«ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ДИСФУНКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ С РЕСПИРАТОРНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

АКУШЕРСТВА И ПЕДИАТРИИ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО

РАЗВИТИЯ

На правах рукописи

ДУДАРЕВА МАРИЯ ВАСИЛЬЕВНА

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ

ДИСФУНКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ С

РЕСПИРАТОРНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ

«03.03.03 – иммунология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

д.м.н., профессор Л.П.Сизякина г. Ростов-на-Дону

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ГЛАВА I. Современные представления об иммунопатогенезе респираторной патологии у новорожденных детей (обзор литературы)……………………………………………………………… Респираторная патология в структуре детской 1.1.

заболеваемости и смертности……………………………….…………… 1.2. Особенности иммунной системы новорожденных и ее постнатальная адаптация………………………………………………….. 1.3. Особенности становления моноцитарно-макрофагальной системы……………………………………………………………………... ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............. 2.1. Общая характеристика обследованных больных………..…… 2.2. Методы исследования.....……………………………………... 2.3 Математические методы анализа данных и статистическая обработка результатов……………………………………………………...

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Иммунологическая характеристика новорожденных детей с синдромом мекониальной аспирации…………………...............…….

ГЛАВА IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Иммунологическая характеристика доношенных новорожденных детей с респираторным дистресс-синдромом

ГЛАВА V. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И

ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Сравнительная иммунологическая характеристика доношенных новорожденных детей с синдромом мекониальной аспирации и респираторным дистресс-синдромом

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Кластеры дифференцировки CD Интерлейкин IL Фактор некроза опухоли TNFИнтерферон IFNТрансформирующий фактор роста TGFГранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий GM-CSF фактор Толл-рецепторы TLR МАС Мекониально-аспирационным синдром РДС Респираторный-дистресс синдром АРО Анестезиолого-реанимационное отделение Т- хелперы Натуральные киллеры ФПН Фетоплацентарная недостаточность ИВЛ Искусственная вентиляция легких БАЛ Бронхоальвеолярный лаваж СН Сепсис новорожденных Изотиоцианат флуоресцеина FITC ИФА Иммуноферментный анализ АМ Альвеолярный макрофаг ОАК Общий анализ крови СВРО Системная воспалительная реакция организма ИКК Иммунокомпетентные клетки

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Иммунная система является одной из трех интегративных систем организма, которая вместе с нервной и эндокринной системами обеспечивает поддержание гомеостаза в условиях постоянного изменения характера иммунологов были получены убедительные данные о роли иммунной респираторными нарушениями.

Синдром дыхательных расстройств является одной из основных причин заболеваемости и смертности как недоношенных, так и доношенных новорожденных не только в нашей стране, но и за рубежом (Дементьева Г.М. и соавт., 2001, 2002; Рюмина И.И., 2002; Байбарина Е.Н. и соавт., 2006;

Сидельникова В.М. и соавт., 2006; Володин Н.Н., 2006, 2007; William D.

Fraser et al., 2005; Carrie K. et al., 2008).

Наиболее частыми причинами развития критических состояний у доношенных новорожденных являются респираторный дистресс-синдром и перинатальном периоде в России являются причиной смерти в 16,9% случаев. На сегодняшний день нет никаких оснований полагать, что частота этой патологии будет уменьшаться. Это объясняется увеличением удельного веса патологически протекающих родов (Дементьева Г.М., Рюмина И.И., Кушнарева М.В., 2001; Серов В.Н. и соавт., 2002).

В течение нескольких десятилетий изучению данной патологии уделяется большое внимание (Гребенников В.А. и соавт., 1995; Шаламов В.Ю, 2000; Антонов А.Г., Володин Н.Н., Гребенников В.А. и соавт., 2002;

Перепелица С.А., Голубев А.М., Мороз В.В., 2007; Avery M.E. et al., 1991;

Carbine D.N., 2008).

состояниях у новорожденных с дыхательными расстройствами остается одной из самых актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту заболеваемости и стабильно высокой летальности и составляет 30-50%, занимая одно из ведущих мест в структуре детской смертности (Вермель А.Е., 2003; Володин И.И., Антонов А.Г., Байбарина Е.Н., 2003; Самсыгина Г.А., 2003; Антонов А.Г., Байбарина Е.Н., Соколовская Ю.В., 2005; Мархулия Х.М. и соавт., 2005; Баранов А.А., 2007;

Володин Н.Н. и соавт., 2007; Яцык Г.В., 2007; Голубев А.М. и соавт., 2008;

Khemani E. et al., 2007; Olaciregui I. et al., 2009; Ramirez K. et al., 2010).

В настоящее время ведутся интенсивные поиски универсальных клинико-лабораторных маркеров присоединения бактериальных инфекций у искусственной вентиляции легких (Эстрин В.В. и соавт., 2006, 2007;

Бирюкова Т.В. и соавт., 2007; Дегтярева М.В., 2008). Вместе с тем, иммунопатологические механизмы, определяющие исход и клиническое новорожденных, получающих респираторную поддержку, остаются мало изученными.

находившихся на ИВЛ, следует отметить, что большинство научных исследований относится к оценке адаптивного иммунитета, тогда как данные о функционировании врожденного иммунитета практически отсутствуют.

обеспечивающих врожденный иммунитет, является основополагающим формирования иммунной дисфункции.

У новорожденных с респираторной патологией реперфузионные процессы, связанные с респираторной поддержкой, приводят к апоптозу тканей и стимуляции клеток иммунной системы, выходу больших количеств провоспалительных цитокинов и медиаторов воспаления, которые в свою очередь являются мощными апоптогенными факторами и, одновременно факторами способными генерировать свободнорадикальные реакции, индуцирующие апоптоз (Белобородова Н.В., Бачинская Е.Н, 2000). Таким процессам в большей степени подвержены клетки иммунной системы, что приводит к глубокому иммунодефицитному состоянию новорожденного и высокому риску присоединения нозокомиальной инфекции, появлению иммунопатологические механизмы у новорожденных с респираторной патологией остаются практически не изученными. Детальное исследование инфекционных осложнений.

Кроме того, все еще недостаточно освещены вопросы динамики восстановления функциональной активности адаптивного и врожденного иммунитета у доношенных новорожденных с дыхательными расстройствами.

Согласно современным представлениям нарушения иммунной системы лежат в основе патогенеза респираторных нарушений. Однако конкретные патогенетические механизмы иммунных нарушений, способствующих дыхательных расстройствах у новорожденных детей, на сегодняшний день не исследованы.

Учитывая вышеизложенное, приоритетным направлением является изучение патогенеза респираторных нарушений с позиций определения роли взаимодействия между ними, разработка ранней диагностики нарушений новорожденных с респираторной патологией. Полученные данные позволят расширить существующие представления об иммунных процессах, которые имеют не только теоретическое, но и отчетливое прикладное значение.

Таким образом, необходимость изучения и решения вышеуказанных проблем, обеспечивают актуальность настоящей темы, приоритетность ее целей и задач.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

системы у новорожденных с респираторными нарушениями и разработать ранние критерии диагностики, прогноза течения и возникновения бактериальных осложнений при респираторных нарушениях.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать уровень экспрессии маркеров позитивной активации новорожденных детей с респираторными нарушениями, обусловленными мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.

2. Оценить влияние негативной активации клеток иммунной системы (экспрессия CD95+, AnnexinV+, AnnexinV+PI+) на клиническое течение заболевания и развитие бактериальных осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.

3. Изучить эффекторные функции иммунной системы, включая секрецию основных провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF-, а также включая секрецию IFN-, IFN-, TGF- и оксида азота в сыворотке респираторными нарушениями.

4. Выявить особенности продукции хемокина RANTES и GM-CSF у новорожденных детей с респираторными нарушениями.

5. Определить роль параметров врожденного иммунитета TLR- (CD282+), TLR-4 (CD284+) и CD14++, как возможных маркеров реализации бактериальных осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями.

6. Исследовать экспрессию молекул адгезии ICAM-1 (CD54+), CD11+, CD11c+, а также уровень экспрессии к Fc фрагментам IgG, и к С1 и С3 компонентам комплемента (CD64+, CD35+) у новорожденных детей с респираторными нарушениями.

7. Исследовать функции фагоцитов у новорожденных детей с респираторными нарушениями.

8. Провести анализ динамики показателей врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с респираторной патологией.

прогнозировать исход заболевания и бактериальные осложнения у новорожденных детей с респираторными нарушениями, обусловленными мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

- Впервые установлено, что у доношенных новорожденных с МАС и РДС развивается иммунологический дистресс-синдром, обусловленный усилением процессов апоптоза клеток иммунной системы, снижением одновременным угнетением цитотоксических реакций, вызванных естественными киллерами и цитотоксическими лимфоцитами.

- Впервые получены данные о значительном снижении уровня фактора хемотаксиса RANTES в сыворотке крови, что отражает особенности течения респираторных нарушений у новорожденных.

- Выявлена ведущая роль альтерации клеток иммунной системы в исходах критических состояний у доношенных новорожденных.

- Впервые получены новые данные о дефектах в системе Toll-подобных рецепторов у новорожденных с респираторными нарушениями. Показаны различия в экспрессии CD14++, TLR-2 (CD282+) и TLR-4 (CD284+) на моноцитах периферической крови здоровых новорожденных и новорожденных с респираторными нарушениями. Полученные данные позволяют оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета у здоровых новорожденных и у новорожденных с респираторными нарушениями.

- Установлено, что количество клеток CD95+ у новорожденных с респираторными нарушениями достоверно увеличено, что, возможно, указывает на пролонгированное течение патологического процесса с признаками апоптоза.

- Установлено, что развитие респираторной патологии ассоциируется с активацией периферических лимфоцитов и моноцитов новорожденных.

-Установлено, что при респираторной патологии нарушаются процессы распознавания и презентации антигена (АГ) периферическими моноцитами новорожденного.

- Установлено, что иммунные механизмы участвуют в патогенезе респираторных нарушений, проявляясь на системном уровне в виде дисбаланса реакций врожденного и адаптивного иммунитета.

- Впервые установлено, что иммунная депрессия врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с респираторными нарушениями сохраняется и в исходе заболевания, являясь основой для формирования иммуноопосредованной патологии.

- Впервые разработан способ раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторной патологией, на основании повышенной экспрессией AnnexinV+ на моноцитах (Патент на изобретение №2414706 от 20 марта 2011 г.).

неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим поражением ЦНС, на основании сниженной экспрессией HLA-DR на моноцитах периферической крови (Патент на изобретение №2374646 от 27 ноября 2009 г.).

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. Расширены представления о патогенетической роли изменений врожденного и адаптивного иммунитета при респираторных нарушениях у новорожденных, обусловленных нарушением процессов активации, дифференцировки, апоптоза и эффекторных функций иммунокомпетентных клеток и сопровождающихся нарушением экспрессии Toll-подобных рецепторов, как физиологических регуляторов врожденного и адаптивного иммунитета.

2. Практическая значимость работы заключается в разработке иммунологических критериев ранней диагностики присоединения вентилятор-ассоциированных инфекционно-воспалительных осложнений бактериальной природы у новорожденных с респираторной патологией, основанных на определении экспрессии AnnexinV+ на моноцитах (Патент на изобретение №2414706 от 20 марта 2011 г.) и экспрессии HLA-DR на моноцитах периферической крови (Патент на изобретение №2374646 от ноября 2009 г.).

