаточности в послеоперационном периоде [13] и многих других состояниях, которые приводят к коагулопатии потребления, гиперфибринолизу и активации функции тромбоцитов.

Выраженный метаболический ацидоз часто обусловлен гиперлактацид- и гиперпируватемией и сочетается с резким нарушением целостности мембранных структур. Об этом свидетельствует значительное повышение активности цитоплазматических (ЛДГ) и митохондриальных (изоцитратдегидрогеназы) ферментов в сыворотке крови [56]..Молочная кислота представляет собой конечный продукт гликолиза и образуется в результате восстановления пировиноградной кислоты. Источником протонов и электронов является глицеральдегид-3-фосфат, роль их переносчика играет кофермент НАД+. Реакция катализируется ЛДГ:

НАД Н СН 3 НСОНСООН НАД

СH 3 COCOO В нормальных условиях равновесие этой реакции сдвинуто в сторону образования МК и соотношение МК/ПВК равно 10. Общая продукция МК организмом взрослого человека около 1300-1500 ммоль/сут. При физической нагрузке продукция лактата может увеличиваться в тысячи раз. В обычных условиях большая часть молочной кислоты подвергается метаболическим превращениям в печени, а также в почках, миокарде, и других органах [85]. При физической нагрузке скелетные мышцы способны одновременно продуцировать и утилизировать МК. Лактат, поступивший в печень, окисляется в пируват, чему благоприятствует низкое отношение [NADH]/[NAD+] в цитозоле печени. Пируват затем превращается в печени в глюкозу в реакциях глюконеогенеза. Молочная кислота может также поглощаться легкими из сосудов малого круга кровообращения. Доля МК, подвергающейся окислению, по данным разных авторов, составляет от 10 – 12% до 50 – 90%, а превращается в глюкозу (глюконеогенез) – 10 – 30% [40]. В патологических условиях метаболизм молочной кислоты может значительно меняться, что особенно важно для понимания патогенеза ЛА [19]. В свое время еще [65] выделил 6 факторов, которые могут привести к развитию ЛА: снижение доступа кислорода к клеткам; нарушение процессов энергообразования; блокада дыхательной цепи на уровне цитохромов, ферментов цикла Кребса, торможение транспорта восстановительных эквивалентов через мембрану митохондрий; нарушение метаболизма пировиноградной кислоты. К числу немногих из агентов, роль которых в развитии ЛА в клинике установлена, относятся некоторые представители бигуанидов (антидиабетические средства), особенно фенформин и метформин. Этому вопросу посвящен ряд работ и обзоров [23, 27, 83]. Описаны случаи развития метаболического ацидоза и коагулопатии при отравлении фенформином [42]. Использование антидиабетического препарата метформина в ряде случаев вызывает молочнокислый ацидоз, особенно у пациентов с нарушением функции печени и почек [23, 26, 27].

Это обусловлено усилением процессов анаэробного гликолиза в стенке кишечника. Однако [25] считает, что ЛА связан не столько с накоплением метформина, сколько с течением основного заболевания. По данным [37] уровень лактата после 3-месячного приема метформина составил 1,23±0,09 ммоль/л против 0,95±0,08 ммоль/л наблюдаемого до лечения. Согласно другому исследованию [197]уровень лактата изменился с 1,22±0,04 до 1,68±0,31 ммоль/л после приема метформина в дозе от 850 до 2250 мг в сутки в течение 10 недель. Таким образом, вероятность лактатацидоза, по данным авторов, на фоне приема данных препаратов крайне мала (0 – 0,084 случая на 1000 пациентов в год). Этот риск повышается у больных с гипоксическими состояниями, тяжелой почечной, печеночной, сердечной недостаточностью и у лиц, злоупотребляющих алкоголем. Введение продуктов парентерального питания: растворов фруктозы, сорбитола, ксилитола и сбалансированных жировых эмульсий для парентерального питания новорожденных, а также сокращение объема внеклеточной жидкости, отрицательный баланс калия может привести к возникновению внутриклеточного метаболического ацидоза [35, 62]. Высокие дозы эпинефрина и метилпреднизолона и других стероидных препаратов, используемые в лечении политравмы с повреждением спинного мозга, являются фактором риска в развитии метаболического ацидоза, особенно на фоне гипергликемии [21]. В клинической практике встречаются случаи ЛА после приема некоторых противоопухолевых антибиотиков и противоглистных средств [85]. Некоторые авторы развитие ЛА наблюдали не только при выраженной гипоксии, но и при лейкемии, голодании, отравлениях этанолом, сепсисе.

В последние годы появились сообщения о развитии тяжелого ЛА у ВИЧ – инфицированных пациентов на фоне антиретровирусной терапии. Молочнокислый ацидоз наступает довольно неожиданно и, часто, с быстрым фатальным исходом. Вопрос контроля этого синдрома все еще остается открытым [28, 43, 47]. По данным [49] гиперлактацидемия развивается у пациентов с нарушениями функции печени, в частности, при трансплантации печени в операционном и раннем послеоперационном периоде. Концентрация молочной кислоты прямо коррелирует со степенью нарушения функции печени – уровнем билирубина и активностью трансаминаз в крови.

В патогенезе ЛА до сих пор остается несколько неясных вопросов. Накопление МК предполагает стойкое нарушение баланса между ее продукцией и утилизацией. Наиболее очевидной причиной увеличения продукции МК является гипоксия. Однако далеко не всегда, даже резкая, гипоксия или другие состояния, характеризующиеся гиперлактацидемией, приводят к развитию ЛА. С другой стороны, ЛА нередко возникает на фоне состояний, не имеющих ничего общего, на первый взгляд, с гипоксией [85]. Лактацидемию [8-10] связывают с дефектом пируватдегидрогеназного комплекса, катализирующего тиаминзависимое декарбоксилирование пирувата. Недостаточность тиамина у людей и экспериментальных животных приводит к серьезному нарушению функции митохондрий [34]. При этом отмечается уменьшение активности тиамин-зависмой кетоглутаратдегидрогеназы и транскетолазы, достоверно увеличивается концентрация лактата вдвое и отмечается снижение рН плазмы и спиномозговой жидкости.

