«Механизмы повреждений плазматических мембран лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома ...»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО

РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ШАРЫПОВА НАТАЛЬЯ ГАВРИИЛОВНА

Механизмы повреждений плазматических мембран лимфоцитов

крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома 14.00.16 – патологическая физиология 14.00.45 – наркология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор СЕРЕБРОВ В.Ю.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор БАЛАШОВ П.П.

ТОМСК-

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………. ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………..

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Патогенетические аспекты развития наркоманий….…………………. 1.1.1. Синдром физической зависимости при опийной наркомании……… 1.1.2. Биологические механизмы формирования наркоманий…………….. 1.1.3. Абстинентный синдром при опийной наркомании………………….. 1.1.4. Нарушение метаболических процессов при наркомании…………… 1.1.5. Терапия наркоманий опийной группы……………………………….. 1.1.5.1. Психотропные свойства – адреноблокаторов…….……………… 1.2. Современные представления о липидах, как биоэффекторах…………. 1.3. Роль сфинголипидов в развитии и течении различных заболеваний………………………………………………………. 1.4. Структура и функции мембран лимфоцитов…………………………… 1.4.1. Структура и функции биологических мембран при различных видах патологии………………………………………………………………………. 1.5. Система перекисного окисления липидов…………………………….. 1.5.1. Перекисное окисление липидов. Характеристика процесса………… 1.5.2. Регуляция перекисного окисления липидов in vivo………………….. 1.5.3. Участие перекисного окисления липидов в патологических процессах………………………………………………………………………. 1. 5.4. Участие фосфолипаз в повреждении клетки…………………………. 1.6. Протеиназно – ингибиторная система в регуляции биологических процессов………………………………………………………………….…… 1.6.1. Протеиназы плазмы крови……………………………………………… 1.6.2. Ингибиторы протеолитических ферментов как протекторы клеточных повреждений……………………………………………………………………. 1.6.3. 1 – Протеиназный ингибитор, 2 – макроглобулин и их роль в патологии………………………………………………………………………

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материал………………………………………………………………….… 2.1.1. Характеристика клинического материала………………………………. 2.2. Использованные в работе методы…………………………………………. 2.2.1. Выделение лимфоцитов периферической крови……………………….. 2.2.2. Выделение плазматических мембран лимфоцитов разделением в двухфазной системе декстран - полиэтиленгликоль………… 2.2.3. Разделение липидов мембран лимфоцитов методом тонкослойной хроматографии…………………………………………………………………... 2.2.4. Изучение асимметрии мембранных фосфолипидов с помощью химических реагентов…………………………………………………… 2.2.5. Определение активности сфингомиелиназы ………………………….. 2.2.6. Определение активности фосфолипазы А2 …………………………….. 2.2.7. Определение активности фосфолипазы D …………………………….. 2.2.8. Определение активности процессов перекисного окисления липидов………………………………………………………………………….. 2.2.8.1. Определение содержания ТБК – активных продуктов в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови…………………………………………………………………………….. 2.2.8.2. Определение активности каталазы в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови ………………………………………………. 2.2.8.3. Определение активности супероксиддисмутазы в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови ……………………………………………………………………………. 2.2.9. Определение активности протеолитических процессов………………. 2.2.9.1. Определение активности трипсина в сыворотке крови…………………………………………………………………………….. 2.2.9.2. Определение содержания плазминогена в плазме крови……………. 2.2.9.3. Определение содержания растворимых фибринмономерных комплексов в плазме крови……………………………………………………. 2.2.9.4. Определение активности 1 – протеиназного ингибитора в плазме крови…………………………………………………………………………….. 2.2.9.5. Определение активности 2 – макроглобулина в плазме крови……………………………………………………………………………. 2.2.9.6. Определение активности антитромбина III в плазме крови………... 2.2.10. Определение активности фактора Виллебранда в плазме крови…… 2.2.11. Определение неорганического фосфата по методу Бодански………. 2.2.12.Микробиуретовый метод определения белка…………………………. 2.2.13. Статистическая обработка данных…………………………………….

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение липидного состава плазматических мембран лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до проведения лечения, находившихся на стандартном лечении и лечении, проводимом в комплексе с - адреноблокатором……………………………. 3.2 Изучение активности сфингомиелиназы, содержания сфингомиелина и церамидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до проведения лечения, находившихся на стандартном лечении и лечении, проводимом в комплексе с - адреноблокатором…………………………………………………………… 3.3. Изучение активности фосфолипаз и процессов перекисного окисления липидов плазматических мембран лимфоцитов и сыворотки крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до проведения лечения, находившихся на стандартном лечении и лечении, проводимом в комплексе с ………………………………...…………………………………………………. 3.4. Изучение протеиназно-ингибиторной системы плазмы крови больных опийной наркоманией в состоянии абстиненции до проведения лечения, находившихся на стандартном лечении и лечении, проводимом в комплексе с – адреноблокатором.………………………………………………………… ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………….. ВЫВОДЫ……………………………………………………………………… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………..

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 – ПИ - 1 – протеиназный ингибитор 2 – МГ – 2 – макроглобулин – АБ – – адреноблокаторы АО - антиоксиданты АОА - антиокислительная активность АТ -III – антитромбин III АФК – активные формы кислорода КА – катехоламины ЛФЛ - лизофосфолипиды ПМ – плазматические мембраны ПОЛ - перекисное окисление липидов РФМК – растворимые фибринмономерные комплексы СОД - супероксиддисмутаза СФМ – сфингомиелин ТБК – ап – ТБК – активные продукты ТМА – трансмембранная асимметрия ТСХ – тонкослойная хроматография ФАТ- фактор активации тромбоцитов ФВ – фактор Виллебранда ФИ - фосфатидилинозитол ФЛ - фосфолипиды ФЛA2 – фосфолипаза А ФЛD – фосфолипаза D ФНО - фактор некроза опухоли ФС - фосфатидилсерин ФХ - фосфатидилхолин ФЭА – фосфатидилэтаноламин ХС - холестерин ЭХ - эфиры холестерина

ВВЕДЕНИЕ

Акуальность. Распространенность заболевания наркоманией в нашей стране не имеет тенденции к снижению. Показатель заболеваемости наркоманией уже приближается к показателю заболеваемости сердечнососудистыми заболеваниями [1, 172]. В настоящее время употребление “чистых“ наркотиков встречается чрезвычайно редко. Чаще всего, применяемые наркотические вещества представляют собой кустарно приготовленную смесь из наркотических средств, балластных, психотропных и часто просто токсических веществ. В процессе кустарного приготовления наркотика в смесь дополнительно привносятся вещества (органические растворители, ангидриды, окислители), обладающие собственным токсическим действием. Использование такой смеси ведет к общему отравлению организма. Стало очевидным, что употребление психоактивных веществ ведет не только к развитию личностных и психических аномалий, но и является причиной широкого круга соматических заболеваний [1, 146, 157].

Опийная наркомания в клиническом отношении, прежде всего, проявляется абстинентным синдромом (состояние отмены), развитие которого связано с целым рядом вегетативных, физиологических и биохимических изменений в организме [209]. Это создает благоприятные условия для накопления во всех органах и тканях продуктов клеточного метаболизма и токсинов. По-видимому, в основе развития патологического процесса при абстинентном синдроме лежит дисбаланс клеточного гомеостаза и, как следствие, повреждение и гибель клетки.

В патогенезе опийной наркомании большое значение имеют изменения иммунологического гомеостаза, выражающиеся в большинстве случаев в нарушении клеточного звена иммунитета. Последнее проявляется как угнетением Т-клеточного звена иммунитета, так и повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов [82, 155]. Не вызывает сомнения наличие у больных наркоманиями (прежде всего опийной группы) признаков вторичного иммунодефицита, повышающего риск возникновения у них дискоординации иммунологических процессов отражает тяжесть течения заболевания, позволяя дать прогноз в отношении осложнений и отдаленных последствий. Иммунопатогенез опийной наркомании характеризуется гетерогенности и функциональной активности иммунокомпетентных клеток [117]. Изучение молекулярных механизмов повреждения клеток, в частности иммунокомпетентных, лежащих в основе развития осложнений опийной наркомании представляет значительный научный и практический интерес.

Сегодня большинство заболеваний рассматривают как состояния, сопряженные с поражением, прежде всего, клеточных мембран, поскольку патологических процессах приводит к потере их функциональной компетентности, изменению жизнедеятельности клеток в целом и, в конечном счете, к их гибели [52, 143].

Биологическим мембранам принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клетки. Хорошо известно, что липиды клеточных мембран являются не только формой депонирования метаболического топлива и основной компонентой клеточных структур, но и участвующих практически во всех физиологических процессах клетки [15, 20, 199]. Особый интерес при этом представляет изучение обмена сфинголипидов. Это связано с тем, что сфингомиелин и продукты его ферментативного гидролиза играют определяющую роль в сигнальной трансдукции, регулирующей ведущие клеточные процессы – иммунный ответ, пролиферацию, рост, дифференцировку и апоптоз клеток [4, 69, 169].

Многообразие функций сфингомииелина и его производных, прямо или косвенно связанных с важнейшими клеточными событиями в норме и при патологии, определяет необходимость изучения обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных опийной наркоманией.

В регуляции состояния мембран клеток принимают участие процессы перекисного окисления липидов, фосфолипазы, ферменты протеолитической системы. Изучение их активности может быть важным диагностическим критерием общего состояния организма, характеристикой адаптивных возможностей организма [38, 39, 121, 167].

Течение и выраженность абстинентного синдрома при наркомании в значительной степени определяет характер лечения и прогноз заболевания.

Существует несколько подходов к лечению абстинентного синдрома. Наряду экстракорпоральной детоксикации (УФО, плазмоферез) [124, 128, 151, 161].

Однако, анализ приведенных в литературе данных, позволяет сделать вывод о минимальной эффективности лечебных программ, используемых для зависимости, и абстинентного синдрома. Необходимость активного поиска новых подходов к лечению больных наркоманиями представляется в этой ситуации чрезвычайно актуальной задачей. Из гипотез, объясняющих патогенетически адекватной признается так называемая “катехоламиновая гипотеза“ [5]. Известно, что опийная абстиненция протекает на фоне адренергического возбуждения [82]. Избыток катехоламинов в крови может приводить к активации перекисного окисления липидов, активации лизофосфолипидов в липидном бислое мембран, лабилизации мембран последующим повреждением клетки. Блокада адренорецепторов, через которые реализуется эффект катехоламинов, может ограничить повреждение клеток, вызванное избытком катехоламинов [133]. Соответственно средствами патогенетической терапии могут являться препараты с адреноблокирующим действием. Исследование влияния адреноблокаторов на липидный спектр плазматических мембран лимфоцитов и механизмы, принимающие участие в его регуляции (перекисное окисление липидов, активность фосфолипаз и активизация процессов протеолиза), безусловно, будут способствовать пониманию патогенеза опийной наркомании, возможности прогнозирования исходов и определения тактики лечения данной патологии.

