Министерство образования и науки Российской Федерации

УДК 577.2:616-006

ГРНТИ 34.15.51, 76.03.31, 76.29.49, 76.35.33

Инв. №

УТВЕРЖДЕНО:

Исполнитель:

Федеральное государственное бюджетное

учреждение "Научно-исследовательский

институт онкологии" Сибирского отделения

Российской академии медицинских наук

От имени Руководителя организации

/ Чойнзонов Е.Л /

М.П.

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ

ОТЧЕТ о выполнении 6 этапа Государственного контракта № П320 от 07 мая 2010 г. и Дополнению от 17 марта 2011 г. № 1, Дополнению от 23 марта 2012 г. № 2 Исполнитель: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научноисследовательский институт онкологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.

Проект: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований Руководитель проекта:

/Кондакова Ирина Викторовна (подпись) Томск 2012 г.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

по Государственному контракту П320 от 07 мая 2010 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд Организация-Исполнитель: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Руководитель темы:

доктор медицинских наук, Кондакова И. В.

профессор подпись, дата Исполнители темы:

доктор медицинских наук, Клишо Е. В.

без ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Спирина Л. В.

наук, без ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Шашова Е. Е.

наук, без ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Савенкова О. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Авдеенко Т. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Фролова А. Е.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Коваль В. Д.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Колегова Е. С.

Отчет 95 с., 1 ч., 1 рис., 12 табл., 31 источн., 0 прил.

Биология злокачественных новообразований, метастазирование, раковый деградом, матриксные металлопротеиназы, протеасомы, химотрипсинподобная активность протеасом, субъединицы протеасом, рецепторы эстрогенов и прогестерона В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 6 этапу Государственного контракта № П320 "Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований" (шифр "НК-541П") от 07 мая 2010 по направлению "Общая биология и генетика" в рамках мероприятия 1.2.1 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.", мероприятия 1.2 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук и кандидатов наук", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий." федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы.

Цель работы - Обобщение результатов поисковой научно-исследовательской работы, полученных на I - V этапах.

Обобщение и оценка результатов исследования, включая оценку полноты решения задач и достижения поставленной цели, а также сопоставление полученных результатов с мировым уровнем с применением пакет прикладных статистических программ «Statistica и База данных Pubmed по биомедицинским публикациям.

Персональный компьютер с доступом в Интернет, ГОСТ 7.32-2001, База данных Pubmed по биомедицинским публикациям Комплексно оценена роль основных матриксных и внутриклеточных компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных опухолей человека, что позволяет на основе полученных данных создать новые критерии прогноза онкологических заболеваний и разаработать новые походы к индивидуальному лечению больных.

Нет

СОДЕРЖАНИЕ

1. Аннотированная справка по научным результатам НИР, полученным на 2. Аналитический отчет о проведении экспериментальных исследований 2.1. Обобщенная характеристика больных, вошедших в исследование металлопротеиназ в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи 2.4. Изучение протеасомной системы как одной из основных 2.4.1 Тотальная активность протеасом и активность 26S и 20S пулов протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при опухолях различной 2.4.2. Субъединичный состав протеасом в опухолях различной локализаций и 2.4.3. Связь субъединичного состава протеасом с клиникоморфологическими параметрами при опухолях различной локализации 2.4.4.Взаимосвязь тотальной активности протеасом, активности 26S и 20S пулов протеасом и субъединичного состава протеасом с уровнем рецепторов 2.5. Оценка эффективности полученных результатов в сравнении с 3.1. Полученные в ходе работы модели, методы, и алгоритмы, позволяющие 3.2. Рекомендации по возможности использования результатов НИР в 3.3 Разработка рекомендаций по использованию результатов НИР при 4. Публикации результатов НИР. Экспертные заключения о возможности открытой публикации результатов НИР. Копии статей. Проведение 6 этапа исследований по проблеме: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность разработки новых подходов к прогнозированию и лечению злокачественных новообразований обоснована широкой распространенностью и социально-экономической значимостью онкологической заболеваемости в России и за рубежом. Необходимо получить новые молекулярные критерии, позволяющие прогнозировать развитие метастазов у онкологических больных, а также развить новые подходы к фармакологической коррекции рака. Исследование молекулярных механизмов этих процессов, наряду с канцерогенезом, является одной из приоритетных направлений современной медицины. К числу социальнозначимых онкологических заболеваний относятся рак молочной железы, занимающий первое место в структуре онкологической заболеваемости у женщин составляя 20%, рак тела матки – 7,2% и 3 место среди женской онкопатологии, злокачественные опухоли головы и шеи, которые в общей структуре онкологической заболеваемости занимают шестое ранговое место и составляют в среднем 16-18%, рак мочевого пузыря – 4,5% (8 место) рак почки – 4,3 % (9 место).