3. На основании собственных исследований установлены наиболее информативные показатели содержания цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) при респираторной патологии. Предложено использовать уровень IL-1, IL-6, IL-8 в БАЛ в качестве маркеров активности воспалительного процесса в бронхолегочной системе при респираторных нарушениях у доношенных новорожденных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

респираторных расстройств и проявляются дисбалансом реакций врожденного и адаптивного иммунитета.

2. Наиболее выраженные изменения врожденного и адаптивного иммунитета регистрируются при респираторных нарушениях на 3-5–е сутки наблюдения.

3. Иммунная депрессия врожденного и адаптивного иммунитета при респираторных нарушениях сохраняется и на 20-е сутки, являясь основой для формирования иммуноопосредованной патологии.

4. Развитию бактериальных осложнений при респираторных нарушениях способствует нарушение презентации антигена и увеличение апоптоза лимфоцитов и моноцитов.

5. Ранняя диагностика иммунных дисфункций врожденного и адаптивного иммунитета позволит уменьшить количество бактериальных осложнений, а так же снизить раннюю неонатальную смертность.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ:

Количественное определение уровней факторов как местного, так и системного иммунитета, молекул межклеточной адгезии и хемокинов в сыворотке крови и в бронхоальвеолярном лаваже у новорожденных с респираторной патологией внедрено в практическую деятельность отделения реанимации ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития, используется в лекционных курсах на семинарах врачей ЮФО, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА:

Основные положения работы представлены:

на Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции «Внутриутробные инфекции плода и новорожденного», Саратов, 2000 г.;

- на 4-ом Конгрессе Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2001 г.;

- на международном конгрессе «Иммунитет и болезни - от теории к терапии», Москва, 2005 г.;

- на Всероссийском форуме «Мать и дитя», Москва, 2007, 2009, 2010г.г.;

- на национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология-междисциплинарные проблемы», Москва, 2008 г.;

- на I Всероссийском конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии», Москва, 2008 г.;

аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 2009 г.;

- на XVI съезде педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 2009 г.;

- на IV ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», Москва, 2009 г.;

- на XIV международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Израиль, 2009 г.;

- на XIV международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Дубай, 2009 г.;

- на V Российском конгрессе «Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия», Москва, 2009 г.;

- на VII съезде союза аллергологов и иммунологов СНГ и Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии, Санкт-Петербург, 2009 г;

- на Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – практическому здравоохранению», Москва, 2010 г.;

- на Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы», Санкт-Петербург, 2010 г.;

- на XV международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Дубай, 2010 г.;

- на IX Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2010 г.;

- на V ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», Москва, 2010 г.;

- на XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 2011 г.;

аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2011 г.;

- на I международном конгрессе по перинатальной медицине, Москва, 2011 г.;

- на XVI международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Париж, 2011 г.;

- на Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология – практическому здравоохранению», Москва, 2012 г.

По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, из них, в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций – 21 публикация, 46 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Лично автором выполнены все иммунологические исследования биологического материала, проведена обработка данных с занесением результатов обследования в компьютерную базу с последующим анализом с использованием пакета прикладных программ “STATISTICA-6”. Автором лично проведен анализ состояния вопроса по данным современной литературы. На основе анализа полученных результатов лично автором сделаны научные выводы и предложены практические рекомендации.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 311 страницах машинописного текста, содержит 107 таблиц, 29 рисунков, 2 схемы. Диссертация включает главы:

«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации», «Список литературы».

Библиографический указатель включает 305 работ, из них отечественных и 147 иностранных источников литературы.

ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ

ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ РЕСПИРАТОРНОЙ ПАТОЛОГИИ У

НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Респираторная патология в структуре детской заболеваемости и смертности Болезни легких занимают важное место в структуре заболеваемости и смертности новорожденных и во многом определяют показатели младенческой смертности (Дементьева Г.М., Рюмина И.И., 2001; Дементьева Г.М., 2002; Володин Н.Н., Антонов А.Г., Байбарина и соав., 2003; Шабалов Н.П., 2004; Фомичев М.В., 2007; Володин Н.Н., 2008; Павлинова Е.Б., Оксеньчук Т.В., Кривцова Л.А. и соавт., 2010).

Известно, что неонатальный период является одним из наиболее критических в жизни ребенка, когда происходит серьезная перестройка его функциональных систем, прежде всего дыхания и кровообращения, к внеутробной жизни. Нарушения в становлении этих жизненно важных систем реализуются в такую патологию, как респираторный дистресссиндром (РДС), как первично развивающийся вследствие дефицита сурфактанта, так и вторично возникающий на фоне патологии перинатального периода, синдром аспирации мекония, задержки элиминации фетальной легочной жидкости, интерстициальной эмфиземы. РДС новорожденных возникает у недоношенных детей в 77,3±5,4% случаев, при асфиксии этот показатель составляет 23,9±6,7%, на фоне родовой травмы 26,1± 5,4%, при сепсисе 19,3±5,4 % и при гемолитической болезни 17,7±11, % (Фомичев М.В., 2002). РДС является причиной смерти примерно у 25% всех умерших новорожденных, а у детей, родившихся на 26-28-й неделе гестации, эта цифра достигает 80% (Рюмина И.И., 2002). С периодом новорожденности связана и такая патология легких, как бронхолегочная дисплазия, формирующаяся преимущественно у недоношенных детей, находившихся на продленной искусственной вентиляции легких (ИВЛ), имеющая хроническое течение.

новорожденности связаны, прежде всего, с тем, что в этом периоде, как ни в каком другом, наблюдается тесная связь формирования патологии у ребенка с состоянием здоровья матери, течением у нее беременности и родов. Острые и хронические соматические и инфекционно-воспалительные заболевания, эндокринная патология у матери, осложненное течение беременности и родов создают угрозу рождения ребенка недоношенным, с признаками морфофункциональной незрелости, возникновения внутриутробной гипоксии и асфиксии в родах, внутриутробного инфицирования и инфекции (Дементьева Г.М., Рюмина И.И., 2001; Ветрова Е.В., 2007).

Важным результатом научных исследований в области неонатальной пульмонологии является раскрытие патогенетических механизмов, лежащих в основе мекониальной аспирации. Хотя по данным акушерских стационаров мекониальная аспирация составляет небольшую долю (1-2,5%), но среди новорожденных, поступивших в отделения реанимации по поводу острой дыхательной недостаточности, частота мекониальной аспирации составляет 23-48% (Романенко В.А., Ерофеев С.А., Аверин А.П. и соавт., 1998;

Абрамченко В.В., 2004). Летальность при тяжелых формах мекониальной аспирации составляет 50% (Fertsh D., 1995; Urbanic K.J., 1996; Thureen P.J. et al., 1997; Fraser William D. et al., 2005).

Как правило, это заболевание встречается у доношенных или переношенных детей. В большинстве случаев аспирацию мекония связывают с острой или хронической асфиксией различной степени.

В ранней стадии САМ наблюдается механическая обструкция дыхательных путей и дисфункция сурфактантной системы с последующим выраженным воспалением дыхательных путей (Davey A.M., Becker J.D., Davis J.M., 1993). Позднее происходит снижение растяжимости легких, повышение аэродинамического сопротивления. Многие компоненты мекония являются ингибиторами сурфактанта, и, вероятно, это играет одну из ключевых ролей в патофизиологии САМ (Moses D., Holm B.A., Spitale P., Liu M.Y., Enhorning G., 1991; Sun B., Curstedt T., Robertson B., 1993). Насколько будет выражен этот эффект, будет зависеть от количества аспирированного мекония. Антенатальный пассаж мекония, например, при гипоксии, приводит к появлению его в дыхательных путях, что нарушает синтез и секрецию сурфактанта альвеолоцитами II типа (Cleary G.M., Wiswell T.E., 1998). Лаваж дыхательных путей разведенным раствором экзогенного сурфактанта или простое введение сурфактанта приводило к быстрому повышению оксигенации (Findlay R.D., Taeusch H.W., Walther F.J., 1996; Schlossser R.L., Veldman A., Fischer D., Allendorf A., von Loewenich V., 2002; Wiswell T., Gail R. Knight, Neil N. Finer et al., 2002), снижало продолжительность ИВЛ (Lam B., Yeung C., 1999; Wiswell T., Gail R. Knight, Neil N. Finer et al., 2002;) длительность О2 терапии (Lam B., Yeung C., 1999), снижало частоту «утечек»

воздуха и необходимость в экстракорпоральной мембранной оксигенации ЭКМО (Mller J., Martina Kohl, Irwin Reiss et al., 1999).

Данные, полученные in vitro, говорят о том, что сурфактант может влиять на различные компоненты иммунной системы (Pison U., Max M., Neuendan A. et al., 1994). Так, сурфактант увеличивает фагоцитарную активность макрофагов, подавляет пролиферацию лимфоцитов, уменьшает выделение медиаторов воспаления, и обладает антибактерицидными и антивирусными свойствами. По экспериментальным данным, частицы мекония в малых разведениях не оказывают токсического влияния на пневмоциты 2-го типа, а компоненты мекония – протеины даже увеличивают секрецию сурфактанта (Сидорова И.С., Эдокова А.Б., Макаров И.О. и соавт., 2000).

При аспирации меконий у новорождённых является индуктором серьёзного химического воспаления лёгких, заканчивающегося синдромом аспирации мекония (САМ) (Tyler D.C., Murphy J., Cheney F.W., 1978; Kaoru Okazaki, Masatoshi Kondo, Masahiko Kato, Ryota Kakinuma et al., 2008).

Важнейшим фактором, осложняющим течение заболевания и исхода САМ, остается развитие бактериальной инфекции.

В своих работах (Davey A.M., Becker J.D., Davis J.M., 1993; Cleary G.M., Wiswell T.E., 1998; Gelfand S.L., Fanaroff J.M., Walsh M.C., 2004; Kaoru Okazaki, Masatoshi Kondo, Masahiko Kato, Ryota Kakinuma et al., 2008) показали, что патофизиология САМ подобна провоспалительному ответу при пневмонии, и, следовательно, цитокины и хемокины могут быть связаны с патофизиологией синдрома аспирации мекония. Авторы исследования пришли к выводу, что большинство типов провоспалительных цитокинов и хемокинов в сыворотках новорождённых с САМ были выше, чем у детей без САМ.

De Beaufort A.J. с соавторами (2003) сообщают, что в меконии содержатся некоторые провоспалительные цитокины, непосредственно ведущие к химической пневмонии и мекониальной аспирации.

По мнению авторов (Kaoru Okazaki, Masatoshi Kondo, Masahiko Kato et al., 2008), повышенные уровни цитокинов и хемокинов подтверждают их связь с патогенезом САМ и свидетельствуют о выраженном воспалительном ответе. Одновременно повышенный уровень противовоспалительного цитокина IL-10, возможно, является компенсаторным механизмом для уменьшения чрезмерного провоспалительного ответа при САМ (Lentsch A.B., Shanley T.P., Sarma V., Ward P.A., 1997; Clarke C.J., Hales A., Hunt A., Foxwell B.M., 1998; Kapur R., Yoder M.C., Polin R.A., 2000; Oberholzer A., Oberholzer C., Moldawer L.L., 2002).