Цель работы:

Изучить механизмы структурных и функциональных нарушений наркоманией в состоянии абстинентного синдрома при использовании стандартной и комплексной схем лечения абстинентного синдрома.

Задачи исследования:

1. Установить особенности содержания липидов: фосфолипидов, нейтральных липидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с - адреноблокатором).

сфингомиелиназы, содержание сфингомиелина, церамидов в плазматических мембранах лимфоцитов крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с адреноблокатором).

3. Изучить состояние системы протеолиза в сыворотке и плазме крови (активность протеолитических ферментов и их ингибитров) у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии и на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с - адреноблокатором).

4. Исследовать активность фосфолипаз, процессы перекисного окисления липидов в плазматических мембранах лимфоцитов и сыворотке крови у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома до начала специфической терапии, на фоне стандартной и комплексной схем лечения (в комплексе с - адреноблокатором), а также установить их роль в механизмах нарушения липидного спектра плазматических мембранах лимфоцитов.

Научная новизна:

Впервые у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции и получавших традиционное лечение, изучен липидный спектр и обмен сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов и их взаимоотношение с основными механизмами фосфолипазного и перекисного повреждения липидов клетки. В результате выполненного исследования метаболических нарушениях в плазматических мембранах лимфоцитов, вызванных употреблением опия-сырца, обработанного уксусным ангидридом. Выявленные изменения характеризуются увеличением содержания холестерина, лизофосфолипидов, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина и уменьшением содержания фосфатидилэтаноламина, фосфатидилэтаноламина и отношения холестерина к фосфолипидам, увеличением активности сфингомиелиназы, уеличением содержания сфингомиелина и снижением количества церамидов. Показано, что у больных опийной наркоманией, находившихся в состоянии абстиненции, происходит выраженная активация фосфолипазного и перекисного механизмов повреждения липидов.

состояния протеиназно-ингибиторной системы крови. Выявленные изменения, характеризуются увеличением активности протеолитических ферментов и снижением активности их ингибиторов.

липидного спектра и обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов крови с помощью - адреноблокатора обзидана.

Был выявлен положительный эффект включения в стандартную терапию обзидана на липидный спектр и соотношение компонентов обмена сфинголипидов в плазматических мембранах лимфоцитов, а также механизмы участвующие в их регуляции.

Практическая значимость работы:

Полученные новые знания фундаментального характера, касающиеся изменений липидного состава, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и механизмов, участвующих в регуляции состояния мембран у больных опийной наркоманией раскрывают новые аспекты патогенеза опийной наркомании. Результаты исследования могут служить основой для разработки новых способов коррекции метаболических нарушений, возникающих при употреблении наркотических препаратов опийной группы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Развитие абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией сопровождается нарушением в липидном спектре и обмене сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов, в механизме нарушений которых особую роль играют увеличение активности фосфолипаз, процессов перекисного окисления липидов и активизация протеолитических процессов крови.

2. Липидный спектр и обмен сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов у больных опийной наркоманией нормализуется при использовании комплексной схемы лечения абстинентного синдрома путем снижения активности фосфолипаз, угнетения процессов перекисного окисления липидов и восстановлении баланса протеиназно-ингибиторной системы.

3. Положительных изменений со стороны липидного спектра, обмена сфинголипидов плазматических мембран лимфоцитов и механизмов, принимающих участие в их нарушении, не было выявлено у больных опийной наркоманией при использовании стандартной схемы лечения абстинентного синдрома.

Апробация работы:

Основные положения работы были представлены на заседании Томского Областного общества лаборантов (Томск, 2004), на научном семинаре кафедры биохимии и молекулярной биологии; на кафедре психиатрии, наркологии, психотерапии Сибирского государственного медицинского университета.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них три в центральной печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 178 страницах, иллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает литературных источника, из которых 212 отечественных и 39 иностранных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Патогенетические аспекты развития наркоманий 1.1.1. Синдром физической зависимости при опийной наркомании синдромом измененной реактивности организма к действию данного наркотика (защитные реакции, толерантность, форма потребления, форма опьянения); 2) синдромом психической зависимости (обсессивное влечение, психический комфорт в интоксикации); 3) синдромом физической зависимости (компульсивное влечение, потеря контроля над дозой, абстинентный синдром, физический комфорт в интоксикации) [209]. Эти три синдрома, составляющие большой наркоманический синдром [171], отличают наркомана от здорового человека. И. Н. Пятницкая [1994] выделяет также синдром последствий наркотизации, включающий энергетическое снижение, полисистемное функциональное истощение организма.

(компульсивное) влечение; 2) способность достигать состояния физического комфорта в интоксикации и 3) абстинентный синдром [209].

Физическое (компульсивное) влечение, один из широко известных наркотизации. Влечение достигает высокой интенсивности, вытесняя даже такие витальные влечения, как голод и жажду. Практически одновременно с интоксикации) больной убеждается, что его самочувствие улучшается только при интоксикации, а без наркотика он уже не чувствует себя довольным и здоровым. Приняв индивидуально необходимую дозу, наркоман испытывает и психический, и физический комфорт. Еще более наглядным показателем того, что вне наркотизации удовлетворительное функционирование у наркомана невозможно, является абстинентный синдром.

Абстинентный синдром формируется постепенно и возникает вслед за обрывом наркотизации спустя какой-то срок после последнего приема наркотика [171, 209].

Абстинентный синдром состоит из фаз, появляющихся последовательно и закономерно во времени. Абстинентный синдром представлен симптомами, которые можно разделить на две группы: симптомы психические и симптомы вегетативные, соматоневрологические. Абстинентный синдром является показателем сформировавшейся физической зависимости от наркотика. Это состояние характеризуется необходимостью в постоянном присутствии наркотика для относительно нормального функционирования организма, теперь уже на качественно ином уровне. Если наркотик не поступает, организм пытается самостоятельно, собственными ресурсами воспроизвести условия, соответствующие наркотической интоксикации.

Структуры и функции, на которые воздействует наркотик, приводятся в состояние, близкое к тому, которое бывает в наркотической интоксикации.

Однако отсутствие обычного условия, интоксикации, ведет к несовершенной компенсации. Отсюда патологическая симптоматика, отличающая абстиненцию от интоксикации, а также избыточная компенсация:

гипертензия, тревога, депрессия и т. п.

Таким образом, абстинентный синдром представляет неудачную, дефектную саморегуляцию, попытку организма собственными ресурсами восстановить гомеостаз, соответствующий уровню имеющейся физической зависимости [171, 209].

1.1.2. Биологические механизмы формирования наркоманий в организме человека Влияние наркотиков на организм человека, его жизнедеятельность и функции проявляется в трех различных аспектах.

Во – первых, наркотики специфически влияют на определенные системы и структуры мозга, вызывая развитие синдрома зависимости. Именно этот синдром является ведущим, стержневым в клинической картине наркологических заболеваний. Во – вторых, они оказывают токсическое воздействие практически на все внутренние органы и системы организма.

Токсическое поражение различных органов не связано напрямую с проявлениями синдрома зависимости. Однако смертность больных наркоманиями (в том числе ранняя) чаще всего обусловлена именно последствиями и осложнениями токсических эффектов наркотических препаратов. Наконец, в – третьих, несомненно, влияние наркологической патологии родителей на потомство. Доказано, что у детей больных наркоманиями существенно повышен риск развития этих заболеваний [82].

Нейрофизиологические механизмы развития зависимости от наркотиков базируются в стволовых и лимбических структурах мозга, тех его областях, где располагается так называемая система подкрепления. Эта система мотивационной сферы, психофизического тонуса, поведения человека в целом, его адаптации к окружающей среде. Результаты многочисленных исследований убедительно доказывают, что именно влияние наркотиков на нейрохимические процессы в мозге являются основой развития синдрома зависимости. При этом массивное воздействие наркотических препаратов приводит к дисфункции почти всех нейрохимических систем мозга.

Изучение механизмов действия наркотических препаратов показало, что каждый из них имеет свой фармакологический спектр действия. Но у всех веществ, способных вызвать синдром зависимости, есть общее звено катехоламиновую нейромедиацию в лимбических структурах мозга, в частности в системах подкрепления [5, 82].

нейромедиаторов из группы катехоламинов из депо, а следовательно, к значительно более сильному возбуждению системы подкрепления.

Свободные катехоламины подвергаются действию ферментов метаболизма и быстро разрушаются. Повторные приемы наркотиков приводят к истощению запасов нейромедиаторов, что проявляется недостаточно выраженным возбуждением системы подкрепления при поступлении “нормального” импульса. Психофизически у человека это выражается в снижении настроения, ощущении вялости, слабости, скуки, эмоционального дополнительное высвобождение нейромедиаторов из депо, что временно компенсирует их дефицит в синаптической щели и нормализует деятельность лимбических структур мозга. Этот процесс сопровождается субъективным ощущением улучшения состояния. Однако свободные катехоламины вновь быстро разрушаются, что приводит к дальнейшему уменьшению их содержания, ухудшению психоэмоционального состояния и, соответственно, к стремлению вновь использовать наркотик. Данный порочный круг лежит в основе формирования психической зависимости от наркотических препаратов [82]. При длительном употреблении наркотиков может развиться дефицит нейромедиаторов, уже угрожающий жизнедеятельности организма.

В качестве механизма компенсации этого явления выступают усиленный синтез катехоламинов и подавление активности ферментов их метаболизма, в первую очередь моноаминоксидазы и дофамин – – гидроксилазы [5, 215], контролирующих превращение дофамина в норадреналин.

Таким образом, стимулируемый очередным приемом наркотиков выброс катехоламинов и их ускоренное, избыточное разрушение сочетаются с компенсаторно-усиленным синтезом этих нейромедиаторов. Формируется ускоренный кругооборот катехоламинов. При прекращении приема наркотика, т. е. при абстиненции, усиленного высвобождения катехоламинов из депо не происходит, но сохраняется их ускоренный синтез (рис. 1).