Ряд статей и обзоров посвящены ЛА при MELAS синдроме [22, 31, 48, 50]. Это один из примеров классической митохондриальной энцефаломиопатии. Молекулярный анализ показал наличие дефекта в дыхательной цепи митохондрий, при котором практически у всех пациентов развивается лактат-ацидоз. Подобный синдром может быть связан с мутациями различных генов, одиночные мутации в геноме митохондрий ведут к различным метаболическим нарушениям, в том числе и ЛА. Другие авторы [46] связывают семейную гиперлактацидемию с недостаточной активностью пируваткарбоксилазы.

Многие авторы считают, что без нарушения утилизации молочной кислоты развитие ЛА в организме невозможно. Важнейший путь утилизации молочной кислоты - глюконеогенез. Среди ферментов, участвующих в этом процессе высокой чувствительностью к изменениям рН обладает пируваткарбоксилаза. При снижении рН угнетение ее активности может резко затормозить глюконеогенез [85]. По данным [67] способность печени утилизировать МК в нормальных условиях составляет 3400 ммоль/сут. Это вдвое превышает ее продукцию. При ацидозе этот процесс нарушается, при рН крови ниже 7,1 происходит угнетение поглощения МК печенью в 10 раз. Значительную роль в патогенезе лактат – ацидоза отводят нарушению функции почек [67]. Снижение рН перфузата до 7,2 – 7,1 активирует удаление МК изолированными почками (в отличие от печени), но при дальнейшем снижении рН этот процесс все же нарушается. В почках при ацидозе и других патологических процессах МК может превращаться в глюкозу в результате глюконеогенеза [81]. Хотя авторы считают, что почки удаляют молочную кислоту преимущественно в результате метаболических, а не экскреторных процессов, роль последних при ЛА не следует недооценивать. После повышения концентрации МК в крови (6 ммоль/л) экскреция лактата с мочой возрастает в линейной зависимости от ее содержания в крови и при выраженном ЛА становится весьма значительной. В этой связи можно еще раз сказать, что молочнокислый ацидоз нередко возникает на фоне сопутствующего нарушения функции почек. Доказательством этого является тот факт, что фенформин на 50% угнетает способность почек к выведению кислот [85]. При сдвиге рН крови ниже 7,2 выведение МК почками снижается [14]. ЛА часто сопровождается повышением концентрации метаболитов, свидетельствующих о почечной недостаточности (мочевины, креатинина, мочевой кислоты). По видимому для развития ЛА необходимо начальное повышение молочной кислоты в крови вследствие гипоксии или других факторов, вторым условием является нарушение функции органов и тканей (особенно печени) ответственных за утилизацию МК. Далее процесс может развиваться по механизму порочного круга [9, 10, 67, 85].

2.1.3.Механизмы развития ДВС-синдрома при ацидозе.

ДВС-синдром – это один из наиболее распространенных и представляющих большую опасность для пациентов вид патологии гемостаза. Он характеризуется рассеянным свертыванием крови с тромбообразованием и сопровождается массивным потреблением факторов свертывания крови и активацией фибринолиза. ДВC-синдром разивается при многих заболеваниях и практически при всех терминальных состояниях в результате появления в кровотоке тканевого тромбопластина. Патогенез ДВС-синдрома связан с первичным повреждением эндотелия сосудов. Динамика развития заключается в последовательной активацией гемостаза со сменой фаз гипер- и гипокоагуляции, свертывания крови, агрегации тромбоцитов и эритроцитов, микротромбозами, блокадой микроциркуляторного русла, истощением компонентов свертывающей системы крови, фибринолиза, физиологических антикоагулянтов, снижением тромбоцитов. Перечень патологических процессов, осложненных ДВС-синдромом, составляет более 46 заболеваний, многие из которых сопровождаются ацидозом [72, 79, 84].

Полиэтиологичность ДВС-синдрома, безусловно, отражается на особенностях его патогенеза. В зависимости от механизма активации гемостаза можно выделить следующие формы ДВСсиндрома: вследствие попадания в кровоток тканевого тромбопластина (по внешнему пути гемостаза), с преобладанием сосудисто-тромбоцитарного гемостаза в результате генерализованного поражения сосудистого эндотелия; в результате внутреннего механизма свертывания через XII фактор и фосфолипиды клеточных мембран [58, 60, 61, 70, 71, 75].

Важное значение в развитии ДВС-синдрома придается активности АТ III, нарастание дефицита которого ведет к генерализации внутрисосудистой коагуляции [57].

В описанном [77] тромбогеморрагическом синдроме также приводится этиологическая, патогенетическая и клиническая классификации, диагностика и терапия. Отмечается, что ТГСсиндром протекает с преобладанем активации внутренней системы гемостаза в четыре стадии: гиперкоагулемия, коагулопатия потребления с усилением фибринолиза, дефибринационнофибринолитическая стадия и стадия исходов. Клинически проявляется острым, подострым, хроническим и рецидивирующим течением при различных заболеваниях, сопровождающихся ацидозом.

Многие авторы констатируют у больных с тяжелой травмой, политравмой, массивным кровотечением, а также при развитии септического шока на фоне инфекции граммотрицательными микроорганизмами возникновение триады: метаболического ацидоза, коагулопатии и гипотермии, как наиболее опасных и угрожающих жизни, осложнений [4, 9,10, 11, 85]. Метаболический ацидоз [15] описывают при ретроперитонеальных повреждениях, травмах печени и внутрибрюшных кровоизлияниях. При этом, у пациентов с ацидозом во время операции чаще развивается тромбогеморрагический синдром, факторами риска которого являются: рН крови меньше чем 7,18, температура тела 33C, цифры протромбинового индекса 16 с, значения тромбопластинового времени 50. Авторы считают, что метаболический ацидоз усиливает коагулопатию у пациентов, требующих массивного переливания крови, при этом гемотрансфузии также могут явиться причиной нарушения электролитного баланса организма и углубления ацидоза.

