«Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии IV Международная научная Интернет-конференция Казань, 16-17 октября 2013 года Материалы конференции В двух томах Том 1 Казань ИП Синяев Д. Н. 2013 УДК 577/579(082) ББК ...»

ISBN 978-5-906217-33-2 (т.2) © Система виртуальных конференций Pax Grid, ISBN 978-5-906217-31- Алимова Фарида Кашифовна - проф., д.б.н., зав. кафедрой биохимии Казанского (Приволжского) федерального университета Программный комитет Абрамова Зинаида Ивановна - д.б.н., профессор (КФУ) Ишмухаметова Диляра Галимовна - д.б.н., профессор (КФУ) Темников Дмитрий Алексеевич - к.б.н., доцент (КФУ) Невзорова Татьяна Александровна - к.б.н., доцент (КФУ) Фаттахова Альфия Нурлимановна - к.б.н., доцент (КФУ) директор ООО НПП "Казан Юниверсити Вивариум" (КФУ) Акберова Наталья Ивановна - к.б.н., доцент зав. НИЛ биоинформатики и молекулярного моделирования (КФУ) Кравцова Ольга Александровна - к.б.н., ст. преп. (КФУ) Тазетдинова Диана Ирековна - к.б.н., ассистент (КФУ) Тарасов Д.С. - координатор Pax Grid Изотова Е.Д. - координатор Pax Grid Алишева Д.А. - исполнительный секретарь Медицинская биохимия Классическая биохимия Молекулярная биология Биохимия питания Биотехнология Микробиологические производства Биоинформатика Нанотехнология Инновационные образовательные технологии

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ СОСТАВА И

ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ СЫРЬЯ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В

ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ.

Лисицкая К.В., Пашинцева Н.В., Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.Н., Еремина Л.С., Иванов А.В.

ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН Уникальный код статьи: 5256c8a93c83e С началом 21-го века в биохимии питания наряду с традиционными подходами, используемыми для анализа сырья и готовых пищевых продуктов (например, [1]), стали активно применять так называемые постгеномные и, в частности, протеомные технологии и подходы [2].

Особую актуальность эти подходы приобрели для обеспечения контроля качества разнообразных мясных изделий, поскольку производство мясной продукции часто предусматривает включение в неё специальных добавок растительного и/или животного происхождения. Значительное внимание при этом уделяется продуктам «функционального питания», которые изготавливают, целенаправленно варьируя состав или включая определенные биологически активные вещества, способные снижать риск развития заболеваний, а также сохранять и улучшать здоровье потребителей [3,4]. Считается, что одним из существенных свойств функциональных продуктов может являться способность обеспечивать цитопротективный эффект против ионов тяжелых металлов, которые рассматриваются как широко распространенные экотоксиканты.

В данной работе с помощью протеомных технологий было проведено изучение белкового состава курятины, двух основных видов мясного сырья (свинины и говядины), а также произведенных из них колбасных изделий. Кроме того, параллельно в специальной клеточной модельной системе были проанализированы биологические (цитопротективные) свойства функционального сырьевого компонента, которые получают при гидролизе мышечных и коллагеновых белков кур и вносят в некоторые мясные продукты для придания им функциональных свойств.

Материалы и методы. Протеомные исследования проводили с препаратами курятины, говядины и свинины, а также образцами вареных колбас «Докторская» и «Любительская», которые были закуплены в торговых центрах Москвы. В качестве функционального сырьевого компонента исследовали коммерческий гидролизат куриного IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

белка НСР-Р-150, произведенного фирмой Proliver (Бельгия).

Основные протеомные технологии представляли собой модификации двумерного электрофореза по О`Фарреллу, которые выполняли как описано ранее [5]. Детекция белков на гелевых пластинах проводилась окрашиванием Кумасси R-250 и азотнокислым серебром. Цифровые изображения двумерных электрофореграмм получали сканированием и редактировали в графическом редакторе из пакетов программ ImageMaster 2D Platinum версия 7 («GE Healthcare», Швейцария).

Идентификацию белковых фракций на ДЭ осуществляли после трипсинолиза методами MALDI-TOF MS и MS/MS масс-спектрометрии на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Германия). Анализ полученных масс-спектров триптических пептидов выполняли с помощью программы Mascot («Matrix Science», США). О результатах идентификации судили по традиционным критериям:

показателю соответствия («score»), количеству совпавших пептидов («№ matched peptides») и покрытию ими полной аминокислотной последовательности идентифицируемого белка («coverage»). Кроме того, учитывалось сходство экспериментально полученных значений Mm и pI у идентифицируемого белка с соответствующими расчетными значениями [5].