Вследствие изменения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях накапливается дофамин. Именно этот процесс обуславливает развитие основных клинических признаков абстинентного синдрома – высокой тревожности, напряженности, возбуждения, подъема артериального давления, ускорения пульса, нарушения сна и пр. Описанные выше изменения нейрохимических функций мозга формируют физическую зависимость от наркотических препаратов. Уровень дофамина в крови четко коррелирует с клинической тяжестью абстинентного синдрома. В течение ремиссии у больных зафиксированы биохимические корреляты так называемой “сухой абстиненции”, когда на фоне длительной ремиссии временно возвращаются симптомы абстинентного синдрома – бессонница, тревога, раздражительность и пр. В этих случаях отмечается спонтанное повышение уровня дофамина в крови, что соответствует нейрохимическим механизмам абстинентного синдрома [82]. Нужно учитывать тесную функциональную связь всех нейрохимических систем мозга. Изменение деятельности одной из них неизбежно ведет к расстройству других. Именно поэтому для разработки новых эффективных средств лечения наркологических заболеваний следует выделить первоначальное, ведущее звено патологии. Идентичность стержневых механизмов развития зависимости и ее клинических проявлений в динамике различных наркологических заболеваний указывает на принципиальное единство биологических механизмов всех форм химической зависимости. Общее звено в механизме фармакологического действия психоактивных веществ – влияние на катехоламиновую, в частности дофаминовую, нейромедиацию в системе подкрепления мозга. Именно оно обуславливает способность вызывать синдром зависимости [5, 82].

подкрепления мозга Однократный прием Многократный прием Наркотическая зависимость Рис. 1. Схема этапов формирования зависимости от психоактивных веществ.

Примечание: КА – катехоламины [82].

1.1.3. Абстинентный синдром при опийной наркомании В последние годы наблюдается тенденция к употреблению больными Использование этих средств, оказывающих, помимо наркотического, также и токсическое действие, отражается на особенностях формирования и течения опийной наркомании [47, 153]. Становление заболевания происходит в более короткие сроки, чем при морфинной наркомании, течение носит более прогредиентный характер, более выражены соматоневрологические последствия. Наблюдается также своеобразный патоморфоз опийного абстинентного синдрома. По сравнению с классическим описанием опийной абстиненции [170] абстинентный синдром, возникающий при употреблении самодельных препаратов опийной группы, имеет целый ряд характерных особенностей. Проявления абстиненции нарастают лавинообразно и достигают пика интенсивности уже к концу вторых суток после последней инъекции наркотика. Диспепсические расстройства и болевой синдром возникают практически одновременно с ознобом, насморком, потливостью.

Обращает на себя внимание значительно большая выраженность в структуре абстиненции психопатологических расстройств. Спектр проявлений психопатологических расстройств во многом зависит от наличия и выраженности преморбидных аномальных свойств личности, дозы вводимого наркотика и длительность его потребления [47]. Соматическое состояние больных в период абстиненции также отличается рядом особенностей: выражена тахикардия при нормальном или пониженном лавинообразном нарастании и большей выраженности проявлений общая продолжительность острого периода абстинентного синдрома несколько меньше (в среднем около 10 дней), чем описана в литературе [170, 187].

У больных применяющих самодельные наркотические препараты, отмечаются более выраженные изменения вен: быстрее возникают рубцовые изменения, склерозирование и запустевание. Перечисленные особенности клинической картины опийного абстинентного синдрома, развивающиеся при использовании кустарно приготовленных растворов мака, выраженные наркогенность и токсичность последних диктуют необходимость поиска новых подходов к лечению этой формы наркомании.

Комплексный и дифференцированный подход к терапии опийного абстинентного синдрома с учетом изменения его клинических проявлений в связи с употреблением больными самодельных наркотических препаратов позволяет сократить длительность абстинентного синдрома и уменьшить выраженность симптомов острого периода [47].

1.1.4. Нарушение метаболических процессов при наркомании Существует мнение, что, употребление наркотиков опийной группы сопряжено с минимальным риском развития патологии внутренних органов.

В настоящее время использование “чистых” наркотиков встречается редко.

Чаще всего они представляют “гремучую смесь” из наркотического средства, балластных, психотропных и часто просто токсических веществ. В процессе приготовления наркотика дополнительно привносятся вещества (органические растворители, ангидриды, окислители), обладающие собственным токсическим действием [163]. Применение такой смеси ведет к общему отравлению, в первую очередь, нарушает деятельность центральной нервной системы [126, 127, 146, 157, 180, 181].

Специфических морфологических изменений, характерных для отравления наркотиками, нет, также как нет и четкой нозологической формы последствий хронической наркотической интоксикации [48, 127]. Однако в последние годы описан целый ряд регистрируемых посмертно изменений внутренних органов и мозга при хронической интоксикации наркотически действующими веществами. При этом специфичность осложнений, определяется не столько видом этих осложнений, сколько их сочетаниями и частотой наблюдения. Например, различные поражения печени возникают почти у всех больных наркоманией, употребляющих кустарные опийные препараты [127]. Распространенным является сочетание дистрофических изменений в печени, почках и миокарде с явлениями продуктивного воспаления, напоминающие токсико-аллергические гранулемы. Острые бактериальные эндокардиты, плевриты в сочетании со спленомегалией также указывают на иммунотоксический эффект опийных алкалоидов [13, 72, 91]. Исследование смертности среди “внутривенных” наркоманов в Москве [6] свидетельствуют о том, что причиной смерти в половине случаев (50,9%) послужило соматическое заболевание, включая инфекционное. Комплекс тканевых и органных изменений, обнаруживаемых посмертно у наркоманов, употреблявших опийные алкалоиды, позволяет идентифицировать наиболее часто встречаемую следующую соматическую патологию (таблица 1) [127].

Клинико-морфологические признаки поражения внутренних органов при систематической опийной интоксикации Всего заболеваний, относящихся к патологии печени 56, Коронарокардиосклероз, периваскулярный кардиосклероз 26, Всего заболеваний, относящихся к патологии ССС 50, Бронхопневмония, крупозная и очаговая пневмония 28, Всего заболеваний, относящихся к патологии органов дыхания 36, Зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев 57, Всего заболеваний, относящихся к патологии почек 65, Основной причиной сопутствующих воспалительных процессов при опийной наркомании считается подавление системы иммунной защиты организма [91].

Таким образом, можно заключить, что хроническая опийная интоксикация с большим постоянством сопровождается полиорганной патологией различной степени выраженности: от клинически очевидных случаев до изменений, диагностируемых только на морфологическом уровне [127].

1.1.5. Терапия наркоманий опийной группы Лечение зависимости, обусловленной приемом препаратов группы опия, имеет более чем столетнюю историю. Недостаточная эффективность непрерывно разрабатываемых методов лечения опийных наркоманий заставляла исследователей вести поиск все новых терапевтических подходов.

Известные в настоящее время методы лечения опийных наркоманий группируются как заместительные, патогенетические, симптоматические, психотерапевтические, блокирующие [161].

патогенетической ориентации, во многом симптоматично. Несмотря на большое разнообразие предлагаемых терапевтических подходов, последние по различным причинам все еще не удовлетворяют запросам практической наркологии. Едиными являются общие направления использования фармакологических средств в терапии наркоманий: лечение острой интоксикации и передозировки наркотических веществ; купирование синдрома отмены, вызванного прекращением приема наркотика; терапия соматических последствий интоксикации; лекарственное воздействие на мотивационно-эмоциональные сдвиги, лежащие в основе стремления к повторному приему наркотиков и рецидиву заболевания [128].

На стадии психической зависимости от наркотика доминируют общеукрепляющая и фитотерапия отварами трав с успокаивающим действием (валерианы, мяты, пустырника); витаминотерапия (группы “В”);

средства, регулирующие метаболические процессы – гипогликемические дозы инсулина [2], большие дозы аминокислот (глутаминовая, глицин).

Обсессивное влечение купируется внутримышечным введением сернокислой магнезии, тераленом, неулептилом [19]. Купирование синдрома отмены представляет собой форму паллиативной помощи и предшествует более специфическим методам лечения наркотической зависимости. Большинство схем отмены наркотика, используемых за рубежом, предусматривают литическое снижение суточной дозы наркотика (на 20% от исходной дозы) с полной отменой за 7-10 дней. При этом наблюдаются легкие абстинентные расстройства. При неудачных попытках лечения отмену наркотика проводят с использованием метадона [95]. В отечественной наркологии применяются лекарственные средства, не являющиеся препаратами зависимости. Известно, что опийная абстиненция протекает на фоне адренергического возбуждения.

Соответственно средствами патогенетической терапии являются препараты с альфа- и бета-адреноблокирующим действием. Для лечения абстинентных расстройств у больных опийной наркоманией рекомендуется использовать пирроксан, обладающий альфа-адреноблокирующим действием [147]. В схемах детоксикации героиновой зависимости используется и бета-блокатор пропранолол [225]. Из неопиатных патогенетических схем наиболее распространена схема терапии опийного абстинентного синдрома с применением клонидина (клофелин). Теоретической основой метода является предпосылка о модулирующей роли эндогенной опиатной системы в отношении адренергических систем. Клонидин, являясь агонистом пресинаптических альфа-адренорецепторов, подавляет выход медиатора из адренергической терминали, имитируя некоторые эффекты опиатов.

Наиболее трудной задачей является разработка методов контроля эмоционально-мотивационных эффектов наркотической интоксикации. В рамках концепции “подкрепления” разрушение порочного круга “наркотизация – синдром отмены с патологическим влечением к наркотику – повторная наркотизация” возможна при устранении психотропного эффекта наркотика, подавлении системы положительного подкрепления наркотической мотивации. Эти принципы, в настоящее время реализуются с помощью следующих способов фармакологического контроля: блокирование эмоционально-позитивного эффекта наркотиков с помощью антагонистов;

применение веществ-агонистов, имитирующих эффект наркотика;

фармакологическая коррекция нейромедиаторных изменений, вызванных наркотической интоксикацией и предположительно связанных с патологическим влечением [76]. Примером первого типа контроля может служить терапия опийной наркомании антагонистами опиатных рецепторов (налтрексон). Следующее направление связано с применением имитаторов действия наркотиков (метадон). Разновидностью патогенетической терапии является и лечение нейролептиками (неулептил, дроперидол) благодоря их высоковариабельной способности воздействовать на дофаминергические рецепторы. В условиях, ограничивающих или полностью исключающих возможность применения “заместительной” и “блокирующей” терапии, нейромедиаторных изменений, вызванных наркотической интоксикацией и предположительно связанных с патологическим влечением к наркотику – это адекватное назначение психотропных средств.

патологии вызвано также изменением состояния серотониновой медиаторной системы с увеличением обратного захвата серотонина пресинаптическими окончаниями. Серотонинергической активностью объясняется контроль за импульсивными влечениями, тревогой, агрессивностью [152]. Центральная серотониновая недостаточность, описана как один из механизмов теоретические предпосылки послужили патогенетическим обоснованием применения препаратов, избирательно блокирующих реаптейк серотонина, в медикаментозной реабилитации больных, зависимых от наркотиков.

