Министерство образования и науки Российской Федерации

УДК 577.2:616-006

ГРНТИ 34.15.51, 76.03.31, 76.29.49, 76.35.33

Инв. №

УТВЕРЖДЕНО:

Исполнитель:

Учреждение Российской академии медицинских

наук Научно-исследовательский институт

онкологии Сибирского отделения РАМН

От имени Руководителя организации

Директор

/ Чойнзонов Е.Л./

М.П.

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ

ОТЧЕТ о выполнении 3 этапа Государственного контракта № П320 от 07 мая 2010 г. и Дополнению от 17 марта 2011 г. № 1 Исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт онкологии Сибирского отделения РАМН Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.

Проект: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований Руководитель проекта:

/Кондакова Ирина Викторовна (подпись) Томск 2011 г.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

по Государственному контракту П320 от 07 мая 2010 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд Организация-Исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт онкологии Сибирского отделения РАМН Руководитель темы:

доктор медицинских наук, Кондакова. В.

профессор подпись, дата Исполнители темы:

кандидат медицинских Клишо Е. В.

наук, без ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Спирина Л. В.

наук, без ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Савенкова О. В.

ученого звания подпись, дата кандидат медицинских Шашова Е. В.

наук, без ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Комарова Т. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Асадчикова О. Н.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Хворилова К. В.

ученого звания подпись, дата без ученой степени, без Иванова Э. В.

ученого звания подпись, дата Отчет 63 с., 1 ч., 3 рис., 15 табл., 39 источн., 0 прил.

Биология злокачественных новообразований, метастазирование, раковый деградом, протеасомы, химотрипсинподобная активность протеасом, 20S- и 26S- пулы протеасом В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 3 этапу Государственного контракта № П320 "Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований" (шифр "НК-541П") от 07 мая 2010 по направлению "Общая биология и генетика" в рамках мероприятия 1.2.1 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.", мероприятия 1.2 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук и кандидатов наук", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий." федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы.

Цель работы - Изучение активности протеасом и их субъединичного состава в злокачественных опухолях различных локализаций во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами заболевания.

Методы, использованные при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту: 1. Определение тотальной активности и активности пулов протеасом 20S и 26S) в тканях плоскоклеточных карцином, рака эндометрия, молочной железы, почки, мочевого пузыря флуориметрическим методом. Разделение пулов протеасом методом высаливания. 2. Статистическая обработка полученных результатов Сопоставление пердварительных показателей активности протеасом с клинико-морфологическими параметрами заболевания, такими как размер опухоли, стадия метастазирования, степень дифференцировки. 3. Подготовка результатов исследований для публикации в зарубежных журналах или в рекомендованных президиумом ВАК ведущих рецензируемых научных журналах со ссылкой на проведение НИР в рамках реализации ФЦП. 4.

Подготовка отчета реализации проекта третьего этапа работы.

Инструментарий, использованный при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту: Флуориметр ФФМ-1, весы электронные настольные «Shimadzu A*120», диспергатор «IKA ultra turrax», спектрофотометр «СФ-56, ломо-спектр», лабораторная центрифуга с охлаждением для микропробирок «Эппендорф 5415R», микродозаторы для дозирования микрообъемов жидкостей, низкотемпературная морозильная камера «Sanyo», pH-метр «Hanna Intrument - pHer+», Термостат ТС 1/ СПУ, персональный компьютер Результаты, полученные при выполнении отдельных видов работ (этапов) по Государственному контракту. Получены данные о тотальной активности протеасом и их пулов (26-S и 20-S протеасомы) в тканях плоскоклеточных карцином, рака эндометрия, молочной железы, почки, мочевого пузыря.

Сопоставлены показателей опухолевых тканей с нормальными тканями, что дает инфрмацию о различиях в функционировании внутриклеточного специфического протеолиза при опухолевой трансформации. Результаты сопоставлены со стадией онкологического процесса и степенью дифференцировки позволят судить о связи опухолевого роста и метастазирования с изучаемыми показателями представленными в различных злокачественных новообразованиях, что позволяет выяснить вклад протеасом в патогенез злокачественных опухолей. Результаты исследования могут быть основой для поиска специфических мишеней при таргетной терапии опухолей и для разработки новых маркеров метастазирования.