Среди большого количества биологически значимых показателей, которые могут помочь в прогнозе рака и выборе адекватной тактики лечения, особое место отводится поиску молекулярных маркеров, ассоциированных с развитием метастазов и рецидивов. К ним относятся клеточные или тканевые маркеры, определяемые непосредственно в опухолевой ткани и характеризующие определенные биологические особенности опухоли.

Метастазирование и рецидивирование злокачественных новообразований, являясь основной причиной летальности онкологических больных, не изучены в достаточной мере на молекулярном уровне. Изучение этих процессов при раке различных локализаций представляется актуальной проблемой.

полифункциональных ферментативных систем, к числу которых относятся протеолитические системы живых организмов, формирующие деградом.

Раковый деградом является одними из основных факторов метастазирования и инвазивного роста в связи с его участием на всех этапах развития неоплазий [1]. К основным компонентам ракового деградома относятся внутриклеточные и внеклеточные протеазы. На главную роль внеклеточных протеаз, обеспечивающих метастазирование опухолевых клеток, претендуют специфическими тканевыми ингибиторами (ТИМП) образуют сложный протеолитический комплекс, способный деградировать все основные белки внеклеточного матрикса [2]. Установлено, что ММП стимулируют миграцию злокачественных клеток, принимают участие в регуляции неоангиогенеза, противоопухолевого иммунного надзора [3,4]. Следует отметить, что большинство проведенных исследований носят экспериментальный характер и выполнены с использованием культур клеток. Единичные исследования, проведенные на клиническом материале, свидетельствуют о большой перспективности определения ММП и их тканевых ингибиторов для прогноза метастазирования [5].

Из всего многообразия внутриклеточных протеаз, наиболее вероятными участниками метастазирования представляются протеасомы, регулирующие мультисубъединичные белковые структуры, обладающие несколькими протеолитическими активностями. Протеасомы являются главным компонентом внутриклеточного ракового деградома и регулируют многочисленные клеточные процессы путем устранения белков и/или образования пептидов, в этих процессах участвующих [7]. Они представлены двумя пулами: 26S и 20S протеасомами [8, 9]. Деградация белков в протеасоме наблюдается при прикреплении к ним цепочки убиквитина и последующим гидроксилированием остатков пролина и аспаргина.

По набору протеолитических субъединиц протеасомы человека можно разделить на две группы – конститутивные и иммунные протеасомы.

Протеолитические субъединицы X, Y, Z конститутивных протеасом замещаются на субъединицы LMP7, LMP2 и LMP10, соответственно, при сборке иммунных протеасом [8, 10]. Субъединицы LMP2 и LMP10, как правило, встраиваются парой, а субъединица LMP7 может включаться в протеасомы либо совместно с этими двумя субъединицами, либо независимо от них, формируя таким образом множественные формы иммунных химотрипсинподобную (ХТП) активность, субъединицы Y и LMP2 – каспазаподобную активность, и субъединицы Z и LMP10 – трипсинподобную активность. При этом иммунные протеасомы обладают более выраженными ХТП и трипсинподобной активностями по сравнению с конститутивными формами [13]. Изменения субъединичного состава множественных форм протеасом отражаются в конечном итоге на активностях общего пула протеасом. Поэтому изменение активностей пула протеасом в разные периоды развития опухоли может быть уникальной характеристикой различных стадий заболевания.

Протеасомы ответственны за избирательную деградацию белков в клетке и, таким образом, играют ключевую роль в таких клеточных процессах, как регуляция апоптоза, пролиферации и клеточного цикла, противоопухолевой иммунной системы, неоангиогенеза, прогрессии и метастазирования опухоли. Протеасомы могут быть вовлечены в регуляцию инвазии и метастазирования злокачественных опухолей путем регуляции содержания и активности различных регуляторных белков [14]. Однако до настоящего времени не изучена патогенетическая роль протеасом в развитии злокачественных опухолей и их грозного осложнения - метастазов.

Таким образом, комплексное изучение экспрессии, активности и субъединичного состава внутриклеточных и внеклеточных протеаз при развитии злокачественных новообразовании различных локализаций создает предпосылки для формирования новых подходов к прогнозированию исхода заболевания и его лечению. Литературные источники не обладают достаточной информацией о роли компонентов ракового деградома в регуляции метастазирования злокачественных опухолей, что делает данную проблему особенно актуальной и значимой для дальнейшего изучения.