Теоретическое обоснование собственно “дезинтоксикационной терапии” проведении гемосорбции подтверждают интоксикационную природу некоторых феноменов, развивающихся при опийной абстиненции, хотя о высказываются противоречивые мнения. С одной стороны, помимо механизмов удаления токсинов, плазмаферез оказывает неспецифическое патологического гомеостаза и образования биологически активных веществ из разрушенных форменных элементов крови. С другой стороны, включение плазмафереза в терапевтический процесс у больных опийной наркоманией, наркотику, что обусловлено, вероятно, активацией симпатоадреналовой дорогостоящего и трудоемкого варианта терапии в состоянии, которое не является жизнеугрожающим [128, 130]. Традиционными средствами гипертонических, изотонических растворов в сочетании со средствами, рибоксином, малыми дозами инсулина, глюкозой [128].

В последние годы, несмотря на положительные тенденции разработки патогенетически обоснованных методов лечения опийных наркоманий, большинство из предложенных методов оказывают воздействие лишь на отдельные звенья наркотической зависимости: в одних случаях на вегетативные, в других – на алгические, в третьих – на психические расстройства [161]. В связи с этим для купирования абстинентного синдрома применяются сложные и громоздкие схемы лечения.

ориентируются на “Стандарты (модели протоколов) диагностики и лечения наркологических больных” [162]. Предлагаемые в них схемы лечения опийных наркоманий строго дифференцированы в зависимости от тяжести заболевания, предусматривают сочетанное назначение патогенетических и симптоматических средств на различных этапах лечебного процесса.

Практические наблюдения свидетельствуют, что ”стандартная” терапия не всегда оказывается эффективной, особенно если речь идет о состоянии отмены опиатов тяжелой степени. Использование “стандартной” терапии во многих случаях не позволяет быстро и эффективно купировать синдром патологического влечения к опиатам. Это приводит к прерыванию по инициативе больного курса лечения и возобновлению наркотизации.

Изложенное делает крайне актуальным обонование терапевтической зависимости. Они должны в короткие сроки купировать состояние отмены опиатов и эффективно влиять на проявления синдрома патологического влечения к наркотикам [161].

1.1.5.1. Психотропные свойства –адреноблокаторов Проблема поиска новых высокоактивных психотропных препаратов эффективных средств среди препаратов, применяющихся в смежных областях медицины [101].

психофармакологических средств для лечения зависимости от опиатов [161].

В то же время, очевидно, что даже применение психофармакологических препаратов новых поколений не способно решить такие проблемы, как результативное купирование тяжелого состояния отмены опиатов, быстрое и полное устранение патологического влечения к наркотику. Внедрение в практику немедикаментозных методов лечения опийных наркоманий невозможно без современного дорогостоящего оборудования и специальной наркологических клиниках. Аналогичная ситуация складывается и в отношении получающих все большую популярность в России методов ”сверхбыстрой детоксикации”. Длительное применение дорогостоящих антагонистов опиатов (налтрексон) должно сочетаться с мероприятиями, направленными на подавление патологического влечения к наркотику, без чего назначение этих препаратов не дает ожидаемого результата [161].

интоксикации является поражение сердечно-сосудистой системы [127] то при лечении больных с наркотической зависимостью желательно использовать препараты, обладающие как нейротропной зависимостью (способны влиять на генерацию и проведение нервных импульсов, на освобождение и кардиопротективным действием и способные уменьшать возбудимость проводящей системы сердца. К таким препаратам можно отнести – адреноблокаторы ( – АБ). Уже вскоре после начала широкого применения – АБ для лечения сердечно-сосудистых заболеваний клиницисты установили, что вещества этой группы способны также влиять на психические процессы. Наиболее характерным свойством – АБ признается влияние веществ на эмоциональную сферу [7]. Следует отметить, что подобным действием обладают липофильные – АБ, способные проникать через гематоэнцефалический барьер. Согласно литературным данным – АБ снижают чувство тревоги и страха у здоровых испытуемых, при длительном приеме подавляют агрессивность больных страдающих шизофренией, потенцируют анксиолитическую активность бензодиазепиновых транквилизаторов. Ряд авторов отмечают у – АБ антипсихотический эффект. Они отчетливо снижают депрессивную симптоматику, потенцируют действие антидепрессантов. Психотропные эффекты – АБ связывают:

- с изменением функции церебральных – адренорецепторов - с влиянием на уровень цАМФ последующим их растормаживанием - с гиперчувствительностью различных рецепторных аппаратов (в том числе адренорецепторов) при аффективных расстройствах - с антисеротониновыми свойствами – АБ Существенным моментом служит адекватно подобранная доза того или противоположный [7].

1.2. Современные представления о липидах, как биоэффекторах природных веществ, различающихся между собой химической структурой. К ним относятся свободные жирные кислоты, нейтральные глицериды, воски, оксилипины, стерины и т.д. Длительное время липиды рассматривали как форму депонирования метаболического топлива. Позднее было установлено, что они являются основными структурными компонентами клеточных мембран [15, 20, 203, 206].

важнейшими биологическими эффекторами, регуляторами и медиаторами, участвующими практически во всех важнейших физиологических процессах сосудистого и мышечного тонуса, гемостаз, воспаление и т.д.), включая биохимические реакции, протекающие в клетках животных и человека. В качестве вторичных мессенджеров они передают внутрь клетки различные внешние сигналы, а также сами являются межклеточными медиаторами [41, 65, 66, 68, 224, 238, 246, 247].

К настоящему времени накоплено огромное количество данных о биоэффекторной функции липидов как в организме в целом, так и в клетке в частности [4, 26, 41, 65, 66, 70, 173, 223, 240, 243, 250]. Широко известна биоэффекторная роль фосфолипидов. Так, имеются многочисленные данные об участии в процессах сигнализации в качестве вторичных мессенджеров инозитфосфата, инозит-1,4,5-трисфосфата, фосфатидной кислоты - которые стимулируют некоторые формы протеинкиназы С, мобилизуют Са2+ из внутриклеточных депо и т.д. [9, 195, 243].

В последнее время появилось большое количество данных о регуляторной функции лизофосфатидилхолина. Эндогенные лизофосфатиды могут играть важную роль в формировании ответной реакции клеток на стимулирующие или угнетающие факторы и регулировать клеточный метаболизм. Известно, что ЛФЛ контролируют активность некоторых мембранно-связанных ферментов [53]. Было обнаружено, что при низких концентрациях лизофосфатидилхолин стимулирует активность протеинкиназы С, усиливает клеточную пролиферацию, стимулирует дифференцировку лимфоидных клеток и т.д. [53, 108, 165, 217].

церамиды) в качестве вторичных мессенджеров участвуют в процессах роста, дифференцировки и апоптоза клеток [4, 70, 132, 175, 200, 201, 211, 248].

Гликосфинголипиды участвуют в процессах роста, дифференцировки и межмембранной передаче сигналов [26, 164, 165, 228], являются антигенами и активными иммуномодуляторами [129, 222, 226, 227].

Клетка может одновременно подвергаться воздействию нескольких липидных эффекторов. Липидные регуляторы и мессенджеры могут оказывать противоположное влияние на процессы в клетке (церамиды ингибирует). В то же время различные липидные биорегуляторы могут мобилизация Са++ наблюдается при действии инозит-1,4,5-трисфосфата, лизофосфатидилхолина, 2-арахидоноилглицерина; стимуляция апоптоза сфингенином или церамидами и т.д.) [190].

Таким образом, липиды являются важными биоэффекторами, без которых не может протекать жизнедеятельность клетки и организма в целом.

В настоящее время можно утверждать, что липидам присущи три основные функции: во-первых, липиды - это важнейшие структурные компоненты клеточных мембран; во-вторых, липиды - это биоэффекторы, регулирующие внутриклеточные биохимические реакции и межклеточные взаимодействия, а также различные физиологические процессы, происходящие в организме.

И, наконец, третья функция, которая в течение долгого периода времени считалась единственной, - это форма запаса метаболического топлива.

1.3. Роль обмена сфинголипидов в развитии и течении различных заболеваний Среди многочисленных процессов, происходящих с липидами, особый интерес представляет сфингомиелиновый цикл, так как его компоненты принимают активное участие в регуляции жизненной программы клетки, оказывая влияние на процессы пролиферации, дифференцировки, апоптоза [69]. Основными компонентами сфингомиелинового цикла являются промежуточные метаболиты сфингомиелина и ферменты, контролирующие соответствующие превращения. К промежуточным метаболитам относятся:

сфингенин, сфинганин, сфингенин–1–фосфат, церамиды.

Установлено, что сфинголипиды влияют на структурные свойства биологических мембран и липопротеинов [190, 193]; являются мембранными «якорями» некоторых белков [249]; участвуют в процессах клеточного узнавания, рецепции гормонов, токсинов, факторов роста, лейкинов, в регуляции и дифференцировке клеток, являются иммуномодуляторами и вторичными мессенджерами [4, 70, 86].

Сфинголипиды в основном локализуются в плазматических мембранах и в мембранах органел, функционально связанных с плазматическими мембранами (аппарат Гольджи, эндосомы и лизосомы). Понятие «сфинголипиды» объединяет сотни соединений липидной природы, различающихся между собой химическим строением и биологическими функциями, но объединенных общей основой – сфингоидным основанием.

Церамиды состоят из двух фрагментов: сфингоидного основания (главным образом сфингозина, т.е. сфингенина) и жирнокислотного остатка, соединенных амидной связью [118].

В последнее десятилетие было установлено, что свободный сфингоид – сфингенин - ингибирует протеинкиназу С in vitro и влияет на клеточный ответ при активации протеинкиназы С в тромбоцитах, нейтрофилах и миелоидных лейкемических клетках HL-60 [86, 87].

Церамиды являются вторичными мессенджерами и участвуют в процессах регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток [67, 69]. Установлено, что биологический эффект зависит от структуры сфингоидного основания и жирных кислот, входящих в молекулу церамида [65, 176].

Церамиды являются промежуточными соединениями в биосинтезе и метаболизме сфингомиелина – структурного липидного компонента клеточных мембран.

Известно, что сфингомиелин образуется, в основном, путем переноса фосфохолиновой группы с фосфатидилхолина на церамид с помощью церамидфосфохолинтрансферазы [10]. При этом отмечается корреляция образования сфингомиелинов из церамидов в зависимости от структуры жирных кислот и сфингоидных оснований, входящих в молекулу церамида.

Однако существует и альтернативный путь биосинтеза сфингомиелина – через ацилирование сфингозилфосфохолина ацил-СоА. По второму пути биосинтеза в молекулу сфингомиелина могут включаться кислоты, отсутствующие в пуле церамида.

К настоящему времени установлено, что при патологических состояниях организма, в частности при злокачественном росте, изменяется состав и метаболизм сфинголипидов, что приводит к нарушению структуры и функций клеток. Установлено, что при клеточной малигнизации, как правило, относительное содержание сфингомиелина увеличивается, при этом наблюдается не только изменение в количестве сфингомиелина, но и его локализация. В клетках злокачественных опухолей происходит “выравнивание” содержания сфингомиелина в различных мембранах. Так как в молекуле сфингомиелина присутствуют в основном остатки насыщенных жирных кислот, то увеличение его содержания способствует повышению микровязкости липидного бислоя мембраны, его ригидности. Между тем, известно, что жидкостность липидной фазы биологических мембран является существенным фактором регуляции внутриклеточных процессов.

