WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     || 2 |

«РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Кафедра биофизики

На правах рукописи

УДК 577.322.6

Наташин Павел Викторович

РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ

В БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ

03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

к.б.н. Е.С. Высоцкий Красноярск, ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 Биолюминесцентные белки.

Механизм биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемые фотопротеины 1.1 Пространственная структура Са2+-регулируемых 1. фотопротеинов 1.3 Особенности пространственной структуры Са2+-разряженного обелина 1.4 Возможные пути формирования 2-гидропероксицелентеразина 1.5 Функциональная роль остатков His и Tyr в формировании активного фотопротеинового комплекса 1.6 Механизм биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов 1.7 Механизм биолюминесцентных реакций других целентеразин-зависимых систем ГЛАВА 2 Материалы и методы 2.1 Клонирование, олигонуклеотид-направленный мутагенез 2.2 Выделение и очистка мутантов фотопротеина обелина Y138F и F88Y Получение Са2+-разряженных мутантов обелина 2. Y138F и F88Y со связанным целентерамидом 2.4 Получение анаэробного апо-обелин– целентеразинового комплекса 2.5 Определение удельной биолюминесцентной активности, концентрации белка и измерение спектров биолюминесценции 2.6 Измерение спектра поглощения апо-обелин– целентеразинового комплекса 2.7 Кинетические измерения методом остановленной струи (stopped-flow) 2.8 Кристаллография ГЛАВА 3 Пространственные структуры обелина Y138F и Са2+-разряженного обелина Y138F. Каталитическая 3.1 Пространственные кристаллические структуры обелина Y138F со связанным 2-гидропероксицелентеразином и Са2+-разряженного обелина Y138F 3.1.5 Спектральные и кинетические свойства обелина 3.2 Каталитическая функция молекулы воды и роль ГЛАВА 4 Пространственные структуры обелина F88Y и Са2+-разряженного обелина F88Y. Структурные основы особенностей спектров биолюминесценции 4.1 Пространственные кристаллические структуры обелина F88Y со связанным 2-гидропероксицелентеразином и Са2+-разряженного обелина F88Y 4.1.4 Системы водородных связей в лиганд-связывающей 4.2 Структурные основы особенностей спектров биолюминесценции Са2+-регулируемых ГЛАВА 5 Анаэробный апо-обелин–целентеразиновый комплекс.

Роль His 175 в процессе формирования активного 5.1 Взаимодействие целентеразина с апо-обелином 5.2 Спектры поглощения целентеразина в анаэробных 5.3 Взаимодействие свободного целентеразина 5.4 Спектральные свойства анаэробного апо-обелин– целентеразинового комплекса. Кинетика превращения апо-обелин–целентеразинового комплекса в активный 5.5 Определение ионной формы целентеразина, связанного с анаэробным апо-обелин– 5.6 His175 как возможный переносчик протона

ВВЕДЕНИЕ

Биолюминесценция является широко распространенным в природе явлением. Светящиеся виды были обнаружены среди живых организмов, различающихся не только средой обитания, но и уровнем структурной организации. Биолюминесцентные организмы можно встретить среди бактерий, грибов, простейших, кишечнополостных, червей, моллюсков, насекомых и рыб. Несмотря на то, что светящиеся организмы находятся на разных уровнях эволюционного пути, все они имеют одинаковую природу свечения. Фактически, биолюминесценция – это хемилюминесцентная реакция, которая протекает вследствие окисления субстрата – люциферина, специфическим ферментом – люциферазой. На самом деле, люциферины и люциферазы – это скорее собирательное и функциональное понятие, чем химическое, поскольку у разных организмов они являются соединениями различной структурной организации. Но, с другой стороны, это говорит о том, что биолюминесценция многократно и независимо возникала в ходе эволюции. За последнее время было сделано множество предположений о причинах возникновения биолюминесценции, а также важности данного явления для живых организмов. И, несмотря на то, что явление биолюминесценции исследуется уже более 100 лет, интерес ученых со всего мира к изучению данного феномена не ослабевает. В большей степени это объясняется широкими перспективами использования биолюминесцентных белков в аналитических целях. Поскольку современная техника обладает возможностями с высокой точностью регистрировать, измерять и характеризовать даже очень слабый световой сигнал, методы, основанные на использовании биолюминесцентных белков, позволяют работать с микроскопическими объемами исследуемых веществ. По этой причине биолюминесцентные методы нашли свое применение, например, в клеточной биологии для мониторинга внутриклеточных процессов, в экологии для биолюминесцентные технологии стремительно развиваются, поскольку данные методы находят новые области применения для решения широкого спектра аналитических задач.

широко представленных среди морских организмов, принадлежит к так биолюминесцентной реакции является целентеразин [Thompson et al., 1997].

Наиболее изученными представителями данных систем являются Са2+-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных животных.

Са2+-регулируемые фотопротеины, в большей или меньшей степени исследованные на настоящий момент, демонстрируют высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей, в пределах 65 – 75%, при этом практически все аминокислоты, формирующие субстрат-связывающую полость белка, консервативны. Фотопротеины представляют собой комплекс, состоящий из молекулы белка (~22 кДа) и «преактивированного»



кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентеразина), прочно, но не ковалентно связанного с белком [Shimomura, Johnson, 1978; Head et al., 2000;

Liu et al., 2000]. Реакция биолюминесценции инициируется добавлением «преактивированного» субстрата. В результате реакции образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и СО2. Переход целентерамида из возбужденного в основное состояние сопровождается излучением кванта света.

Сотрудниками лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН были клонированы кДНК гены, созданы экспрессионные конструкции и проводятся всесторонние исследования ряда целентеразин-зависимых белков, таких как: обелины из Obelia longissima и Obelia geniculata, клитин из Clytia gregaria, митрокомин Mitrocoma cellularia, светочувствительный фотопротеин беровин из гребневика Beroe abyssicola.

Большой интерес с теоретической и практической точек зрения вызывают результаты, полученные при изучении физико-химических свойств мутантов фотопротеинов с аминокислотными заменами в активном центре белка. Единичные замены некоторых аминокислотных остатков в существенным изменениям спектров биолюминесценции фотопротеинов [Deng et al., 2001; Malikova et al., 2003; Stepanyuk et al., 2005; Liu et al., 2006], кинетики формирования активного фотопротеина из целентеразина и апобелка [Eremeeva et al., 2009, 2013], а также кинетики реакции декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина [Vysotski et al., 2003; Liu et al., 2006]. В связи с данными наблюдениями у научного сообщества сформировался вопрос о роли отдельных аминокислотных остатков в биолюминесцентной реакции.

За последние годы были определены кристаллические структуры для четырех конформационных состояний Са2+-регулируемого фотопротеина обелина [Liu et al., 2000; Deng et al., 2004; Deng et al., 2005; Liu et al., 2006], пространственные структуры ряда других фотопротеинов и их мутантов, например, акворина [Head et al., 2000] и клитина [Titushin et al., 2010].

Полученные структуры позволили высказать предположения относительно функции некоторых аминокислотных остатков в биолюминесценции фотопротеинов [Shimomura, 2006; Высоцкий и др., 2006; Vysotski, Lee, 2004;

Vysotski, Lee, 2007]. Однако для более глубокого изучения данного вопроса является целесообразным осуществить всестороннее исследование свойств пространственную организацию.

Выяснение роли отдельных аминокислотных остатков активного центра Са2+-регулируемого фотопротеина в реакции биолюминесценции, безусловно, имеет и фундаментальное, и прикладное значение, так как является необходимым шагом в понимании явления биолюминесценции в целом. В перспективе это будет способствовать существенному повышению эффективности аналитического применения фотопротеинов, например, при их использовании в качестве репортерных молекул in vivo.

Целью работы являлось выяснение функциональной роли отдельных аминокислот активного центра Са2+-регулируемых фотопротеинов в процессе биолюминесценции.

Выполнение исследования требовало решения следующих задач:

1. Найти условия кристаллизации для мутантов обелина с заменой Tyr138 на Phe (Y138F) и Phe88 на Tyr (F88Y) для двух конформационных состояний – до и после биолюминесцентной реакции, т.е. связанных с субстратом, 2-гидропероксицелентеразином, и с продуктом реакции, целентерамидом, и ионами кальция, соответственно.

2. Получить дифракционные данные от кристаллов и построить установленной электронной плотности.

3. Исследовать биолюминесцентные свойства мутанта обелина Y138F.

4. Отработать технологию получения анаэробного комплекса апообелин–целентеразин и исследовать его свойства.

При решении поставленных задач были получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Пространственные структуры двух конформационных состояний (до и после биолюминесцентной реакции) мутанта обелина Y138F и его биолюминесцентные свойства доказывают участие молекулы воды, расположенной в субстрат-связывающей полости фотопротеинов, в реакции декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина через протонирование диоксиэтанонового интермедиата. Остаток Tyr относительно субстрата для обеспечения максимальной скорости биолюминесцентной реакции.

2. Пространственные структуры двух конформационных состояний (до и после биолюминесцентной реакции) мутанта обелина F88Y, имеющего спектр биолюминесценции, практически совпадающий со спектром биолюминесценции акворина, доказывают, что отличие спектров биолюминесценции этих Са2+-регулируемых фотопротеинов обусловлено различной организацией сети водородных связей около атома кислорода 6-(п-гидрокси)-фенильной группы 2-гидропероксицелентеразина, зависящей от присутствия Phe или Tyr в полости 3. В анаэробных условиях апо-обелин и целентеразин образуют прочный комплекс. В анаэробном комплексе целентеразин связан в двух формах – протонированной и в форме C2(-) аниона. Процесс образования активного фотопротеина при экспозиции анаэробного комплекса апо-обелин–целентеразин кислороду протекает в несколько стадий. His175 в обелине играет ключевую роль в формировании активного фотопротеина, выполняя функцию переносчика протона при образовании 2-гидропероксицелентеразина.

Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию роли отдельных аминокислотных остатков в процессе биолюминесценции фотопротеинов кишечнополостных. В дальнейшем полученные результаты найдут свое применение в фундаментальных и прикладных исследованиях. Например, установление роли отдельных аминокислотных остатков в биолюминесцентной реакции в будущем позволит сконструировать мутантные формы фотопротеинов с измененными физико-химическими свойствами (увеличенная удельная активность, определенные спектральные свойства, измененная кинетика активности, термостабильность и т. д.) применительно к каждой конкретной задаче. Это, безусловно, найдет широчайшее применение при разработке новых биолюминесцентных технологий для биологии, медицины, фармацевтической промышленности.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов РФФИ №09-04-00172, 12-04и 12-04-91153-ГФЕН, Программы Правительства РФ по привлечению ведущих ученых в образовательные учреждения (№11.G34.31.0058) и НШ №3951.2012.4.

Международном симпозиуме SISCS' 2012 (г. Куньмин, КНР, 2012 г.), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, на объединенных биолюминесцентных семинарах Сибирского федерального университета и семинарах Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КНР).

Результаты исследований опубликованы в 3-х статьях в рецензируемых журналах и включены в международную базу данных PDB.

ГЛАВА 1 Биолюминесцентные белки. Механизм биолюминесцентной 1.1 Са2+-регулируемые фотопротеины Биолюминесценция – повсеместно распространенное явление живой природы. В настоящее время известно огромное количество различных биолюминесцентных видов животных – несколько тысяч. На суше светящиеся организмы представлены в меньшей степени, чем в мировом океане. Это – бактерии, насекомые, черви и грибы. Но среди морских обитателей способность к самосвечению распространена более широко, для 90% жителей глубоководных районов океана она является неотъемлемой частью жизнедеятельности. Интересно, что при существовании различных биохимических механизмов биолюминесценции большое количество светящихся организмов использует один и тот же субстрат (и его производные) – целентеразин [Thompson et al., 1997].

На данный момент наиболее исследованы биолюминесцентные белки, использующие целентеразин как субстрат (рис. 1.1А). Такими белками являются Са2+-регулируемые фотопротеины [Shimomura, 2006; Высоцкий и др., 2006; Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007], ответственные за свечение морских кишечнополостных животных [Morin et al., 1971; Morin, 1974].

Термин “фотопротеины“ был введен Шимомурой и Джонсоном [Shimomura, Jonson, 1966] как общее определение предварительно заряженных белков, не требующих для своей работы наличия молекул кислорода и излучающих свет при взаимодействии с ионами металлов. Энергия запасена в предварительно заряженном белке и излучается в ходе реакции. Поскольку в большинстве известных фотопротеиновых систем реакция запускается добавлением ионов кальция, Гастингсом и Мориным был предложен термин “Са2+-регулируемые фотопротеины“ [Hastings, Morin, 1969].