Нет

СОДЕРЖАНИЕ

1. Аналитический отчет о проведении экспериментальных исследований 1.2. Результаты экспериментальных исследований. Систематизация 1.2.2. Тотальная активность протеасом и активность 26S и 20S пулов протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при опухолях различной 1.2.2.1. Тотальная активность протеасом и активность пулов протеасом в 1.2.2.2. Тотальная активность протеасом и активность пулов протеасом в 1.2.2.3 Тотальная активность протеасом и активность 26S и 20S пулов протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при раке молочной железы 1.2.2.4. Тотальная активность протеасом и активность пулов протеасом в 1.2.2.5. Тотальная активность протеасом и активность пулов протеасом в 1.2.3. Связь тотальной активности протеасом и активности 26S и 20S пулов протеасом с клинико-морфологическими параметрами при опухолях 1.2.3.1. Связь активности протеасом с клинико-морфологическими параметрами при плоскоклеточных карциномах головы и шеи 1.2.3.2. Связь активности протеасом с клинико-морфологическими 1.2.3.3. Связь тотальной активности протеасом, активности пулов с клиникоморфологическими параметрами заболевания при раке молочной железы 1.2.3.4. Связь тотальной активности протеасом, активности пулов с клиникоморфологическими параметрами заболевания при раке почки и мочевого 1.3. Оценка полноты решения задач и достижения поставленных целей 1.4. Оценка эффективности полученных результатов в сравнении 1.5. Разработка рекомендаций по возможности использования результатов 1.6 Разработка рекомендаций по использованию результатов НИР при Экспертные заключения о возможности открытой публикации и Проведение 3 этапа исследований по проблеме: Исследование роли компонентов ракового деградома в патогенезе злокачественных новообразований

ВВЕДЕНИЕ

Важнейшими этапами патогенеза злокачественных новообразований являются усиленная пролиферация, ингибирование апоптоза, неоангиогенез, инвазия и метастазирование. Регуляция этих процессов может осуществляться на разных этапах: связывания гормонов и ростовых факторов с рецепторами, передачи сигнала, экспрессии генов, трансляции и белкового фолдинга и протеолитической деградации белков. Конечный регуляторный этап внутри клеток связан, прежде всего, с протеасомной системой, которая является одними из основных внутриклеточных составляющих ракового деградома.

Основным компонентом убиквитин-протеасомной системы являются протеасомы — мультисубъединичные комплексы, включающие каталитическое ядро - 20S, к которому присоединена одна или две регуляторные частицы. Если по крайней мере одной из этих частиц является РА700 (19S регуляторная частица), то образуется 26S протеасома, осуществляющая, главным образом, АТФ- и убиквитин-зависимый протеолиз большинства клеточных белков. Если же в роли регуляторной частицы выступает другой белок (РА28, РА200), то такая ассоциация представляет собой 20S протеасому и деградирует малые, аномальные и коротко живущие белки. 20S протеасомы представлены иммунными и конститутивными формами, образующимися при сочетании конститутивных (1234567) или иммунных (LMP 2, LMP 7) протеолитических субъединиц. Замена конститутивных субъединиц на иммунные приводит к образованию модифицированных форм протеасом и сопровождается изменением их активности [Almond J.B., Cohen G.M., 2002]. Протеасома обладает трипсиноподобной, химотрипсиноподобной, каспазной активностями. Относительное содержание протеасом в клетке, их состав и активность изменяются в соответствии с потребностями клетки и условиями, взаимодействию протеасом с большим количеством белков, а также благодаря механизмам регуляции на уровне транскрипции, которые на данный момент остаются мало изученными [Сорокин, 2009].

Протеасомы играют важную роль в поддержании функциональной активности клеток, в частности, в регуляции работы сигнальных систем, соответствующими рецепторами [Girnita L., Kim W.Y.,]. Нарушение в патологиями и имеет большое значение в развитии онкологических заболеваний. В экспериментальных условиях показано изменение активности и состава пула 26S протеасом в онкогенезе [Астахова]. В настоящее время активно изучается роль убиквитин-зависимого протеолиза в патогенезе злокачественных образований различных локализаций, в частности, предстательной железы [Li B.,2000], молочной железы [Chen C2006], кишечника [Voutsadakis I.A.] и др. Однако в этих исследованиях большое внимание уделяется изучению убиквитинирования белков, в то время как активность протеасом исследована недостаточно, в том числе, в опухолях, заболеваемости.

К числу социально-значимых онкологических заболеваний относят рак молочной железы, который занимает 1-е место у женщин и составляет 20% среди женской онкопатологии, рак тела матки, составляющий 7,2%;

злокачественные опухоли головы и шеи, которые в общей структуре онкологической заболеваемости занимают шестое ранговое место и составляют в среднем 16-18%; рак мочевого пузыря – 4,5% (8 место); рак почки – 4,3% (9 место). За последние годы сохраняется тенденция к неуклонному росту заболеваемости по всем вышеперечисленным локализациям. Так, по России в 2000 году стандартизованный показатель заболеваемости раком молочной железы составил 36,8%, смертности – 16,9%, а в 2008 г. число вновь выявленных больных возросло до 41,8%, а умерших до 19,2%. В России за последние 20 лет заболеваемость РЭ увеличилась в 2 раза и составляет 12,6 случая на 100 тыс. населения.