Повышение микровязкости липидного бислоя мембраны может привести к снижению активности мембрансвязанных ферментов (5’-нуклеотидазы, Na,K-АТФазы). Поскольку многочисленные данные свидетельствуют о том, что в опухолях активность многих ферментов значительно снижена, не исключено, что одной из причин этих нарушений является повышение ригидности липидного бислоя мембран вследствие увеличения содержания СФМ [67].

Известно, что снижение активности такого фермента как 5’нуклеотидазы приводит к нарушению функций транспорта аденозина в клетки, дефицит которого является причиной функциональной недостаточности лимфоцитов. С другой стороны известно, что содержание церамидов в малигнизированных клетках резко снижено. В целом, исходя из того, что церамиды обладают антипролиферативной активностью и стимулируют апоптоз, было высказано предположение, что церамиды являются супрессорами роста опухолей [67].

Таким образом, нарушения в обмене сфинголипидов способствуют изменению жидкосности мембраны, ферментативной активности мембраносвязанных ферментов, антигенного статуса клетки, межклеточных взаимодействий, адгезивных свойств и передачи сигналов между мембранами. Возникновение таких нарушений в мембранах лимфоцитов может способствовать появлению лимфоцитов с измененным поверхностным фенотипом, что приводит к нарушению иммунологического гомеостаза, выражающегося в нарушении клеточного звена иммунитета. Это может являться одним из основных факторов, обуславливающих нарушение функциональной активности лимфоцитов.

1.4. Структура и функции мембран лимфоцитов В последнее время изучение структуры и функции биологических мембран является одним из наиболее важных и быстро развивающихся направлений в биологии. Показано, что липиды не просто образуют матрицу для функционирования мембранных белков, но сами являются активными участниками этих процессов. Изменение липидного состава мембран приводит к изменению способности лимфоидных клеток подвергаться активации под влиянием митогенов или других внешних факторов.

Липидный состав плазматических мембран лимфоцитов изучен достаточно подробно; он представлен в таблице 2. [202].

Липидный состав плазматических мембран лимфоцитов (%) Липиды выполняют роль матрикса для мембранных белков, создавая необходимые условия для их функционирования, в частности, необходимую жидкостность. При прочих равных условиях жидкостность мембраны можно изменить, изменив отношение ХС/ФЛ, которое в покоящихся лимфоцитах равно 1,01. Для того, чтобы клетка функционировала нормально, отношение ХС/ФЛ должно находиться в определенных, весьма узких пределах [44].

Основная функция ХС – создание определенной степени жесткости мембраны, необходимой для ее нормального функционирования. ЖК различной степени насыщенности входят в состав мембранных ФЛ, жирнокислотный состав которых изменяется в зависимости от содержания их в пище. Степень насыщенности ЖК и содержание ХС влияют на подвижность мембраны [103].

Включение ненасыщенных ЖК в клеточные мембраны приводит к увеличению цитолитической способности клеток, а насыщенных – к ее уменьшению. Кинетика этого влияния оказалась параллельной включению ЖК в состав сложных липидов мембран. В норме ФХ плазматических миристиновой, а гликосфинголипид – олеиновой кислотами. Изменение микровязкости мембраны, к последующим конформационным перестройкам рецепторных молекул и, как следствие, к уменьшению способности клетки к активации митогенами [98, 202]. Большое значение имеют липидные производные простагландины, лейкотриены, ФАТ, которые относятся к биологически активным веществам. Они образуются при расщеплении ФХ, ФЭА, ФИ и не только участвуют в межклеточных взаимодействиях, но и регулируют функциональное состояние клеток [80, 110, 177].

Известно, что активация иммунокомпетентных клеток сопровождается гидролизом мембранного фосфолипида фосфатидилинозид – 4, 5 – инозитолтрифосфат, который вызывает выброс кальция из внутриклеточных депо. Подобный механизм описан для Т – и В – лимфоцитов, клеток макрофагального ряда, полиморфноядерных лейкоцитов, естественных киллеров [84].

В тучных клетках, нейтрофилах, макрофагах процесс активации связан с изменением во фракции ФХ, содержание которого увеличивается во внешнем слое мембраны, вследствие чего уменьшается вязкость этого слоя и возрастает поступление кальция в клетки. ФХ образуется из ФЭА путем поэтапного метилирования. В свою очередь, образование ФЭА связано с фосфолипидного бислоя мембраны. Поступление кальция и процесс освобождением арахидоновой кислоты из ФХ [202]. Арахидоновая кислота супероксиданиона, синглетного кислорода. В результате окислительного метаболизма по липоксигеназному и циклооксигеназному путям образования свободных радикалов гидроксила образуются активные производные – лейкотриены и простагландины, обладающие иммуномодулирующими свойствами [114].

Таким образом, процесс активации иммунокомпетентных клеток- это вследствие уменьшения доли ненасыщенных жирных кислот, участвующих в процессе передачи активационного сигнала, а также, вследствие увеличения вязкости липидного бислоя, уменьшения подвижности белков в бислое и вероятности взаимодействия рецепторных субъедениц с регуляторными субъединицами. Устойчивость клеток-мишеней к действию цитолитических Т- лимфоцитов связана с содержанием в мембране ФЛ (ФХ и СФМ), изменяющих поверхностный заряд мембраны. Снижение поверхностного заряда в результате увеличения содержания ФХ и СФМ повышает чувствительность клеток – мишеней к лизису, так как облегчает их контакт с киллерами [20].

Таким образом, липиды осуществляют связь между рецепторными белками, ферментными и другими системами лимфоцита, участвуют в реализации активационного сигнала, который формируется при контакте лектина с рецепторами.

1.4.1. Структура и функции биологических мембран при различных видах патологии важнейшими являются биоэнергетические процессы. Липиды, входящие в состав мембран, несут на себе основную функциональную нагрузку при активации и кооперации клеток, регуляции иммунного ответа и т. д.

У детей, больных сахарным диабетом обнаружены структурные нарушения мембран эритроцитов. У больных с первым типом сахарного диабета происходит снижение содержания СФМ и ФЭА [89, 184] и повышение ФС, ФИ. Исследование липидных компонентов мембран эритроцитов больных вторым типом сахарного диабета показало, что наблюдается возрастание содержания ХС и снижение ФХ, ФЭА и СФМ, ФИ. Обращает на себя внимание тот факт, что с развитием диабетических микроангиопатий повышается количество ЭХ, участвующих в процессах детоксикации и выведения из метаболического русла избытка НЭЖК. Повышение уровня ЭХ существенно увеличивает проницаемость мембран эритроцитов для одновалентных ионов [71] и тем самым может снижать осмотическую стойкость эритроцитов. Независимо от типа сахарного диабета при наличии сосудистых поражений резко уменьшается уровень СФМ. Исходя из того, что СФМ участвует в процессах межклеточного взаимодействия и рецепции, можно предположить, что уменьшение количества СФМ отражает степень снижения чувствительности эритроцитов к инсулину [194].

Известно, что при значительном изменении липидного состава мембраны становятся ригидными. Повышение микровязкости мембран в условиях патологии чаще всего обусловлено отношениями ХС/ФЛ, ФЭА/ФХ.

Выяснено, что при втором типе диабета изменение микровязкости в основном осуществляется за счет возрастания содержания ХС, повышающего «жесткость» мембраны вследствие упорядочения и снижения свободного объема. При первом типе диабета повышение микровязкости в большей степени связано с уменьшением отношения ФЭА/ФХ [194].

Изменения липидного состава эритроцитов «пассивно» следует за изменениями липидного состава сыворотки крови у детей с сахарным диабетом. Напротив, изменения липидного состава мембран лимфоцитов при сахарном диабете носят «активный» характер и, видимо, вызваны смещением метаболических превращений липидов на новый патологический уровень.

При этом меняются показатели липидного состава, имеющие значение в осуществлении функциональной активности лимфоцитов: увеличивается коэффициент ХС/ФЛ, (ограничение подвижности), уменьшается процентное содержание ТГ, НЭЖК (энергетическое обеспечение, источник ПГ, ЛТ).

иммунокомпетентных клеток, описанную рядом авторов при сахарном диабете, можно связать с «активным» дисбалансом в липидном обмене лимфоцитов. Выявленные изменения липидного состава мембран лимфоцитов являются одним из основных факторов, снижающих функциональную активность лимфоцитов, обусловливающих формирование иммунодефицита и как следствие присоединение инфекционных заболеваний [184].

Нарушения липидного обмена являются одним из основных факторов повышенного риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Так, у мужчин, перенесших инфаркт миокарда в возрасте от 18 до 40 лет, в эритроцитах крови было обнаружено увеличение содержания фракций ФХ, СФМ и уменьшение ФЭА [145]. Одним из ключевых моментов в патогенезе атеросклероза и его осложнений является увеличение содержания ХС в плазматических мембранах форменных элементов крови, приводящее к изменению физического состояния липидной фазы [116, 207]. Накопление в липидном бислое ХС, ведет к нарушению внутриклеточного ионного гомеостаза в результате угнетения активности ферментов транспорта ионов.

Увеличение содержания ХС в мембранах форменных элементов крови фосфолипидного слоя плазматической мембраны в цитоплазму, как известно, пролиферацией. Накопление ХС и связанный с этим рост вязкости липидной митогенстимулируемого перераспределения кальция. Все это ведет к угнетению функций этих клеток [43, 61, 107].

Повышение микровязкости мембран клеток может быть связано как с накоплением ХС, так и со сдвигом качественного состава ФЛ в сторону СФМ, а так же с замещением в структуре ФЛ полиненасыщенных ЖК насыщенными, которые обладают меньшей, чем первые, подвижностью, следовательно, способностью увеличивать «жесткость» мембраны [118].

У больных алкоголизмом выявлены существенные нарушения ФЛ состава биомембран, в частности повышенное образование различных форм ЛФЛ, возникающее на фоне уменьшения содержания ФХ и ФЭА и отсутствие изменений сумарного содержания ФЛ [54, 93].

иммунокомпетентных клетках, а именно, нарушений в липидном составе мембран лимфоцитов, является перспективным направлением в изучении патогенеза наркотической зависимости.

биологических мембран, является процесс перекисного окисления липидов.

1.5. Система перекисного окисления липидов 1.5.1. Перекисное окисление липидов. Характеристика процесса Одним из основных факторов, регулирующих липидный обмен, является перекисное окисление. Первые представления Б.Н. Тарусова и Н. М.