На сегодняшний день известно более 25-ти видов кишечнополостных животных, за свечение которых ответственны фотопротеины. Но только для семи из них получены коплементарные ДНК, все они в разной степени исследованы и охарактеризованы: акворин [Prasher et al., 1985; Inouye et al., 1985], митрокомин [Fagan et al., 1993] и клитин [Inouye et al., 1993] из медуз Aequorea, Mitrocoma (Halistaura) и Clytia (Phialidium) [Shimomura, 1962; Shimomura, 2006]; обелины из гидроидов Obelia geniculata [Markova et al., 2002] и Obelia longissima [Campbell, 1974;

Высоцкий и др., 1989]; мнемиопсин и беровин из ктенофор (гребневиков) Mnemiopsis и Beroe [Ward, Seliger, 1974; Ward, Cormier, 1975].

Рисунок 1.1 – Химическая структура целентеразина (А), 2-гидропероксицелентеразина (Б) и целентерамида (В).

Са2+-регулируемые фотопротеины представляют собой стабильный в отсутствие ионов кальция фермент-субстратный комплекс, состоящий из апобелка и молекулы субстрата – преактивированного кислородом целентеразина, 2-гидропероксицелентеразина (рис. 1.1Б), прочно, но нековалентно связанного с белком [Shimomura et al., 1978, Hastings et al., 1963]. Биолюминесценция инициируется конформационными изменениями молекулы белка, опосредованными связыванием ионов кальция, и является следствием декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина. Несмотря на то, что ионы кальция являются триггером биолюминесцентной реакции, для фотопротеинов также характерен очень низкий уровень самосвечения – Са2+-независимая люминесценция [Allen et al., 1977]. Продуктами реакции являются молекула целентерамида (рис. 1.1В) в возбужденном состоянии и CO2. Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта света.

Биолюминесценция фотопротеинов наблюдается в диапазоне длин волн 465-490 нм и зависит от организма, из которого фотопротеин выделен [Shimomura et al., 1963; Ohmiya, Hirano, 1996; Vysotski, Lee, 2004].

Реакция биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов не зависит от каких либо дополнительных элементов, кроме кальция, в том 2-гидропероксипроизводного целентеразина [Shimomura et al., 1978]. Это свойство отличает фотопротеины от классических люциферинлюциферазных систем, которые способны функционировать только в присутствии молекулярного кислорода.

Са2+-регулируемые фотопротеины, связанные с 2-гидропероксицелентеразином, не флуоресцируют. Яркую флуоресценцию можно наблюдать только после биолюминесцентной реакции, так как белок остается связанным с продуктом реакции – целентерамидом [Shimomura et al., 1962;

Cormier et al., 1973]. Поэтому фотопротеин способен делать только один каталитический оборот. Эта особенность является еще одной отличительной характеристикой фотопротеиновой биолюминесцентной реакции в сравнении с классическими люциферин-люциферазными реакциями, в которых продукт высвобождается из активного центра белка после окончания реакции окисления.

Са2+-регулируемые фотопротеины ответственны за свечение не только кишечнополостных животных – представителей класса Hydrozoa, но и морских гребневиков (ктенофор) Mnemiopsis и Beroe [Ward, Seliger, 1974;

Ward, Seliger, 1976]. Ктенофорные фотопротеины по своей функции и свойствам во многом схожи с фотопротеинами кишечнополостных, несмотря на то, что аминокислотные последовательности показывают очень низкую степень гомологии. Наибольшее сходство первичных последовательностей (примерно 28%) наблюдается только с обелином из O. longissima, причем практически все идентичные аминокислотные остатки относятся к высококонсервативным «EF-hand» последовательностям. Но, с другой стороны, фотопротеины ктенофор демонстрируют высокую гомологию аминокислотных последовательностей между собой. Например, между представителями отрядов Beroida и Lobata, Beroe abyssicola и Mnemiopsis leidyi, соответственно, которые таксономически очень далеки, идентичность аминокислотных последовательностей составляет 90-95% [Ward, Seliger, 1974]. И если сравнивать с фотопротеинами кишечнополостных животных, то подобный уровень сходства наблюдается только для последовательностей у видов одного рода, например, у обелинов из O. longissima и O. geniculata он составляет 86% [Markova et al., 2002].

Экспериментальным путем было показано, что фотопротеины гребневиков, также как и фотопротеины кишечнополостных, в качестве субстрата биолюминесцентной реакции используют целентеразин [Ward, Seliger, 1974; Ward, Cormier, 1975; Hori et al., 1975]. Для запуска реакции биолюминесценции этих фотопротеинов также необходимы ионы кальция и не требуется наличие молекулярного кислорода. Но у ктенофор, в отличие от кишечнополостных, комплекс белка с «преактивированным» кислородом субстратом инактивируется светом [Ward, Cormier, 1975; Girsch et al., 1977].

Биолюминесценция гребневиков in vivo также ингибируется светом. Однако фотоинактивация in vivo обратима. Животные, пребывающие в темном помещении, через некоторое время восстанавливают способность к биолюминесценции [Anctil, Shimomura, 1984].

Фотоинактивирующим эффектом обладает свет как видимой (область поглощения целентеразина), так и ультрафиолетовой части спектра (250 – 280 нм, область поглощения ароматических аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина) [Ward, Seliger, 1976]. На примере мнемиопсина было показано, что за фотоинактивацию ответственен как белок (280 нм), так и сам целентеразин (435 нм) в соотношении 0,8 и 0,2. Предполагается, что фотохимическая реакция сопровождается появлением активных форм кислорода, которые и приводят к необратимому разрушению 2гидропероксицелентеразина. Но стоит отметить, что продукт данной реакции не был идентифицирован ни как целентеразин, ни как окисленный продукт, целентерамид. О механизме фотоинактивации фотопротеинов ктенофор на сегодняшний день известно очень мало, но предполагается, что он может быть похож на механизм фотолиза рибофлавина [Ahmad et al., 2006; Silva et al., 1999; Lu et al., 2002]. То есть фотоинактивация происходит с участием активных форм кислорода и ароматических аминокислотных остатков, которые должны находиться в активном центре фотопротеина гребневиков.

Также интересен тот факт, что апоформа фотопротеина ктенофор обладает довольно высокой «люциферазной» активностью при значениях рН, близких к нейтральным (рН 6,5), т.е. способностью окислять целентеразин в отсутствие ионов кальция. Причем эффективное образование фотопротеинового комплекса происходит при рН 9,0 [Markova et al., 2012].

1.2 Пространственная структура Са2+-регулируемых фотопротеинов молекулярной массой примерно 22 кДа и демонстрируют высокую степень гомологии как аминокислотных последовательностей (65 – 75%) (рис. 1.2) [Tsuji et al., 1995; Markova et al., 2002], так и пространственных структур [Liu et al., 2000; Deng et al., 2005; Liu et al., 2006; Titushin et al., 2010].

Фотопротеины имеют три активных Са2+-связывающих центра – «EF-hand»

связывающих белков (рис. 1.2) [McPhalen et al., 1991; Falke et al., 1994]. Они Рисунок 1.2 – Аминокислотные последовательности Са2+-регулируемых фотопротеинов акворина, клитина, митрокомина и обелинов из O. geniculata и O. longissima. Вторичная структура представлена в соответствии с кристаллической структурой обелина из O. longissima; -спирали отмечены латинскими буквами (A-H) и показаны в виде цилиндров серого цвета.

Аминокислоты, образующие внутреннюю субстрат-связывающую полость, отмечены серым цветом. Са2+-связывающие центры подчеркнуты и пронумерованы цифрами I, II и III [Высоцкий и др., 2006].

также имеют одну неактивную «EF-hand» последовательность, не способную связывать ионы кальция, так как она не содержит необходимых для выполнения этой функции аминокислотных остатков – аспарагиновую и глутаминовую кислоты [Strynadka et al., 1989].

В 2000 году были определены пространственные структуры двух «заряженных» (связанных с 2-гидропероксицелентеразином) фотопротеинов:

акворина [Head et al., 2000] и обелина [Liu et al., 2000] (рис. 1.3), а 10-тью годами позже также для клитина [Titushin et al., 2010]. После анализа полученных рентгеноструктурных данных было определено, что молекула фотопротеина имеет компактную глобулярную структуру с радиусом около 25, состоящую из двух доменов. Каждый домен содержит две «EF-hand»

последовательности и может быть представлен в форме «чашки», внутренняя полость которой «выстлана» боковыми цепями гидрофобных аминокислот, расположенных во всех восьми -спиралях белка. Также имеются четыре гидрофильных остатка (His22, Tyr138, His175, Tyr190), боковые цепи которых направлены внутрь полости [Liu et al., 2000]. «Чашки», соединяясь краями, образуют гидрофобную полость, в которой находится субстрат – 2-гидропероксицелентеразин. Такая защищенность субстрата от растворителя обеспечивает необходимые условия для образования продукта в возбужденном состоянии и дальнейшего его перехода в основное состояние с выделением кванта света. Также важен тот факт, что практически все аминокислоты, формирующие субстрат-связывающую полость, являются Са2+-регулируемых фотопротеинов [Vysotski, Lee, 2004].

Еще до определения пространственных структур был проведен ряд экспериментов, показавших важность некоторых аминокислотных остатков для биолюминесценции фотопротеинов. К примеру, мутант акворина с заменой триптофана на фенилаланин (W86F) имел бимодальный спектр излучения с максимумами при 455 и 400 нм [Ohmiya et al., 1992].

Рисунок 1.3 – Пространственные структуры обелина (А) и Основываясь на полученных данных, было предположено, что Trp принимает участие в образовании эмиттера и находится в непосредственной близости от молекулы целентеразина. Также с помощью олигонуклеотиднаправленного мутагенеза и химических модификаций было показано большое функциональное значение остатков гистидина [Ohmiya, Tsuji, 1993;

Bondar et al., 1999]. Было продемонстрировано, что замена в акворине His на Ala, Trp или Phe ведет к полной потере активности белка, но в то же время мутанты с модификациями оставшихся четырех гистидинов сохраняют биолюминесцентную активность.

Спустя некоторое время анализ полученных рентгеноструктурных данных показал, что два гистидина и триптофан действительно находятся вблизи молекулы 2-гидропероксицелентеразина в активных центрах как обелина, так и акворина. Например, в обелине His175 образует водородную связь с ОН-группой Tyr190, а His22 и Trp92 формируют водородные связи с гидроксилом 6-(n-гидрокси)-фенильной группы (рис. 1.4).

Кроме отмеченных ранее аминокислот, водородные связи с атомами 2-гидропероксицелентеразина образуют Tyr138 и Tyr190 (рис. 1.4). Остаток Tyr138 формирует водородную связь с N1-атомом, а Tyr190 соединен с С2-гидроперокси группой. Предполагается, что водородная связь, образованная Tyr190, стабилизирует 2-гидропероксицелентеразин в активном центре фотопротеинов [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007].

Рисунок 1.4 – Двухмерное изображение 2-гидропероксицелентеразина в молекуле обелина в окружении аминокислотных остатков, формирующих водородные связи с атомами субстрата. Водородные связи показаны пунктиром, расстояние указано в ангстремах. W1 и W2 – молекулы воды.

Следует отметить, что аминокислотный состав Са2+-регулируемых фотопротеинов и представителей семейства Са2+-связывающих белков «EFhand» типа сильно различается, поскольку фотопротеины содержат довольно много остатков триптофана [Kretsinger, Nockolds, 1973]. Все фотопротеины, аминокислотные последовательности которых охарактеризованы на данный момент, содержат 6 остатков триптофана. Четыре из них (Trp92, Trp114, Trp135, Trp179) находятся в целентеразин-связывающей полости, а Trp18 и Trp103 располагаются за ее пределами в первой и четвертой -спиралях, соответственно. Боковые цепи остатков Trp92 и Trp179 находятся по обе стороны от 6-(п-гидрокси)-фенильного кольца целентеразина; а боковые цепи Trp114 и Trp135 располагаются вблизи 2-(п-гидрокси)-бензильной группы целентеразина (рис. 1.5). Более того, атомы азота индольных колец Trp92 и Trp179 формируют водородные связи с атомами кислорода 6-(п-гидрокси)фенильной группы и С3-карбонилом целентеразина [Vysotski, Lee, 2004;

Vysotski, Lee, 2007].

Рисунок 1.5 – Двухмерное изображение целентеразин-связывающей полости обелина (А) и Са2+-разряженного обелина (Б) [Liu et al., 2006].