Плоскоклеточные карциномы головы и шеи представляют наиболее часто встречающиеся неоплазмы слизистой оболочки верхних дыхательных путей и являются существенной причиной заболеваемости и смертности [Е. Л.

Чойнзонов,]. Ежегодно в мире регистрируется более 500 000 новых случаев заболевания и более 270 000 случаев смертных исходов, смертность от ПКГШ составляет около 50%, а у 5 % пациентов развиваются рецидивы [Stewart; J.R. Grandis]. Заболеваемость раком мочевого пузыря в мире составляет 19.5, а смертность 7.9 случаев на 100 тыс. человек в год. В мире ежегодно регистрируется 208000 новых случаев рака почки и у больных в России ежегодно, составляя около 3 % от общей структуры злокачественных заболеваний.

В настоящее время не вызывает сомнения, что рак является мультифакториальным заболеванием. В механизмах развития злокачественных образований неотъемлемую роль играет протеасомная система, осуществляющая деградацию внутриклеточных белков.

Целью исследования третьего этапа явилось изучение активности протеасом и их субъединичного состава в злокачественных опухолях различных локализаций во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами заболевания.

Задачи исследования:

1. Определить тотальную активность и активность 20S и 26S пулов протеасом в тканях плоскоклеточных карцином головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, почки, мочевого пузыря.

2. Сопоставить значения тотальной активности и активности пулов протеасом (20S и 26S) в опухолевой и неизмененной тканях при плоскоклеточных карциномах головы и шеи, раке эндометрия, раке молочной железы, раке почки, раке мочевого пузыря.

3. Сопоставить показатели активности протеасом с клиникоморфологическими параметрами заболевания, такими как размер опухоли, стадия метастазирования, степень дифференцировки опухоли при опухолях различных локализаций.

Результаты исследования существенно расширят фундаментальные представления о биологических закономерностях опухолевого роста и метастазирования и сформируют новые представления о механизмах функционирования внутриклеточных протеаз в злокачественных новообразованиях человека.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ О ПРОВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На базе клинического отдела НИИ онкологии СО РАМН был проведен сбор операционного и биопсийного материала опухолевых и неизмененных тканей больных опухолями головы и шеи, раком эндометрия, молочной железы, почки, мочевого пузыря, взятых во время операции или эндоскопических процедур, а также сбор анамнеза пациентов и их обследование для обнаружения регионарных и отдаленных метастазов.

Всего собрано 220 образцов тканей опухолей. Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288), получено разрешение этического комитета института.

В соответствии с поставленной целью и задачами работы было проведено комплексное обследование 37 больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи, 49 больных раком эндометрия, 58 больных раком молочной железы, 37 больных раком почки, 39 больных раком мочевого пузыря.

1.1.1. Материал и объект исследования Материалом для исследования служили послеоперационные образцы опухолевой и визуально неизменной ткани, находящейся на расстоянии не менее 1 см от границы опухолевого очага. Также в исследование были включены образцы биопсийного материала опухолевой и неизмененной ткани. У всех больных, включенных в исследование, диагноз рака был морфологически верифицирован. Также была проведена морфологическая верификация неизмененной ткани.

После взятия образцы изучаемых тканей (опухолевая и неизмененная ткани), взятые из операционного материала, очищали от участков некроза и кровоизлияний, замораживали и хранили при -80 оС.

1.1.2. Методы исследования.

Во всех изучаемых тканях проводилось определение тотальной химотрипсиноподобной активности протеасом и активности 20S и 26S пулов протеасом. На первом этапе для определения тотальной активности протеасом и активности 20S и 26S пулов протеасом из изучаемых тканей получали осветленные гомогенаты. Для этого замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, мМ дитиотреитол, 1мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 минут при 10000g и 4оС.

Фракционирование протеасом. Все процедуры проводили при 4°С. Белки осветленных гомогенатов фракционировали с помощью сульфата аммония в два этапа. Фракцию, обогащенную 26S-протеасомами, получали добавлением сульфата аммония до 40% насыщения, фракцию 20S-протеасом – добавлением сульфата аммония до 70% насыщения [Абрамова Е.Б., 2006].

Определение активности протеасом. Химотрипсиноподобную активность тотального пула протеасом, содержащего формы 26S и 20S, определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC, утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом [Ben-Shahar S., 1999].

Реакционная смесь для определения активности тотального пула протеасом и пула 26S протеасом содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ. Реакционная смесь для определения активности пула 20S протеасом имела такой же состав за исключением MgCl2 и АТФ. Реакцию проводили при 370С в течение 20 мин.

Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре «Hitachi-850»

(Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1мг белка.

Содержание белка определяли по методу Лоури [Lowry, O.H. 1951].

1.1.3. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 8.0. Проверка нормальности распределения исследуемых выборок проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок. В таблицах все результаты представлены как m±M, где m-среднее выборочное, M – ошибка среднего. Различия считались