Эмануэля о возможности возникновения и развития реакций свободнорадикального перекисного окисления в липидной фазе биологических мембран [38] позволили заключить, что эти процессы не только играют важную роль в нормальной физиологии клетки, но и выступают как ключевые звенья патогенеза распространенных болезней: авитаминозы Е, К, ишемические и реоксигенационные повреждения, диабет, злокачественный рост, стрессовые расстройства, токсическое действие гипербарической оксигенации и озона и ряда других [11, 12, 56, 115]. Вывод об участии процессов ПОЛ в возникновении и развитии патологических состояний был сделан, на основе способности ингибиторов свободнорадикального окисления различной природы предупреждать или ограничивать повреждения, характерные для разных патологий [75].

Радикальные реакции ПОЛ протекают во всех клетках живых организмов, четко отражают функциональное состояние субклеточных и клеточных мембранных структур, имеющих существенное значение для жизнеобеспечения целостного организма. Развитию того или иного патологического процесса предшествует повреждение именно мембран клетки, однако и другие структуры, в том числе хроматин ядра, подвергаются влиянию активных продуктов ПОЛ из мембран [11, 12].

ПОЛ представляет собой многоэтапный процесс окислительной деградации их полиненасыщенных жирнокислотных остатков. В ходе процесса ацильные цепи подвергаются гомолитическим разрывам по С-С и С-Н связям с образованием высокоактивных радикальных интермедиатов, промежуточных молекулярных продуктов, низкомолекулярных конечных соединений и продуктов полимеризации с неопределенной химической биологических мембран и их свойств [92, 99].

Процесс ПОЛ делят на три фазы: зарождение цепей, развитие цепных реакций и обрыв цепей. Лимитирующей стадией процесса в целом является стадия его инициации [38]. В тканях организма представлены различные механизмы активации ПОЛ. Индукция может происходить при спонтанном самоокислении ряда химических соединений (например, метгемоглобина, флавинов, катехоламинов, тиолов) [60]. Инициаторами цепного окисления липидов могут быть энзиматические системы. Так, генерация активных форм кислорода (АФК), обладающих высокой реакционной способностью, связана с окислительно-восстановительными ферментативными реакциями, катализируемыми флавиновыми дегидрогеназами, глутатионредуктазой, дигидратат дегидрогеназой, а также металлофлавопротеидами, ксантиноксидазой в процессе окисления пуринов в фагоцитирующих клетках, при функционировании миелопероксидазы нейтрофилов, электронов и других биохимических реакциях [55, 136].

В тканях имеются специфические ферментные системы: цикло- и липоксигеназы, осуществляющие ферментативное перекисное окисление ПНЖК [113]. Известно большое количество процессов, протекание которых невозможно без участия свободных радикалов или инициируемых ими продуктов окисления. Они имеют важное значение для обновления липидов, необходимы для поддержания стабильности структурного клеточного гомеостаза и состава внутренней среды организма, для уничтожения собственных отживающих клеток, выведения ксенобиотиков, осуществления процесса фагоцитоза, предупреждения злокачественной трансформации дифференцировку клеток, синтез простагландинов, лейкотриенов, тромбоксанов, транспорт ионов, активность терминальной дыхательной цепи в митохондриях; с другой стороны, АФК оказывают повреждающее действие [97].

1.5.2. Регуляция процессов перекисного окисления липидов in vivo Регуляция реакций ПОЛ в мембранных структурах достигается за счет согласованной системы ферментативного и неферментативного контроля за содержанием АФК, свободных радикалов, молекулярных продуктов ПОЛ, компартментализацией инициаторов и субстратов ПОЛ.

Регулирование процессов ПОЛ осуществляется трехступенчатой системой: ферментами антиоксидантной защиты, антиокислительной активностью липидов и за счет изменения способности липидов к окислению [17, 49]. Существуют как цитозольные (СОД, каталаза, и др.), так и мембранно-связанные системы (липидрастворимые антиоксиданты, структурный эффект) обеспечивающие определенный уровень перекисного окисления в клетке [26,185]. Различные ступени каскада антиоксидантных ферментов, согласно представлениям о механизме генерации АКМ и липидных перекисей, имеют выраженную специализацию, характеризуются высокой специфичностью действия, клеточной и органной локализацией [136, 137, 138]. Реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала осуществляет высокоспецифичный фермент - суперокиддисмутаза (СОД: КФ 1.15.1.11) - металлопротеид с субъединичной структурной организацией.

Существует несколько изоферментных форм СОД. Cu, Zn - СОД локализована приемущественно в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий клеток эукариотов; Mn- СОД содержится в митохондриях эукариотов, а также у бактерий; для микроорганизмов характерна Fe- СОД, обнаружена также экстрацеллюлярная высокомолекулярная форма СОД [62, 63]. Снижение активности СОД являются причиной патологических процессов, вследствие увеличения АФК и в результате усиления цитотоксического действия перекиси водорода, образующейся при Последовательность действия двух координированных систем СОД и каталазы высокоэффективно ингибирует образование гидроксильного радикала, наиболее реакционноспособного из АФК [137, 138].

Клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию перекиси водорода благодаря наличию глутатионпероксидазы и каталазы, первая из которых эффективно работает при малых концентрациях перекиси, вторая при высоких [135].

Каталаза (КФ: 1.11.16) - фермент локализован преимущественно в пероксисомах клеток, катализирует разложение перекиси водорода [75].

инициации, создается за счет ингибиторов свободнорадикальных реакций [38]. Специфических ингибиторов для гидроксильных и липидных радикалов нет ввиду высокой неспецифичности их реакций с разными органическими молекулами. Природными ингибиторами являются различные токоферолы, стероидные гормоны, аскорбиновая кислота, убихиноны, витамин К, пуриновые основания и другие [46]. Их АОА в целом складывается из образующегося из молекулы ингибитора [27]. Наиболее мощным и изученным природным антиоксидантом является токоферол [25].

Ключевой этап индукции ПОЛ - гомолитический распад гидроперекисей с образованием новых реакционноспособных радикалов предупреждается глутатионпероксидазной ферментативной системой, которая может использовать в качестве субстратов гидроперекиси фосфолипидов, оксипроизводные интермедиаты - окисления жирных кислот [233].

Другая возможность антиокислительной защиты на этапе индукции ПОЛ состоит в удалении из гидрофобной фазы ионов металлов при участии эндогенных хелаторов, основными из которых являютя мочевая кислота, некоторые пептиды, лактоферрин, церулоплазмин, трансферрин, гаптоглобин, альбумин, ферритин и другие. Эти белки находятся в плазме, и могут, как антиоксиданты неферментативной природы поддерживать стационарную концентрацию продуктов ПОЛ [97, 131, 194].

Важным неспецифическим фактором регуляции ПОЛ, действующим практически на все стадии процесса, является так называемый структурный эффект, под которым понимается комплекс свойств мембранного бислоя, ограничивающего доступность молекул кислорода и его активных форм, а также радикальных интермедиатов и катализаторов ПОЛ к полиеновым ацилам фосфолипидов [26, 27, 38].

Существует гипотеза, согласно которой процессы ПОЛ в клетке поддерживаются на стационарном уровне с помощью системы, организованной по принципу отрицательной обратной связи по замкнутому кругу и обрывающей цепи окисления [26, 112]. При этом изменение количества природных антиоксидантов в липидах, их антиокислительная активность, состав и окисляемость связаны таким образом, что возможно осуществление эффективной регуляции процессов ПОЛ. Воздействие, при котором изменяются параметры любого звена этой цепи, должны приводить в действие всю сложную систему регуляции, в результате чего скорость окисления липидов возвращается на исходный стационарный уровень.

Такого рода взаимосвязь между изменениями АОА и состава липидов может рассматриваться с одной стороны, как физико-химическая регуляция, обусловливающая протекание окислительных реакций в липидах на постоянном уровне, с другой, как одна из систем обновления состава липидов мембран [17].

Антиокислительные системы организма в своей совокупности обладают значительной буферной емкостью, сохраняющей активность ПОЛ на стационарном уровне. В условиях напряжения механизмов регуляции существенно повышается риск их срыва и развития патологического процесса. Окислительные и антиоксидантные звенья являются, таким образом, важными составляющими гомеостаза организма [11, 12, 58].

В условиях значительных изменений активности образования радикалов, либо недостаточной эффективности работы антиоксидантных механизмов, резервная мощность антиокислительных систем оказывается недостаточной для полной компенсации несбалансированного свободнорадикального окисления, что приводит к развитию окислительного стресса, которым обозначают состояние напряжения антиоксидантных систем, нарушение функционированием системы антиоксидантной защиты [133, 135].

Нарушение окислительных процессов при различных патологических состояниях является основным метаболическим синдромом, формирующим развитие многочисленных морфофункциональных изменений, которые могут проявляться на клеточном, тканевом, организменном уровне [135].

Возникновение окислительного стресса это важный патогенетический фактор развития воспалительных процессов, бронхо-легочных, сердечнососудистых и генетических заболеваний [136, 138].

Изменение реакций перекисного окисления при многих заболеваниях позволяет сделать вывод о том, что в их основе лежат мембранодеструктивные процессы. Поэтому изучение ПОЛ и совершенствование методов контроля окислительных процессов in vivo представляет не только теоретический, но и большой практический интерес.

1.5.3. Участие перекисного окисления липидов в патологических процессах Процесс ПОЛ протекает как в нормально функционирующей клетке, так и при патологических состояниях. Известно множество патологических состояний, для которых характерно нарушение равновесия процессов свободнорадикального окисления липидов. В последне время в патогенезе диабетических ангиопатий, наряду с нарушениями обмена липидов большое значение придают продуктам ПОЛ. Имеются сообщения о том, что продукты гиперкоагуляции, что ускоряет развитие сосудистых осложнений [125].

Большое значение придается интесификации процесссов ПОЛ и синдрому антиоксидантной недостаточности в нарушении функциональной целостности тканей респираторного тракта и повышении сосудисто-тканевой проницаемости при многих видах патологии дыхательных путей. На фоне снижени всех компонентов системы антиоксидантов отмечается рецидивирующем течении бронхолегочных заболеваний, у лиц с бронхоэктатической болезнью, при пневмосклерозе, туберкулезе, сахарном диабете [111, 122].

Избыточная интесификация ПОЛ является одним из ключевых механизмов развития структурно-функциональных нарушений в клеточных мембранах тканей центральной нервной системы. Изучение ПОЛ позволило сформулировать перекисную концепцию атерогенеза. Выявлена важная роль свободнорадикального окисления в развити многих видов патологии новорожденных и детей раннего возраста. Известно также, что канцерогенезу сопутствует накопление продуктов ПОЛ [38].