1.3 Особенности пространственной структуры Са2+-разряженного обелина longissima со связанным целентерамидом и ионами Са2+ имеет компактную глобулярную организацию, характерную для всех фотопротеинов (рис. 1.3) [Liu et al., 2006]. Общая пространственная структура Са2+-разряженного обелина сходна со структурой обелина до биолюминесцентной реакции (PDB код 1QV0), когда белок связан с молекулой 2-гидропероксицелентеразина.

Среднеквадратичное отклонение (RMSD) атомов основной цепи обелина и Са2+-разряженного обелина составляет всего 1,7. Молекула продукта реакции, целентерамида, расположена в центре белковой глобулы в той же ориентации и положении, как и 2-гидропероксицелентеразин в молекуле обелина, и окружена аминокислотными остатками всех восьми -спиралей.

Ионы кальция были обнаружены в каждом из предсказанных центров связывания кальция («EF-hand» петли I, III и IV) (рис. 1.3). «EF-hand» петля II в N-концевом домене белка не участвует в связывании кальция и не претерпевает существенных конформационных изменений [Liu et al., 2006].

внутреннюю субстрат-связывающую полость, таким образом обеспечивая для целентерамида гидрофобное окружение, недоступное растворителю. По всей видимости, это создает благоприятные условия для эффективного образования возбужденного электронного состояния целентерамида и излучения с высоким квантовым выходом [Vysotski, Lee, 2007].

В процессе связывания Са2+ происходит изменение ориентации всех 12 аминокислот, формирующих Са2+-связывающюю петлю, при котором образуется оптимальная конформация данной петли, необходимая для связывания иона кальция. Связывание кальция вызывает сдвиг восьмой -спирали, приводящий к изменению ориентации His175, смещение имидазольного кольца которого и «запускает» биолюминесцентную реакцию Са2+-регулируемых фотопротеинов, согласно предложенному механизму биолюминесцентной реакции [Liu et al., 2006; Vysotski, Lee, 2007].

Ион кальция во всех трех Са2+-связывающих петлях обелина координируется по схеме пентагональной бипирамиды, типичной для «EFhand» белков [McPhalen et al., 1991; Kawasaki et al., 1998]. Во всех из них шестью кислородными координационными лигандами выступают карбоксильные группы боковых цепей Asp и Glu, карбонильные группы основной цепи или боковой цепи Asn, а также гидроксильные группы серина.

Седьмым лигандом, связывающим ион кальция, является атом кислорода молекулы воды. Длина координационных связей равна ~ 2,4 [Liu et al., 2006].

аминокислотные остатки субстрат-связывающей полости белка сохраняют свою прежнюю ориентацию и положение, за исключением Ile142, Ile111, Phe119, Trp135 и Tyr138, которые уходят из целентерамид-связывающий полости на поверхность белка, и, наоборот, Phe28, Gly143 и Thr перемещаются внутрь полости. Аминокислотные остатки, перемещающиеся в центр полости, в целом, более полярны, чем остатки, вытесненные из нее.

Во внутренней полости Са2+-разряженного обелина располагаются две молекулы воды, как и в «заряженном» обелине, но одна из них, W2, меняет свое положение, сместившись на место гидроксильной группы Tyr138 (рис.

1.5). В Са2+-разряженном обелине эта молекула воды образует водородную связь с атомом азота амидной группы 2-гидропероксицелентеразина [Liu et al., 2006; Vysotski, Lee, 2007].

1.4 Возможные пути формирования 2-гидропероксицелентеразина В составе Са2+-регулируемых фотопротеинов молекула целентеразина находится в преактивированной кислородом форме, в виде 2-гидропероксицелентеразина [Head et al., 2000; Liu et al., 2003].

хемилюминесценции аналогов целентеразина в присутствии оснований в декарбоксилирования целентеразина (рис. 1.6) [Goto, 1968; Goto et al., 1968;

Kondo et al, 2005; Hirano et al., 2008].

Предложенный механизм был положен в основу гипотезы об одном из возможных путей формирования пероксипроизводных целентеразина.

Согласно ей, первым этапом является депротонирование N7-атома азота имидазолпиразинового кольца целентеразина, которое приводит к образованию целентеразин-аниона (рис. 1.6). На следующем этапе после переноса электрона с аниона целентеразина на кислород формируются короткоживущие целентеразин-радикал и супероксиданион-радикал О2•.

Рисунок 1.6 – Механизм хемилюминесценции аналогов люциферина Скорее всего, перенос электрона – этап, лимитирующий скорость всего процесса. Радикальное спаривание целентеразин-радикала и супероксиданион-радикала приводит к образованию пероксид-аниона целентеразина. И, в случае люциферазной биолюминесцентной системы, на следующем этапе происходит циклизация пероксид-аниона, и образуется диоксиэтанон, в результате распада которого происходит формирование синглетного возбужденного состояния продукта и высвобождение СО2.

Хирано с соавторами, используя кинетику хемилюминесценции, рассчитали скорость реакции второго порядка для нескольких аналогов люциферина Cypridina в DMSO с 1,1,3,3–тетраметилгуанидином в качестве основания [Kondo et al., 2005]. И согласно предложенному Гото механизму [Goto, 1968; Goto et al., 1968], данные константы скорости характеризуют лимитирующим для всего процесса.

Основываясь на данных исследованиях, можно предположить, что механизм образования 2-гидропероксицелентеразина при формировании активного фотопротеина достаточно близок к вышеописанному (рис. 1.6), но с важным отличием: пероксид-анион целентеразина, образующийся в результате радикального спаривания, должен быть протонирован до этапа циклизации в диоксиэтанон.

Несмотря на то, что вышеописанный механизм является достаточно обоснованным, возможен и альтернативный механизм образования 2-гидропероксицелентеразина. Группа Кормьера провела подробное исследование влияния pH, а также протонных и апротонных растворов в анаэробных условиях, на спектральные свойства целентеразина и некоторых его аналогов [Hori et al., 1975]. Оказалось, что изменения в видимой области спектра абсорбции целентеразина и его аналогов находятся в зависимости от полярности растворителя: максимум поглощения в метаноле равен 435 нм, тогда как в апротонном растворителе, диметилформамиде или DMSO, видимое поглощение смещалось к 454 нм. Исследователи отнесли максимумы поглощения на 435 и 454 нм к таутомерным формам целентеразина, протонированного по N7- и C2-атомам имидазолпиразинового кольца, соответственно.

Как уже было сказано ранее, субстрат-связывающие полости акворина и обелина сформированы в основном гидрофобными боковыми цепями аминокислотных остатков [Head et al., 2000; Liu et al., 2000; Liu et al., 2003;

Liu et al., 2006], следовательно, можно сделать вывод, что после быстрого связывания с апофотопротеином целентеразин подвергается таутомеризации, которая заключается в переносе протона с N7- в C2-положение. На следующем этапе C2-таутомерная форма целентеразина взаимодействует с молекулярным кислородом, и в результате образуется 2-гидропероксицелентеразин, который затем стабилизируется водородной связью с гидроксильной группой тирозина [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007].

Представленный механизм формирования 2-гидропероксицелентеразина в Са2+-регулируемых фотопротеинах имеет полное право на существование, так как не требует дополнительных условий, вроде наличия основания или «обратного» переноса протона для продукции 2-гидропероксипроизводного, как в механизме, рассмотренном выше.

1.5 Функциональная роль остатков His и Tyr в формировании активного фотопротеинового комплекса Согласно описанному выше предполагаемому механизму образования 2-гидропероксицелентеразина в субстрат-связывающей полости фотопротеина, на первом этапе этой реакции происходит депротонирование N7-атома азота целентеразина при участии основания (рис. 1.6). Но согласно пространственным структурам обелина [Liu et al., 2000; Liu et al., 2003] и акворина [Head et al., 2000], в непосредственной близости от N7-атома азота молекулы целентеразина нет ни одной боковой цепи аминокислотных остатков, которые могли бы выполнять функцию основания. Несмотря на это, формирование 2-гидропероксицелентеразина посредством оксигенации целентеразина, несомненно, происходит. Поэтому можно сделать вывод, что депротонирование N7-атома азота имеет место, скорее всего, до того, как целентеразин займет свое окончательное положение в субстрат-связывающей полости, т.е. в течение миллисекунд, за которые происходит его связывание.

Поэтому вполне резонно предположить, что в этом процессе участвует один из остатков His, который может выступать в роли основания при нейтральных pH, особенно в паре с карбоксильной группой Glu или Asp. И так как, по предложенному гипотетическому механизму, депротонирование не лимитирует скорость формирования 2-гидропероксицелентеразина, данное предположение выглядит достаточно обоснованным [Eremeeva et al., 2009; Eremeeva et al., 2013a,b] (рис. 1.6).

Боковая цепь гистидина представляет собой имидазольное кольцо, имеющее в своем составе два атома азота с различными свойствами. Один из атомов азота, связанный с атомом водорода, может отдавать свою неподеленную электронную пару имидазольному кольцу и вследствие этого проявлять свойства кислоты. В свою очередь, второй атом азота может отдавать ароматическому кольцу только один электрон и сохранять свободную неподеленную электронную пару, поэтому он является «основным». Благодаря этим свойствам гистидин может успешно осуществлять функцию переносчика протона [Eremeeva et al., 2013a,b].

После анализа пространственных структур субстрат-связывающей полости Са2+-регулируемых фотопротеинов, а также данных, полученных при исследовании влияния различных мутаций His на образование активного фотопротеинового комплекса, и результатов квантово-химических расчетов было сделано предположение, что более вероятным кандидатом на роль основания в случае обелина является His175, который, кроме того, может выполнять двойную функцию [Eremeeva et al., 2009; Eremeeva et al., 2013a,b].

Схема предполагаемой функциональной роли His175 в образовании 2-гидропероксицелентеразина в субстрат-связывающей полости обелина показана на рисунке 1.7. На первом этапе в момент связывания целентеразина с апобелком протон от N7-атома азота целентеразина переходит на His посредством «основного» атома азота. Это приводит к формированию N7-целентеразин-аниона, который за счет быстрой перестройки системы связей превращается в C2-анион целентеразина (рис. 1.7). На следующем этапе положительно заряженный остаток His175 передает протон от своего «кислого» атома азота на С2-атом углерода аниона целентеразина с образованием целентеразина, протонированного по С2-атому углерода (C2(H)-целентеразин). Из этого можно заключить, что His175 выполняет функцию переносчика протона (“proton shuttle mechanism”), на разных этапах реакции являясь и «основанием», и «кислотой» [Eremeeva et al., 2009;

Eremeeva et al., 2013a,b] (рис. 1.7.).

Рисунок 1.7 – Предполагаемая функция His175 в образовании активного Представленный механизм переноса протона при образовании 2-гидропероксицелентеразина в Са2+-регулируемых фотопротеинах сходен с механизмом, предложенным для диоксигеназ из Arthrobacter nitroguajacolicus и Pseudomonas putida. Согласно ему, ключевая роль в переносе протона играет пара, состоящая из аминокислотного остатка, проявляющего свойства основания (His), и остатка, проявляющего свойства кислоты (Asp) [Steiner et al., 2010].

Стоит также отметить, что согласно квантово-химическим расчетам, энергия активации для депротонирования N7-атома азота целентеразина с участием His (рис. 1.7) составляет 11 кДж/моль [Tomilin et al., 2010]. И, вследствие того, что реакция не требует больших затрат энергии, она может протекать с довольно высокой скоростью. Кроме того, с помощью квантовохимических расчетов показано, что только целентеразин, протонированный по C2-атому углерода, геометрически соответствует аминокислотному окружению субстрат-связывающей полости активного обелина, потому что при переходе от N7(H)- к C2(H)-целентеразину конфигурация C2-атома углерода изменяется с sp2 на sp3. Изменяется и угол связи между имидазолпиразиновым кольцом и 2-(п-гидрокси)-бензильной группой целентеразина таким образом, чтобы последняя могла поместиться в пространстве между боковыми цепями Trp135 и His175 [Tomilin et al., 2010] (рис. 1.8).

Рисунок 1.8 – Схематическое представление целентеразина, протонированного по N7-атому азота (N7(H)-целентеразин) и C2-атому углерода (C2(H)-целентеразин), в целентеразин-связывающей полости На следующем этапе, после образования протонированного по C2-атому углерода целентеразина – C2(H)-целентеразина, происходит его взаимодействие с кислородом, в результате которого образуется 2-гидропероксицелентеразин. Предполагаемая функциональная роль Tyr138 в этом процессе схематически продемонстрирована на рисунке 1.9.