Гиперлактацидемия и лактат-ацидоз – важная особенность кардиогенного и других видов шока [15, 93]. Гиперлактацидемия при шоке является ценным прогностическим маркером. Повышение концентрации лактата от 2,1 до 8,0 mEq% снижает возможность выживаемости от 90% до 10%. Значения лактата, превышающие 7 – 8 mEq% всегда являются критическими. Наряду с повышенной продукцией молочной кислоты тканями при гипоксии, при поздних стадиях шока появляется и ее недостаточное использование печенью (благодаря пониженной перфузии), и цикл Кори становится недействующим. Анаэробный гликолиз обусловливает накопление огромного количества молочной кислоты благодаря тому, что равновесие реакции ПВК + НАДН+Н + = лактат + НАД+ сдвинуто вправо. Не имея возможности разгружаться в цепи окислительного фосфорилирования (деятельность которой прекращена из-за отсутствия кислорода), восстановленный НАД, накопившийся в чрезмерном количестве, тормозит процесс синтеза цитрата, замыкая его в основной химический feek-bask, располагающийся между ферментацией и дыханием. Таким образом, существующий в избытке НАДН + Н+, останавливает обороты цикла Кребса. Возникает эффект Crabtree (торможение дыхания ферментацией), характерный для шоковой клетки. В конце концов, восстановленный НАД тормозит и процесс гликолиза, прекращая выработку молочной кислоты, а одновременно с этим и последний энергетический источник энергии. Из числа пагубных последствий ацидоза следует упомянуть: ассиметричное открытие шлюза в микроциркуляции, миокардиальную токсичность, повышенную гидратацию клеток, возникновение сладжей и ДВС, ингибирование активности оксидоредуктаз и лигаз, а также и выход лизосомальных гидролаз [44, 89, 93].

Введение продуктов парентерального питания: растворов фруктозы, сорбитола, ксилитола и сбалансированных жировых эмульсий для парентерального питания новорожденных, а также сокращение объема внеклеточной жидкости, отрицательный баланс калия может привести к возникновению внутриклеточного метаболического ацидоза [9, 85]. В клинической практике встречаются случаи ЛА после приема некоторых противоопухолевых антибиотиков и противоглистных средств [85]. Некоторые авторы развитие ЛА наблюдали не только при выраженной гипоксии, но и при лейкемии, голодании, отравлениях этанолом, сепсисе [71]. Несомненно, что вопросы изучения патогенетических аспектов ацидоза и разработка методов коррекции наблюдаемых сдвигов являются весьма актуальными и на сегодняшний день. Продукты метаболизма, вызывающие ацидоз, представляют реальную опасность для организма, так как способны не только нарушать функции, но и приводят к морфологическим изменениям в различных органах. Экспериментальный ацидоз различной глубины (от рН 7,3 до 6,5 и продолжительности от 5мин до 3 часов) приводит к неспецифическим морфологическим изменениям во всех изучаемых органах и тканях (почках, легких, сердце и др.) [52-55]. Повреждение структуры клеток, межклеточного вещества, тканей и органов, сопровождающееся нарушением их жизнедеятельности является результатом расстройства метаболических регуляций. Ведущей причиной, вызывающей дистрофические нарушения, является снижение окислительных процессов, внутриклеточного дыхания, приводящих к накоплению в тканях кислых продуктов, прежде всего молочной кислоты, и к развитию ацидоза.

В течение нескольких последних десятилетий в медицине развивается метаболическое направление – цель которого анализ обменных процессов различных уровней как основы или фона развития многих болезней. Особенно активно формируются представления о роли нарушений клеточного метаболизма при сердечно-сосудистой патологии. Ключевым звеном этого метаболизма является митохондрия – органелла общего назначения, выполняющая жизненно-важные функции.

Основная роль митохондрий - обеспечение клеток энергией, которая образуется за счет молекул аденозинтрифосфата в биохимических циклах клеточного дыхания.

Больные пороками клапанов сердца (ПКС) составляют значительную часть среди пациентов с заболеваниями сердечно - сосудистой системы и число их растет [62]. Основным методом лечения этой патологии является хирургическая коррекция ПКС. За последние десятилетия, благодаря развитию и совершенствованию кардиохирургии, в этой области достигнут значительный прогресс. Однако, у значительной части пациентов, даже после гемодинамически эффективной коррекции ПКС, сохраняется и прогрессирует сердечная недостаточность. По современным представлениям это объясняется исходным состоянием (ремоделированием) миокарда - развитием в нем кардиосклероза и гибернации кардиомиоцитов вследствии хронической гипоперфузии [6].

Известно, что гибернация миокарда, характеризующаяся стойким снижением метаболических процессов в кардиомиоцитах и нарушением их сократительной функции, обратима при нормализации кровоснабжения [41]. Поэтому восстановление адекватного кровоснабжения миокарда является важной задачей комплексного хирургического лечения больных ПКС, решение которой невозможно без полного представления перед операцией характера и уровня нарушения кровотока в сердечной мышце.