Принимая во внимание фундаментальное биологическое значение динамического равновесия систем ПОЛ – АОС для жизни клеток, нельзя не учитывать этого механизма при изучении патогенеза зависимости от наркотических средств.

1.5.4. Участие фосфолипаз в повреждении клетки В регуляции функционального состояния мембран особая роль неферментативные превращения мембранных фосфолипидов. Наиболее важными из них являются фосфолипазы, катализирующие гидролиз и трансэтерификацию мембранных липидов. Обнаружено участие фосфолипаз в ряде физиологических и патологических процессов. Литературные данные о взаимосвязи ПОЛ и ферментативного липолиза противоречивы. Так было показано, что фосфолипаза А2, оказывает стимулирующий эффект на скорость ПОЛ, тогда как другие авторы продемонстрировали ингибирование ПОЛ в результате гидролиза мембран фосфолипазой А2 [22, 27, 245].

Фосфолипазы – особый класс белков, специфическая функция которых состоит в расщеплении фосфолипидов клеточных мембран и липопротеидов [198]. Продукты фосфолипазной реакции обладают токсическим действием на организм человека и животных, поскольку большинство из них является гемолитическими ядами.

Фосфолипаза А2 (лецитиназа А2, фосфатид-2-ацилгидролаза; К.Ф.

гидролитическое отщепление жирной кислоты в -положении молекулы лизофосфолипид [25, 57].

Лизофосфолипиды обладают сильным гемолитическим действием. В плазме крови человека содержится 50-120 мг/л лизофосфолипидов, токсическое действие. В последнее время появилось множество данных о регуляторной функции лизофосфатидилхолина (лизолецитина), который ранее рассматривался только как эндогенный детергент. Было обнаружено, что при низких концентрациях (1-10 мкМ) лизофосфатидилхолин стимулирует активность протеинкиназы С, усиливает клеточную пролиферацию, стимулирует дифференцировку лимфоидных клеток и т.д. [26, 59, 244].

Фосфолипаза А2 - наиболее изученный фермент из группы фосфолипаз.

Он выделен в чистом виде из яда змей, пчел и из ткани поджелудочной железы животных. В мембранах митохондрий, выделенных из животных тканей, присутствуют фосфолипазы А2, которые устойчивы к нагреванию, не содержат SH- групп и являются кальций-зависимыми ферментами. По своим свойствам эти ферменты напоминают таковые из ядов змей и поджелудочной функционировании мембран, по всей вероятности выполняя транспортную функцию [22].

К настоящему времени установлено, что внутриклеточные фосфолипазы А2 участвуют в таких важных биохимических процессах, как образование высвобождение свободной арахидоновой кислоты - предшественника эйкозаноидов. ФАТ является первичным медиатором воспалительных и аллергических реакций [118, 160, 229]. Эйкозаноиды так же играют важную роль в развитии внутриклеточного ответа при воспалительных процессах [110, 237, 242]. Учитывая то обстоятельство, что объектом атаки фосфолипазы А2 являются мембраны, можно ожидать наличие корреляции между степенью повреждения мембранных структур и тяжестью течения многих заболеваний. Также известно, что фосфолипаза А2 повышает выход из клеток биологически активных веществ – ацетилхолина, адреналина, гистамина, что может иметь значение при патологии [198]. В то же время повышение активности фосфолипазы А2 приводит к удалению токсичных переокисленных жирнокислотных остатков фосфолипидов из тканей [99, 198].

Полагают, что вещества, ингибирующие фосфолипазу А2, могут обладать полезными фармакологическими свойствами. Среди ингибиторов фосфолипазы А2 обнаружены вещества, значительно различающиеся по своей химической структуре и физиологическому действию: катионные амфифилы, замещенные бутирофеноны, н-алканолы, производные стрептомицина и стрептримициламина, структурные аналоги фосфолипидов.

За исключением структурных аналогов фосфолипидов указанные выше вещества являются неконкурентными ингибиторами фосфолипазы А2, механизм действия которых заключается в изменении свойств липидного бислоя и, как следствие этого, ингибирование связывания фермента с поверхностью мембраны [22, 244].

Фосфолипаза D (лецитиназа D; фосфатидилхолинфосфатидилгидролаза; К.Ф. 3.1.4.4.) впервые обнаружена в растениях.

Фосфолипаза D гидролизует эфирную связь между фосфатной группой и гидрофильным спиртом в фосфоглицеридах и соответствующую связь в сфингомиелинах.

Фермент практически не обладает устойчивостью к высокой температуре и не выдерживает даже непродолжительного нагревания до В клетке фосфолипаза D действуя на ФЛ, приводит к высвобождению фосфатидной кислоты, которая, действуя на диацилглицерол, активирует сфингомиелиназу и происходит стимуляция сфингомиелинового цикла [10, 29].

Перекисный и фосфолипазный механизмы повреждения липидов тесно взаимосвязаны. Окисленные фосфолипиды легче подвергаются гидролизу фосфолипазами, а фосфолипазы, в свою очередь, нарушая целостность липидного бислоя мембран, делают липиды более доступными для свободнорадикального окисления. Тот и другой механизмы тесно взаимосвязаны с циклом сфингомиелина. ПОЛ действует на цепи жирных кислот, которые входят в состав сфингомиелина и церамида, а продукты действия фосфолипаз являются активаторами цикла сфингомиелина.

Таким образом, исследование активности фосфолипаз – ферментов, участвующих в обмене фосфолипидных компонентов клеточных мембран может иметь диагностическое значение и использоваться в качестве критерия эффективности проводимой терапии.

Кроме перекисного и фосфолипазного механизмов, в регуляции состояния мембран могут принимать участие и протеолитические ферменты.

1.6. Протеиназно – ингибиторная система в регуляции биологических процессов К числу фундаментальных достижений молекулярной биологии последних лет относится осознание протеолиза как особой формы биологической регуляции. Ограниченный протеолиз служит пусковым механизмом многих биологических процессов и обеспечивает быстрый физиологический ответ организма на меняющиеся условия или поступающий извне сигнал [121]. Понимание регуляторной роли протеолитических ферментов имеет первостепенное значение для расшифровки молекулярных механизмов таких биологических явлений, как деление и трансформация клеток, дифференцировка и морфогенез, нейробиологические процессы и т.

д. Этим определяется большой интерес к изучению протеолитических ферментов в медицине [121].

Протеолитические ферменты участвуют в регуляции биологических процессов на разных уровнях (рис. 2).

Они контролируют концентрацию белковых и пептидных биорегуляторов на молекулярном уровне, включены в реализацию многих клеточных функций (биогенез структур, фагоцитоз, деление и т. д.) и тем самым играют важную роль в физиологии клетки. Первостепенная роль принадлежит протеолитическим ферментам в осуществлении ряда физиологических процессов, реализуемых определенными системами белков или отдельными тканями. В таких процессах, как свертывание крови, активация системы комплемента и т. д., протеолиз служит не только для запуска, но и для реализации всего процесса. Образуя и инактивируя различные продукты – медиаторы, протеиназы участвуют в гормональной, нейро- и функционирования различных клеточных систем и интеграцию организма как целого [32, 121, 166].

Уровень регуляции Биологические функции протеиназы Пример Клеточный Рис. 2. Протеолитические ферменты в системе биологической регуляции [121].

1.6.1. Протеиназы плазмы крови Существует пять протеолитических систем плазмы крови:

свертывающая, противосвертывающая, кининовая и ангиотензин-рениновая, а также система комплемента. Все эти системы действуют по каскадному принципу с чередованием неактивных, активирующих и ингибирующих компонентов. Такой принцип организации позволяет в случае необходимости существенно ускорить физиологические процессы организма, а также тонко их регулировать на каждом этапе. Активация систем протеолиза противоположным характером действия, обеспечивая нормальное функционирование сложной системы гомеостаза. Протеолитические ферменты плазмы крови являются, как правило, сериновыми протеиназами.

К ним относится плазмин, тромбин, калликреин, ренин, которые регулируют ангиотензиновой систем [166].

Согласованное действие протеолитических систем обеспечивается общими активаторами. Общим активатором протеолитических систем крови может быть трипсин. Трипсин, представляет собой сериновую протеиназу.

Действие трипсина в организме более разностороннее. Кроме активации проферментов поджелудочной железы (химотрипсин, проэластаза, профосфорилаза) трипсин превращает проинсулин в инсулин, проренин в ренин, предшественника адренокортикотропного гормона в активный гормон. Установлено, что трипсин участвует в образовании кининов, активирует плазминоген, увеличивает концентрацию фибриногена.

Известны эффекты трипсина на биологические мембраны: повышение проницаемости, изменение электропроводности и поверхностного заряда, трипсин активирует аденилатциклазу, высвобождение альдостерона, увеличивает транспорт глюкозы по типу инсулина. Имеются данныо о способности трипсина воздействовать на ферменты обмена нуклеиновых кислот и белка. Установлено, что трипсин способен индуцировать клеточную пролиферацию (синтез ДНК, фосфорилирование гистонов, метилирование ДНК). Принимает участие в ответе Т и В лимфоцитов на митогенный стимул.

В норме трипсин в плазме крови существует в неактивном состоянии из-за образования комплекса с ингибиторами. Увеличение активности трипсина в плазме, как правило, связано с повреждением поджелудочной железы и может быть патогенетическим фактором развития таких патологических состояний как язвенная болезнь, панкреатит, инфаркт миокарда, лучевая болезнь, нарушение микроциркуляции и развитие шоковых реакций.

Повышение активности трипсина может являться рекомендацией для назначения ингибиторов протеолиза в терапии подобных состояний [34, 196].

1.6.2. Ингибиторы протеолитических ферментов как протекторы клеточных повреждений Присутствие в тканях большого количества протеолитических ферментов, требует наличия ингибиторов протеиназ, которые контролируют действие ферментов, защищают ткань от аутолиза. За последние годы опубликовано значительное количество работ о влиянии эндогенных и экзогенных ингибиторов протеолитических ферментов на структуру, биохимизм и функцию клетки при различных неблагоприятных воздействиях на организм. Изменение метаболизма, структуры и функции клеток во многом предопределяется активацией внеклеточных и внутриклеточных процессов ограниченного протеолиза [167].

Каскадная, лавинообразная активация этих ферментов сдерживается и регулируется клеточной системой ингибиторов протеиназ, которые осуществляют специфическое блокирование активности протеолитических ферментов. Высокомолекулярные ингибиторы находятся в основном в плазме крови. К ним относятся: 1 – антитрипсин – поливалентный ингибитор, который тормозит биологическое и энзиматическое действие многих протеолитических ферментов; 1 – антихимотрипсин, который ингибирует преимущественно химотриптическую активность; 2 – макроглобулин – основной ингибитор калликреина. Кроме того, имеются ингибиторы с узким спектром действия: С1 – инактиватор, блокирующий активацию системы комплемента; антитромбин III, предупреждающий активацию тромбина в системе гемокоагуляции, и ряд других [83, 167].