Рисунок 1.9 – Предполагаемая роль Tyr138 в образовании активного Дальнейшие квантово-химические вычисления [Tomilin et al., 2010] показали, что вероятность приближения молекулы кислорода к протонированному С2-атому углерода целентеразина на расстояние, необходимое для взаимодействия, сильно повышается при условии наличия полярной группы, например ОН-группы Tyr138 или Н2О, возле N1-атома азота имидазолпиразинового кольца. И, скорее всего, именно наличие полярной группы в непосредственной близости от имидазолпиразинового кольца C2(H)-целентеразина может приводить к поляризации его N1-атома азота. Также C2-H связь может поляризоваться в результате так называемого индукционного эффекта. Под воздействием дисперсионных сил молекула кислорода приближается к C2-атому целентеразина на расстояние 2,3, что увеличивает вероятность инициации реакции образования 2-гидропероксипроизводного [Eremeeva et al., 2013a,b].

Более того, важность Tyr138 для образования активного фотопротеина была подтверждена заменой Tyr на Phe. Но все же важно отметить, что, несмотря на существенное замедление скорости при замене Tyr, активный фотопротеиновый комплекс все же формируется. Скорее всего, присоединение кислорода является процессом вероятностным, и поляризация C2-H связи просто увеличивает эту вероятность.

По причине того, что кристаллическая структура апофотопротеина до сих пор не определена, для моделирования аминокислотного окружения целентеразина в субстрат-связывающей полости была использована пространственная структура активного обелина, т.е. обелина, связанного с 2-гидропероксицелентеразином [Liu et al., 2000; Liu et al., 2003]. В итоге было предположено, что основные конформационные изменения в молекуле апообелина происходят в процессе связывания целентеразина, протекающем за несколько миллисекунд, и далее, в процессе активации связанного целентеразина кислородом, существенного изменения кристаллической структуры субстрат-связывающей полости уже не происходит. Данное предположение вполне правдоподобно, учитывая тот факт, что нестабильное 2-гидропероксипроизводное целентеразина должно быть незамедлительно стабилизировано сетью водородных связей с аминокислотными остатками субстрат-связывающей полости фотопротеина [Tomilin et al., 2010; Eremeeva et al., 2013a,b].

1.6 Механизм биолюминесцентной реакции фотопротеинов В ряде экспериментальных исследований было показано, что в водных растворах целентеразин нестабилен и со временем медленно самоокисляется [Shimomura, 2006]. Более того, установлен тот факт, что в органических растворителях его устойчивость еще меньше, целентеразин может вступать в реакцию с кислородом, которая сопровождается излучением с низким квантовым выходом. На основании исследований хемилюминесценции аналогов целентеразина в апротонных растворах было сделано предложение о механизме его окисления, в соответствии с которым кислород взаимодействует с неустойчивой формой целентеразин-N7-аниона, которая образуется при щелочных значениях pH [Goto, 1968; McCapra et al., 1967]. Согласно данному механизму, окислительное декарбоксилирование целентеразина происходит через образование нескольких интермедиатов (рис. 1.10). В результате взаимодействия целентеразина с кислородом формируется первичный окисленный продукт – С2-гидроксипероксид. В апротонных растворителях, например, в диметилсульфоксиде (DMSO), при наличии сильного основания реакция протекает с образованием диоксиэтанона (этап 1), затем происходит отщепление молекулы СО2 (этап 2) и образование амид-аниона (этап 4) в возбужденном состоянии. Переход молекулы в основное состояние сопровождается излучением света (max = нм) (рис. 1.10). МакКапра и Чанг предложили этот механизм для использующих целентеразин в качестве субстрата биолюминесцентных систем (Са2+-регулируемые фотопротеины, Renilla люцифераза).

Рис.1.10 – Механизм образования возбужденного состояния, который предложили МакКапра и Чанг [McCapra et al., 1967] для биолюминесцентных систем, использующих целентеразин в качестве субстрата.

Но некоторое время спустя данная модель была расширена благодаря исследованиям хемилюминесцентных свойств ряда аналогов целентеразина [Hori et al., 1973]. На основании спектрального сходства биолюминесценции акворина и флуоресценции амид-аниона был сделан вывод о том, что именно амид-анион в возбужденном состоянии является эмиттером при биолюминесценции акворина.

В работе Шимомуры и Тераниши [Shimomura, Teranishi, 2000] об аналогах целентерамида было показано, что целентерамид может образовывать пять различных возбужденных состояний (рис. 1.11):

нейтральное, амид-анион, резонансные структуры фенолят/пиразин-N4аниона и ионную пару с акцептором протона. Также описывалось, что добавление n-бутиламина к раствору целентерамида в бензоле приводит к появлению бимодального спектра флуоресценции с максимумами при 397 и 467 нм. Возбужденное состояние ионной пары было соотнесено с флуоресценцией на 467 нм. В основном состоянии гидроксильная группа фенола образует водородную связь с амином без ионной диссоциации, следовательно, максимумы возбуждения при 302 и 337 нм близки максимумам возбуждения нейтрального целентерамида. При возбуждении протон фенольной ОН-группы переходит на амин, это приводит к тому, что флуоресценция вновь образованной ионной пары (465 – 479 нм) становится очень близка излучению фенолят-аниона (480 – 490 нм). Факт того, что в возбужденном состоянии гидроксильная группа фенола является гораздо более сильной кислотой, чем в основном состоянии, делает такой перенос протона возможным [Shimomura, Teranishi, 2000].

В своем исследовании флуоресценции аналогов целентерамида Хирано с соавторами [Imai et al., 2001] пришли к схожему заключению относительно формирования ионной пары с аминами и предположили, что, скорее всего, данная конфигурация фенолят-аниона является эмиттером в биолюминесценции акворина.

Рисунок 1.11 – Различные ионные формы целентерамида В предложенном МакКапрой и Чангом [McCapra et al., 1967] модельном механизме образования возбужденного состояния целентерамида при окислительном декарбоксилировании целентеразина первичным эмиттером является амид-анион целентерамида. Но важен тот факт, что при биолюминесценции фотопротеинов, в отличие от модельных экспериментов, целентеразин располагается в активном центре белка в окружении аминокислотных остатков и взаимодействует с ними через систему водородных связей. И в таких условиях довольно вероятен перенос протона, который изменит структуру молекулы-излучателя. На основании подробного анализа кристаллических структур фотопротеинов дикого типа [Liu et al., 2003; Deng et al., 2004; Deng et al., 2005; Liu et al., 2006] и мутанта обелина W92F [Deng et al., 2001; Vysotski et al., 2003] в различных лиганд-зависимых конформационных состояниях, а также данных, полученных при исследовании хемилюминесценции и флуоресценции аналогов целентеразина и целентерамида [McCapra et al., 1967; Usami, Isobi, 1996; Shimomura Teranishi, 2000; Imai et al., 2001] была предложена гипотеза (“proton-relay mechanism”) о роли аминокислотных остатков субстрат-связывающей полости в реакции окислительного декарбоксилирования и в формировании эмиттера биолюминесценции фотопротеинов [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007].

При исследовании пространственных структур обелина и акворина обнаружено, что в обоих случаях Tyr138 связан водородной связью с N1-атомом 2-гидропероксицелентеразина [Head et al., 2000; Liu et al., 2000], однако в Са2+-разряженном обелине этот остаток располагается за пределами субстрат-связывающей полости, и его боковая цепь формирует водородную связь с поверхностным Glu55 [Liu et al., 2006] (рис. 1.5). В разряженном белке Tyr138 замещается молекулой воды (W2), которая может служить донором водородной связи для атома азота амидной группы целентеразина.

Усами и Изоби [Usami, Isobe, 1996] в экспериментах по исследованию хемилюминесценции целентеразина в неполярных растворителях, моделирующих окружение связывающей полости фотопротеинов, наблюдали хемилюминесценцию после фотоокисления целентеразина при низких температурах (-78С). Методом низкотемпературного ядерного магнитного резонанса они определили структуру интермедиата и выяснили, что данное соединение является производным диоксиэтанона. Распад интермедиата с образованием возбужденного состояния нейтрального целентерамида и испусканием света в коротковолновой области спектра (400 нм) наблюдался при более низкой температуре нагревания, нежели хемилюминесценция от возбужденного состояния целентерамид-аниона (475 нм). Следовательно, целентерамид-анион является более стабильным соединением. Из этого авторами был сделан вывод, что декарбоксилирование целентеразина может происходить и из нейтрального диоксиэтанона, и из диоксиэтанон аниона, и что переход аниона в нейтральное состояние не осуществляется при низких температурах. Также на основе данных исследований был сделан ряд предположений о функции молекулы воды W2 [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007].

Механизм образования возбужденного состояния целентерамида при окислительном декарбоксилировании целентеразина [McCapra et al., 1967] предполагает, что биолюминесценция инициируется в результате небольшого сдвига His175, расположенного в восьмой -спирали (рис. 1.2), который происходит после связывания иона кальция с белком. В результате уменьшается расстояние между остатками His175 и Tyr190, что делает возможным перенос протона от гидроксильной группы Tyr190 на His175 и, как следствие, образование пероксианиона (рис. 1.12, шаг 1).

Затем пероксианион «атакует» С3-положение целентеразина с образованием диоксиэтанонового интермедиата [Vysotski, Lee, 2007] (рис. 1.12, шаг 2). Сравнение кристаллических структур обелина до и после биолюминесцентной реакции подтверждает правдоподобность данного механизма, так как на них хорошо видно, что His175 немного смещается по направлению к Tyr190, а его имидазольное кольцо поворачивается на [Liu et al., 2006]. Диоксиэтаноновый интермедиат довольно нестабильное соединение и, согласно гипотезе МакКапра и Чанга, должен распадаться с образованием СО2 и амид-аниона целентерамида в возбужденном состоянии.

Поскольку pK N-аниона в данном окружении выше, чем у соседней молекулы воды (W2), его протонирование за счет молекулы воды (рис. 1.12, шаг 3) приводит к образованию диоксиэтанона в нейтральном состоянии. Протонированная форма гистидина энергетически более выгодна, и поэтому His64, в свою очередь, может отдавать протон на молекулу воды (W2) (рис. 1.12, шаг 3А).

Рисунок 1.12 – Механизм переноса протона, инициируемый связыванием ионов кальция, и формирования эмиттера биолюминесценции Таким образом, молекула воды W2 катализирует реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина через протонирование диоксиэтанон-аниона. В результате формируется нейтральный целентерамид биолюминесценции фотопротеинов.

Предположение о том, что именно нейтральная форма целентерамида является первичным эмиттером, может объяснить многие свойства целентеразин-зависимой биолюминесценции in vitro. И для целентеразинзависимых люцифераз, и для Са2+-регулируемых фотопротеинов характерен максимум биолюминесценции в диапазоне 460 – 495 нм. Флуоресценция аналогов целентерамида в растворах различной полярности в присутствии сильных оснований также наблюдается в сходном диапазоне [Shimomura, Teranishi, 2000; Imai et al., 2001]. Спектр биолюминесценции обелина имеет максимум при 485 нм с небольшим плечом на 400 нм [Markova et al., 2002], которое соответствует излучению от нейтральной формы целентерамида и усиливается в случае некоторых мутантов обелина и акворина [Ohmiya et al., 1992; Malikova et al., 2003; Deng et al., 2001; Vysotski et al., 2003]. Но амиданион излучает при 435-458 нм (рис. 1.11).

первичного возбужденного состояния в биолюминесцентной реакции фотопротеинов, так как в противном случае сложно объяснить появление более высокоэнергетических состояний, характерных для нейтральной формы возбужденного целентерамида.

Шаг 5 на рисунке 1.12 объясняет образование возбужденных состояний целентерамида, которые излучают в более длинноволновой области спектра (вторичный эмиттер биолюминесценции). После переноса протона на His22 образуется фенолят-анионная форма целентерамида в возбужденном состоянии, за счет излучения которого возникает биолюминесценция в длинноволновой области спектра. Этот остаток гидроксильной группы как в структуре заряженного, так и разряженного обелина (рис. 1.5). Поскольку pK 5-(п-гидрокси)-фенильной группы целентерамида в возбужденном состоянии [Ireland, Wyatt, 1976] может быть меньше 6,5, то становится возможен переход протона на гистидин, который приводит к формированию фенолята в возбужденном состоянии. Согласно экспериментам Мори с соавторами [Mori et al., 2006], фенолят-анионная форма целентерамида может существовать в различных резонансных формах в зависимости от полярности растворителя. Максимумы флуоресценции различных ионных форм фенолят-аниона в растворе варьируют в диапазоне биолюминесценции различных фотопротеинов (465-495 нм) [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007].