Помимо патогенетической роли провоспалительных цитокинов не менее важное значение принадлежит и оксиду азота. Исследования у взрослых с легочной гипертензией и в эксперименте на животных показали, что ингаляции оксида азота вызывают селективную дилятацию легочных сосудов. Это послужило основанием для использования метода лечения у новорожденных. Рядом авторов было показано, что ингаляция оксида азота сопровождалась улучшением оксигенации крови у детей с мекониальной аспирацией (Moncada S, Palmer R.M., Higgs E.A., 2001; Marlella M.A., Kirk M., Maxey M.O., 2006).

Изучение роли оксида азота как медиатора воспаления находится на начальном этапе. Целесообразность исследований в этом направлении совершенно очевидна, поскольку формирование целостных представлений о нитроксидзависимых механизмах при респираторной патологии имеет принципиальное значение для разработки новых подходов к этиопатогенетическому лечению данной патологии (Сомова Л.М., Плехова Н.Г., 2006).

Механизмы воздействия NO на организм еще не достаточно изучены, однако, на сегодняшний день известно, что эта молекула выполняет многие важные биологические функции (Star R.A., 2003).

Так, синтезируемый в макрофагах и моноцитах NO, обеспечивает их цитотоксическую активность по отношению к чужеродным клеткам, в том числе и к микробным, и активирует Т-лимфоциты. Известно, что синтезируемый в эндотелиальных клетках NO, воздействует через систему циклического ГМФ на гладкую мускулатуру гладкомышечных волокон сосудов и является вазодилятатором, антиагрегантом тромбоцитов и эритроцитов, ингибитором тромбообразования. NO активно участвует в регуляции тонуса сосудистой системы.

Инфекционно-воспалительные осложнения, развивающиеся на фоне продленной искусственной вентиляции легких (ИВЛ) у новорожденных с тяжелыми дыхательными нарушениями, являются по-прежнему одной из основных причин смерти у этих детей, а у выживших определяют риск формирования хронической бронхолегочной патологии (Кешишян Е.С., 1996; Дементьева Г.М., Рюмина И.И., Кушнарева М.В., 2001).

Формирование реактивности ребенка и сопротивляемости повышенной микробной колонизации определяется как состоянием его иммунной системы, так и ее функционированием в условиях проведения ИВЛ.

Новорожденные дети с дыхательными расстройствами, находившиеся на ИВЛ, в дальнейшем подвержены хроническим бронхолегочным заболеваниям, бронхолегочной дисплазии, вирусно-бактериальным инфекциям, тяжелым неврологическим расстройствам (Никулин Л.А., Кулагина М.Г., Каюмова Д.А., 2008).

Вместе с тем для элиминации вирусной или бактериальной инфекции организму необходимо хорошо координированное взаимодействие систем врожденного и адаптивного иммунитета (Малиновская В.В., Дмитриева Е.В., Паршина О.В. и соавт., 2009; Ковальчук Л.В. и соавт., 2005, 2008).

постнатальная адаптация Известно, что иммунологические взаимоотношения матери и плода формируются в рамках единой функциональной системы мать-плацентаплод. Нарушение нормальных взаимоотношений в этой системе является ведущим звеном патогенеза различных форм патологии, как матери, так и плода, в значительной степени определяют течение перинатального периода.

В последние годы пристальное внимание исследователей и практических врачей уделяется комплексу проблем, связанных с изучением онтогенеза иммунной системы в норме и функционированием её при патологических состояниях в перинатальном периоде и в раннем детском возрасте (Рогалева Т.Е. и соавт., 2006; Прямкова Ю.В., Самсыгина Г.А., 2007; Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., 2007; Чистякова Г.Н., Газиева И.А., Ремизова И.И., 2007;

Ганковская Л.В., Макаров О.В., Ковальчук Л.В. и соавт., 2008; Казюкова Т.В., Левина А.А., Сергеева А.И. и соавт., 2008).

Иммунная система новорожденного, как и нервная система, является интегрирующей, ответственной за сохранение постоянства его внутренней среды, особенно в условиях постнатальной адаптации. По значимости для становления иммунной системы перинатальный период уникален и не сопоставим ни с одним другим возрастным периодом. Роль иммунной системы в ранней постнатальной адаптации чрезвычайно важна. В процессе перехода из стерильных условий внутриутробного развития в условия повышенной антигенной нагрузки неизбежно изменяется состояние различных звеньев иммунной системы. В результате одновременно происходят разнонаправленные процессы: постепенное становление адекватного иммунного ответа, формирование иммунологической памяти и поддержание иммунологической толерантности, сдерживание возможного развития гиперергических реакций и воспаления (Володин Н.Н., Дегтярева М.В., Симбирцев А.С. и соавт., 2000).

Известно, что иммунная система новорожденных формируется на последних этапах внутриутробного развития и в первые месяцы жизни ребенка, поэтому иммунная система здорового доношенного новорожденного существенно отличается от иммунной системы взрослого человека. Любые деструктивные воздействия, приводящие к отклонениям в ходе беременности, сокращению сроков вынашивания, гипотрофии и гипоксии плода, неминуемо приводят к задержке развития иммунной системы детей и дефициту поступающих от матери гуморальных факторов защиты, что в свою очередь увеличивает риск нарушений соматического, иммунного и неврологического статуса новорожденных, а также уровень здоровья ребенка в последующие годы жизни (Серов В.В., Пауков В.С., 1995;

Сухих Г.Т. и соавт., 1997; Вабищевич Н.К. и соавт., 1998; Володин Н.Н., Рогаткин С.О., Людовская Е.В., 2005; Толстопятова М.А., Буслаева Г.А., Козлов И.Г., 2009).

Нарушения структуры плаценты и процессов микроциркуляции в ней при поздних гестозах беременных, воздействие лекарственных препаратов и других вредных факторов обуславливают хроническое кислородное голодание плода, сопровождающееся снижением напряжения кислорода в крови, гиперкапнией, декомпенсированным ацидозом, нарушением водноэлектролитного обмена, снижением содержания кортикостероидов. Это, в свою очередь, вызывает нарушение функции центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, регуляции гомеостаза, повышение проницаемости сосудов, снижение иммунологической реактивности организма плода (Струнина И.Г., 1993).

Многолетние исследования показывают, что здоровье новорожденного ребенка в значительной степени определяется течением антенатального периода (Милованов А.П., 1999; Цинзерлинг В.А., Мельникова В.Ф., 2002).

Плацентарная недостаточность (ПН) - одна из важнейших причин перинатальной заболеваемости и смертности (Цинзерлинг В.А., Мельникова В.Ф., 2002). Универсальным индикатором всех патологических процессов, происходящих в организме плода на фоне хронической фетоплацентарной недостаточности, является иммунная система (Рогалева Т.Е., Кочмарева С.И., Цецуняк Е.А. и соавт., 2006). Становление иммунной системы детей в периоде новорожденности в значительной степени связано с особенностями течения беременности у матери. При этом особое значение приобретают иммунные процессы, происходящие на поздних этапах антенатального развития в зоне плодово-материнского контакта (Сотникова Н.Ю., 2005). В частности, известно, что такое осложнение беременности как гестоз, не только часто приводит к формированию фетоплацентарной недостаточности, но и сопровождается выраженными нарушениями локального иммунного ответа на уровне плаценты, оказывающим негативное влияние на развивающийся плод (Шабалов Н.П., 2004; Сотникова Н.Ю., 2005.

Хроническая внутриутробная гипоксия, как следствие нарушений в фетоплацентарном комплексе, является патогенетическим звеном в механизме развития церебральных поражений у плодов и новорожденных (Шабалов Н.П., 2004).

Большинство исследователей делает вывод, что перинатальная гипоксия инициирует запуск целого каскада патологических процессов, которые приводят к формированию вторичной иммунологической недостаточности и обусловливают склонность к развитию инфекционных осложнений у этой категории детей (Володин Н.И., Дегтярева М.В., Симбирцев А.С. и соавт., 2000; Голосная Г.С., 2004).

Установлено, что состояние иммунной системы беременной женщины определяет состояние иммунитета плода (Вабищев Н.К., Полетаев А.Б., Будыкина Т.С. и соавт., 1998; Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2003; Малиновская В.В., Дмитриева Е.В., Паршина О.В. и соавт., 2009).

чувствительна и лабильна и быстро реагирует на изменения в организме матери инфекционной и неинфекционной природы (Краснопольский В.И., Тареева Т.Г., Малиновская В.В. и соавт., 2004). Так по данным Малиновской В.В. (2009) у новорожденных от матерей с урогенитальной инфекцией, было значимо снижено процентное содержание натуральных киллеров с новорожденными. Это же характерно и для натуральных киллеров с высоким цитотоксическим потенциалом, характеризующихся фенотипом CD3-CD8+.

При этом дефицит натуральных киллеров свидетельствует о низкой резистентности иммунной системы новорожденного к инфекции, в первую очередь вирусной.

Известно, что у новорожденных при физиологически протекающих беременности и родов иммунный надзор способен противостоять массивной и быстрой колонизации бактериями и вирусами, которая происходит в течение 1- й недели жизни (Подосинников И.С., Качанова С.В., Блинов А.Е.

и соавт., 1997; Самсыгина Г.А., Минасян B.C., 2007).

Так, по данным Дегтяревой М.В., Володина Н.Н. и соавт. (2000), хроническая фетоплацентарная недостаточность влияет на степень восприятия лимфоцитами IL-1 и снижает уровень пролиферативного ответа на него в присутствии митогена, а в клинике может снижать пролиферацию лимфоцитов при развитии иммунного ответа ребенка на экзогенные антигены.

Исследованиями многих авторов (Сухих Г.Т. и соавт., 1997; Таболин В.А. и соавт., 1997; Володин Н.Н. и соавт., 1999; Bot A. et al., 1997) показано, что фенотип иммунокомпетентных клеток крови новорожденного отличается от такового у взрослых выраженными супрессорными характеристиками, признаками незрелости лимфоцитов и сниженной активностью цитотоксических реакций, что обусловливает повышенную восприимчивость новорожденных детей к вирусным и бактериальным инфекциям в результате сниженной функции клеток-эффекторов и отсутствия адекватного регуляторного сигнала на антигенный стимул (Дегтярева М.В., 2001).

новорожденного ребенка имеет свои особенности (Таболин В.А., Володин Н.Н., Дегтярева М.В., 1997; Bot A., Antohi S., Bona C., 1997).

Так, по данным Шабалова Н.П. и Иванова Д.О. (2001) особенностями иммунного статуса новорожденных, обусловливающих повышенную чувствительность к инфекции, являются: сниженный хемотаксис, низкая бактерицидность фагоцитов, слабая экспрессия молекул HLA-2 класса незрелость механизмов презентации. «Наивные» CD4+CD45ROCD45RA+CD29low- Т-клетки новорожденных фенотипически менее зрелые, чем у взрослых, низкая продукция TNF-, GM-CSF, M-CSF, низкие уровни IgM, IgA, функция натуральных киллеров подавлена, слабая экспрессия CD21 на неонатальных В-лимфоцитах, ответственных за неотвечаемость к полисахаридным детерминантам (т.е. за повышенную чувствительность к инфекциям, вызываемых капсульными бактериями).

