«МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РАЗНЫХ ТИПОВ НЕЙРОНОВ И ИХ СИНАПТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ МАКАКИ И КРЫСЫ ...»

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии

наук

На правах рукописи

Зайцев Алексей Васильевич

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РАЗНЫХ ТИПОВ НЕЙРОНОВ

И ИХ СИНАПТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ

МАКАКИ И КРЫСЫ

03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

чл.-корр. РАН, д.б.н., проф., Магазаник Лев Гиршевич Санкт-Петербург –

СОДЕРЖАНИЕ

Введение Глава 1. Нейрофизиология префронтальной коры и ее функции (литературный обзор) 1.1. Критерии для определения префронтальной коры

1.2. Функции префронтальной коры

1.3. Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян

1.4. Развитие и инволюция префронтальной коры в онтогенезе

1.5. Цитоархитектоника префронтальной коры обезьян

1.6. Афферентные и эфферентные связи префронтальной коры у приматов

1.7. Нейроны префронтальной коры и их основные характеристики

1.8. Заключение по литературному обзору

Глава 2. Методы исследования 2.1. Приготовление переживающих срезов коры мозга макаки и крысы

2.2. Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры

2.3. Гистологические методы и морфологическая реконструкция нейронов

2.4. Статистическая обработка данных

Глава 3. Пирамидные нейроны префронтальной коры обезьяны 3.1. Электрофизиологическая классификация пирамидных клеток на основе многомерного статистического анализа

3.2. Электрофизиологические свойства пирамидных клеток разных классов

3.3. Особенности электрофизиологии пирамидных клеток обезьян

3.4. Функциональная роль пирамидных клеток разных электрофизиологических классов в коре обезьян

Глава 4. Интернейроны префронтальной коры обезьяны 4.1. Морфологические группы интернейронов 2-3 слоев дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки

4.2. Электрофизиологические характеристики интернейронов

4.3. Иммуногистохимические характеристики интернейронов префронтальной коры макаки

4.4. Функциональная роль разных типов интернейронов префронтальной коры макаки Глава 5. Сравнение свойств нейроглиаформных и корзинчатых интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны 5.1. Характеристики нейроглиаформных нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы

корзинчатых нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы

физиологических свойствах нейроглиаформных и корзинчатых клеток крысы и обезьяны

Глава 6. Функциональные особенности возбуждающих синаптических входов у 6.1. Cвойства быстроразряжающихся интернейронов у обезьян и крыс

6.2. Cвойства вызванных ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крыс и обезьян

интернейронов и пирамидных клеток

6.4. Функциональное значение различий в свойствах ВПСП у интернейронов и пирамидных клеток: механизм упреждающего дисинаптического торможения в коре

6.5. Значение различий в организации возбуждающих входов для функционирования префронтальной коры крысы и обезьяны

Глава 7. Особенности взаимодействия быстроразряжающихся интернейронов и быстроразряжающимися интернейронами

7.2. Краткосрочная динамика синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах

7.3. Реципрокные синаптические соединения имеют более высокую эффективность и надежность, чем односторонние

7.4. Пресинаптические потенциалзависимые кальциевые каналы

7.5. Функциональное значение

Глава 8. Особенности долговременной синаптической пластичности пирамидных 8.1. Синаптическая пластичность во 2-3 слоях префронтальной коры, вызванная синхронизирующим протоколом, не подчиняется правилу Хэбба

8.2. Ингибирование кальцийзависимого калиевого тока, обеспечивающего медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливает хэббову пластичность

восстанавливают хэббову пластичность

8.4. Сайт экспрессии синаптической пластичности в префронтальной коре

8.5. Фармакологические свойства пластичности в префронтальной коре

8.6. Функциональное значение

Глава 9. Особенности функционального созревания возбуждающих синапсов 9.1. Плотность шипиков на дендритах пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры макаки значительно уменьшается в возрасте от 15 до 42 месяцев

9.2. Функциональное созревание глутаматергической передачи в префронтальной коре макаки в возрасте от 3 до 84 месяцев: постсинаптические изменения

9.3. Функциональное созревание глутаматергической передачи в коре макаки:

пресинаптические изменения

9.4. Функциональные значение выявленных изменений в работе возбуждающих синапсов префронтальной коры макаки в ходе постнатального развития.................

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Префронтальная кора – важнейший интегративный центр нервной системы. Эта область мозга необходима для организации целенаправленных действий во времени, она обеспечивает удержание в памяти недавних событий (сенсорных стимулов), концентрацию внимания на целевых стимулах и подготовку к выполнению будущих действий.

Важную роль префронтальная кора играет в регуляции эмоций, социальном поведении, контроле вегетативных функций.