Цитопротективные свойства препарата НСР-Р-150 определяли в модельных экспериментах, используя в качестве тест-объекта клеточную линию HT-29 и оценивая цитотоксичность путем витального окрашивания МТТ [6]. Клетки линии HT-29 были получены из ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.

Ивановского» (паспорт №68/12). Культивирование клеток проводили в гумифицированной атмосфере 5% CO 2 при 37С в СО 2 -инкубаторе («Sanyo», Япония) в среде Игла MEM («ПанЭко», Россия) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой («HyClone», США) и добавками стрептомицина («ПанЭко», Россия) и L-глутамина («ПанЭко», Россия).

Манипуляции, требующие стерильных условий, проводились в ламинарном шкафу второго класса защиты («Jouan», Франция).

Результаты. Фракционирование основными модификациями двумерного электрофореза с изоэлектрофокусированием в амфолиновом (IEF-PAGE) или иммобилиновом (IPG-PAGE) градиентах pH белковых экстрактов из образцов курятины, говядины и свинины, а также образцами вареных колбас «Докторская» и «Любительская» обеспечило получение во многом сходных протеомных профилей, которые состояли из нескольких десятков (до сотни) белковых фракций, окрашиваемых Кумасси R-250. Выявляемые фракции характеризовались значениями IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

';

молекулярных масс (Мм) от 220 кДа до 10 кДа и располагались в широком диапазоне изоэлектрических точек (pI).

На Рис. 1 в качестве примера представлена типичная двумерная электрофореграмма белков, экстрагированных из образцов бедренных мышц кур, на которой присутствуют более 100 фракций. Среди них ряд фракций идентифицировали масс-спектрометрическими методами.

Проведенная идентификация ряда белковых фракций на двумерных электрофореграммах куриного, говяжьего и свиного мяса методом MALDI-TOF масс-спектрометрии позволила выявить ряд видоспецифичных белков. Эти белки у изучавшихся видов выполняют одинаковые функции, но различаются по первичной структуре, что выражается в регистрируемых изменениях изоэлектрических точек и/или молекулярных масс. В частности, подобными свойствами обладали некоторые миозиновые легкие цепи, а также мышечная енолаза 3, триозофасфатизомераза 1 и тропонины быстрого типа. Таким образом, указанные белки могут найти применение как биомаркеры присутствия соответствующего сырья в готовом мясном продукте. На Рис. 2, в качестве примера показаны результаты протеомного анализа образцов колбасы «Докторская» в одно из которых было обнаружено присутствие куриной енолазы.

Параллельно с изучением белкового состава анализировались биологические свойства функционального сырьевого компонента, вносимого в мясные продукты для придания им функциональных свойств.

Цитопротективные свойства изучались in vitro на культуральной модели кишечной стенки на основе культивируемых клеток человека линии НТ-29 (аденокарцинома кишечника) в отношении цитотоксичности, индуцированной ионами тяжелых металлов. Результаты данных исследований позволили выявить, что функциональный сырьевой компонент, полученный при гидролизе мышечных и коллагеновых белков, обладает достоверными цитопротективными свойствами (Рис. 3).

Выводы. В результате проведенных исследований экспериментально обоснована возможность использования протеомного подхода для анализа видоспецифичности сырья, используемого в пищевой промышленности. Показано, что in vitro эксперименты на культуральных модельных тест-системах позволяют подтвердить биофункциональные свойства у некоторых сырьевых компонентов, используемых в пищевой промышленности.

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

Рис. 1. Двумерная электрофореграмма белков скелетной мышцы кур (Gallus gallus). Окраска Кумасси R250. Справа показаны белки – маркеры молекулярных масс (в кДа). Пунктирными прямоугольниками выделены зоны расположения ряда основных саркомерных белков: А/Д актин – десмин; ТПМ – тропомиозины; ТнТ – изоформы тропонина Т; МЛЦ – миозиновые легкие цепи.

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

Рис. 2. Фрагменты двумерных электрофореграмм (область расположения изоформ мышеной енлолазы) исследованных образцов колбасных изделий. Желтыми овалами отмечены изоформы бычьей и свиной мышечной енолазы; черной стрелкой показана дополнительная фракция, обнаруженная при анализе одного из коммерческих образцов колбасы «Докторская» и идентифицированная как мышечная енолаза курицы.

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

Рис. 3. Цитопротективное действие исследованного биофункционального сырьевого компонента на клетки НТ-29 при добавлении в среду ионов кадмия в концентрации 10 мкМоль/л (18 ч инкубации).