В В-клеточном репертуаре новорожденного ребенка преобладают незрелые В-лимфоциты (Володин Н.Н., Дегтярева М.В., Дегтярев Д.Н. и соавт., 1999). В - лимфоциты новорожденного лишены второго сигнала при кооперации с неонатальными Т-клетками, поскольку для неонатальных Тлимфоцитов характерен крайне низкий уровень экспрессии CD40-лиганда (CD40L) (Рабсон А., Ройт А., Далвз П., 2006).

Установлено, что мембранный белок CD40 играет важную роль в выживаемости, росте и дифференцировке В-клеток. При этом отсутствие взаимодействия CD40-CD40L может приводить к преимущественно непрофессиональному представлению антигенов Т-лимфоцитам, так как нарушается экспрессия В-7 молекул на антиген - представляющих клетках (АПК) (Ярилин А.А., 1999).

Володиным Н.Н., Дегтяревой М.В., Дегтяревым Д.Н. и соавт. (1999) установлено, что у здоровых доношенных новорожденных детей в пуповинной крови имеется особое, отличное от взрослых, биологически целесообразное состояние клеточных и гуморальных факторов иммунологического реагирования. Плод синтезирует собственные антитела, которые независимо от природы антигенной стимуляции являются полиреактивными IgM. В-лимфоциты новорожденного с фенотипом CD5+ способны к синтезу субклассов IgG1 и IgG3, но не IgG2 или IgG4, к которым принадлежат антитела к капсулярному полисахариду бактерий. И хотя у плода уже с 12-15 недели гестации обнаруживаются зрелые лимфоциты и отмечена способность синтеза иммуноглобулинов, уровень и интенсивность их продукции в антенатальный период существенно ограничены.

Предполагается, что ограничением для активного синтеза иммуноглобулинов в антенатальном периоде является относительная защищенность организма плода от антигенных стимулов. В результате этого концентрация IgG в сыворотке крови до 32 недели гестационного периода не превышает 0,4 г/л.

С 34-35 недели гестации у плода отмечается быстрое и существенное повышение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови – до 10 г/л к моменту рождения. Данное увеличение концентрации иммуноглобулинов связано с активным трансплацентарным поступлением материнских антител в организм плода. Установлено, что среди всех иммуноглобулинов способностью проникать через плаценту обладают только иммуноглобулины класса IgG. Известно, что основное количество антител класса IgG ребенок получает от матери трансплацентарно, начиная с 35-ой недели гестации благодаря малой молекулярной массе и наличию рецепторов к IgG на трофобласте (Сухих Г.Т., Ванько Л.В., Кулаков В.И., 1997). Из-за того, что IgМ и IgА не способны проникать через плаценту палитра гуморальной иммунной защиты у новорожденного имеет определенные ограничения. У большинства новорожденных из-за отсутствия антител класса IgМ отмечается недостаточный уровень защиты против грамотрицательных бактерий (Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е., 1996). Установлено, что критической концентрацией сывороточного IgG является уровень 4 г/л, ниже которого у недоношенных новорожденных отмечается высокий риск развития сепсиса с неблагоприятным исходом. Следует также отметить, что спектр гуморальной защиты новорожденного может быть существенно ограничен не только за счет крайне низкого содержания IgМ, но и в том случае, если в репертуаре материнских иммуноглобулинов нет антител против каких-либо патогенов (Коровина Н.А., Заплатников А.Л., 2008).

Известно, что соотношение между количеством профессиональных и непрофессиональных клеток, представляющих антиген наивным Тлимфоцитам, преобладающим у новорожденных, влияет на исход иммунного ответа на антиген: завершится ли он праймингом или толерантностью.

Neubert R.T., Delgado I., Webb J.R. (2000) провели сравнительные фенотипические исследования и показали, что среди лимфоцитов пуповинной крови новорожденных в отличие от периферической крови взрослых доноров преобладают «наивные» CD4+CD45RO-CD45RA+CD29lowТ-клетки и практически полностью отсутствуют CD4+CD45RO+CD45RACD29high-Т-клетки-памяти. Кроме того, свидетельством незрелости фетальных клеток считают более низкий уровень экспрессии на них рецепторов к IL-2 (CD25), молекул Fas (CD95) и Fas-L, а также снижение относительного содержания общей популяции CD3+ -Т-лимфоцитов в сочетании с повышенным количеством CD19+-B-клеток. К проявлениям функциональной незрелости лимфоцитов относят более низкое содержание в пуповинной крови цитокинпродуцирующих клеток (CD4+ - и CD8+ -Тлимфоцитов, NK-клеток, моноцитов), отсутствие в сыворотке пуповинной крови ростовых факторов, необходимых для усиления митогенной реактивности Т-клеток, низкий уровень естественной цитотоксической активности лимфоцитов, неэффективное межклеточное взаимодействие, антигенпрезентирующих клетках и В-лимфоцитах.

Макогон А.В., Леплина О.Ю., Пасман Н.М. и соавт. (2005) обнаружили снижение относительного содержания HLA-DRhigh моноцитов в крови плодов и новорожденных. Ими было установлено, что фетальные клетки в отличие пролиферативного ответа в культурах, стимулированных КонА и/или антиCD3-МАТ. Важно отметить, что дефект пролиферативного ответа Т-клеток при стимуляции анти-CD3-антителами сохраняется также и в раннем постнатальном периоде.

Небезынтересно, что естественные киллеры (NK-клетки) (CD3-CD16+ CD56+) являются третьей (наряду с Т - и В - клеточной) субпопуляцией лимфоцитов иммунной системы (Кузник Б.И., 2001; Сепиашвили Р.И., 2005).

Механизм действия NK-клеток заключается в индукции апоптоза и перфорин-зависимом лизисе. Т-зависимые естественные киллеры (T-NK– клетки) (CD3+CD16+CD56+) также осуществляют важную иммунорегулирующую роль. Некоторыми авторами указывается на способность T-NK – клеток изменять скорость многих иммунных реакций.

Так на факт значительного снижения уровня естественных киллеров и Т – зависимых естественных киллеров у новорожденных детей, рожденных от матерей с гестозами, указывают Рогалева Т.Е. и соавт. (2006). Такие изменения свидетельствуют об участии этих клеток в иммунопатологических процессах, в том числе, в патогенезе перинатального поражения ЦНС.

Общеизвестно, что важная роль в иммунных процессах принадлежит цитокинам. Цитокины участвуют в механизмах взаимодействия клеток (Кетлинский С.А., 1999). С их помощью обеспечиваются иммунные реакции, необходимые для роста и развития плаценты – органа, функционирующего в определенный промежуток времени и обеспечивающего развитие беременности и рождение ребенка. Уникальностью плаценты является тот факт, что макрофаги ворсин хориона и децидуальные макрофаги имеют различное происхождение: макрофаги ворсин хориона принадлежат плоду, а макрофаги децидуальной области вырабатываются клетками костного мозга матери (Сельков С.А., Павлов О.В., 2007). Это обстоятельство обеспечивает различную экспрессию цитокинов. На протяжении всего гестационного периода цитокины осуществляют регуляторную функцию посредством паракринных, эндокринных и аутокринных механизмов, направленных на сохранение и развитие беременности. В маточно-плацентарном комплексе выделяют следующие звенья межклеточных взаимодействий, которые находятся под контролем цитокинов: иммунорегуляцию, клеточную адгезию и инвазию, дифференцировку и пролиферацию клеток, ремоделирование и репарацию клеток, регуляцию синтеза гормонов (Никитина Л.А., Демидова Е.М., Радзинский В.Е. и соавт., 2007). Важным аспектом является иммунное взаимодействие матери, плаценты и плода. Многие цитокины обнаружены и миометрии, плодных оболочках, амниотической жидкостях. В маточноплацентарном комплексе функционирует сбалансированная система контроля гестационных процессов. Наиболее часто в связи со спонтанной родовой деятельностью в литературе встречаются сведения об активном участии в этом процессе провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF- (Сельков С.А., Павлов О.В., 2007). В амниотической жидкости при срочных и преждевременных родах наиболее часто отмечается повышенная экспрессия TNF- (Romero R., Mazor M., Sepulveda W. et al., 1992; Opsjin S.L., Wathen N.C., Tingulstad S. et al., 1993; Laham N., Brennecke S.P., Bendtzen K. et al., 1994).

Таким образом, цитокины выступают посредниками в развитии воспалительных и иммунных реакций в системе мать-плацента-плод. При наступлении преждевременных родов происходит активация про- и противовоспалительных цитокинов, нарушение функциональных и морфологических свойств клеточных мембран, энергетического обмена (Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2007).

В работах, посвященных аспектам иммунологии новорожденных с дыхательными расстройствами, доминирует понятие системной воспалительной реакции, связанное с развитием внутриутробной пневмонии, неонатального сепсиса (Дегтярева М.В., Дегтярев Д.Н., Володин В.В. и соавт., 1996; Глуховец Б.И., Глуховец Н.И., 2006; Бирюкова Т.В., Солдатова И.Г., Володин Н.Н. и соавт., 2007). Вместе с тем роль провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в патогенезе дыхательных расстройств недостаточно исследована. Так по данным Перепелицы С.А., Голубева А.М., Мороза В.В. и соавт., (2009), у недоношенных новорожденных при ОРДС наблюдалась сильная корреляционная связь между уровнем IL-6 в бронхоальвеолярной жидкости, оценкой по Апгар на 1-й минуте жизни и длительностью ИВЛ, свидетельствующая о взаимосвязи степени тяжести анте - и интранатальной гипоксии и интенсивности продукции IL-6. По данным литературы повышение уровня IL-6 в остаточной пуповинной крови новорожденного имеет определенную патогенетическую связь с характером воспалительных реакций в последе (Глуховец Б.И., Глуховец Н.И., 2006;

Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2007).

По сведениям Перепелицы С.А., Голубева А.М., Мороза В.В. и соавт.

(2009), экспрессия IL-6 в остаточной пуповинной крови наиболее выражена у новорожденных с развившимся ОРДС. По мнению авторов, повышение морфологическими исследованиями плаценты и соответствует данным других авторов (Глуховец Б.И., Глуховец Н.И., 2006; Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2007). Установлено, что повышенное содержание IL-6 в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) свидетельствует о внутриутробном повреждении альвеолярного эпителия, что способствовует развитию ОРДС и влияет на длительность ИВЛ (Перепелица С.А., Голубев А.М., Мороз В.В. и соавт., 2009).

Таким образом, для иммунокомпетентных клеток новорожденных характерен отличный от взрослых уровень цитокинов. Так, синтез одних цитокинов - TNF-, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) у новорожденных снижен незначительно, других IFN-, IL-3, IL-4, IL-5 и IL-12, необходимых для быстрого согласованного иммунного ответа - существенно (Siegrist C.A., 2001). Следует отметить, что эта недостаточность распространяется не на все цитокины: IL-2 и TNF- с рождения вырабатываются примерно в таком же количестве, как и у взрослых. Стимулированные лимфоциты CD4 у здорового новорожденного дифференцируются преимущественно в T-хелперы 2-го типа, однако стоит повысить концентрацию CD28, как направление дифференцировки меняется, и лимфоциты начинают секретировать цитокины, характерные для Tхелперов 1-го типа (Delespesse G., Yang L. P., Ohshima Y. et al., 1998).