Возможность количественно оценить миокардиальный кровоток и изучить роль в кровоснабжении и метаболизме миокарда всех отделов коронарного русла и интрамуральной сосудистой сети появилась лишь в последние годы, благодаря широкому применению не только коронарографии, но и внедрению в клиническую практику новых методов оценки перфузии миокарда:

однофотонной эмиссионной компьютерной томографии, позитронной эмиссионной томографии, магнитно-резонансной томографии. Было выявлено, что ишемия миокарда может быть обусловлена не только патологией проксимального отдела коронарных артерий (спазм, стеноз, окклюзия), но и изменением его дистального отдела и интрамуральных микрососудов. Поэтому стали различать ишемическую болезнь сердца и микрососудистую ишемию миокарда, которая в случаи клинического проявления стенокардией стала обозначаться как кардиальный синдром Х [51, 74]. Как показали данные исследований последних лет, при гипертрофии миокарда, кардиосклерозе, кардиомиопатии, миокардите, а также при метаболическом синдроме (ожирение, сахарный диабет, дислипидемия, гипертоническая болезнь) очень часто (в 30-50% случаев) выявляется именно микрососудистая ишемия миокарда, что позволило рассматривать ее как синдром, свойственный многим заболеваниям [51, 74, 88]. В основе микрососудистой ишемии миокарда могут лежать как обратимые функциональные нарушения кровотока (при дисфункции эндотелия, нарушениях реологических параметров крови, нарушении диастолической функции миокарда), так и необратимая потеря части микрососудистого русла вследствие ремоделирования миокарда при развитии кардиосклероза или несоответствие количества капилляров возросшей массе сердца при его гипертрофии. Значение микрососудистой ишемии миокарда в полной мере не изучено, но показано, что она может играть важную роль в возникновении жизнеугрожающих аритмий, острой и хронической сердечной недостаточности, ухудшать результаты операций реваскуляризации миокарда и даже быть причиной внезапной смерти [6, 41].

Кардиохирургическая операция в большей степени, чем другие инвазивные методы лечения требует от организма напряжения его функциональных резервов. Длительная искусственная вентиляция легких, применение искусственного кровообращения, обескровливание сердца на период до 2 часов в условиях фармакологической Холодовой кардиоплегии, обширные хирургические манипуляции в области мощнейших рефлексогенных зон приводят к серьезным сдвигам в компенсаторных системах организма человека, вызывая их перенапряжение или даже срыв компенсации с развитием тяжелых послеоперационных рсложнений. Пусковым механизмом большинства из них является развитие в послеоперационном периоде острой миокардиальной недостаточности, которая в настоящее время является основной причиной летальных исходов при хирургической коррекции пороков сердца [56]. В связи с этим большое внимание кардиохирургов и кардиологов уделяется разработке предоперационного подготовки и послеоперационного ведения больных. У большинства больных более 30% в послеоперационном периоде после митральной комиссуротомии, протезирования митрального клапана, оперированных по поводу ВПС имел место метаболический ацидоз и сердечная слабость различной степени выраженности. Выраженный метаболический ацидоз со сдвигом рН крови ниже 7,3 в большей степени обусловлен лактат- и пируватемией, о чем свидетельствует значительное повышение активности цитоплазматических ЛДГ и митохондриальных ИЦДГ ферментов в сыворотке крови, а также аденозинтрифосфотазы. Концентрация лактата в крови возрастала до 22,7-32,8мг на 100 мл. Для коррекции метаболических нарушений в послеоперационном периоде применялись сукцианатсодержащие биологически активные вещества. После введения сукцината отмечается существенное повышение рН крови, увеличение избытка оснований и стандартного бикарбоната, общего содержания буферных систем, снижение концентрации лактата, таким образом, состояние кислотно-щелочного равновесия в целом приближается к нормальным величинам [9, 10, 56]. Анализ электронограмм биоптатов миокарда позволяет говорить о наличии повышении проницаемости лизосомальных мембран, снижении коэффициента энергетической эффективности митохондрий. Клинические испытания проведенные на больных с пороками сердца и сердечной недостаточностью показали что сукцинат обладает выраженным нормализующим дейтвием при наличии метаболического ацидоза, уменьшает утечку ферментов МВ КФК, ЛДГ, ИЦДГ из клеток, в том числе и из печеночных, во внеклеточную жидкость и кровь. Как стойкая нормализация КЩР, так и стабилизация мембранных структур после введения сукцината, по всей вероятности, связаны с увеличением энергетической обеспеченности тканей.

Целесообразность использования гипотермии в кардиохирургии не вызывает сомнений.

Основным достоинством гипотермии является снижение метаболизма и потребления кислорода.

Поэтому методика гипотермического режима перфузии на долгое время стала обязательной для выполнения сложных реконструктивных операций на сердце. Однако наряду с достоинствами гипотермия вызывает весьма нежелательные изменения в организме: снижение температуры, которое сопровождается вазоспазмом и приводит к централизации кровотока, холодовой диурез, возникающий вследствии подавления антидиуретического гормона, а также выход жидкости в межклеточное пространство. Растут гематокрит и вязкость крови, что усугубляет расстройства микроциркуляции. Возникновение спазма периферических сосудов и нарушение микроциркуляции приводи к тканевой гипоксии, а упрочнение связи гемоглобина с кислородом, в связи с холодовым сдвигом кривой оксигемоглобина влево, еще больше усугубляет гипоксию. Выраженная гиперреактивность симпатоадреналовой системы сопровождается резким повышением обменных процессов, мышечной дрожью и метаболическим ацидозом [56, 73, 74].

С середины 90-х годов все чаще стал применяться нормотермический режим перфузии, который лишен недостатков умеренной гипотермии (28-30°С). Но в связи с часто встречающимися после искусственного кровообращения неврологическими осложнениями в последние годы проводят сеансы искусственного кровообращения со спонтанным охлаждением пациентов до поверхностной гипотермии (34°С) [73]. Ряд авторов изучали влияние различных температурных режимов кровообращения на кислотно-щелочное равновесие, параметры метаболизма и тканевой гипоксии при использовании сочетанной анестезии у больных ИБС на фоне поверхностного уровня наркоза/ Использование сочетанной анестезии при операции аорто-коронарное шунтирование требует применения искусственного кровообращения в режиме нормотермии или поверхностной гипотермии. Охлаждение пациента в ходе перфузии до 30-32°С, как правило, сопровождается вазоспазмом и неадекватной оксигенацией тканей, что находит свое отражение в более частом возникновении метаболического ацидоза, чем при других температурных режимах. Он особенно заметен в конце операции и раннем послеоперационном периоде у пациентов с охлаждением до 30С. При этом содержание лактата выше 3 ммоль/л отмечается у 25% больных[73].