Целью исследования шестого этапа явилось обобщение результатов поисковой научно-исследовательской работы, полученных на I - V этапах.

Задачи исследования:

1. Статистическая обработка полученных результатов.

2. Обобщение и оценка результатов исследования, включая оценку полноты решения задач и достижения поставленной цели.

3. Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. АННОТИРОВАННАЯ СПРАВКА ПО НАУЧНЫМ РЕЗУЛЬТАТАМ НИР,

ПОЛУЧЕННЫМ НА ПРЕДЫДУЩИХ ЭТАПАХ

1. На первом этапе в результате аналитического обзора установлено, что благодаря развитию современных методов молекулярной биологии и биохимии в настоящее время получена обширная теоретическая база о роли компонентов ракового деградома в патогенезе опухолей. Среди всех компонентов ракового деградома наиболее перспективными для изучения в металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы, активность и субъединичный состав протеасом. Требуются исследования в этом направлении и протеолитических систем в развитии и метастазировании рака.

2. На втором этапе выявлены клинико-морфологические аспекты экспрессии маркеров системы матриксных металлопротеиназ (ММП) у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи. Экспрессия ММП- и ММП-9 опухолевыми клетками связана с гистологическим типом злокачественных новообразований; экспрессия маркеров не зависит от размера опухоли, но ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП) играют важную роль в метастазировании опухолей головы и шеи. В связи с этим, можно рекомендовать использовать определение экспрессии ТИМП-1 и ТИМП-2 в качестве факторов риска появления лимфогенных метастазов у больных опухолями головы и шеи, что может повлиять на характер лечебной тактики данной группы больных.

злокачественного процесса изменяется активность протеасом. Роль протеасом в распространении злокачественных опухолей неоднозначна и тканеспецифична. Механизмы, регулирующие метастазирование в различных злокачественных новообразованиях, вероятно, зависят от конкретных условий, характерных для определенных тканей и их особенностями метаболизма. Кроме того, полученные результаты, которые объясняют причину неэффективности бортезомиба – пока единственного противоопухолевого лекарства, действие которого направлено на подавление активности протеасом. Очевидно, что в периоды низкой активности протеасом это соединение не может приводить к желаемому эффекту.

4. На четвертом этапе показана важная роль субъединичного состава протеасом в развитии рака различных локализаций. В то же время, следует отметить тканеспецифичность протеасомной деградации белков, которая проявляется в разнонаправленном изменении тотального пула протеасом в различных опухолях. Для рака почки характерно снижение содержания Rpt субъединицы протеасом при появлении отдаленных метастазов. Увеличение размеров опухоли мочевого пузыря сопровождается увеличением активности протеасом, что протекает на фоне снижения тотального пула протеасом.

Поражении регионарных лимфоузлов при плоскоклеточном раке головы и шеи сопровождается изменением содержания LMP7 и LMP2субъединиц протеасом. Полученные данные могут стать основой для разработки новых дополнительных критериев прогноза развития онкологических заболеваний и поиска эффективных противоопухолевых средств.

5. На пятом этапе установлено, что протеасомы участвуют в метаболизме рецепторов эстрогенов. Изучение связей между изменениями в пуле протеасом и экспрессией рецепторов половых стероидных гормонов показало возможность их регуляции как 20S, так и 26S протеасомами.

Учитывая важность рецепторов эстрогенов и прогестерона в патогенезе рака молочной железы, выявление молекулярных механизмов их регуляции способствует пониманию биологических закономерностей развития злокачественных новообразований.

2. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ О ПРОВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Обобщенная характеристика больных, вошедших в исследование В исследование включены образцы операционного и биопсийного материала опухолевых и неизмененных тканей больных опухолями головы и шеи, раком эндометрия, молочной железы, почки, мочевого пузыря, взятых во время операции или эндоскопических процедур. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288), получено разрешение этического комитета института.

Всего было набрано 294 образца тканей опухолей, из них 99 образцов плоскоклеточных карциномам головы и шеи (среди которых в 62 образцах изучались показатели внеклеточного протеолиза, такие как ММП-1,2,9 и ТИМП-1,2; в 37 образцах ПКГШ изучалась система внутриклеточного протеолиза), также в исследование было включено 49 образцов рака эндометрия, 70 образцов рака молочной железы, 37 образцов рака почки, образцов рака мочевого пузыря. У всех больных, включенных в исследование, диагноз рака был морфологически верифицирован. Также была проведена морфологическая верификация неизмененной ткани.

Группу больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи составили 99 человек T1-3N0-3M0 (Табл. 1), средний возраст 57,7±2,19 лет.