Следовательно, секреторные особенности лимфоцитов новорожденных не абсолютны, а связаны с условиями активации. Кроме того, лабораторные эксперименты показали, что введение новорожденным животным IL-12 в присущих взрослым количествах запускает хелперный ответ 1-го типа (Arulanandam B.P., Van Cleve V.H., Metzger D., 1999). Установлено, что способность лимфоцитов к выработке цитокинов повышается с возрастом:

синтез TNF- достигает нормального уровня на первых месяцах жизни, а IFN- и IL-12 - к году (Siegrist C.A., 2001). Кроме того, у новорожденных отмечается иная, чем у взрослых, экспрессия рецепторов к цитокинам, в частности, слабая - к IL-2 при сохранении высокого сродства к этому цитокину. Особенности цитокинового профиля и экспрессии рецепторов к цитокинам во многом определяют характер формирования иммунитета. Так, низкие концентрации IL-1 и TNF- и слабая экспрессия рецепторов к IL- обуславливает угнетение ранних этапов иммунного ответа, а высокая продукция IL-2 и /или IL-1 – усиление его последующих этапов.

Известно, что интерфероны (IFN) являются важнейшими факторами естественной резистентности организма человека. Они вырабатываются и содержатся во всех ядросодержащих клетках крови и эпителиальных клетках слизистых оболочек, обладают антивирусным и антимикробным эффектом. В качестве медиаторов иммунитета обеспечивают координацию пролиферации, дифференцировки и активации эффекторных клеток иммунитета (Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., 2002).

Для новорожденных детей характерны физиологически обусловленные особенности функционирования системы интерферонов, характеризующиеся низкими титрами IFN-, высоким уровнем “раннего” IFN- (Stiehm E.R., Ochs H.D., Winkelstein J.A., 2004). Однако “ранний” IFN- новорожденных отличается от IFN- взрослых полипептидным составом и гидрофобными свойствами, что и определяет наличие у них различных функций: IFNплода в большей степени обеспечивает регуляцию, чем противовирусную или антибактериальную защиту (Беликова М.Э., Чаша Т.В., Сотникова Н.Ю.

и соавт., 2002). Эти особенности системы интерферонов у новорожденных детей составляют основу для возможного срыва защитных реакций и развития у них бактериальных и вирусных инфекций (Страчунский Л.С., 2002). Отмечено, что осложненное течение гестационного периода вызывает нарушение функционирования системы IFN как у матери, так и у новорожденного (Нецеевская М.А., 2000; Бондарь О.Е., Ванько Л.В., Логинова Н.С. и соавт., 2004).

Установлено, что TGF- оказывает иммуносупрессивное действие на различные типы клеток, в том числе на фагоциты, уменьшая выработку ими активных форм кислорода, наблюдается отмена прайминга нейтрофилов.

TGF- фактор подавляет гемопоэз, синтез воспалительных цитокинов, ответ лимфоцитов на IL-2, IL-4, IL-7, формирование цитотоксических NK-клеток и Т-клеток (Ивчик Т.В., Кокосов А.Н., Янчина Е.Д. и соавт., 2003; Kuwano K., Kawasaki M., Maeyama T., 2000; Hagimoto N., Kuwano K., Miyazaki H., 2003;

Xaubet A., Marin-Arguedas A., Lario S. et al., 2003; Lee C.G., Cho S.J., Kang M.J., 2004; Stern D.A., 2007). При этом TGF- усиливает синтез белков межклеточного матрикса, коллагена, активирует нейтрофилы, способствует новообразованию соединительной ткани и сосудов. В том числе TGF-, являясь фиброгенным цитокином, стимулирует изменение структуры стенки бронха, его ремоделирование. Морфологическая перестройка в стенке бронха приводит к появлению частично обратимой или необратимой обструкции дыхательных путей. В этих условиях TGF- играет огромную роль в развитии легочного фиброза и потенцировании апоптоза бронхиальных эпителиальных клеток. Доказано, что уровень фактора роста достоверно выше в бронхоальвеолярной жидкости и экстрацеллюлярном пространстве у больных с идиопатическим фиброзом легких (Green F.H.Y., 2002).

Так в экспериментальных работах на животных определена высокая экспрессия данного фактора в альвеолярных макрофагах в острую фазу воспаления и в эпителиальных клетках бронхиального дерева в позднюю стадию легочного фиброза (Hagimoto N., Kuwano K., Miyazaki H., 2003; Lee C.G., Cho S.J., Kang M.J., 2004). В ряде экспериментальных работ изучается роль данного фактора в развитии бронхолегочной дисплазии в неонатальном периоде (Clement A., 2004; Bartram U., Christian P., 2004).

По данным Little S. (1995) в трахеобронхиальных аспиратах новорожденных, находившихся на ИВЛ по поводу РДС, наблюдается возрастание уровня провоспалительных медиаторов – IL-6 и IL-8, фактора некроза опухолей. У этих детей развивалась тяжелая пневмония и бронхолегочная дисплазия – РДС – ИВЛ – пневмония – бронхолегочная дисплазия.

Таким образом, иммунный ответ включает множество звеньев, одним из которых является привлечение иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления. При этом белки адгезии играют важную роль во многих биологических процессах, таких как эмбриогенез, гемостаз и воспаление.

Основная их функция состоит в поддержании межклеточных взаимодействий и взаимодействий между клетками и экстраклеточным матриксом. Подобные контакты обеспечивают передачу сигналов, регулирующих функции структурных компонентов цитоскелета, участвующих в процессе активации клетки. Благодаря своим цитоплазматическим доменам адгезивные молекулы воспринимают внутриклеточные сигналы, которые регулируют экспрессию, распределение по клеточной мембране (спрейдинг) и функциональную активность поверхностных рецепторов (Aplin J.T. et al., 1998).

Наиболее важную роль в иммунных реакциях играет семейство 2интегринов и иммуноглобулиноподобные белки семейства ICAM. Так, в формировании иммунологического синапса участвуют 2-интегрин, называемый LFA-1, и белок адгезии ICAM-1 (Ярилин А.А., 1999). В инициации первичного иммунного ответа принимает участие антиген адгезии ICAM-3, взаимодействующий на дендритных клетках с DC-SIGN, а также с LFA-1 (CD11a/CD18) (Ярилин А.А., 1999).

Важную роль в межклеточных взаимодействиях играют так же такие антигены адгезии, как CD54 (ICAM-1), CD50 (ICAM-3), LFA- (CD11a/CD18), CD11b/CD18. Нарушение их содержания приводит к модуляции межклеточных взаимодействий и, соответственно, иммунного ответа (Новиков В.В., Бабаев А.А., Кравченко Г.А. и соавт., 2008).

Установлено, что CD11b/CD18 – интегрин, который присутствует на поверхности моноцитов, макрофагов, гранулоцитов, дендритных клетках, некоторых натуральных киллерах, опосредует прилипание клеток к фибронектину и продуктам его расщепления, а также прилипанию моноцитов к стимулированному эндотелию и фагоцитозу частиц, покрытым комплементом.

Одним из факторов, влияющих на экспрессию молекул адгезии, являются цитокины. Ключевыми цитокинами адаптивного клеточного и гуморального иммунного ответа остаются IFN- и IL-4 как главные медиаторы Th1 и Th2 ответа, соответственно (Железникова Г.Ф., 2008).

Процесс привлечения иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления на сегодняшний день вызывает большой интерес, так как является ключевым в патогенезе воспаления, в том числе в бронхолегочной системе. Немалое количество работ посвящено изучению участия молекул межклеточной адгезии и хемокинов в течение воспалительного процесса при бронхиальной астме, имеются публикации участия молекул адгезии и хемокинов в патогенезе развития и течения хронических и рецидивирующих болезней легких у детей (Черешнев В.А., 2002; Булгакова В.А., 2009). Однако остаются малоизученными особенности иммунорегуляторных механизмов при синдроме дыхательных расстройств у новорожденных.

В этой связи следует отметить, что у новорожденных ослаблены по сравнению с взрослыми процессы активации системы комплемента - С1, С2, С3 и С4 (в 2 раза ниже уровня взрослых). Этот фактор обуславливает низкую опсоническую активность крови новорожденных и слабость фагоцитарной антибактериальной защиты (Владимирская Е.Б., 1997; Вельтищев Ю.Е., 1998;

Самсыгина Г.А., Минасян В.С., 2007).

Известно, что в процессе развития ребенка неонатальный период является одним из критических для функционирования иммунной системы, когда последняя неадекватно реагирует на антигенное раздражение (Дегтярева М.В., 2000). На 5-7 сутки после рождения у новорожденных происходит первый “физиологический перекрест в лейкоцитарной формуле”:

нейтрофилез сменяется относительным и абсолютным лимфоцитозом.

Увеличение числа лимфоцитов происходит, главным образом, за счет незрелых CD45RA+ клеток, в то время как количество CD8+ лимфоцитов уменьшается, что проявляется возрастанием иммунорегуляторного индекса (ИРИ). Одновременно отмечается повышение процента моноцитов и эозинофилов и снижение уровня В-клеток.

Апоптоз как один из видов клеточной смерти играет важную роль в развитии патологических процессов: с его усилением или, наоборот, ингибированием связано возникновение и прогрессирование различных заболеваний (Самуилов В.И., Алескин А.В., Лагунова Е.М., 2000;

Барышников А.Ю., Шишкин А.В., 2002; Булгакова В.А., 2009; Hengartener M.O., 2000).

Известно, что апоптоз является естественным завершением жизненного цикла любой клетки, а механизмы его регуляции универсальны и не имеют выраженной тканевой специфичности. В норме апоптоз участвует в регуляции дифференцировки клеток и тканей, а также обеспечивает нормальное развитие многоклеточных организмов в период эмбриогенеза. В то же время при патологических процессах в организме очень часто отмечаются те или иные нарушения биологической программы клеток, которые могут приводить к усилению или угнетению апоптоза. Установлено, что при нормальном прохождении клеткой своего жизненного цикла апоптоз следует за этапом активации и проявлением их максимальной биологической активности клетки (Сепиашвили Р.И., Шубич М.Г., Колесникова Н.В. и соавт., 2000; Ярилин А.А., Никонова М.Ф., Ярилина А.А. и соавт., 2000;

Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002; Блохин Д.Ю., 2003).

Включение программы гибели клетки зависит от результата действия разнообразных внешних и внутренних факторов. Ключевыми молекулами апоптоза являются рецепторы смерти, которые передают внутрь клетки сигналы, поступающие в виде лигандов смерти (Блохин Д.Ю., 2003). Таким образом, апоптоз запускается в результате проведения экзогенного сигнала через специализированные мембранные рецепторы, такие как Fas, TNFRSF – Tumor Necrosis Factor receptor Super Family, DR-3, DR-4, DR-5, DR-6 и др.