В последнее время в коронарной хирургии повысился интерес к операциям без искусственного кровообращения, особенно у пациентов с тяжелой патологией и высоким риском проведения искусственного кровообращения. Достаточно широко в литературе обсуждается проблема гемостаза у больных в условиях ИК. При операциях МИАКШ после 6 ч операции отмечается усиление генерации тромбина, что является компенсаторной реакцией организма на оперативное вмешательство [79]. В первые 24 часа после МИАКШ отмечается увеличение прокоагулянтной активности [41]. В тоже время отмечается угнетение системы естественных антикоагулянтов в большей степени антитромбина III [79]. Тромбоцитарное звено гемостаза после операций МИАКШ характеризуется гиперагрегацией тромбоцитов на фоне умеренного снижения их количества. Активация прокоагулянтной активности тромбоцитов в раннем послеоперационном периоде обеспечивает сохранность системы гемостаза [31]. У больных, оперированных в условиях ИК, в послеоперационном периоде отмечается дисфункция тромбоцитов, связанная с длительностью и температурным режимом [79]. Через 6 часов после операции наблюдается активация системы фибринолиза.

Этот процесс, скорее всего, связан с описанным выше увеличением генерации тромбина и носит компенсаторный характер в связи с недостаточностью антикоагулянтов. Некоторые авторы находят повышение Д-димера только у больных с ИК [7], тогда как по данным [79] транзиторный подъем Д-димера отмечается и при МИАКШ. Активация фибринолиза у больных после МИАКШ носит волновой характер с максимальной активацией через 6 часов после операции, что является компенсаторной реакцией на усиление тромбина. Считается, что причиной активации фибринолиза и коагуляции после кардиохирургических операций является использование ИК. В тоже время [79] считают, что обширная хирургическая травма, в большей степени, чем ИК является причиной активации как фибринолиза, так и системы гемостаза за счет выброса тканевых факторов.

Определение лактата в крови представляет собой важный метод мониторинга у больных с тканевой гипоксией. Клинически увеличение лактата в крови связано с обострением заболевания и повышением риска неблагоприятного исхода. Клеткам необходима энергия для нормального функционирования и гомеостаза. Это возможно при нормальном функционировании всех метаболических циклов, как внутриклеточных, так и внеклеточных [65]. У пациентов, оперированных на «открытом» сердце в условиях искусственного кровообращения, в раннем послеоперационном периоде необходимо мониторировать тканевую оксигенацию и контролировать метаболические процессы, происходящие в организме больного. У пациентов, оперированных в гипотермическом режиме ИК, уровень лактата и парциального давления кислорода в венозной крови отличается от такового при операции в нормотермическом режиме. У больных, оперированных в гипотермическом режиме ИК, отмечается подъем лактата до 4,2 – 5,6 ммоль/л наряду с повышением уровня РvО2. Через 3 часа после операции уровень Р vО2 нормализуется, а уровень лактата восстанавливается только в конце первых суток. При нарушении доставки кислорода к тканям компенсаторно увеличивается его утилизация, и если в этих условиях не изменить условия доставки кислорода, в тканях активируется анаэробный метаболизм, что проявляется повышением уровня лактата. Уровень лактата в артериальной крови соответствует уровню Р vО2 и часто их изменения предшествует клинически значимым гемодинамическим нарушениям. Авторы утверждают, что понижение уровня РvО2 ниже 30 мм.рт.ст. при неизменном режиме вентиляции расценивается авторами как проявление сердечной недостаточности и требует назначения инотропной поддержки (адреналин, дофамин и т.д.), нормализация уровня лактата до 1,5-1,7 ммоль/л является основанием для прекращения инотропной поддержки. Уровень лактата крови может быть использован как маркер тканевой гипоксии. У пациентов оперированных на «открытом сердце» в условиях искусственного кровообращения, в раннем послеоперационном периоде необходимо мониторировать тканевую оксигенацию и контролировать метаболические процессы, происходящие в организме больных [73, 74, 79].

2.1.4. Морфология органов и тканей при ацидозе.

Влияние ацидоза на морфологию внутренних органов изучалось [52-55]. Гистохимическими и электронномикроскопическими методами было показано, что сдвиг рН от 7,4 в контроле до 6,5 в опыте приводит к деструктивно-дистрофическим изменениям сердца, легких и других органов. Ацидоз вызывает изменения стенки сосудов, отек соединительной ткани и нарушение мягкого остова внутренних органов. Ацидоз, по данным [54, 55] оказывает выраженное влияние на морфологию органов и тканей. При асфиксии, гипоксии и ацидозе плода у новорожденного отмечаются общие патологические признаки, выражающиеся в нарушении кровообращения, явлениях дистрофического характера в паренхиме и строме органов. При асфиксии плодов и новорожденных с различными сроками жизни наблюдаются изменения в сосудах, характеризующиеся венозным полнокровием и стазами, наличием агрегатов тромбоцитов и сладжей эритроцитов, набуханием стенок сосудов за счет отека их соединительнотканных компонентов. По данным [52, 54], лактат-ацидоз, вызываемый дозированной внутривенной инъекцией молочной кислоты в эксперименте на животных приводит к выраженным изменениям структуры внутренних органов. Динамика и характер наблюдаемых изменений зависят от продолжительности и степени сдвига рН в кислую сторону. Острый декомпенсированный лактат-ацидоз приводит к слущиванию эндотелия, отеку сосудистой стенки и околососудистого пространства. Неспецифические морфологические изменения нарастают по мере изменения кислотно–основного баланса внутренней среды организма. На протяжении первых 5 – 30 минут ацидоза преобладают сосудистые поражения, а через 60 – мин (рН крови 7,0 – 6,5) нарастают деструктивно - дистрофические изменения в паренхиме органов. Они выражаются в нарушении структурной организации коллагеновых, эластических и ретикулиновых волокон. Наиболее выражены эти изменения в органах, ответственных за поддержание кислотно – основного равновесия (почки, легкие и др.).