Материал исследования составили послеоперационные образцы опухолевой и визуально неизменной ткани, находящейся на расстоянии не менее 1 см от границы опухолей.

Распределение больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи по стадиям заболевания Все опухоли имели гистологическое строение плоскоклеточных низкодифференцированный плоскоклеточный рак (НДПР) наблюдался у 26% пациентов, умереннодифференцированный плоскоклеточный рак (УДПР) высокодифференцированный плоскоклеточный рак (ВДПР).

морфологически верифицированным диагнозом рак эндометрия I-II стадии (n=49, средний возраст 56,8±1,5 лет). Iа стадию заболевания имели больных раком эндометрия, Ib – 24 больных, Iс – 3 пациента, II стадию – больных (Табл. 2).

соответствовали рекомендуемым алгоритмам объемов диагностики и лечения здравоохранения и социального развития РФ и включали на первом этапе оперативное вмешательство, а на втором – лучевую терапию.

Распределение больных раком эндометрия на группы в зависимости от Также была сформирована группа больных раком молочной железы, в которую вошли 70 человек в возрасте 33-85 лет (средний возраст больных составил 54±1,6 лет) со стадией Т1-4N0-3М0. У всех больных, включенных в исследование, диагноз рака молочной железы был морфологически верифицирован. У 30 пациентов неоадьювантная химиотерапия не проводилась. У 40 пациентов лечение включало в себя проведение 2 – курсов неоадьювантной химиотерапии (НАХТ) по схемам CMF, CAF, FAC с последующим выполнением хирургического вмешательства в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. При изучении активности протеасом и активности 20S и 26S пулов протеасом в зависимости от проведения НАХТ достоверных различий не обнаружено. В послеоперационном периоде всем больным проводилось 4 курса адьювантной химиотерапии по одной из вышеуказанных схем, лучевая и антиэстрогенная терапия по показаниям.

Все пациентки РМЖ были условно разделены в соответствии с возрастом на три группы: больные РМЖ моложе 40 лет, в возрасте от 41 года до 50 лет и старше 50 лет. В представленном исследовании большая часть пациенток была старше 50 лет – 45 человек (64%), в возрасте от 40 до 50 лет –14 человек (20%), больных до 40 лет – 11 человек (16%). Анализ состояния менструальной функции показал, что у 30 (43%) больных она была сохранена (средний возраст 44,3±4,3 лет), а 40 пациенток (57%) находились в менопаузальном периоде (средний возраст 59,1±7,7 лет). Распространенность заболевания определялась согласно международной классификации по системе TNM (6 Edition AJCC, 2002 г.). Оценивая распространенность опухолевого процесса, больные раком молочной железы были также разделены на группы в зависимости от сочетания размера первичного опухолевого очага и вовлеченности в опухолевый процесс регионарных лимфатических узлов (Табл. 3).

распространенности опухолевого процесса По гистологическому строению, среди опухолей молочной железы преобладают раки инвазивно- протокового строения, на их долю приходится 87%. На долю инвазивных дольковых раков в данном исследовании приходится 10%. Среди прочих форм рака по гистологическому строению были выявлены медуллярный и слизистый раки.

В исследование вошли 37 больных светлоклеточным раком почки T1-4N0-1M0-1 (средний возраст 56,7±2,2 лет) (Табл. 4).

Размер опухоли (Т) Наличие регионарных Наличие отдаленных Т3 – Т4 – У 8 больных раком почки диагностирована Т1 стадия, у 11 – Т2 стадия, у 15 – Т3 стадия и у 3 – Т4. Больные были разделены на группы в зависимости от наличия регионарных метастазов: 25 человек с опухолями почки не имели поражения регионарных лимфатических узлов, у 8 была выявлена стадия N2.

Отдаленные метастазы были обнаружены у 10 человек и 23 больных имели стадию М0 (отсутствие отдаленных метастазов).

Распределение больных раком мочевого пузыря на группы в зависимости от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли Группу больных с опухолями мочевого пузыря составили 39 больных с дифференцировки T2-3N0M0 (средний возраст 57,2±1,8 лет) (Табл. 5).

Таким образом, конечный этап работы был выполнен с использованием онкологических больных, которым проведено специальное обследования для установления стадии опухолевого процесса и гистологической верификации опухолевого процесса.

2.2 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 8.0. Проверка нормальности распределения исследуемых выборок проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для использованием непараметрического критерия Спирмена. Также был проведен дисперсионный анализ с использованием непараметрического критерия Краскол-Уоллиса (F). В таблицах все результаты представлены как m±M, где m-среднее выборочное, M – ошибка среднего. Различия считались