(Самуилов В.И., Алескин А.В., Лагунова Е.М., 2000; Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002). Наиболее изученными рецепторами смерти являются CD95 (он же АРО-1 и FAS) и рецептор фактора некроза опухолей 1 (TNFR1).

Известно, что при гипоксии – основной причине перинатальной патологии, в том числе, респираторных заболеваний и поражений ЦНС, происходит активация свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов (ПОЛ), что на фоне снижения антиоксидантной защиты создает условия для реализации NO – опосредованного апоптоза.

В патологических условиях, например, при воспалении, образование NO может увеличиваться в сотни раз, становясь токсичным для разных типов клеток и, тем самым, индуцируя апоптоз (Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Вольский Н.Н. и соавт., 1999; M`hammed S., Vongthip S., Arlette A., 1993).

Установлено, что наиболее чувствительными к являются моноциты/макрофаги (Lowenstein C.J. et al., 1994). В то же время непрямые данные показывают, что и антиапоптотические механизмы могут быть NOзависимыми. Принципиальная возможность NO угнетать апоптоз была продемонстрирована на некоторых линиях клеток: лимфоциты, эозинофилы, гепатоциты. Кроме того, способность NO угнетать апоптоз была установлена в опытах in vivo (Малышев И.Ю., Монастырская Е.А., Смирин Б.В. и соавт., 2000).

Ситуация эндогенной модуляции программы гибели клетки может возникнуть при лишении ее ростовых факторов, которые относятся к наиболее серьезным физиологическим ингибиторам запрограммированной гибели клеток, а так же при нарушении межклеточных контактов, внутриклеточного уровня кальция и др. (Самуилов В.И., Алескин А.В., Лагунова Е.М., 2000; Ярилин А.А., 2001; Рязанцева Н.В. и соавт., 2005;

Clifford B., Beljin M., Stark G.R. et al., 2003). При этом реализации танатогенной программы клетки могут препятствовать различные внутриклеточные регуляторы (белки семейства Bcl-2, продукты гена Ich и др.) (Kluck R.M. et al., 1997; Bellows D.S., 2002; Kim M., Sgagias M., Deng X.

et al., 2004; Festjens N., Gurp M., Loo G. et al., 2004).

Нарушение механизмов апоптоза лимфоцитов и моноцитов при синдроме дыхательных расстройств, представляется наименее изученным. В констатируется факт увеличения или снижения экспрессии Fas рецептора (CD95) на лимфоцитах периферической крови, что, безусловно, не является отражением и характеристикой механизмов апоптотической регуляции. В связи с этим, выяснение механизмов нарушений апоптоза моноцитов и лимфоцитов при синдроме дыхательных расстройств позволит не только углубить понимание патогенеза этого заболевания, но и позволит наметить новые пути и подходы к иммунокорригирующей терапии.

перестройки иммунной системы новорожденных, в неонатальном периоде эта перестройка еще не завершается, и ребенок высоко восприимчив к инфекциям, часто осложняющимся сепсисом (Tommiska V., Heinonen K., Ikonen S. et al., 2001), который продолжает занимать ведущее место в детской смертности.

характеризуется незрелостью иммунокомпетентных клеток, их низкой функциональной активностью и супрессорной направленностью механизмов формирования иммунного ответа.

Такие особенности иммунной системы новорожденного одновременно возникновения инфекционных заболеваний.

исследований приводятся данные об иммунологических нарушениях у недоношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом. Так по данным Ветровой Е.В. (2007), у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом, находящихся на искусственной вентиляции легких, наиболее выраженные иммуносупрессивные изменения популяционного состава лимфоцитов крови зафиксированы на 3-5 сутки жизни, когда осложнений. Автором отмечено многократное снижение общего числа лейкоцитов и лимфоцитов, числа CD3+, CD4+, CD8+, CD22+.

Несмотря на то, что в настоящее время активно изучаются иммунные нарушения у новорожденных с дыхательной патологией, крайне мало работ, в которых представлены данные о врожденном и адаптивном иммунитете у доношенных новорожденных с МАС и РДС.

новорожденных с респираторной патологией регистрировалось развитие содержания CD19+ (В-лимфоцитов), повышение уровня провоспалительного IL-8, колониестимулирующего фактора).

1.3. Особенности становления моноцитарно-макрофагальной системы Успехи современной иммунологии во многом связаны с изучением процессов кооперации между различными клетками иммунной системы.

Необходимость такого рода межклеточных контактов доказана для различных субпопуляций лимфоцитов, для лимфоцитов и макрофагов.

Многообразие паттернов активации клеток этого типа и широкий спектр экспрессируемых и секретируемых ими регуляторных молекул позволяет говорить о важной роли моноцитов и макрофагов в функционировании иммунной системы.

Моноциты и макрофаги являются основными клетками системы единую линию дифференцировки (Воробьев А.И., Бриллиант М.Д., 1985;

Фрейдлин И.С., 2001; Ulvestad E., Williams K., Mork S. et al., 1994).

моноцитов/макрофагов в системе иммунитета. В последние годы в работах многих исследователей показано, что от состояния именно этого звена иммунной системы зависит прогноз и исход ряда заболеваний. Установлено, что запуск иммунного ответа (активация Т-лимфоцита к пролиферации и дифференцировке) осуществляется при сочетанном взаимодействии некоторых молекул на поверхности Т-лимфоцита с рядом комплементарных молекул на поверхности макрофага с образованием супрамолекулярных агрегатов.

Известно, что абсолютное количество моноцитов у новорожденных выше, чем у взрослых, и постепенно снижается, достигая взрослых значений (Johnston R.B., 1998). Тканевые макрофаги у грудных детей хуже справляются с некоторыми возбудителями, чем макрофаги взрослых, и несколько слабее вырабатывают активные формы кислорода после фагоцитоза. Функции моноцитов находятся под контролем разнообразных лимфокинов, секретируемых активированными T-лимфоцитами. У новорожденных моноциты в меньшей степени, чем у взрослых, реагируют на интерферон -, выделяемый NK- и T-лимфоцитами, а это понижает его секрецию. Ситуация усугубляется недостаточной секрецией моноцитами и макрофагами новорожденных ряда цитокинов и факторов роста (TNF-, IL-8, IL-6, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора) (Wilson C., Lewis D., Penix L., 1996; Johnston R. B. Jr., 1998). Но самое разительное возрастное отличие заключается в скорости хемотаксиса макрофагов в очаги инфекции и воспаления. Хемотаксис моноцитов новорожденных в очаг инфекции происходит медленно. Причин тому несколько: слабая адгезия на эндотелии, сниженная выработка цитокинов моноцитами и физиологическая недостаточность хемотаксиса неуточненного характера. Только к двухлетнему возрасту скорость миграции моноцитов достигает таковой у взрослых.

Разнообразие и многочисленность возбудителей инфекционных заболеваний, с которыми перманентно сталкивается слизистая оболочка респираторного тракта, предполагает наличие сложной, мультифакторной организации локальной защиты респираторного тракта (Wessler I., Kirkpatrick C.J., 1999; Wijkstrom-Frei C., El-Chemaly S., Ali-Rachedi R. et al., 2003; BlachOlszewska Z., 2005).

Известно, что альвеолярные макрофаги, выстилающие альвеолы, являются важнейшими клетками, отвечающими за развитие воспалительного процесса в легких и реализацию механизмов защиты легочной ткани и поддержании иммунного гомеостаза в легких (Kobayashi A. et al., 1998). Так, продукция интерлейкинов альвеолярными макрофагами у новорожденных с ОРДС отражает течение патологического процесса в легких (Перепелица С.А., Голубев А.М., Мороз В.В. и соавт, 2009).

Установлено, что в начале острой фазы воспаления АМ выделяют огромные количества TNF-, одного из главных провоспалительных цитокинов, который связывается с рецепторами на тех же самих клетках и обеспечивает их активацию. Помимо этого, TNF- вызывает выраженную экспрессию молекул межклеточной адгезии (ICAM) на поверхности активированных АМ. Молекулы ICAM играют важную роль в адгезии Тлимфоцитов к АМ, которая сопровождается передачей регуляторных сигналов Т-клетке. Взаимодействие молекулы ICAM-1, расположенной на поверхности АМ, с ее лигандом, молекулой LFA -1 на Т-клетках, является необходимым условием активации покоящихся Т-клеток, индукции пролиферации и проявления других функций активированными Т-клетками (Michele Fattal-German, Francois Le Roy Ladurie, Jacgues Cerrina et al., 1998).

Авторами было показано, что активированные АМ на месте продуцируют также хемокины, такие, как RANTES (экспрессируемый и секретируемый фактор, регулируемый активацией нормальных Т-клеток), который является мощным хемотаксическим цитокином для моноцитов, Т-клеток памяти с субэндотелиальное пространство и далее к участку воспаления. RANTES, подобно некоторым другим членам группы С-С хемокинов, вызывает формирование киллеров из CD56+ клеток. In vivo продукция RANTES зависит от эндогенной цитокиновой сети, в которой TNF служит первичным сигналом для экспрессии RANTES в легких. Таким образом, регуляция экспрессии TNF-, ICAM-1 и RANTES может оказаться основным воспалительный процесс. АМ способны к фагоцитозу и осуществляют различные микробоцидные реакции.

Макрофаги в легочных альвеолах и других тканях могут обладать низкой активностью, что имеет следствием повышенную восприимчивость к инфекциям (Michele Fattal-German, Francois Le Roy Ladurie, Jacgues Cerrina et al., 1998). Однако если макрофаги активируются in vivo, то может потребоваться применение препаратов, снижающих эту чрезмерную активность.

Так по данным В.В. Эстрина и соавт. (1996), метод культивирования АМ in vitro на стекле позволил анализировать клеточную дифференциацию новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции легких по поводу респираторных расстройств различной этиологии. Авторами установлено, что изменения функционального состояния клеточных и гуморальных факторов БАЛ зависят от характера легочной патологии новорожденного. Так, у новорожденных с мекониальной аспирацией, развитие инфекционного процесса в легких сопровождалось нейтрофильным сдвигом, а также резким снижением всех показателей функциональной активности АМ и (или) полной неспособностью к перевариванию микроорганизмов АМ. Авторы утверждают, что МАС у новорожденных детей способствует значительному снижению активности АМ, увеличивает риск развития инфекционно-воспалительных осложнений бронхолегочной системы у новорожденных.

Вместе с тем для элиминации вирусной или бактериальной инфекции организму необходимо хорошо координированное взаимодействие систем адаптивный компонент иммунной системы характеризуется значительной иммунологическая память и снижена способность к формированию специфических антител к патогенам (Marodi L., 2006). Поэтому защита от инфекции в этот период зависит главным образом от врожденного иммунитета.

Система врожденного иммунитета является филогенетически более древней линией защиты организма от патогенов и функционирует, опираясь на воспаление и фагоцитоз (Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007). Механизмы врожденного иммунитета обеспечивают быструю элиминацию патогенов и предотвращение инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще отсутствуют и которым для реализации своего действия, учитывая время, требуемое для клональной генерации Т – и В – лимфоцитов с релевантными специфическими рецепторами, и продолжительности дифференцировки эффекторных клеток, необходимо от 4 до 7 суток (Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., 2002; Меджидов Р., Джанневей Ч., 2004; Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варидова А.С., 2005; Воробьев А.И., Быков А.С., Караулов А.В., 2006; Кокряков В.Н., 2006; Medzhitov R., Janeway C.A.Jr., 2000; Janeway C.A.Jr., Medzhitov R., 2002; Girardin S.E., Travassos L.H., Herve M. et al.,, 2003; Bhardwaj N., 2005; Blach-Olszewska, 2005).