Литература 1. Singh V.P., Sachan N. Meat species specification to ensure the quality of meat-a review // Int J Meat Sci. – 2011. – №1. – С. 15-26.

2. Bendixen E. The use of proteomics in meat science // Meat Sci. – 2005. – № 71.

– С. 138-149.

3. Hasler C. M. Functional foods: their role in disease prevention and health promotion // Food Technol. – 1998. – №52. – С. 63-70.

4. Arihara K. Strategies for designing novel functional meat products. // Meat Sci. – 2006. – V.74. – №1. – P.219-229.

5. Ковалева М.А., Ковалев Л.И., Торопыгин И.Ю., Шигеев С.В., Иванов А.В., Шишкин С.С. Протеомный анализ белков скелетной мышцы (m. vastus lateralis) человека, идентификация 89 белковых продуктов генной экспрессии. // Биохимия. – 2009 – Т.74. – №11. – С.1524-1538.

6. Wen Y.F., Zhao J.Q., Bhadauria M., Nirala S.K. Baicalin prevents cadmium induced hepatic cytotoxicity, oxidative stress and histomorphometric alterations // Exp Toxicol Pathol. –2013. – №65. – С.189-196.

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПИТАНИЯ БОДИБИЛДЕРОВ

ПРИ СНИЖЕНИИ ВЕСА

Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого При снижении веса в бодибилдинге применяются низкоуглеводные, содержащие минимальное количество жиров, высокопротеиновые диеты.

Для бодибилдинга было разработано несколько высокопротеиновых низкоуглеводных диет, предусматривающих экстремально низкое потребление углеводов – пять дней в неделю (от 30 до 0 г в день) – и увеличение их количества в выходные дни. При этом в низкоуглеводные дни выход инсулина будет минимальным, зато максимальной будет секреция других гормонов, в том числе тестостерона и гормона роста, мобилизующих жиры и помогающих протеканию анаболических процессов в мышцах [1, 3].

В выходные дни углеводная загрузка повысит инсулин, который является анаболиком и обеспечивает эффективное восполнение запасов гликогена в мышцах и печени. Конечным результатом должно стать минимальное количество жира в организме и максимальное сохранение мышечной массы.

Главный принцип диеты в предсоревновательный период в бодибилдинге – это контроль за динамикой уровня инсулина в крови.

Инсулин необходим как для метаболизма углеводов, так и протеинов, обеспечивая поступление углеводов в клетки и аминокислоты в мышцы.

При этом инсулин является мощным липогенным гормоном, способствующим и синтезу, и депонированию жира [8].

Считается, что для интенсивных тренировок необходимы углеводы, дефицит которых восполняется за счет глюконеогенеза. При этом 57% потребляемого протеина напрямую превращаются печенью в глюкозу.

Кроме того, со временем активизируется липолиз, и для энергообеспечения используются не только липиды, но и побочные продукты их метаболизма.

Некоторые исследования показывают, что омега-3 жирные кислоты, обнаруженные в рыбьем жире, даже способны блокировать многие негативные эффекты потребления насыщенных жиров, например, подъем уровня триглицеридов в крови [6].

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

Одна из омега-3 жирных кислот – ЕРА способна повышать содержание энзима СРТ-1, который совместно с карнитином участвует в транспортировке жирных кислот в клеточные митохондрии, где в процессе бета-оксидации жир окисляется. Минимальная дневная доза омега-3 жиров составляет 4 г.

Одновременно необходимо увеличить прием витамина Е (по крайней мере, 400 международных единиц в день) – активного антиоксиданта.

Вместе с другими диетарными антиоксидантами он препятствует образованию свободных радикалов, усиливающемуся вместе с ростом потребления омега-3 жирных кислот.

Для сохранения максимума мышечной массы диету лучше начать за 12 недель до выступления и стараться не терять более 0,5–1 кг в неделю.

При снижении ежедневного калоража питания на 500–1000 единиц в течение одной недели потеря жира составит 0,5–1 кг.

Большинство бодибилдеров начинают терять жир при энергопотреблении в 30–35 калорий на килограмм веса.

Следует отметить, что еженедельная потеря жира вследствие ограничения ресурса энзимов не может превышать 1,5 кг, даже если перейти на полное голодание.

Соответственно, более интенсивное снижение веса происходит не только за счет жиров, но и углеводов, белков и воды.

Наблюдения показывают, что все углеводы, принятые после тренировки, сразу же используются для пополнения запасов гликогена;

на протяжении примерно 2 ч не теряется ничего. Прием в это время комбинации углеводов и протеина вызывает анаболические эффекты в мышцах и ускоряет восстановительный процесс, не ослабляя действия низкоуглеводной диеты.