В клинической практике наиболее характерными гипоксическими состояниями являются критические состояния организма и шок, где основной ареной патологии являются легкие и сердце. По данным исследований [52, 71, 72] в условиях молочно – кислого ацидоза, в легких отмечались дисциркуляторные явления, а по мере увеличения глубины и продолжительности ацидоза появлялись дистрофические и деструктивные процессы, касающиеся сурфактанта, альвеолоцитов и эндотелиоцитов аэрогематического барьера, а также волокнистого и основного компонентов интерстиция. Это позволяет судить о нарушении газообменной и других функций легкого. По данным [8, 9] экспериментальный ацидоз приводит к образованию пристеночных тромбов, расслоению крови, десквамации и отеку сосудов легких. В легочной ткани наблюдался отек, разрушение коллагеновых и ретикулярных волокон, ателектаз альвеол, набухание соединительнотканных клеток, при сдвиге рН 7,0 и более отмечались некротические явления, пропитывание ткани легкого элементами крови.

Морфология почек при экспериментальном молочно-кислом ацидозе изучалась рядом авторов [9]. Выраженные изменения при ацидозе претерпевают структурные элементы почки. При сдвиге рН крови до 7,2-7,0 в течении 5-30 мин возникает набухание цитоплазмы нефроцитов проксимальных канальцев; выявляются зернистая дистрофия, жировая вакуолизация деструкция щеточной каемки. В отдельных участах коркового вещества наблюдается изменение структуры сосудистого клубочка почечного тельца и появление белковой жидкости в полости капсулы. По данным [8, 9] были выявлены морфологические изменения различных отделов почечного сегмента на молекулярном, субклеточном и клеточном уровнях в условиях экспериментального ацидоза на лабораторных животных. Данные экспериментов свидетельствуют о том, что в начальные стадии развития ацидоза в микроциркуляторном русле почек наблюдается образование эритроцитарных агрегатов в сосудах как коркового, так и мозгового вещества. Уменьшение активности дыхательных ферментов эпителиоцитов, углубление ацидоза и увеличение его продолжительности проявляется дистрофически-некротическими изменениями эпителиоцитов нефрона и его стромальных элементов. Стенки кровеносных сосудов подвержены плазматическому пропитыванию, появляется геморрагический компонент. Дальнейшее увеличение ацидоза сопровождается деструктивными процессами стромы, паренхимы, сосудистых компонентов коркового и мозгового вещества почки.

Дисциркуляторные и деструктивно-дистрофические изменения сосудисто-тканевого комплекса почки зависят от глубины и продолжительности этих состояний. Выраженные изменения возникают в почке.

Исследование морфологии органов иммунной системы при ацидозе проводилось рядом авторов. Изменение морфологии селезенки при газовом ацидозе изучалось. Исследования были проведены на беспородных собаках под общим гексеналовым наркозом. Путем увеличения в дыхательной смеси СО2 в крови создавали газовый ацидоз. На протяжении всего эксперимента из бедренной артерии забиралась кровь при различных значениях рН крови 7,4; 7,3-7,2; 6,95; брались кусочки селезенки, фиксировались в 5% растворе нейтрального формалина и окрашивались гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону и Харту. По данным планиметрии внутриселезеночная соединительная ткань с проходящими в ней сосудами занимает 6,92% от общей площади селезенки.

Сдвиг рН крови до 7,2 приводил к уменьшению объема селезенки. Отмечалось достоверное увеличение площади соединительной ткани по отношению к паренхиме. Дальнейшее снижение рН крови 7,20-6,95 приводило к резкому сокращению селезенки, что можно расценивать как компенсаторную реакцию, направленную на увеличение щелочного резерва крови. По данным [10] при сдвиге рН от 7,4 до 7,3-7,2 размеры селезенки уменьшаются недостоверно, но прослеживаются утолщения капсулы, подкапсулярных трабекул и общих сосудистых влагалищных оболочек. Изменения в структуре соединительной ткани характеризуется увеличением удельной части коллагеновых волокон по отношению к эластическим и ретикулиновым волокнам. Исследования, проведенные [55], показали, что в условиях экспериментального лактат – ацидоза изменяются размеры селезенки кошки.

Метаболический ацидоз (рН – 7,2 – 7,0) приводит во всех случаях к достоверному уменьшению длины, ширины органа соответственно на 9,8%, 29,3% по сравнению с контролем. От момента введения молочной кислоты и на протяжении 1 часа отмечается значимое увеличение поперечника капсулы на 97,1%, подкапсулярных трабекул на 38,9% и недостоверное изменение толщины общих сосудистых влагалищных оболочек. В фиброзной оболочке капсулы селезенки прослеживается увеличение объема коллагеновых волокон на 96,2% на фоне достоверного снижения процентных отношений содержания эластических на 43,2% и ретикулиновых волокон на 56,1% в поперечнике фиброзной оболочки капсулы.

При метаболическом ацидозе (рН 7,2-7,0) продолжительностью от 30 до 60 мин, вызванном внутривенной инъекцией молочной кислоты наблюдаются существенные изменения в соединительнотканных структурах, паренхиме и сосудистом русле вилочковой железы. По ходу фиброзной оболочки капсулы коллагеновые волокна интенсивно окрашиваются кислым фуксином, однако появляются единичные участки с бледным окрашиванием в местах отека и набухания волокон.