Рисунок 1.13 – Резонансные формы фенолят-аниона целентерамида стабилизирует возбужденный целентерамид в форме фенолят-аниона, и по этой причине обелин показывает низкую интенсивность биолюминесценции в коротковолновой области от нейтрального целентерамида, а в спектре излучения фотопротеина акворина плечо на 400 нм отсутствует полностью.

При мутационной замене Trp92 на фенилаланин, которая приводит к исчезновению водородной связи, происходит замедление переноса протона, и поэтому увеличивается вероятность излучения от нейтральной формы целентерамида, что выражается в бимодальном спектре биолюминесценции мутанта [Vysotski et al., 2003]. Так как в акворине Tyr82 образует дополнительную водородную связь с 5-(п-гидрокси)-фенильной группой целентерамида, то даже в случае замены Trp86 (Trp92 в обелине) перенос коротковолновой полосы излучения у W86F акворина меньше, чем у W92F обелина [Deng et al., 2001].

Из сказанного выше можно сделать вывод о том, что формирование эмиттера биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов происходит, скорее всего, через образование ряда промежуточных протекает при непосредственном участии аминокислотных остатков активного центра белка [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007].

1.7 Механизм биолюминесцентных реакций других целентеразинзависимых систем Кальмары Watasenia scintillans и Symplectoteuthis oualaniensis, в используют производные целентеразина – целентеразин дисульфат и дегидроцелентеразин, соответственно.

На рисунке 1.14 представлена схема биолюминесцентной реакции, предложенная для W. scintillans [Tsuji, 2002, Tsuji, 2005]. В отличие от других целентеразин-зависимых люцифераз, люциферазе кальмара Watasenia кроме биолюмиесцентной реакции также необходимы Mg2+ и АТФ. Согласно предложенной схеме, на первом этапе реакции в активном центре люциферазы образуется целентеразинаденилат дисульфат.

Рисунок 1.14 – Предложенный механизм биолюминесцентной реакции кальмара Watasenia scintillans [Tsuji, 2002].

На следующем этапе, еще до присоединения кислорода, происходит отщепление аденозинмонофосфата. Следовательно, целентеразинаденилат дисульфат не участвует в образовании эмиттера, что отличает биолюминесцентную реакцию, катализируемую люциферазой Watasenia, от таковой у светляков.

экспериментальные данные. Однако его нельзя считать окончательным, поскольку функциональная роль аденилирования субстрата еще не полностью выяснена. Считается маловероятным, что это требуется только для правильного позиционирования субстрата в активном центре фермента, потому что эту функцию обычно выполняет белок [Tsuji, 2002; Tsuji, 2005].

фотопротеина симплектина из кальмара представлен на рисунке 1.15 [Tsuji, Leisman, 1981; Isobe et al., 1998]. В симплектин в качестве субстрата использует дегидроцелентеразин.

Рисунок 1.15 – Предложенный механизм биолюминесцентной реакции кальмара Symplectoteuthis oualaniensis [Tsuji, Leisman, 1981].

На первом этапе дегидроцелентеразин взаимодействует с SH-группой цистеина апобелка, в процессе чего образуется активный фотопротеин. Далее взаимодействие кислорода с С2-атомом целентеразина приводит к формированию пероксид-аниона и, следовательно, продукту реакции, целентерамиду, в возбужденном состоянии. Целентерамид, оставаясь связанным с белком, является эмиттером данной биолюминесцентной реакции, одной из важных особенностей которой является ее зависимость от одновалентных катионов К+ и Na+. На данный момент это единственный пример среди всех изученных биолюминесцентных систем [Tsuji, Leisman, 1981; Isobe et al., 1998].

Механизм биолюминесценной реакции кальмара Symplectoteuthis, аналогично рассмотренному ранее биолюминесцентному механизму кальмара Watasenia, нуждается в дополнительных исследованиях, поскольку недостаточно понятна роль в каталитической реакции одновалентных катионов К+ и Na+, отдельных аминокислотных остатков активного центра, да и самй белковой молекулы.

Среди целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков, помимо Са2+-регулируемых фотопротеинов, также достаточно охарактеризована люцифераза из морского светящегося мягкого коралла Renilla [Matthews et al., 1977]. Биолюминесценция Renilla контролируется нервной системой и инициируется в результате увеличения концентрации внутриклеточного кальция [Hastings, Morin, 1969] в ответ на механическую стимуляцию. В биолюминесцентную реакцию Renilla in vivo вовлечено как минимум три Са2+-регулируемый люцифераза и зеленый флуоресцентный белок (GFP). В конце 1970-x годов все три белка были выделены, очищены и охарактеризованы [Matthews et al., 1977; Ward, Cormier, 1976; Charbonneau, Cormier, 1979].

Люцифераза Renilla reniformis – это односубъединичный белок (~36 кДа), состоящий из 311 аминокислотных остатков с большим содержанием ароматических и гидрофобных аминокислот [Lorenz et al., 1991]. Люцифераза катализирует окислительное декарбоксилирование целентеразина с образованием комплекса люцифераза-целентерамид в возбужденном состоянии, переход которого в основное состояние сопровождается излучением света в голубой области спектра (max = 480 нм) [Hori et al., 1973; Charbonneau et al., 1979]. Биолюминесценция полипа in vivo в зеленой области спектра (max = 509 нм) объясняется резонансным переносом энергии от биолюминесцентного донора (люциферазы) к флуоресцентному акцептору (GFP) в результате образования белокбелкового комплекса между люциферазой и GFP [Ward et al., 1976]. СВР является односубъединичным белком, состоящим из 184 аминокислотных остатков, принадлежит к семейству Са2+-связывающих белков «EF-hand»

типа и, подобно Са2+-регулируемым фотопротеинам, содержит три Са2+связывающих петли (I, III, IV) [Kumar et al., 1990]. И хотя СВР, как и Са2+регулируемые фотопротеины, связывает целентеразин, аминокислотные последовательности этих белков показывают очень низкую гомологию (22%), которая, главным образом, обусловлена консервативными аминокислотными последовательностями Са2+-связывающих петель. СВР содержит одну молекулу прочносвязанного целентеразина, которая становится доступной для реакции с люциферазой и О2 только после связывания Са2+ с СВР [Charbonneau et al., 1979].

Несмотря на то, что для люциферазы R. reniformis была определена кристаллическая структура [Loening et al., 2007], это не позволило однозначно локализовать активный центр фермента, поскольку структура была без субстрата или продукта реакции. По этой причине оказалось затруднительным применение сайт-направленого мутагенеза для каталитическом окислении целентеразина и в формировании эмиттера.

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что на настоящий момент известно достаточно много совершенно не похожих друг на друга биолюминесцентных систем, использующих целентеразин в качестве субстрата. При этом механизмы его окисления в большинстве систем слабо изучены. Исключение составляют лишь Са2+-регулируемые фотопротеины кишечнополостных животных, в исследовании которых в последнее время удалось достичь больших успехов, сделавших возможным использование фотопротеинов при разработке новых биолюминесцентных технологий для биологии, медицины, фармацевтической промышленности.

Но несмотря на это, детальное выяснение механизма биолюминесцентной реакции Са2+-регулируемых фотопротеинов на молекулярном уровне, а именно установление конкретной роли аминокислот активного центра белка, является первоочередной задачей, поскольку это сделает возможным вывести применение данных белков на совершенно новый качественный уровень, позволяя целенаправленно изменять биохимические свойства и создавать характеристиками (увеличенная удельная активность, заданные спектральные свойства, измененная кинетика активности, термостабильность и т. д.) применительно к каждой конкретной задаче.

Поэтому целью данной работы является выяснение функциональной роли отдельных аминокислот активного центра биолюминесценции.

ГЛАВА 2 Материалы и методы 2.1 Клонирование, олигонуклеотид-направленный мутагенез Клонирование и конструирование экспрессионных плазмид для обелина из Obelia longissima и его мутантов Y138F и F88Y было выполнено старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой С.В.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с использованием Quick-Change site-directed mutagenesis kit (Stratagene, США) в соответствии с протоколом на экспрессионной плазмиде pET19-OL8, Олигонуклеотидные праймеры были сконструированы так, чтобы получить фенилаланин и Phe88 на тирозин. Наличие мутаций было подтверждено проводили щелочным методом с использованием E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit (Omega Bio-Tek, США).

2.2 Выделение и очистка мутантов фотопротеина обелина Y138F и F88Y культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин (250 мг/мл) при 37°C.

Синтез белка индуцировали добавлением в среду ИПТГ в конечной концентрации 1 мМ при достижении клетками оптической плотности OD 0,6 – 0,8. После индукции клетки выращивали еще в течение 3 часов при интенсивном перемешивании. Выделение и очистку обелина и его мутантных форм проводили по схеме, описанной в работах [Illarionov et al., 2000; Vysotski et al., 2001] с небольшими модификациями. Клеточный осадок ресуспендировали в пятикратном объеме 20 мМ Трис-НСI, pH 7,0 и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора UD-20 (Techpan, Польша) шестикратной обработкой в течение 25 секунд с интервалами по секунд на льду. Затем образец центрифугировали (14000 об/мин, 10 мин), осадок промывали, последовательно ресуспендируя в 20 мМ Трис-HCl pH 7, с 0,9% NaCl, а затем с 0,1% Тритон Х-100 (трижды). Полученные тельца включений растворяли в растворе 6 М мочевины в 20 мМ Трис-HCl (1:10;

w/v) при 4°С в течение ночи. Затем образец центрифугировали 5 минут при 8000 об/мин, осадок отбрасывали, а супернатант использовали для хроматографической очистки.

Белок, экстрагированный из телец включений мочевиной, чистили методом ионообменной хроматографии на колонке с DEAE-Sepharose Fast Flow (Amersham-Biosciences, США) с помощью системы Bio-Rad (США).

Элюцию белков с колонки проводили градиентом концентрации ацетата натрия (0 – 1 М) в буфере 20 мМ Трис-HCl рН 7,0, содержащем 6 М мочевину, при скорости 2 мл/мин. Рефолдинг белка проводили разведением в буфере, содержащем 5 мМ ДТТ и избыток целентеразина (JNC Corporation, Япония), с последующей инкубацией в течение ночи при 4°С. Затем образец «заряженного» фотопротеина дочищали с помощью ионообменной хроматографии на колонке Mono Q и гель-фильтрацией на колонке Superdex 75 (GE Healthcare, Великобритания), уравновешенной 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl pH 7,0. В результате были получены мутанты обелина Y138F и F88Y высокой степени чистоты. Для кристаллизации мутанты обелина Y138F и F88Y были сконцентрированы до 18 мг/мл и 16 мг/мл, соответственно, с помощью центрифужных концентраторов (Millipore, США). Выход «заряженного» целентеразином белка обычно составлял 25 – 30 мг с 1 г сырой биомассы клеток.

2.3 Получение Са2+-разряженных мутантов обелина Y138F и F88Y со связанным целентерамидом Са2+-разряженные образцы мутантов обелина со связанным целентерамидом для кристаллизации получали добавлением кальция ацетата в 10 мМ Бис-Трис буфере (pH 6,5) в раствор белка (0,5 – 1,0 мг/мл) в том же буфере до финальной концентрации 4 мМ. При возбуждении ближним UVсветом растворы Са2+-разряженных мутантов обелина проявляли зеленую флуоресценцию. Это однозначно показывает, что целентерамид остается связанным с белком. Для кристаллизации белки были сконцентрированы до 12 мг/мл для обелина Y138F и 10 мг/мл для обелина F88Y c помощью центрифужных концентраторов (Millipore, США).

2.4 Получение анаэробного апо-обелин–целентеразинового комплекса Для удаления молекулярного кислорода образцы и растворы для эксперимента подвергались 10 – 15 циклам вакуумного дегазирования с использованием азота в качестве газового заместителя. Все этапы получения анаэробного апо-обелин–целентеразинового комплекса были проведены внутри специальной анаэробной камеры Forma Anaerobic Station (Thermo Fisher, США).