Под префронтальной корой в настоящее время понимают участок лобной коры, имеющий наиболее тесные связи с ассоциативным медиодорсальным ядром таламуса и получающим многочисленные дофаминергические проекции от стволовых ядер [1].

Префронтальная кора также имеет тесные двусторонние связи с большинством вторичных и третичных сенсорных и моторных областей коры, восходящие и нисходящие проекции от многих ядер таламуса, покрышки мозга [2], гипоталамуса [3-6], бледного шара [7], амигдалы [5, 8-10], гиппокампа [11], ретикулярной формации среднего мозга [12, 13], черной субстанции среднего мозга [14], мозжечка и ряда других структур.

Префронтальная кора значительно увеличивается в размерах в ходе эволюции млекопитающих, достигая наибольшего размера у приматов. У человека она составляет до 29% от общей поверхности коры. Развитие префронтальной коры в онтогенезе продолжается длительный период, у человека созревание префронтальной коры продолжается до 20-летнего возраста [15-19]. Эти нейробиологические данные хорошо соотносятся с тем, что высшие психические функции, напрямую связанные с работой префронтальной коры, такие как принятие решений, планирование, языковые навыки достигают своего полного развития примерно в этот же возраст [1]. Префронтальная кора задействована в патогенезе многих психических заболеваний, включая шизофрению, депрессию и другие [20, 21].

Исходя из исключительно важной роли префронтальной коры в организации психической деятельности человека и ее вовлеченности в ряде патологий, в настоящее время ведутся интенсивные исследования клеточных нейрофизиологических механизмов осуществления функций префронтальной корой, а также изучается специфический вклад разных типов нейронов. Для понимания механизмов работы префронтальной коры необходимо доскональное изучение свойств структурных элементов коры (нейронов) и особенностей их взаимодействий.

В настоящее время широко распространено предположение, что нейронные сети внутрикорковых модулей у всех видов млекопитающих состоят из сходных структурных элементов и построены по единому каноническому принципу [22, 23]. Межвидовые различия возникают в основном из-за различий в количестве этих модулей и особенностей их внешних связей. Поэтому большинство сведений о нейронной организации коры были получены при работе со срезами коры грызунов, так как этот объект существенно удобнее для изучения.

Однако к настоящему времени накоплено большое количество данных, указывающих, что сами структурные компоненты корковых модулей могут отличаться у различных видов [24поэтому остается дискуссионным вопрос: насколько правомерно использование этих результатов для выяснения функций префронтальной коры приматов? Вместе с тем экспериментальных работ, посвященных изучению свойств нейронов префронтальной коры приматов, в особенности ГАМКергических тормозных интернейронов, крайне мало. Это делает необходимым проведение комплексного изучения нейронов префронтальной коры приматов.

Цель работы. Провести комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки (Macaca fascicularis), выявить основные типы нейронов и дать описание их характеристик, определить свойства их синаптических связей, а также провести сравнение свойств нейронов префронтальной коры крысы и макаки, и тем самым приблизиться к пониманию особенностей механизмов работы префронтальной коры и роли отдельных типов нейронов в осуществлении функций.

Основные задачи исследования.

1. Провести изучение электрофизиологических свойств популяции пирамидных нейронов 2слоев префронтальной коры макаки и выявить основные физиологические классы пирамидных нейронов, используя методы многомерного статистического анализа.

Определить возможную роль разных классов пирамидных нейронов в функционировании префронтальной коры.

2. Изучить и проанализировать морфологические, электрофизиологические и биохимические свойства гетерогенной популяции ГАМКергических тормозных интернейронов 2-3 слоев префронтальной коры макаки и разработать их классификацию;

интернейронов.

3. Провести сравнение электрофизиологических и морфологических свойств сходных типов интернейронов префронтальной коры крысы и макаки и тем самым установить, насколько схожи и насколько различаются гомологичные элементы нейронных сетей у двух видов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.

4. Изучить и сопоставить свойства возбуждающих постсинаптических ответов у разных типов нейронов префронтальной коры крысы и макаки. В частности, исследовать свойства миниатюрных и вызванных постсинаптических возбуждающих ответов, изучить субъединичный состав постсинаптических глутаматных рецепторов. Выявить функциональное значений различий в постсинаптических ответах у разных типов нейронов, их роль в реализации упреждающего дисинаптического торможения.

Исследовать особенности синаптических связей между пирамидными нейронами и тормозными быстроразряжающимися корзинчатыми клетками в префронтальной коре крысы.

5. Выявить специфические особенности формирования долговременной синаптической пластичности у пирамидных клеток префронтальной коры крысы и определить факторы, влияющие на возникновение пластичности. Изучить роль и механизмы действия некоторых нейромодуляторов на синаптическую пластичность.