В более глубоких слоях капсулы коллагеновые волокна также сохраняют способность окрашиваться кислым фуксином, при этом их структурная целостность не нарушается. На поверхности капсулы наблюдаются разрывы и отек фиброзной оболочки, происходит разделение капсулы на 2слоя. В стенке сосудов аргирофильные волокна слабо импрегнируются серебром, встречаются утолщенные, фрагментированные волокна. Эластические волокна толщиной 0,8 мкм – 1,0 мкм слабо окрашиваются в коричневый цвет, многие из них отечны и утолщены. В просвете междольковых артерий и вен наблюдаются сладжи эритроцитов и лейкоциты, происходит расслоение крови на форменные элементы и плазму. Просвет междольковых артерий в пределах 50-75 мкм, толщина стенки составляет 25-36 мкм. Междольковые вены имеют просвет 100-200мкм, толщина стенки варьирует от 18 до 28 мкм, встречаются вены с оптически пустым просветом. В мозговых зонах долек просвет капилляров расширен, они забиты форменными элементами крови, наблюдается отек стенки сосудов, расширение межклеточных щелей мозгового вещества.

Были также исследованы лимфатические узлы 12 регионов. При этом наблюдались диффузная или очаговая делимфатизация зародышевых центров. Коллагеновые волокна капсулы были утолщены, разрыхлены с элементами нарушения их целостности. Лимфоциты обнаруживались также и в промежуточных синусах, что приводило к сглаживанию границ между корковым и мозговым веществом. При дальнейшем углублении ацидоза (рН крови 6,8 - 6,5) и его продолжительности явления делимфатизации нарастали как в центральных лимфатических узлах, так и в других группах лимфоузлов [55].

Ряд исслдеований посвящено изучению влияния молочнокислого ацидоза на структуру эндотелиоцитов in vitro [3]. Одним из ранних признаков ишемии является увеличение концентрации лактата, которое происходит в результате интенсификации анаэробного метаболизма. Сдвиг рН среды от 7,4 до 6,8 не вызывает набухания эндотелиоцитов, а при рН ниже 6,6, 6,4 и 6,0 происходит существенный Н+-зависимый отек и вздутие клеток [3, 72].

Патологические процессы в легких при сдвиге рН в кислую сторону сопровождаются появлением очагов эмфиземы и ателектаза, которые увеличиваются с нарастанием ацидоза. Авторы приходят к выводу, что динамика и характер наблюдаемых при экспериментальном ацидозе морфологических изменений в различных органах зависят от продолжительности и степени сдвига рН в кислую сторону [72].

Тяжесть функциональных нарушений, а соответственно, и клинические признаки печеночной недостаточности коррелируют с выраженностью морфологических изменений при ацидозе.

Ацидоз при острой почечной недостаточности, пересадке печени, гипотермии, интоксикации грибами, вирусной лихорадке сопровождается гиперкоагулемией, коагулопатией потребления и нарушением морфологии легких, сердца, печени, почек [4, 12-14, 33, 67, 83, 89].

Таким образом, в литературе имеются единичные работы, которые свидетельствуют о морфологических изменениях в различных органах и тканях при метаболическим ацидозе. Показано, что эти изменения зависят от глубины и продолжительности ацидоза. В связи с вышеизложенным, изучение влияния сдвигов кислотно-основного равновесия на морфологию органов пищеварения, гемокоагуляционный и сосудисто-тромбоцитарный гемостаз представляется весьма значимым.

2.2. Выбор и обоснование оптимального варианта направления исследования.

Продукты анаэробного метаболизма, вызывающие ацидоз, представляют реальную опасность для организма, т.к. способны нарушать не только функции, но и приводить к морфологическим изменениям в органах и тканях. Накопление молочной кислоты изменяет гемостатические свойства крови, усиливает гипоксию, уменьшает функцию энергообразования в клетке. Тем неменее, морфология органов при ацидозе остается не изученной, до конца не ясны механизмы развития ДВС-синдрома при ацидозе, вопросы терапии остаются во многом открытыми. Этим объясняется не угосающий интерес к проблеме лактат-ацидоза. В связи с этим, нам кажется важным изучение роли ацидоза в развитии ДВС-синдрома, его морфологического эквивалента и нарушений структурной организации органов и тканей.

2.3. План исследования 3.1. Аналитический обзор 3.2. Экспериментальное исследование I этапа.

3. 2.1. Создать модель лактат-ацидоза в/в капельным введением 3% растора молочной кислоты и под контролем рН достич различных сдвигов рН от 7,2 до 6,8 в опытах на животных. Изучить показатели КЩР в различных регионах сердечно-сосудистой системы.

3. 2.2. Изучить в условиях экспериментального лактат-ацидоза в опытах in vivo показатели системы сосудисто-тромбоцитарного, гемокоагуляционного гемостаза, фибринолиз в различных регионах сердечно-сосудистой системы 3.3. Экспериментальное исслдеование 2 этапа 3.3.1.Исследовать морфологию органов и тканей (сердце, печень, почки, легкие, органы иммунной системы) при различных сдвигах рН крови (рН от 7,2 до 6,8 и различной продолжительности ацидоза от 15 минут до 180 мин, а также после перенесенного ацидоза на 4, 10, 14 сутки) на уровне световой и электронной микроскопии.

3.3.2.Изучить морфологию нервной системы при различных сдвигах рН крови (рН от 7,2 до 6,8 и различной продолжительности ацидоза от 15 минут до 180 мин, а также после перенесенного ацидоза на 4, 10, 14 сутки) на уровне световой микроскопии.