В этих условиях система врожденной неспецифической защиты предопределяет как выбор антигенов инфекционных агентов, на которые будет отвечать специфический иммунитет, так и характер этой реакции (Diamond G., Legarda D., Ryan L.K., 2000; Diefenbach A., Raulet D. H., 2003;

Dempsey P.W., Vaidya S.A., Cheng G., 2003; Beutler B., Hoffmann J., 2004).

Таким образом, основная задача системы врожденного иммунитета обнаружение инфекционного агента с помощью патогенраспознающих рецепторов: распознаются специфические, консервативные структуры, экспрессируемые широким спектром микроорганизмов, например липополисахарид (ЛПС) – основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Hou L., Sasaki H., Stashenko P., 2000; Robert D.

et al., 2001; Janeway C.A.J., Medzhitov R., 2002).

Установлено, что основополагающим структурно-молекулярным компонентом врожденной системы неспецифической защиты являются образраспознающие рецепторы (pattern recognition receptors – PRR). PRR узнают высоко уникальные, не имеющих аналогов в макроорганизме, консервативные молекулярные структуры, которые были названы патогенассоциированными молекулярными структурами (pathogen-associated molecular patterns – PAMP) (Akira S. et al., 2003, 2004, 2005; Adams K.M. et al., 2007).

Наиболее известными PAMP являются липополисахариды (LPS) (Aderem A., Ulevitch R.J., 2000; Janeway C.A.J., Medzhitov R., 2002; Takeda K., Kaisho T., Akira S., 2003; Werling D., Jundi T.W., 2003). В свою очередь каждая патоген-ассоциированная молекулярная структура является маркером достаточно больших кластеров микроорганизмов, поэтому процесс их распознавания PRR носит неспецифический характер (Blach-Olszewska, 2005).

Согласно современным представлениям, центральными патогенраспознающими рецепторами системы врожденного иммунитета являются рецепторы семейства TLR (Medzhitov R., Janeway C., 2000; Medzhitov R., 2001; Vasselon T., Detmers P.A., 2002; Janssens S., Beyaert R., 2003; Yang J.S., Kim H.J., Ryu Y.H. et al, 2006; Majewska M., Szcepanik M., 2006; Yu F.-S.X., Hazlett L.D., 2006; Lu X., Wang M., Qi J., Wang H., Li X., Gupta D., Dziarski R., 2006).

Известно, что возбуждение TLR приводит к активации нескольких групп генов, участвующих в регуляции воспалительного процесса, врожденных механизмов защиты от инфекционных агентов, приобретенного иммунитета (Rhee S.H., Hwang D., 2000; Akira S., 2003; Vogel S.N., Fitzgerald K.A., Fenton M.J., 2003; O`Neill L.A., 2004; Hemmi H., Akira S., 2005).

Различные TLR экспрессируются на дендритных клетках, моноцитах, макрофагах, играющих важную роль в инициации врожденного иммунитета и его координации с адаптивным иммунитетом (Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С., 2005). При этом наиболее широким спектром специфичности обладает TLR-2. Связывание TLR-2 микробными продуктами приводит к воспалительному ответу, опосредованному продукцией цитокинов и противомикробных пептидов.

Характерный для моноцитов/макрофагов поверхностный антиген CD также функционирует как патогенраспознающий рецептор (da Silva C.J., Solday K., Christen U. et al., 2001; Medzitov R., 2001; Van Amersfoort E.S., Van Berkel T.J., Kuiper J., 2003). Характерной онтогенетической особенностью экспрессии TLR является постепенное увеличение плотности рецептора на поверхности мембран клетки в течение интра - и постнатального развития новорожденного ребенка (Visintin A., Mazzoni A., Spitzer J.H. et al., 2001).

На настоящий момент времени не существует анализа возрастных изменений количественного представительства молекул различных типов TLR (Du X., Poltorak A., Wei Y., Beutler B., 2000; Sabroe I., Read R.C., Whyte M.K.B. et al., 2003; Girardin S.E., Travassos L.H., Herve M. et al., 2003).

Значимость врожденного звена иммунитета трудно переоценить, особенно у новорожденных, у которых TLR необходимы для эффективной работы иммунной системы в неонатальный период развития. Более того, именно у новорожденных они играют ключевую роль в противоинфекционной защите, у которых система адаптивного иммунитета отличается функциональной незрелостью (Малиновская В.В., Дмитриева Е.В., Паршина О.В. и соавт., 2009).

К сожалению, на основании имеющихся исследований невозможно представить четкую картину функционирования TLR звена иммунитета у свидетельствующие о важности данной системы рецепторов врожденного эмбрионального периода и до рождения, TLR широко представлены в ткани легких, где они размещаются на поверхности альвеолярного эпителия 2-го типа и альвеолярных макрофагах. Считается, что изменение экспрессии TLR, может быть связано с легочной патологией в ранний постнатальный период (Harju K., Glumoff V., Hallman M., 2001; Droemann D., Goldmann T., Branscheid D. et al, 2003).

Имеются доказательства влияния гестационного возраста на уровень экспрессии TLR. Так, у недоношенных детей уровень экспрессии TLR минимален по сравнению с доношенными новорожденными и взрослыми.

Поэтому стимулированная ЛПС через этот рецептор секреция IL-6, IL -8, IL и TNF- у детей, рожденных раньше срока, снижена, что, возможно, и обусловливает высокую их восприимчивость к грамотрицательным инфекциям (Forster-Waldi E.K., Sadeghi D., Tamandl B. et al, 2005; Sadeghi K., Berger A., Langgartner M. et al., 2007; Yan S.R., Qing G., Byers D.M. et al., 2007).

Инфекция является одним из основных факторов, оказывающих влияние на изменение экспрессии TLR во внутриутробном и постнатальном периодах развития. При этом уровень экспрессии TLR прямо коррелирует с тяжестью процесса, что в ряде случаев позволяет рассматривать данные рецепторы как ранние маркеры инфекции. В зависимости от природы патогена наблюдается усиление экспрессии того ли иного TLR. Например, у новорожденных, инфицированных грамположительными бактериями, увеличивается экспрессия TLR-2, а экспрессия TLR-4 возрастает у детей, инфицированных грамотрицательными бактериями (Gargo А., Tominac M., Krsulovic-Hresic V. et al., 2004; Zhang J.P., Yang C.C., Changes Y., 2007).

Вирусная инфекция индуцирует экспрессию TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9 и запускает продукцию TNF 1-го типа (Bouder E.L., 2003; Netea M., Killberg B.J., Van der Meer J.W.M.J., 2004; Xu J., Yang Y., Sun J. et al., 2006).

При сепсисе у новорожденных существенное и быстрое увеличение экспрессии TLR-2 на моноцитах прослеживается уже при первоначальных признаках воспаления и остается неизменно высокой в остром периоде.

Напротив, на гранулоцитах TLR-2 появляется лишь на короткий промежуток времени. Уменьшение уровня экспрессии TLR-2 указывает на успешность терапии (Viemann D., Dubbel G., Schleifenbaum S. et al., 2005; Tsujimoto H., Ono S., Efron P.A. et al., 2008).

функционирования, безусловно, могут быть одной из причин повышенной восприимчивости к инфекционным заболеваниям, особенно в период раннего постнатального развития, когда механизмы приобретенного иммунитета еще не являются достаточно эффективными (Толстопятова М.А., Буслаева Г.А., Козлов И.Г., 2009). Напротив, гиперактивация этой системы является важнейшим патогенетическим фактором воспалительных неинфекционных заболеваний, которые могут проявляться в очень раннем возрасте.

Одним из важнейших показателей неспецифической резистентности макроорганизма является уровень функциональной активности клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы, поскольку они первыми взаимодействуют с чужеродными антигенами при развитии инфекции и играют существенную роль в противомикробной защите организма.

Учитывая ключевую роль фагоцитов в реализации врожденного иммунного ответа, является актуальным изучение фагоцитарной и метаболической активности моноцитов-макрофагов для комплексной оценки противоинфекционной защиты больного ребенка. Это связано с ведущей ролью фагоцитоза в неспецифической защите организма от инфекции.

Показано, что течение и исход инфекционно-воспалительного процесса в значительной мере определяются адекватной реакцией фагоцитов, которые являются важнейшим элементом первой линии антимикробной защиты.

Фагоцитарная система новорожденных также имеет свои, отличные от взрослых, характеристики. В первые дни жизни (5-7-е сутки) наблюдается нейтрофильный лейкоцитоз. В то же время имеет место снижение функциональной активности фагоцитов: их спонтанной и индуцированной миграции, хемотаксиса, адгезивной активности, кислородзависимой цитотоксичности и микробицидности. Кроме того, происходит отмена эффекта прайминга нейтрофилов вследствие изменения передачи сигнала внутрь клетки и /или уровня цитокинов, в частности, трансформирующего фактора роста (TGF-1) (Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Клебанов Г.И., У здоровых новорожденных наблюдается снижение выработки 2000).

активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами, что вызвано снижение уровня продукции IL-4 и IFN-. Изменение спектра цитокинов может быть одной из причин супрессии функциональной активности фагоцитов новорожденных. Данный дефект может явиться важной причиной развития различных инфекционных осложнений у новорожденных (Ганковская Л.В. и соавт., 2000).

Таким образом, незрелость фагоцитарного иммунитета оказывает значительное влияние на соответствующее иммунодефицитное состояние у новорожденного.

Резюмируя вышесказанное совершенно очевидно, что из-за своей физиологической незрелости иммунитет новорожденного не может обеспечить достаточный уровень эффективной противоинфекционной защиты в раннем неонатальном периоде. На сегодняшний день остаются недостаточно изученными многие аспекты рецепторной структуры моноцитарно-макрофагальной системы и механизмы сигнальных путей в рамках такой тяжелой патологии как дыхательные расстройства новорожденных. Становится очевидным, что для полного раскрытия роли иммунной системы в механизмах респираторной патологии важное значение может иметь дальнейшее изучение взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета, которое представляется высоко значимым не только для дальнейшего развития фундаментальных аспектов физиологии иммунной системы, но и в прикладных аспектах. Выявление характера дефекта в иммунной системе, в частности в моноцитарно-макрофагальном ее звене, важно для расширения теоретических представлений о повреждениях основных звеньев иммунитета у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, разработки новых высокоспецифичных тестов, позволяющих прогнозировать исходы заболевания и инфекционные осложнения.

Представляется важным изучение изменений иммунологических показателей у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств не только в периферической крови, но и в бронхоальвеолярном лаваже.