На первом этапе дегазированные растворы помещались в анаэробную камеру и исследовались на наличие кислорода. Переход апо-обелина в активный фотопротеин является индикатором кислорода, так как кислород используется в биолюминесцентной реакции. Аликвоты (15 мкл) дегазированных растворов внутри рабочей камеры (буфер для ионообменной хроматографии – 20 мМ Трис-HCl pH 7,0, 2 мМ ЭДТА; буфер для элюции белка с хроматографической колонки – 20 мМ Трис-HCl pH 7,0, 2 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl; буфер для промывки колонки – 20 мМ Трис-HCl pH 7,0, 2 мМ ЭДТА, 1 М NaCl) были смешаны с концентрированным апо-обелином (5 мкл) и 5 мкл активационного буфера (20 мМ Трис-HCl pH 7,0, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ с избытком целентеразина). Через 15 минут инкубации растворов к ним добавлялось 2 мкл раствора кальция (100 мМ Трис-HCl pH 7,0, 100 мМ CaCl2). Отсутствие видимой биолюминесцентной реакции говорило о достаточной дегазированности образцов.

На втором этапе получения апо-обелин–целентеразинового комплекса дегазированный апо-обелин в 6 М мочевине объемом ~2 мл и концентрацией 2 мг/мл был разведен в активационном растворе, содержащем целентеразин (с молярным избытком к белку в соотношении 1:1,1), и оставлен инкубироваться в анаэробной камере в течение ночи.

Для очистки образца от несвязанного целентеразина была проведена ионообменная хроматография на колонке Q Sepharose Fast Flow (AmershamBiosciences, США), уравновешенной буфером для хроматографии. Образец смывали буфером для элюции. Фракции желтого цвета собирались и концентрировались с помощью центрифужных концентраторов.

Для измерения спектров поглощения полученного чистого апообелин–целентеразинового комплекса образец помещали в специальную кювету с герметично запечатываемой крышкой (#117.104-QS; Hellma Analytics, Германия) и плотно запечатывали во избежание проникновения кислорода в образец.

На финальном этапе образец в запечатанной кювете был извлечен из анаэробной камеры.

2.5 Определение удельной биолюминесцентной активности, концентрации белка и измерение спектров биолюминесценции Концентрацию белка определяли спектрофотометрически, используя реагент DC protein assay (Bio-Rad, США) и бычий сывороточный альбумин как стандарт, а также коэффициенты экстинкции для апофотопротеинов, рассчитанные из аминокислотных последовательностей белков с помощью программы ProtParam tool (http://us.expasy.org/tools/protparam-doc.html), использующей при расчете метод Эделхоча [Edelhoch, 1967].

спектрофотометра UVIKON 943 (Kontron Instruments, Италия).

(относительно фотопротеинов дикого типа) мутантов обелина определяли с помощью планшетного люминометра Luminoskan Ascent (Thermo Electron, Финляндия). Для этого в лунки непрозрачного планшета вносили по 50 мкл раствора фотопротеина в 20 мМ Трис-HCl буфере pH 7,0, содержащем 5 мМ ЭДТА и 0,2 М NaCl. Реакцию инициировали впрыскиванием в каждую лунку планшета 50 мкл 100 мМ Трис-HCl буфера pH 8,8, содержащего 100 мМ CaCl2. Приведенные значения представляют собой среднее 3-х независимых измерений.

Спектры биолюминесценции и флуоресценции были измерены на флуоресцентном спектрофотометре Varian Cary Eclipse (Varian Medical Systems, США) и корректированы на чувствительность ФЭУ к различным длинам волн с помощью программного обеспечения прибора. Спектры биолюминесценции фотопротеинов измеряли в растворах, содержащих 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Бис-Трис пропан pH 7,0. В том же буфере инициировали биолюминесценцию, используя CaCl2. Спектры флуоресценции были записаны для Са2+-разряженных мутантов фотопротеинов при 10-кратном разбавлении концентрированных белковых растворов в 50 мМ Бис-Трис пропан буфере (pH 7,0), содержащем 1 мМ CaCl2.

Все спектральные измерения выполнены при комнатной температуре.

2.6 Измерение спектра поглощения апо-обелин–целентеразинового комплекса Спектры поглощения апо-обелин–целентеразинового комплекса в спектрофотометре U-2010 (Hitachi, Япония) против чистого буфера для элюции белка (20 мМ Трис-HCl pH 7,0, 2 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl).

Спектры поглощения анаэробных образцов целентеразина с различными рН (2 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl pH 7,0; 2 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl pH 10,0; 2 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl, мМ Бис-Трис-HCl pH 6,5) были промерены против соответствующих буферов. рН всех исследуемых растворов был проверен перед добавлением целентеразина. Объемная доля этанола в исследуемых образцах не превышала 1 %.

Спектры поглощения апо-обелин–целентеразинового комплекса и целентеразина, характеризующие процесс насыщения образца кислородом, были получены путем измерения поглощения образца в открытой доступу кислорода кювете против аналогичного образца в закрытой кювете.

Измерения проводились каждые 5 минут в течение первых 30 минут, затем каждые 15 минут в течение 7 часов. Измерения проводились при комнатной температуре.

2.7 Кинетические измерения методом остановленной струи (stoppedflow) Измерение кинетики биолюминесценции обелина дикого типа и его мутантов Y138F и F88Y с помощью метода остановленной струи проводили на приборе Applied Photophysics SX20 (Великобритания) с объемом камеры 20 мкл и мертвым временем 1,1 миллисекунды. Температурный контроль осуществлялся циркулированием воды через водную баню. Измерения проводились при 20°С. Шприцы для впрыскивания растворов содержали образец белка в 1 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl рН 7,2 и 2 мМ CaCl2, 20 мМ Трис-HCl рН 7,2. Растворы смешивались в камере за одинаковое время.

Константы кинетик подъема и спада биолюминесцентных реакций были рассчитаны с помощью программы Sigma Plot 2012. Приведенные значения представляют собой среднее 3-х независимых измерений.

2.8 Кристаллография Первоначальный поиск условий кристаллизации белков выполняли с использованием 672 коммерческих растворов при помощи робота Mosquito (TTPLabtech, Великобритания) и 96-луночного планшета Greiner CrystalQuick (Германия) методом сидячей капли: 0,3 мкл раствора белка смешивали с 0, мкл раствора для кристаллизации. После этого планшеты запаивали герметичной пленкой и хранили при 4° и 16°С.

Кристалл вынимали из лунки при помощи волокняной петли, удаляя избыток жидкости прикосновением к покровному стеклу. После этого кристалл быстро замораживали в жидком азоте.

Дифракционные данные для мутантов обелина Y138F и F88Y со связанным 2-гидропероксицелентеразином, а также мутантов со связанными ионами кальция и целентерамидом были получены при облучении кристаллов длиной волны 0,9789 с использованием рентгеновского излучения синхротрона (BL17U1, Shanghai Synchrotron Radiation Facility, Китай).

Рентгеновскую дифракцию кристалла записывали с помощью Quantum 315r CCD камеры (расстояние от кристалла до камеры 200-250 мм, время экспозиции 1 секунда, вращение кристалла 360° с шагом 1°).

2.9 Программное обеспечение Дифракционные данные обрабатывали с помощью программы HKL2000. Фазы были рассчитаны программой PHASER по методу молекулярных замещений с использованием структур обелина и Са2+-разряженного обелина из O. longissima (идентификационные номера в PDB банке 1QV0 и 2F8P, соответственно) в качестве модельных. Модели белков были автоматически построены с помощью программы PHENIX.

Расчет параметров модели и ее усовершенствование выполняли при помощи программ REFMAC5 (CCP4i) и COOT.

Для визуализации белковых молекул использовали 3D графическую программу PYMOL (0,99).

Для построения графиков использовались пакеты Mircosoft Excel и Sigma Plot 2012.

Расчет углов между -спиралями выполнен с использованием программы Interhlx (http://nmr.uhnres.utoronto.ca/ikura/interhlx/).

В работе были использованы следующие реактивы: ампициллин (Sigma Aldrich, США), триптон (Sigma Chemical Co, США), дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), LB среда (Fisher Scientific, UK), изопропил--D-тиогалактопиранозид (СибЭнзим, Новосибирск, Россия), Трис (Fluka, Швейцария), Бис-Трис (Sigma Chemical Co, США), мочевина (USB Corp), додецилсульфат натрия, ЭДТА-натриевая соль, дитиотреитол (Aldrich Chemical Co., США), синтетический целентеразин (JNC Corporation, Япония), бычий сывороточный альбумин (Pierce, США), кальций хлорид (JT Backer, США), кальций ацетат (EMD Chemicals, США), растворы для кристаллизации (Hampton Research, США; Emerald BioSystems, США).

Все остальные использованные реактивы относились к категории ХЧ или ЧДА.

ГЛАВА 3 Пространственные структуры обелина Y138F и Са2+-разряженного обелина Y138F. Каталитическая функция молекулы воды и роль Tyr138 в биолюминесцентной реакции 3.1 Пространственные кристаллические структуры обелина Y138F со связанным 2-гидропероксицелентеразином и Са2+-разряженного обелина Y138F со связанными целентерамидом и ионами Са2+ 3.1.1 Кристаллизация Для кристаллизации обелин Y138F после хроматографической очистки был переведен в буфер, содержащий 2 мМ ЭДTA, 10 мМ Бис-Трис pH 6,5, и сконцентрирован до концентрации 18 мг/мл.

Для приготовления Са2+-разряженного обелина Y138F образец заряженного белка при температуре 4°С был разведен раствором, содержащем 4 мМ CaCl2, 10 мМ Бис-Трис pH 6,5, до финальной концентрации примерно 1 мг/мл. Во время данной процедуры наблюдалось биолюминесцентное свечение светло-зеленого цвета. После окончания биолюминесцентного свечения белковый раствор сменил желтую окраску на бесцветную, что говорит о превращении целентеразина в целентерамид. Для проверки присутствия связанного с белком целентерамида в растворе был измерен флуоресцентный спектр образца. Затем образец Са2+-разряженного обелина Y138F был сконцентрирован для постановки кристаллизации до 12 мг/мл.

Кристаллы обелина Y138F были выращены в течение 5 дней после постановки кристаллизации при 4°С в 2,1 М яблочной кислоте. Кристаллы имели желтый окрас и палочковидную форму (рис. 3.1А).

Большой бесцветный кристалл Са2+-разряженного обелина Y138F выращивали в течение 7дней при следующих условиях: 0,2 M нитрат аммония, 20% PEG 3350, при 16°С (рис. 3.1Б).

Рисунок 3.1 – А – кристаллы обелина Y138F со связанным 2-гидропероксицелентеразином. Б – кристалл Са2+-разряженного обелина Y138F со связанным целентерамидом и ионами Са2+.

ультрафиолетом можно было наблюдать зеленую флуоресценцию, показывающую, что целентерамид прочно связан с белком.

В таблице 3.1 приведена кристаллографическая статистика после обработки дифракционных данных и построения пространственных моделей белков. Пространственные модели для обелина Y138F со связанным 2-гидропероксицелентеразином и Са2+-разряженного обелина Y138F со связанным целентерамидом и ионами Са2+ были помещены в базу данных кристаллических структур белков [Berman et al., 2000] с PDB кодами 4MRX и 4MRY, соответственно.

3.1.2 Общая структура белков 2-гидропероксицелентеразином и Са2+-разряженного обелина Y138F со связанным целентерамидом сохраняют компактную глобулярную пространственную организацию (рис. 3.2), характерную для всех лигандТаблица 3. Кристаллографическая статистика для обелина Y138F со связанным 2-гидропероксицелентеразином и Са2+-разряженного обелина Y138F Обработка данных предел разрешения, размеры элементарной ячейки, уникальные отражения (свободные) Усовершенствование модели использованные отражения (несвязанные) зависимых конформационных состояний Са2+-регулируемых фотопротеинов [Head et al., 2000; Liu et al., 2000; Liu et al., 2006; Titushin et al., 2010]. Кроме того, обе описываемые структуры очень похожи на пространственные структуры дикого обелина в тех же конформационных состояниях (рис. 3.2).

Среднеквадратичное отклонение (RMSD) атомов основной цепи обелина Y138F и дикого обелина (рис. 3.2; табл. 3.2) составляет всего 0,3. Для структур Са2+-разряженных конформационных состояний обелина Y138F и дикого обелина RMSD атомов основной цепи составляет 1,52 (рис. 3.2;

табл. 3.2), при этом С-концевой домен имеет более значительные конформационные различия, чем N-концевой домен.

RMSD атомов основной цепи обелина Y138F и Са2+-разряженного обелина Y138F составляет 2,46, что несколько больше, чем отклонение, конформационных состояниях, равное 1,92 [Liu et al., 2006]. Несмотря на это, в пространственных структурах дикого обелина и его мутанта Y138F происходят практически одинаковые изменения в ответ на связывание Са2+, например, конформационная трансформация C-концевого домена гораздо выше, чем N-концевого домена.