Взаимодействие ингибиторов плазмы крови и протеолитических ферментов плазмы и тканей представлено на рисунке 3.

1 -антихимотрипсин Интер- 1 - антитрипсин Рис. 3. Взаимодействие ингибиторов плазмы крови с протеолитическими ферментами плазмы крови и тканей.

В соответствии с этой схемой в воспалительных реакциях при повреждениях участвуют цистеиновые протеиназы, нейтральные протеиназы лейкоцитов, действие которых контролирует 1 – антихимотрипсин, интер - 1 – ингибитор трипсина, 1 – протеиназный ингибитор.

Протеиназы каскада свертывающей, кининовой, фибринолитической систем взаимодействуют с антитромбином III, 2 антиплазмином, С1 – инактиватором, 1 – протеиназным ингибитором [83].

1.6.3 1 – Протеиназный ингибитор, 2 – макроглобулин и их роль в патологии Из 7 наиболее изученных в настоящее время ингибиторов протеолиза плазмы крови особый интерес представляет 1 – протеиназный ингибитор ( – ПИ), локализованный в 1 – глобулиновой фракции. 1 – ПИ обладает широким спектром действия. Кроме трипсина, он тормозит активность эластазы, коллагеназы, тромбина, плазмина, калликреина, акрозина, фактора X и XI свертывания крови, а также микробные сериновые протеиназы [24].

При патологических состояниях в плазме (сыворотке) крови наблюдается как понижение, так и повышение уровня 1 – ИП [33]. Пониженный уровень ингибитора, не связанный с генетическими нарушениями, выявляется у больных с неонатальной дыхательной недостаточностью, острой желтой атрофией печени, при заболеваниях почек связанных с повышенной протеинурией [90].

Увеличение концентрации 1 – ПИ при воспалении происходит вследствие усиленного поступления этого белка в кровь, из которой он достигает поврежденных тканей, где быстро взаимодействует с освобожденными из клеток протеолитическими ферментами. Полагают, что недостаток этого белкового ингибитора предрасполагает к повреждению соединительной ткани лизосомальными протеазами, высвобождающимися в процессе фагоцитоза. Особую роль при этом играет эластаза нейтрофилов.

Все это усугубляется действием некоторых ксенобиотиков, табачного дыма.

Протеолитические ферменты, кроме расщепления тканевых структур, могут также усиливать образование окисляющих веществ, вследствие чего 1 – ПИ значительно инактивируется, т. е. ингибиторное звено исключается из механизма контроля за действием образующихся протеиназ. По имеющимся данным, протеазы, продуцируемые микроорганизмами, разрушают 1 – ПИ.

Поэтому эти микроорганизмы, инактивируя ингибитор, дают возможность эндогенным сериновым протеиназам вызывать деструкцию тканей [24]. В последние годы проявляется большой интерес к изучению диагностической ценности определения 1 – ПИ крови при ненаследственной патологии [33, 141]. Уровень 1 – ПИ возрастает при остром и хроническом панкреатите [33]. Острый вирусный гепатит сопровождается увеличением концентрации 1 – ПИ в сыворотке крови, в то время как при хроническом течении заболевания выявляются низкие его значения. Антипротеолитическая активность сыворотки резко повышается после приема алкоголя, а также у больных хроническим алкоголизмом [35].

Значительную регуляторную роль выполняет 2 – макроглобулин (2 – МГ) [64]. Он синтезируется гепатоцитами, лимфоцитами, полиморфноядерными лейкоцитами, макрофагами, фибробластами [34, 79].

2 – МГ функционирует не только в кровеносном русле, но и в лимфе, плевральной, асцитной, синовиальной жидкостях. 2 – МГ является универсальным ингибитором, подавляет активность протеаз всех четырех классов – сериновых, тиоловых, кислых и металлопротеиназ. Образуя комплекс с протеиназами, 2 – МГ не ингибирует их полностью, а только снижает их активность: тормозит протеиназную и сохраняет при этом эстеразную [34].

2 – МГ играет важную роль в деятельности иммунной системы:

стимулирует развитие лимфоцитов и гранулоцитов, ингибирует образование кининов, ингибирует митогенный эффект ФГА, КонА, ингибирует высвобождение катионных протеаз при фагоцитозе и т. д. Модификация 2 – МГ иммунологических реакций, вероятно, связана с ингибированием протеиназозовисимых стадий иммунологических феноменов, а также может Известно, что 2 – МГ способен связывать фактор роста тромбоцитов и специфичностью к протеолитическим ферментам, 2 – МГ предотвращает избыточный протеолиз, принимает участие в защитных реакциях организма, является важным диагностическим показателем ряда патологических состояний организма. Активность 2 – МГ сыворотки крови возрастает при воспалительных процессах, при сахарном диабете, нарушении функции почек [64].

В связи с выше изложенным, определение активности ингибиторов возможности использования данных ингибиторов в диагностике ряда патологических состояний [35].

Таким образом, использование наркотических средств, полученных абстинентного синдрома. В основе развития патологических процессов при наркомании лежит дисбаланс клеточного гомеостаза, сопровождающийся повреждением клеточных мембран в результате непосредственного влияния, принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клеток. Известно, что липиды клеточных мембран являются не только формой депонирования метаболического топлива и основным структурным компонентом клеточных мембран, но служат молекулярной основой, определяющей их структурные и функциональные свойства и системой биологических эффекторов, регуляторов и медиаторов, участвующих практически во всех физиологических процессах клетки.

Наркотические вещества, являясь высоколипотропными соединениями, взаимодействуют с мембранами, поэтому несомненный интерес представляет исследование липидного спектра мембран, поддержание которых на физиологическом уровне является непременным условием нормального функционирования клетки; компонентов обмена сфинголипидов – играющих определяющую роль в сигнальной трансдукции, регулирующей ведущие клеточные процессы – иммунный ответ, дифференцировку и апоптоз клеток; основных механизмов повреждения мембран клетки – действие фосфолипаз, протеолитических ферментов, процессов перекисного окисления липидов. Именно поэтому в настоящей работе проведено сравнительное исследование этих процессов у больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома находившихся на разных видах лечения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Материал 2.1.1. Характеристика клинического материала В основу работы положены результаты обследования 100 человек, которые были разделены по четырем группам. Схема распределения больных по группам представлена на рис. 4. Первую группу составили 75 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома (шифр по МКБ – 10 F 11.30). В первой группе взятие крови осуществляли в первые сутки после поступления в стационар до начала лечения (Группа 1). Вторую группу составили 41 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на фоне стандартной схемы лечения (Группа 2). В третью группу были включены 34 больных опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на фоне комплексной терапии (стандартная схема лечения в комплексе с применением препарата группы - адреноблокаторов (обзидан) в дозе 20 мг/сутки) (Группа 3). Во второй и третьей группе взятие крови осуществляли на 4-5 сутки от последней инъекции наркотика.

Четвертую группу составили 25 практически здоровых доноров (Группа контроля).

Взятие крови осуществляли утром натощак из локтевой вены. Ни у одного из пациентов не был выставлен диагноз ВИЧ. Также в исследование не включались пациенты, инфицированные вирусом гепатита.

Пациенты поступили в стационар областного наркологического диспансера в связи с выраженными проявлениями синдрома отмены, которые развились в результате систематического внутривенного введения опиясырца обработанного уксусным ангидридом. Длительность потребления наркотиков составляла от 3 до 7 лет с суточной дозой от 2 до 4 граммов.

Пациенты за пределами клинических проявлений синдрома отмены исключались из исследования. Также не включались в исследование пациенты, которые употребляли наркотические препараты эпизодически.

Скрининг пациентов проходил с февраля 2002 по июль 2003года.

Количество пациентов включенных в исследование N= Контрольная группа N= Больные опийной наркоманией в состоянии абстинентного Больные опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на стандартной Больные опийной наркоманией в состоянии абстинентного синдрома на стандартной схеме лечения в комплексе с – адреноблокатором Рис. 4. Схема распределения больных по группам.

Возрастно-половая характеристика обследованных больных, а также здоровых доноров представлена в табл.3.

Возрастно-половая характеристика больных опийной наркоманией и здоровых доноров (муж/жен) Исследовали лимфоциты, сыворотку и плазму. Сыворотку получали путем центрифугирования крови при 1500 об/мин в течение 15 минут. Для получения плазмы кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут.

клиническая картина, сопровождавшаяся целым рядом биохимических расстройств. По данным историй болезни при поступлении нарушение биохимических и клинических показателей характеризовались:

гипербилирубинемией, снижением уровня гемоглобина, лейкоцитозом, протеинурией. С клинической точки зрения при поступлении в стационар у обследованных больных выявлялся болевой синдром, а также анорексия, рвота, диарея, обильная потливость, повышение артериального давления, расстройств периферической нервной деятельности, вегетативная дисфункция (тремор). В соматическом статусе явлений дистрофии выявлено не было. Так как в группе 1 забор крови осуществляли в первые сутки абстинентного синдрома до начала лечения, то это не исключает наличия в крови наркотического средства. Стандартная медикаментозная терапия опийной абстиненции проводилась в соответствии со стандартами лечения наркоманий и включала в себя использование клофелина, нейролептиков, седативных средств. Пациенты лечение проходили стационарно под контролем медицинского персонала. Все назначения вносились лечащим врачом. Препарат для комплексной схемы лечения обзидан разрешен для применения в медицинской практике.

2.2. Использованные в работе методы 2.2.1. Выделение лимфоцитов периферической крови [119] Метод основан на разделении клеток крови по плотности.

Кровь в количестве 9,0 мл забирали из локтевой вены в пластиковую пробирку, содержащую 1,0 мл 3,8% раствора цитрата натрия, и тщательно перемешивали.

На дно сухой пробирки наливали 1,5-2 мл градиента плотности “HISTOPAQUE” - 1077 (производства “SIGMA DIAGNOSTICS”) и аккуратно, наклонив пробирку под углом 450, наслаивали на градиент кровь.

Пробирки центрифугировали при 1500 об/ мин в течение 40 минут. После центрифугирования снимали кольцо лимфоцитов находящееся между плазмой и градиентом. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором.

2.2.2 Выделение плазматических мембран лимфоцитов разделением в двухфазной системе декстран-полиэтиленгликоль [199] Метод основан на разделении клеточных компартментов в двухфазной системе декстран (500 000)- полиэтиленгликоль 6000.

1. Приготовление двухфазной разделительной системы: 100 мл. 30% декстрана (500 000), 70 мл 24% полиэтиленгликоля 6000, 100 мл.

дистиллированной воды и 50 мл. 50 мМ фосфатного буфера, рН 7, сливали и тщательно перемешивали 6 кратным переворачиванием колбы.