Из всего выше изложенного следует, что изучение патогенетических механизмов повреждения врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с тяжелой респираторной патологией имеет не только научную, но и прикладную и медико-социальную значимость. Такие исследования дадут возможность разработать скрининговые маркеры, позволяющие выявить доклинические формы септических осложнений и предупредить развитие неблагоприятных исходов, а так же наметить принципиально новые подходы к профилактике бактериальной инфекции в неонатальном периоде.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика обследованных больных Дизайн исследования Иммунологическое обследование детей проводили в объединенной клинико-диагностической лаборатории Ростовского научноисследовательского института акушерства и педиатрии с использованием стандартных тестов в соответствии с разработанной там же схемой иммунологического обследования, рекомендованной ВОЗ. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом института.

сотрудниками анестезиолого-реанимационного и родильного отделений РНИИАП в процессе лечебного процесса и планового обследования.

Для решения поставленных задач нами было проведено первичное, новорожденные, у которых в раннем периоде адаптации отмечались дыхательные расстройства, обусловленные мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом, поступившие из родильных домов г.

новорожденных Института акушерства и педиатрии г. Ростова-на-Дону за период с 2005 по 2009 гг.

Группу сравнения составили 38 условно-здоровых новорожденных ребенка, у которых отмечалось физиологическое течение раннего периода адаптации.

В процессе выполнения работы у новорожденных из основной группы проводилось 3-х кратное иммунологическое обследование в динамике катамнестического наблюдения. У детей группы сравнения обследование проводилось один раз сразу после рождения. Исследовались иммунологические показатели пуповинной крови.

Критерии включения новорожденных в исследование:

Новорожденные включались в исследование, если соответствовали следующим критериям:

- имели респираторную патологию и перинатальное поражение ЦНС;

- гестационный возраст 38-41 неделя;

- вес при рождении не менее 2500 грамм;

- поступали в отделение реанимации на ИВЛ не позднее 7-х суток;

- при поступлении не имели клинических признаков внутриутробной инфекции, в том числе врожденной пневмонии.

Критерии исключения новорожденных в исследование:

Новорожденные не включались в исследование в случае:

- генетического нарушения гемопоэза;

- синдрома Дауна;

- тяжелых врожденных пороков развития.

Возраст новорожденных, поступивших в отделение реанимации, был представлен следующим образом (табл. 1). Как видно из приведенной таблицы 1, чаще всего дети из основной группы поступали в отделение реанимации в первые 24-72 часов жизни.

Это свидетельствует о том, что эти новорожденные родились в тяжелом состоянии, обусловленном дыхательной недостаточностью и перинатальным поражением центральной нервной системы гипоксического генеза, и нуждались в проведении комплекса реанимационных мероприятий и интенсивной терапии.

Вес поступивших новорожденных детей варьировал в широких пределах (2501 – 4000 грамм) (табл. 2), но не был менее 2500 грамм, что свидетельствовало о соответствии гестационному возрасту.

Новорожденные группы сравнения составили более однородную весовую группу.

Масса тела детей основной группы и группы сравнения сравнения Гестационный возраст новорожденных, поступивших в отделение реанимации и группы сравнения, был представлен следующим образом (табл. 3).

Как видно из таблицы 3, у большинства новорожденных обеих групп гестационный срок составил 39-40 недель. Полученные данные согласуются с исследованиями отечественных и зарубежных клиницистов о развитии мекониальной аспирации, свойственной в основном доношенным детям (Кешишян Е.С., 1996; Романенко В.А., Ерофеев С.А. с соавт., 1998; Шалина Р.И., Курцер М.А. с соавт., 2000; Шалина Р.И., Тищенко Е.П., 2003).

В основной группе и группе сравнения, среди наблюдаемых новорожденных, преобладали мальчики, но существенной разницы в течении заболевания в зависимости от пола выявлено не было (табл. 4).

Пол новорожденных детей основной группы и группы сравнения Особенности бронхолегочной патологии в неонатальном периоде обусловлены, прежде всего, тем, что ни в одном возрастном периоде не отмечается тесная взаимосвязь между формированием заболевания ребенка и состоянием здоровья матери, течением у нее беременности и родов. Острые и хронические соматические и инфекционно-воспалительные заболевания матери, осложненное течение беременности с развитием фетоплацентарной недостаточности нередко являются причиной рождения ребенка в асфиксии, внутриутробного инфицирования и недоношенности (Дементьева Г.М., Рюмина И.И., 2001).

Учитывая данные факторы, нами был проведен анализ этих показателей у матерей новорожденных обеих групп. Распределение матерей по возрасту представлено в таблице 5.

Возрастной состав матерей новорожденных Как видно из табл. 5 возраст матерей колебался в основном от 20 до лет. Возраст женщин, родивших больных детей, был следующий: до 20 лет – 7,03 %, 20–24 лет – 37,19 %, 25-29 лет – 34,24 %, 30 – 40 лет – 21,54 %.

Анализируя результаты исследования можно отметить, что большинство женщин имели благоприятный для родов возраст от 20 до 30 лет.

Первобеременными и первородящими матерями детей основной группы были 143 женщины, повторно беременными – 298. В группе сравнения детей первобеременными и первородящими были 22 женщины, повторно беременными – 16 (табл. 6).

беременности по Как показано в таблицах 7 и 8, на основании анализа оценки по шкале Апгар, новорожденные основной группы родились в тяжелом состоянии.

Новорожденные основной группы с оценкой по шкале Апгар на первой минуте менее 4 баллов рождались в 33,56 % случаев, 4 – 6 баллов - 30,84%, – 8 баллов - 35,60%. Оценка новорожденных группы сравнения по шкале Апгар в 86,84% составила 9 – 10 баллов.

Оценка по шкале Апгар на 5 минуте у новорожденных основной группы в 53,06% составила 7 – 8 баллов, а у новорожденных группы сравнения в 97,37% - 9 – 10 баллов.

Проведенный клинический анализ позволил установить, что у всех новорожденных основной группы имелась клиника респираторной патологии.

Наличие у детей острой дыхательной недостаточности (ОДН) в сочетании с данными прямой ларингоскопии, обнаружившей меконий ниже голосовых связок, позволили врачам реаниматологам поставить диагноз мекониально аспирационный синдром (МАС) у 186 новорожденных (42,2%).

У остальных 255 новорожденных (57,8%), вошедших в исследование, имели место вторичные ателектазы легких, причиной которых в 2% случаев стал геморрагический синдром, а в 98% - перинатальное сочетанное поражение центральной нервной системы (ЦНС).

Согласно критериям стратификации в исследование вошли новорожденные с респираторной патологией (МАС, ателектазы легких) и перинатальным поражением ЦНС, поступившие в отделение реанимации на ИВЛ и не имеющие признаков внутриутробного инфицирования. В процессе терапии течение основного заболевания новорожденных детей осложнялось развитием наиболее грозной бактериальной инфекции - сепсисом (7,48%).

2.2. Методы исследования.

Исследование параметров иммунной системы проводилось на основе патогенетического принципа оценки иммунного статуса, разработанного в 1990 и дополненного в 1997 годах А.Н. Чередеевым и Л.В. Ковальчуком. В основу было положено изучение основных этапов функционирования клеток иммунной системы в процессе развития иммунного ответа, таких как распознавание, активация, пролиферация, дифференцировка и регуляция.

Определяли количественные и функциональные показатели клеточного и гуморального иммунитета, иммунорегуляторного звена, системы фагоцитов, уровня апоптоза. При оценке клеточного звена иммунитета определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и моноцитов периферической крови, уровень экспрессии маркеров активации, молекул адгезии, TLR- рецепторов методом одно- и двухпараметрического фенотипирования, используя комбинации моноклональных антител к дифференцировочным и активационным маркерам фирмы IQProducts (Нидерланды), Caltag (США), Immunotex (Франция), HyCultbiotechnology (Нидерланды): FITC (изотиоцианат флуоресцеина) и PE (фикоэритрин)меченые: CD3+CD19-, CD3-CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+, CD4+CD25+, CD16+CD25+, CD3+CD69+, CD3+CD71+, CD3+НLA-DR+, CD3+CD95+, CD14++, CD14+CD282+, CD14+CD284+, CD3-CD16+56+, CD3+CD16+56+, CD14+CD11b+, CD14+CD11c+, CD14+CD54+, CD14+CD64+, CD14+CD35+, CD14+CD69+, CD14+CD71+, CD14+НLA-DR+, CD14+CD16+, CD16+CD11b+, CD14+CD95+, CD45-FITC/CD14-PE.

Клетки метили анти-CD45 и анти-CD14 мАТ для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов и моноцитов/макрофагов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния. При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-, моноцитарно-макрофагальный гейт включал не менее 93-96% клеток с фенотипом CD45+CD14+. В каждом образце анализировали не менее 104 клеток.

Количество лимфоцитов и моноцитов, вступивших в апоптоз, выявляли с использованием диагностического набора, включающего Аннексин-V+, меченый FITC и пропидиум йодид (PI+), меченый PE (Caltag, США).

использованием лизирующего раствора OptiLise C фирмы Immunotex (Франция) по прилагаемому протоколу.

Результаты учитывали на проточном цитофлюориметре BECKMAN COULTER EPICS XL-II (США), используя стандартные протоколы.

При поступлении у новорожденного забирали 1,5 мл венозной крови в пробирку Vacutainer (BD) с гепарином. К 20 мкл соответствующих моноклональных антител добавляли 100 мкл гепаринизированной крови, перемешивали на шейкере (1000 об/мин) в течении 3 секунд и инкубировали при комнатной температуре 20 минут. Затем добавляли 500 мкл лизирующего раствора Optilyse C и инкубировали до полного лизиса эритроцитов (но не более 2 часов). Далее дважды отмывали в 1 мл РВС (фосфатно-солевой буфер) фирмы Биолот при 1500 об/мин по 3 минуты. К осадку добавляли 1 мл РВС и ресуспендировали. Величину экспрессии мембранных маркеров лимфоцитов и моноцитов крови определяли на проточном цитофлуориметре.

Для оценки апоптоза у новорожденного забирали 1 мл венозной крови в пробирку с гепарином, выделяли мононуклеары (МНПК) на градиенте плотности фикол-верографина, дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Клетки ресуспендировали в связывающем буфере (концентрация 1х106 клеток\мл). Помещали 100 мкл клеточной суспензии в пробирку объемом 5 мл. Добавляли в пробирку 5 мкл аннексина Y – FITC и 10 мкл раствора пропидиума иодида, перемешивали и инкубировали минут при комнатной температуре (20-25 С) в темноте. Затем добавляли в пробирку 400 мкл связывающего буфера. Анализировали на проточном цитометре в течение одного часа.

Для настройки режимов компенсации и установки границ квадрантов использовали следующие контроли: неокрашенные клетки, клетки, окрашенные только Annexin V-FITС (без PI), клетки, окрашенные только PI (без Annexin V-FITС). В образце оценивали показатели прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния клеток, интенсивность флуоресценции Annexin V-FITС (FL1) и PI (FL3). После исключения дебриса (по показателям прямого и бокового светорассеяния) и выделения лимфоцитарного гейта определяли количество AnnexinV+- и PI+-клеток в режиме DotPlot (двумерная гистограмма). Количество апоптотических Annexin +-клеток определяли в нижнем правом квадранте, клетки в позднем апоптозе (AnnexinV+PI+-клетки) оценивали в верхнем правом квадранте гистограммы.