В Са2+-регулируемых фотопротеинах С-концевая петля закрывает внутреннюю субстрат-связывающую полость, обеспечивая для субстрата неполярное и недоступное растворителю окружение. Это условие, по всей вероятности, способствует эффективному образованию возбужденного электронного состояния целентерамида и излучению с высоким квантовым выходом [Head et al., 2000; Liu et al., 2000; Liu et al., 2003; Titushin et al., 2010].

Сравнение конформационных состояний обелина Y138F и дикого обелина фотопротеинов Са2+-связывающая петля I Са2+-связывающая петля II Са2+-связывающая петля III Са2+-связывающая петля IV Схожая картина наблюдается и в случае мутанта обелина Y138F.

Исходя из анализа пространственных структур, недоступность продукта биолюминесцентной реакции растворителю обеспечивается за счет формирования водородных связей между аминокислотными остатками, расположенными в -спиралях А и H (рис. 3.2), а также в С-концевой петле.

Атомы N2 His22 и His24, находящиеся в -спирали А, формируют водородные связи с атомами кислородов карбонильных групп Trp (-спираль H) и Gly193 (С-концевая петля), а атомы N1 и N2 Arg21, также расположенного в -спирали А, – с атомами кислорода карбонильной группы Phe178 (-спираль H), O1 Asp187 и С-концевого терминирующего Pro195.

Са2+-разряженный обелин Y138F сохраняет все описанные водородные связи Рисунок 3.2 – А – структурное сравнение обелина Y138F (желтый) и дикого обелина (зеленый). 2-гидропероксицелентеразин показан в центре белковой глобулы;

-спирали обозначены латинскими буквами А-H; Са2+-связывающие петли обозначены цифрами I-IV. Б – структурное сравнение Са2+-разряженного обелина Y138F (синий) и Са2+-разряженного дикого обелина (золотой). Целентерамид показан в центре белковой глобулы, Са2+ – в виде сфер. В – стереоизображение структурного сравнения обелина Y138F (желтый) и Са2+-разряженного обелина Y138F (синий). Г – аминокислотная последовательность обелина из O. longissima. Место мутационной замены выделено красным. -спирали показаны желтыми и синими прямоугольниками, в соответствии со структурами обелина Y138F и Са2+-разряженного обелина Y138F. Са2+-связывающие петли показаны красными прямоугольниками.

и, кроме того, образует одну новую между N2 атомом Arg17 (-спираль A) и практически идентичны у обелина Y138F и обелина дикого типа [Liu et al., 2000; Liu et al., 2003; Liu et al., 2006].

3.1.3 «EF-hand» Са2+-связывающие петли Строение Са2+-связывающих петель обелина Y138F и все изменения, происходящие с ними в процессе биолюминесцентной реакции, практически полностью повторяют данные, описанные для обелина дикого типа [Liu et al., 2006]. В структуре Са2+-разряженного обелина Y138F ионы кальция найдены в каждом из предполагаемых центров связывания кальция («EF-hand» петли I, III и IV) (рис. 3.2). Са2+-связывающая петля II в N-концевом домене белка не участвует в связывании кальция из-за отсутствия в ее составе определенных аминокислотных остатков и поэтому не претерпевает существенных конформационных изменений. Наиболее существенные конформационные изменения после связывания ионов кальция происходят в Са2+-связывающей «EF-hand» петле IV (табл. 3.2). Изменение ориентации оптимальной конформации, делает возможным связывание иона Са2+. В структуре Са2+-разряженного обелина Y138F ион кальция во всех трех Са2+связывающих петлях координируется по типичной схеме пентагональной бипирамиды. Шестью координационными лигандами выступают атомы кислорода карбоксильной группы боковых цепей Asp и Glu, карбонильные группы основной цепи или боковой цепи Asn, а также гидроксильные группы серина. Седьмым лигандом для связывания кальция является атом кислорода молекулы воды. Длина координационных связей составляет ~ 2,4.

Данные, полученные при сравнении кристаллических структур соответствующими им структурами дикого обелина, говорят о том, что мутационная замена тирозина на фенилаланин в 138 положении не оказывает конформационную реорганизацию, связанную со связыванием Са2+.

3.1.4 Субстрат-связывающие полости Аминокислотные остатки, формирующие субстрат-связывающую полость в обелине Y138F, то есть аминокислоты в пределах 4 вокруг 2-гидропероксицелентеразина, относятся ко всем 8 -спиралям:

-спираль А (His22, Met25, Phe28, Leu29), -спираль B (Lys45 и Ile50), -спираль C (Phe72), -спираль D (Phe88 и Trp92), -спираль E (Ile111, Trp114, Gly115, Phe119), -спираль F (Trp135 и Phe138), -спираль H (Met171, His175, Trp179). Кроме того, Ile144 из петли между -спиралями F и G, а также Tyr190, находящийся на С-конце белка. Набор аминокислотных остатков в субстрат-связывающих полостях обелина Y138F и обелина дикого типа (PDB код 1QV0) практически идентичен. Но все же структура обелина Y138F обладает некоторыми отличиями. В структуре мутанта Ile42, входящий в состав -спирали B, из-за небольшого смещения не входит в зону 4 вокруг целентеразина. И, конечно же, главным отличием является замена Tyr138 на Phe138.

Системы водородных связей в обелине дикого типа и обелине Y138F, формируемые 2-гидропероксицелентеразином и некоторыми ключевыми аминокислотными остатками активного центра, показаны на рисунке 3.3А. В диком обелине (рис. 3.3А, слева) His22 и Trp92 находятся на расстоянии водородной связи от кислорода 6-(п-гидрокси)-фенильной группы, Tyr образует водородную связь с пероксидной группой, His175 формирует водородную связь с Tyr190 и C3 карбонильным кислородом, атом N Trp также находится на расстоянии водородной связи от C3 карбонильного 2-гидропероксицелентеразина.

Рисунок 3.3 – А – схематическое изображение 2-гидропероксицелентеразинсвязывающих полостей в обелине дикого типа (слева) и обелина Y138F (справа). Б – стереоизображение структурного наложения 2-гидропероксицелентеразина в окружении ключевых аминокислотных остатков активного центра обелина дикого типа (зеленый, PDB код 1QV0) и обелина Y138F (желтый). Молекулы воды показаны в виде сфер соответствующего цвета.

Кроме того, в полости находятся две молекулы воды, W1 и W2, положение которых стабилизировано водородными связями с окружающими аминокислотными остатками и субстратом. Третья молекула воды (W3) ориентирована ближе к поверхности белковой молекулы и удерживается водородными связями с His64, Ser47, Thr61 и азотом основной цепи Gln (рис. 3.3А, слева). Важно отметить, что обелин Y138F, связанный с 2-гидропероксицелентеразином, имеет аналогичную организацию субстратсвязывающей полости. Более того, все аминокислотные остатки имеют схожее местоположение (рис. 3.3Б). Есть только одно, но очень важное отличие – во внутренней полости обелина Y138F отсутствует молекула воды, обозначенная в W2 положении у дикого обелина (рис. 3.3).

Аминокислотные остатки, формирующие субстрат-связывающую непосредственной близости от целентерамида, относятся к -спирали A (His22, Met25, Phe28, Leu29), -спирали B (Ala46 и Ile50), -спирали C (Phe72), -спирали D (Phe88 и Trp92), -спирали E (Trp114, Gly115, Val118), -спирали F (Phe138) и -спирали H (Met171, His175, Trp179). В формировании полости также принимает участие Ile141, находящийся в петле между -спиралями F и G, и Tyr190, расположенный на С-конце белка.

То есть, фактически все те же аминокислоты, что и в обелине Y138F, связанном с 2-гидропероксицелентеразином, за исключением Lys45, Ile111, Phe119, Trp135, Ile144, которые уходят из полости, и Ala46, Val118, Ile141, которые перемещаются в полость Са2+-разряженного белка. Также стоит отметить, что аминокислотный состав целентерамид-связывающих полостей в обелине Y138F и обелине дикого типа практически идентичен, за исключением двух различий. Во внутренней полости Ca2+-разряженного обелина Y138F были найдены остатки Phe138 и Ile141 вместо Gly143.

Двухмерные изображения систем водородных связей, образованных между целентерамидом и ключевыми аминокислотными остатками разряженного обелина Y138F, показаны на рисунке 3.4А.

В Ca2+-разряженном обелине дикого типа боковые цепи His22 и Trp92, до реакции находившиеся на расстоянии водородной связи от кислорода 6п-гидрокси)-фенильной группы 2-гидропероксицелентеразина (рис. 3.3А), располагаются на примерно той же дистанции от кислорода 5-(п-гидрокси)фенильной группы целентерамида. Атом N Trp179 формировал водородную связь с кислородом C3-карбонильной группы, но после реакции он соединен с гидроксилом Tyr190 (рис. 3.4А).

Рисунок 3.4 – Внутренние полости Са2+-разряженных обелина дикого типа и обелина Y138F. А – схематическое изображение целентерамид-связывающих полостей в Са2+-разряженных обелине дикого типа (слева) и обелине Y138F (справа). Б – стереоизображение структурного наложения целентерамида в окружении ключевых аминокислотных остатков активного центра обелина дикого типа (золотой, PDB код 2F8P) и обелина Y138F (синий). Молекулы воды показаны в виде сфер соответствующего цвета.

Более того, Tyr190, который ранее стабилизировал пероксидную группу производного целентеразина и был связан с His175, после реакции теряет водородную связь с His175, но образует новую с карбонильным кислородом целентерамида. Остаток His175 также формирует новую водородную связь с N1 атомом целентерамида и молекулой воды W1, которая изменяет положение по причине смещения 2-(п-гидрокси)-бензильной группы целентерамида. Из-за смены местоположения молекула воды W1 сохраняет водородную связь только с Ile111. Гидроксильная группа Tyr138, изначально образовавшая водородную связь с N1 атомом субстрата, теперь формирует водородную связь с Glu55 на поверхности белковой молекулы (рис. 3.4А).

Очевидно, что Tyr138 замещается молекулой воды W2, которая до реакции соединяла Tyr138 с His64 (рис. 3.3А). В результате остаток His64 также немного смещается к целентерамиду и сохраняет водородную связь с W2.

Кроме того, после реакции W2 также связана с карбонильным кислородом Ala46. Несмотря на то, что His64 изменил свое местоположение, молекула воды W3 сохраняет водородную связь с Ser47 и образует новые с атомами кислорода Asp48 и Gln65 (рис. 3.4А, слева). В целентерамид-связывающей полости Ca2+-разряженного обелина Y138F все аминокислотные остатки находятся практически в тех же положениях (рис. 3.4А, справа). Небольшое отличие наблюдается в системе связей молекулы воды W3. В структуре обелина Y138F молекула воды W3 формирует водородные связи только с Ser47 и Asp48, тогда как в обелине дикого типа есть еще одна связь с Gln65.

Также исчезает водородная связь между атомом N Trp114 и W2.

Наиболее важной находкой в структуре целентерамид-связывающей полости Ca2+-разряженного обелина Y138F является молекула воды W2 (рис.

3.4А, справа), которая, как было описано выше, исчезла в структуре обелина Y138F со связанным 2-гидропероксицелентеразином (рис. 3.3А, справа). На рисунке 3.5 показаны поверхности белковых глобул обелина Y138F и обелина дикого типа в двух конформационных состояниях, до и после биоРисунок 3.5 – Изображение поверхностей белковых глобул обелина Y138F и обелина дикого типа в двух конформационных состояниях. А – обелин Y138F (с 2-гидропероксицелентеразином). Б – Ca2+-разряженный обелин Y138F. В – обелин дикого типа (с 2-гидропероксицелентеразином).

Г – Ca2+-разряженный дикий обелин. Доступные растворителю отверстия на поверхности Ca2+-разряженного обелина Y138F (Б) и дикого обелина (Г) показаны в центре. 2-гидропероксицелентеразин, целентерамид и аминокислотные остатки показаны в виде серых палочек. Молекулы воды показаны в виде сфер голубого цвета. Все структуры в одинаковой ориентации. Водородные связи показаны в виде прерывистых черных линий.

На белковой поверхности атомы углерода обозначены светло-серым цветом, азота – синим, кислорода – красным и серы – желтым.

люминесцентной реакции. Несмотря на то, что связывание ионов Ca2+ незначительно влияет на пространственную структуру фотопротеинов (табл.