В ходе одного эксперимента потребленные атлетами после тренировки 900 г углеводов почти полностью были использованы для пополнения запасов гликогена, а оставшиеся быстро окислились в печени. Послетренировочный прием углеводов вызывал также клеточный гидратационный эффект, что способствовало протеканию анаболических процессов в мышцах и одновременно тормозило катаболические.

Еще одним поводом не исключать углеводы из своего рациона полностью служит тот факт, что с потерей жира растет чувствительность к инсулину. На потребление протеина это оказывает как положительный, так и отрицательный эффект.

При инсулиновой резистентности, сопутствующей обычно высокому содержанию жира в организме, после приема большой порции протеина IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

– более 50 г, сохраняется стабильный уровень глюкозы в крови [2].

В отличие от этого при сохраненной чувствительности к инсулину после приема чистого протеина отмечается снижение уровня глюкозы в крови.

Углеводы способствуют высвобождению инсулина, который, в свою очередь, активирует транспортировку креатина. Аналогичного эффекта можно добиться, принимая креатин с быстроусвояемым сывороточным протеином.

В то же время углеводы не являются необходимым пищевым ингредиентом, и в отличие от незаменимых аминокислот или жирных кислот они могут быть синтезированы в печени из протеина.

Соответственно, применение низкоуглеводной диеты требует увеличения количества потребляемого протеина. При этом избыточный протеин конвертируется печенью в углеводы.

Следует отметить, что энергообеспечение центральной нервной системы происходит за счет расщепления углеводов, что при их недостаточном поступлении или образовании существует риск развития функциональных нарушений и психоэмоциональных расстройств [4, 7].

В связи с этим необходимо обеспечение поступления и синтеза глютамина в достаточном количестве, поскольку во время низкоуглеводной диеты его содержание в мышечной ткани за счет использования в качестве энергетического субстрата снижается на 25% и более. При этом полностью покрыть дефицит глютамина за счет его перорального приема не представляется возможным.

Большое значение имеет время, остающееся у спортсмена после процедуры определения весовой категории и снижения веса до выступления. При этом, чем больше этот интервал, тем эффективнее его можно использовать для восстановления запасов гликогена, воды, возмещения электролитов, потерянных в процессе дегидратации.

Целесообразным представляется:

– большую часть лишнего веса убрать постепенно в течение предсоревновательного периода, а остаточный вес – путем дегидратации за 24–48 ч до соревнований;

– стараться, чтобы соревновательному периоду сопутствовал высокоуглеводный рацион (60–70% потребляемой энергии за счет углеводов) в сочетании с аминокислотными комплексами, поскольку запасы гликогена мышц и печени должны адекватно восполняться;

– рекомендуемое количество белка 1,2–1,8 г/кг массы тела, причем соотношение «количество белка / количество получаемой энергии»

важно и должно увеличиваться в случае снижения калорийности IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

рациона;

– употреблять витаминно-минеральные комплексы во время соревнований, особенно, если количество потребляемой пищи ограничивается в течение более 8–10 недель;

– поддерживать нормальную гидратацию в ходе предсоревновательного периода за исключением 24–48-часового периода до процедуры определения весовой категории в случае, если необходима коррекция веса путем дегидратации;

– в случае необходимости использования дегидратации для коррекции веса стараться максимально удлинять период времени между процедурой определения весовой категории и выступлением в целях использования этого времени для восстановления энергетических запасов и запасов воды в организме. Для этого хорошо подходят спортивные напитки (5–10% углеводов и электролиты) в сочетании с высокоуглеводными продуктами спортивного питания [5].

К сожалению, в большинстве своем мониторинг за состоянием здоровья спортсмена не выдерживает никакой критики, а иногда попросту отсутствует. Соответственно, дополнительный прием продуктов спортивного питания производится огульно и основывается на опыте тренера и направлен на достижение максимально высоких спортивных достижений в ущерб здоровью спортсмена, его спортивного и биологического долголетия. Поэтому эффективность применения спортивного питания как продукта оздоровления, нормализации обмена веществ и геропротектора рассматривать не следует, поскольку в спорте высших достижений важен в первую очередь спортивный результат здесь и сейчас, а проблемы самого спортсмена отступают на второй–третий план.

Литература 1. Арансон М.В. Питание для спортсменов / М.В. Арансон. М., 2001. 222 с.

2. Барабанов А. Особенности атлетических тренировок катаболической направленности / А. Барабанов // Санкт-Петербург родина отечественного атлетизма: междунар. сб. научно-метод. тр. СПб., 2004. С. 41–43.