3.3.3. Провести гистохимическое исследование морфологического материала 3.3.4. Провести морфометрическое исследование морфологического материала с использованием компьютерных программ анализа в микроскопии «Мастер-морфология»

3.4. Написание и публикация статей.

Подготовка статей и публикаций с изложением полученных результатов по 2 этапу исследования и их публикация в зарубежных журнал или в рекомендованных Президиумом Высшей аттестационной комиссией. 1статья по каждому направлению, что составит 3 статьи в целом.

3.5. Изучить в условиях метаболического ацидоза влияние биологических пептидов (Ile-Trp, Lys-Glu-Val-Trp и Lys-Glu (вилон), Glu-Trp (тимоген) на гемостаз в эксперименте 3.6. Исследовать в условиях метаболического ацидоза влияние (Ile-Trp, Lys-Glu-Val-Trp и Lys-Glu (вилон), Glu-Trp (тимоген) на структурную организацию органов иммунной системы (вилочковая железа, селезенка, лимфатические узлы различных регионов, лимфоидные образования пищеварительной системы) 3.7. В клинических условиях у пациентов с нарушениями кислотно-щелочного равновесия в сторону ацидоза изучить состояние иммунной системы и влияние (Ile-Trp, Lys-Glu-Val-Trp и LysGlu (вилон), Glu-Trp (тимоген) на иммуните 3.8.Подготовка рекомендаций по теме исследования 3.9. Подготовка и публикация монографии «ДВС-синдром в клинике и эксперименте»

3.10. Подготовка и публикация статей в ретинговых журналах 2.4. Экспериментальное исследование I этапа.

2.4.1. Методика экспериментальной модели лактат-ацидоза.

Исследования проведены на беспородных животных (42 кошках), которые содержались в виварии на стандартном рационе. Животные (кошки) были разделены на 5 групп: 6 животных относились к контрольной группе и 4 группы по 8 животных подвергались экспериментальному лактат-ацидозу. Дополнительно были использованы 4 животных для проведения электронной микроскопии. Лактат-ацидоз создавали введением 3% раствора молочной кислоты в изотоническом растворе NaCl в бедренную вену под гексеналовым наркозом. Различный сдвиг рН в кислую сторону достигали дозированным капельным введением лактата обычно от 20 до 38 капель в мин, и через каждые пять минут забирались порции крови для определения сдвига рН на рНметре. По достижении необходимого значения рН (от 7,2, 7,0, 6,8, 6,5), в течение 5 – 10 мин дозу вводимой молочной кислоты уменьшали до 3 – 5 капель в мин, и поддерживали необходимый уровень соответственно 30, 60, 120, 180 мин, затем брали пробы крови для изучения показателей системы гемостаза и кусочки органов для гистологических, гистохимических и электронномикроскопических исследований (В.В.Альфонсов и соавт., 1985). Выведение животных из опытов проводилось с соблюдением правил эвтаназии, предусмотренных приказом МЗ СССР № 78 от.

Морфологические изменения в органах и показатели гемостаза изучались в зависимости от продолжительности и глубины ацидоза.

2.4.2. Методы исследования системы гемостаза Для характеристики системы свертывания крови, фибринолиза и функции тромбоцитов определяли следующие показатели:

1. Время рекальцификации (H.Bergerhof, L.Roka, 1954).

2. Протромбиновое время (A.Quick, 1937).

3. Тромбиновое время (E.Szirmai, 1957).

4. Содержание фибриногена (Р.А.Ретберг, 1972).

ПДФ (L.B.Naniga, M.M.Guest, 1967).

6. Количество тромбоцитов (C.Brecher, 1953).

7. Тромбоэластография (H.Hartert, H.Lasch, 1958) 8. Электрокоагулография по У.А.Ватмахеру и др., Концентрация Н+-ионов (C.Saunier et al., 1961) на рН метре ЛПУ – 340.

10. Определение электрокинетической подвижности тромбоцитов и эритроцитов в камере H.A.Abramson (1928) модификации В.В.Альфонсова (1977).

11. Разделение субклеточных фракций методом дифференциального центрифугирования (А.Ленинджер, 1985) и исследование их влияния на показатели гемостаза.

Пробы крови для исследования показателей гемостаза брали до, и после введения молочной кислоты одновременно из бедренной артерии и селезеночной вены. Было проведено несколько серий опытов, в которых создавали ацидоз различной глубины от рН 7,2 до рН 6,5 и продолжительности от 30 до 180 минут. Пробы крови брали в силиконированные пробирки, содержащие 3,8% цитрат натрия, так, чтобы конечное соотношение цитрата и крови составляло 1 к 9. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 10 минут в центрифуге ЦЛК 1 при 1500 об/мин, а плазму богатую тромбоцитами для изучения дзета-потенциала и агрегации – при 1000 об/мин.

Для определения электрокинетических свойств тромбоцитов и эритроцитов была сконструирована камера. В основу предложенного метода положены принципы, разработанные С.С.Харамоненко, 1960 др. Определение электрофоретической скорости велось в прямоугольной горизонтальной термостатированной камере из стекла. Размеры камеры соответствовали следующим параметрам: глубина – 0,8 мм, ширина – 14 мм, длина – 45 мм. Расстояние между электродами составляло 180 мм; емкость камеры 4,5 мл. Источником постоянного электрического тока служит стабилизированный выпрямитель УИП – 1. В электрическую схему установки входят: миллиамперметр МА II/5, вольтметр 359, коммутатор, потенциометр и неполяризующиеся электроды.

Термостатирование микрокамеры производилось при помощи термостата – Т–16, создававшего циркуляцию воды в кожухе, окружающем камеру. Наблюдение за передвижением клеток осуществлялось через объектив с водной иммерсией и окулярмикрометр с общим увеличением в раз. Герметичность между термостатирующим кожухом и объективом обеспечивалась резиновым сальником.