3.2), этих изменений вполне достаточно для образования открытого растворителю отверстия на поверхности белковой глобулы (рис. 3.5), что, повидимому, связано со смещением остатков Lys45 и Ser142.

3.1.5 Спектральные и кинетические свойства обелина Y138F Замена Tyr на Phe в 138 положении не приводит к таким существенным изменениям функциональной активности обелина (табл. 3.3), как замена некоторых других аминокислотных остатков субстратсвязывающей полости фотопротеинов [Ohmiya, Tsuji, 1993; Eremeeva et al., 2013]. Но некоторые биолюминесцентные характеристики меняются заметно.

На рисунке 3.6 отображены кинетики биолюминесцентных реакций обелина дикого типа и обелина Y138F, измеренные методом остановленной струи.

Рисунок 3.6 – Кинетики подъема (слева) и спада (справа) биолюминесцентной реакции дикого обелина (А) и обелина Y138F (Б).

Концентрация белка – 4,5 мкМ. Каждый график – отдельное измерение.

При сравнении полученных данных, мы обнаружили, что значение константы подъема кинетики биолюминесцентной реакции (рис. 3.6) уменьшилось с 476,5 ± 1,4 сек-1 у дикого обелина до 305,3 ± 1,4 сек-1 у обелина Y138F (табл. 3.3). То есть мутационная замена остатка Tyr снижает скорость подъема кинетики биолюминесцентной реакции в 1,5 раза по сравнению с обелином дикого типа.

Спектральные и кинетические характеристики обелина Y138F Удельная активность, (% от активности Максимум спектра биолюминесценции, Максимум спектра флуоресценции, max, Константы спада, Значение констант спада кинетики биолюминесцентной реакции обелина Y138F также уменьшается: k1 и k2 для обелина дикого типа равны 43,6 ± 0,23 сек-1 и 5,0 ± 0,01 сек-1,соответственно, тогда как у описываемого мутанта 13,7 ± 0,3 сек-1 и 0,06 ± 0,0003 сек-1 (табл. 3.3). Кроме того, мутация повышает вклад «быстрой» и уменьшает вклад «медленной» компоненты на фазе спада (табл. 3.3).

Максимум спектра биолюминесценции дикого обелина составляет 480 нм с небольшим плечом на 400 нм (рис. 3.7А, табл. 3.3). Замена тирозина на фенилаланин приводит к смещению максимума биолюминесценции в длинноволновую область на 10 нм и снижению интенсивности сигнала на 400 нм (рис. 3.7А, табл. 3.3). Тем не менее, оба обелина в Ca2+-разряженном состоянии имеют сходные спектры флуоресценции с максимумом примерно 510 нм (рис. 3.7Б, табл. 3.3).

Рисунок 3.7 – Спектры биолюминесценции (А) и флуоресценции (Б) дикого обелина (сплошная линия) и обелина Y138F (пунктирная линия).

3.2 Каталитическая функция молекулы воды и роль Tyr138 в биолюминесцентной реакции Как уже было сказано выше, на основе анализа полученных пространственных структур нескольких Ca2+-регулируемых фотопротеинов [Head et al., 2000; Liu et al., 2000; Liu et al, 2003; Titushin et al., 2010] и их различных лиганд-зависимых конформационных состояний [Deng et al., 2004;

Deng et al., 2005; Liu et al., 2006], а также данных, полученных при исследовании свойств различных мутантов фотопротеинов, были сделаны биолюминесценции фотопротеинов. Предполагается, что система водородных связей, формируемая остатками His175 и Tyr190 (His169 и Tyr184 в акворине), стабилизирует молекулу 2-гидропероксицелентеразина, причем роль His критична для биолюминесцентной реакции, потому что его замена приводит к практически полной потере биолюминесцентной активности [Ohmiya, Tsuji, 1993; Eremeeva et al., 2013a]. Факт перемещения предположить, что His может служить своеобразным «спусковым крючком»

биолюминесцентной реакции [Liu et al., 2006; Vysotski, Lee, 2007]. Более того, His может быть ключевым аминокислотным остатком в процессе формирования активного фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода [Eremeeva et al., 2013b; Eremeeva et al., 2013c]. Боковые цепи His22, Trp92 в обелине и His16, Tyr82 и Trp86 в акворине находятся на расстоянии водородной связи от гидроксила 6-(п-гидрокси)-фенильной группы 2-гидропероксицелентеразина. Система водородных связей, формируемая этими остатками, имеет большое значение для формирования эмиттера биолюминесценции, потому что их замена приводит к изменению спектра излучения [Ohmiya et al., 1992; Deng et al., 2001; Vysotski et al., 2003;

Malikova et al., 2003; Stepanyuk et al., 2005; Frank et al., 2008]. Это объясняется тем, что целентеразин имеет диссоциируемую 6-(п-гидрокси)фенильную группу, и излучение в длинноволновой части спектра возникает от возбужденной формы фенолят аниона после переноса протона на His22 в обелине (His16 в акворине) [Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007; Tomilin et al., 2008; van Oort et al., 2009].

В диком обелине Tyr138 (Tyr132 в акворине) располагается на расстоянии водородной связи от N1-атома 2-гидропероксицелентеразина (рис. 3А, слева) и также формирует водородную связь с молекулой воды W2, которая, в свою очередь, связана с His64. Основываясь на данных, полученных при анализе кристаллической структуры Ca2+-разряженного обелина (рис. 3.4А, слева), было предположено, что W1 катализирует реакцию декарбоксилирования путем протонирования диоксиэтанонового аниона (рис. 1.12) [Liu et al., 2006; Vysotski, Lee, 2007].

пространственные структуры обелина Y138F в двух лиганд-зависимых конформационных состояниях – до и после биолюминесцентной реакции.



Pages:     || 2 |


Похожие работы:

«Жидкова Юнна Юрьевна РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ФАРМАКОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПОЗИТНЫХ ГЕЛЕЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГИПЕРТРОФИЧЕСКИХ И КЕЛОИДНЫХ РУБЦОВ 14.04.01. – технология получения лекарств ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель :...»

«ПИКАЛОВА Татьяна Александровна УПРАВЛЕНИЕ ОПЕРАЦИОННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬЮ ГОРНОЙ КОМПАНИИ НА ОСНОВЕ КОНЦЕПЦИИ КОРПОРАТИВНОГО УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями,...»

«Мазуров Сергей Федорович КОМПЛЕКСНОЕ ГЕОИНФОРМАЦИОННОЕ КАРТОГРАФИРОВАНИЕ АДМИНИСТРАТИВНЫХ И ХОЗЯЙСТВЕННЫХ ТЕРРИТОРИЙ И ИХ СТРУКТУР (НА ПРИМЕРЕ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА) 25.00.33 – Картография Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный...»

«Тютюнник Игорь Георгиевич КОРЫСТНЫЙ МОТИВ В СТРУКТУРЕ ПРЕСТУПЛЕНИЙ ПРОТИВ СВОБОДЫ ЛИЧНОСТИ: УГОЛОВНО-ПРАВОВОЙ И КРИМИНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Специальность 12.00.08 – Уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный...»

«ЛЮБУШКИНА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА ОБЩЕСТВЕННЫЕ ОРГАНИЗАЦИИ СТАВРОПОЛЬСКОЙ ГУБЕРНИИ И КУБАНСКОЙ ОБЛАСТИ В ПЕРИОД С 1860-Х гг. ПО ОКТЯБРЬ 1917 г. Специальность 07.00.02 Отечественная история Диссертация на соискание ученой степени кандидата исторических наук Научный руководитель доктор исторических наук, профессор Покотилова Т.Е. Ставрополь – ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.. Глава I. Организационные...»

«УДК 123.456 ПЕТРОВ Вадим Александрович Руководство по оформлению диссертации с использованием TEXовского класса thesisby версии 1.0 Диссертация на соискание ученой степени кандидата физ. - TEX наук по специальности 12.34.56 TEXника Научный руководитель д-р физ. - TEX наук, профессор Петров А.В. Минск ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 НАЧАЛО...»

«УДК 539.196 Ермолова Екатерина Владимировна ДИНАМИКА ПРОЦЕССОВ ПРЯМОЙ ТРЕХТЕЛЬНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ ТЯЖЕЛЫХ ИОНОВ Специальность 01.04.17 — Химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель — д.ф.-м.н. Л.Ю. Русин Москва – ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Глазовский государственный педагогический институт им. В.Г. Короленко Ульянова Наталия Сергеевна Формирование эмоциональной культуры младших школьников на занятиях по изобразительному искусству 13.00.01- Общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание учёной степени кандидата педагогических наук Научный руководитель доктор педагогических наук, профессор А.С. Казаринов...»

«ШАРЫПОВА НАТАЛЬЯ ГАВРИИЛОВНА Механизмы повреждений плазматических мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома 14.00.16 – патологическая физиология 14.00.45 – наркология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор СЕРЕБРОВ В.Ю....»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Тюхтенев, Алексей Степанович Экономическая (материальная) основа местного самоуправления в Российской Федерации Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Тюхтенев, Алексей Степанович.    Экономическая (материальная) основа местного самоуправления в Российской Федерации  [Электронный ресурс] : Теоретико­правовые аспекты : Дис. . канд. юрид. наук  : 12.00.02. ­ М.: РГБ, 2006. ­ (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)....»

«Вакурин Алексей Александрович Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель : д.б.н., с.н.с. Картавцева Ирина Васильевна Владивосток –...»

«Марданян Гайк Ваникович КЛИНИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ ЧРЕСКОЖНЫХ КОРОНАРНЫХ ВМЕШАТЕЛЬСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТЕНТОВ С РАЗНЫМИ ТИПАМИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПОКРЫТИЯ 14.01.26 – сердечно-сосудистая хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель д.м.н., профессор С.А. Абугов...»

«Кахнович Светлана Вячеславовна ФОРМИРОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЙ У ДЕТЕЙ ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА В ХУДОЖЕСТВЕННО-ТВОРЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ 13.00.02 Теория и методика обучения и воспитания (изобразительное искусство) Диссертация на соискание ученой степени доктора педагогических наук Научный консультант – доктор педагогических наук, профессор Т. С. Комарова Саранск 2014 1 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Королев Виктор Васильевич АДСОРБЦИОННЫЕ И МАГНИТОТЕПЛОВЫЕ СВОЙСТВА НЕКОТОРЫХ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ МАГНЕТИКОВ 02.00.04 – физическая химия 02.00.01 – неорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук Иваново – 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 6 Глава 1. Высокодисперсные магнетики. 1.1. Строение кристаллической решетки и структура...»

«Кудинов Владимир Владимирович ЭКОНОМИЧЕСКОЕ ВОСПИТАНИЕ УЧАЩИХСЯ СТАРШИХ КЛАССОВ В ИНФОРМАЦИОННОЙ СРЕДЕ ШКОЛЫ 13.00.01 – общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – заслуженный деятель науки УР доктор педагогических наук профессор Л. К. Веретенникова Москва – 2005 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.. Глава 1....»

«Дмитриев Юрий Конетаитииович ~ РЕСУРСО-И ЭНЕРГОСБЕРЕГАЮЩИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ ЭТИЛЕНА И ПРОПИЛЕНА Специальность 02.00.13 -Нефтехимия ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора технических...»

«Парфнова Ольга Владимировна ОЦЕНКА РИСКА ПОВТОРНЫХ ОПЕРАТИВНЫХ ВМЕШАТЕЛЬСТВ У ПАЦИЕНТОВ С РАСПРОСТРАНЕННЫМ ПЕРИТОНИТОМ 14.01.17 - хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, Л.Л. Плоткин Челябинск -...»

«Матыцин Михаил Сергеевич Моделирование индексов потребительских цен для доходных групп российских домашних хозяйств (на основе совместного использования информации выборочных обследований и макростатистики) 08.00.13 – Математические и инструментальные методы экономики Диссертация на соискание ученой степени...»

«БЕЛОЗЕРОВА Наталья Сергеевна Влияние салициловой кислоты и цитокинина на экспрессию генов митохондриальных белков (03.01.05 – физиология и биохимия растений) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – кандидат биологических наук Пожидаева Елена Станиславовна Москва – ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Буреломова Анастасия Сергеевна СОЦИАЛЬНО-ПСИХОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦЕННОСТЕЙ СОВРЕМЕННЫХ ПОДРОСТКОВ 19.00.05 – Социальная психология (психологические наук и) Диссертация на соискание ученой степени кандидата психологических наук Научный руководитель : доктор психологических наук, профессор, академик РАО Собкин В.С. Москва – 2013 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Социально-психологические особенности ценностных...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.