специализированном питании спортсменов / Н.И. Волков, В.И. Олейников.

М., 2001. 79 с.

4. Левин М.Я. Основы спортивной иммунологии / М.Я. Левина, В.М. Шубина.

СПб., 2006. 224 с.

5. Максимюк Н.Н. Физиологическая роль и значение микроэлементов в питании человека / Н.Н. Максимюк, М.И. Степанов, Г.К. Альхамова // Материалы III научно-практ. конф. с международным участием IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

«Современное состояние и перспективы развития пищевой промышленности и общественного питания». Том II. Общественное питание. Нутрициология. Челябинск: ЮУрГУ, 2010. С. 55–58.

6. Регулирование массы тела в единоборствах и биологически активные добавки (БАД): метод. пособие / сост. С.А. Полиевский, Б.А. Подливаев, О.В. Григорьева. М., 2002. 56 с.

7. Салехов С.А. Патогенез нарушения белоксинтезирующей функции печени при интенсивном снижении веса у спортсменов / С.А. Салехов, А.М. Маратова, Н.Н. Максимюк// Вестн. Новг. гос. ун-та. Сер.:

Медицинские науки. 2013. №71. Т.1. С.109–114.

8. Miller Brand-J.C. Insulin sensitivity predicts glycemia after a protein load / Brand-J.C. Miller et al. // Metabolism. 2000. Vol. 49. P. 1–5.

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

ВЛИЯНИЕ ВИТРЭКТОМИИ НА ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО

ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ У ПАЦИЕНТОВ С ПОМУТНЕНИЯМИ

СТЕКЛОВИДНОГО ТЕЛА

ГБУ «Краевая клиническая больница №1 им. проф. С.В.Очаповского, Цель - изучить активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови у пациентов с помутнениями стекловидного тела (ПСТ) при проведении витрэктомии.

Материалы и методы. Исследование показателей ПОЛ у пациентов с ПСТ - концентрации гидропероксидов (ГП) и продуктов, активных при реакции с тиобарбитуровой кислотой – (ТБК-АП), и уровень общей антиокислительной активности (АОА) – проводили до операции, через 1 неделю и 6 месяцев после проведения витрэктомии. Группу контроля составили 20 пациентов.

Результаты и обсуждение. Дооперационное обследование показало, что все значения ПОЛ соответствовали таковым в группе контроля (р>0,05). В раннем послеоперационном периоде по отношению к норме изменялся только уровень АОА (р0,05).

Заключение. Развитие процесса помутнений стекловидного тела и их оперативное лечение оказывает минимальное влияние на показатели антиоксидантного статуса организма в целом.

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

ЗНАЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ ТЕРАПИИ В РАЗВИТИИ

ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ВИТРЭКТОМИИ

ГБУ «Краевая клиническая больница №1 им. проф. С.В.Очаповского, Цель - изучить частоту развития катаракты при проведении витрэктомии у пациентов с гемофтальмом.

Материалы и методы. Всего было обследовано 45 пациентов с гемофтальмом. В I группе (n=24) при проведении операции использовались стандартные сбалансированные солевые растворы (ССР);

во II группе (n=21) использовались ССР с антиоксидантом (глутатионом) – BSS plus. Пациентов обследовали до операции и через 6 месяцев после проведения витрэктомии.

Результаты и обсуждение. Дооперационное обследование показало, что катаракта отмечалась у 8 пациентов в каждой из групп.

Спустя 6 месяцев минимальное прогрессирование катаракты наблюдалось у пациентов II группы (возникла только у 1 человека), в I группе отмечалось увеличение частоты встречаемости катаракты в 2, раза (с 33,3 до 75%).

Заключение. Проведение витрэктомии с дополнительным интраоперационным введением антиоксидантов является оптимальным с точки зрения функциональных результатов - прогрессирования катаракты.

IV - Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии. Октябрь 2013. Том II.

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ У

ПАЦИЕНТОВ С ГЕМОФТАЛЬМОМ

ГБУ «Краевая клиническая больница №1 им. проф. С.В.Очаповского, Цель – изучить активность супероксиддисмутазы (СОД) в слезной жидкости (СЖ) у пациентов с гемофтальмом.

Материалы и методы. Исследование СОД в СЖ было проведено у 24 пациентов - до операции, через 1 неделю и 6 месяцев после проведения витрэктомии. Группу контроля составили 20 пациентов.

ксантиноксидаза-ксантин-нитросиний тетразолий по методу Sun Y. и выражали в условных единицах (U) на мг или на мл.

Результаты и обсуждение. Дооперационное обследование показало, что уровень СОД превышал показатели нормы в 1,8 раза