6. Определить, есть ли связь между массовой элиминацией глутаматергических кортикальных синапсов и их функциональным созреванием в подростковом возрасте у приматов. Для этого исследовать особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток 2-3 слоя префронтальной коры макаки, выявить пресинаптические (вероятность освобождения медиатора) и постсинаптические (соотношение вклада AMPA и NMDA рецепторов, субъединичный состав рецепторов) изменения в ходе онтогенеза.

Научная новизна. На основе статистически репрезентативной серии экспериментов и кластерного анализа результатов впервые выявлено, что пирамидные клетки 2-3 слоев коры приматов по электрофизиологическим свойствам подразделяются на 4 класса:

регулярноразряжающиеся нейроны с низким и высоким входным сопротивлением, залповые низкопороговые нейроны и нейроны с промежуточным паттерном. Эти результаты существенно отличаются от данных, полученных ранее при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к регулярноразряжающимся нейронам.

Впервые проведено комплексное исследование ГАМКергических интернейронов электрофизиологических и биохимических характеристик, на основе чего была разработана классификация интернейронов коры макаки. Впервые обнаружены и охарактеризованы типы интернейронов, не встречающиеся в коре грызунов.

Впервые проведено прямое сравнение свойств интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны, выявлено, что, морфологически сходные интернейроны крысы и обезьяны могут относиться к разным электрофизиологическим типам. Впервые показано, что интернейроны у обезьяны характеризуются большей возбудимостью, чем у крысы.

Впервые всесторонне изучены и сопоставлены возбуждающие постсинаптические ответы пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов префронтальной коры быстроразряжающихся интернейронов характеризуются более быстрой кинетикой, большей амплитудой и при суммации раньше вызывают потенциалы действия, чем у пирамидных клеток. При изучении синаптически связанных пар интернейронов и пирамидных клеток крысы впервые показано, что латеральное торможение в префронтальной коре, реализуемое через быстроразряжающиеся интернейроны, слабее, чем возвратное торможение.

Впервые обнаружено, что в префронтальной коре крысы при использовании синхронизирующих протоколов наблюдается нарушение правила Хэбба о знаке долговременной синаптической пластичности: протоколы с негативной задержкой и позитивной задержкой вызывают долговременную депрессию в отличие от других районов коры. Впервые установлено, что подавление медленной следовой гиперполяризации позволяет восстановить выработку долговременной потенциации при использовании синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Выявлен возможный механизм действия нейромодуляторов на синаптическую пластичность через ингибирование медленной следовой гиперполяризации.

Впервые показано, что функциональное созревание возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макак завершается до подросткового возраста, и что массовая элиминация возбуждающих синапсов в подростковом возрасте происходит через механизмы, не связанные с их функциональной зрелостью.

Теоретическая и практическая значимость работы Проведенное комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки, идентификация основных типов нейронов, описание их характеристик и синаптических свойств позволяет приблизиться к пониманию клеточных механизмов работы префронтальной коры и предсказать роль отдельных типов нейронов в осуществлении функций в норме и при патологиях ЦНС. Использованные в работе методы многомерного статистического анализа позволили выявить фундаментальные закономерности в проявлении электрофизиологических свойств нейронов, полученные результаты прямо свидетельствуют в пользу существования ограниченного количества классов нейронов с определенным набором свойств. Проведенное межвидовое сравнение свойств разных типов интернейронов выявило различие в их электрофизиологических характеристиках, что свидетельствует о различиях в функционировании префронтальной коры представителей грызунов и приматов.

Новые данные об особенностях функционального становления синаптической передачи в онтогенезе, а также синаптической пластичности в префронтальной коре важны для понимания механизмов развития психических функций в норме, также они будут полезны при изучении патогенеза ряда заболеваний ЦНС, связанных с нарушениями в развитии. Важное практическое значение имеют результаты, полученные при изучении субъединичного состава синаптических рецепторов у разных типов нейронов, они позволяют разрабатывать фармакологические подходы с избирательным воздействием на целевые группы нейронов.

Положения, выносимые на защиту 1. Методы многомерного статистического анализа позволяют идентифицировать непересекающиеся группы нейронов коры и выявить наиболее важные критерии для классификации и идентификации типов нейронов.

2. Морфологически сходные интернейроны префронтальной коры крысы и макаки могут различаться по электрофизиологическим свойствам, что свидетельствует о преимущественно функциональных различиях в организации работы префронтальной коры грызунов и приматов.

3. Различия в свойствах синаптических входов у пирамидных клеток и интернейронов имеет важное функциональное значение для обеспечения работы коры.

4. В префронтальной коре крысы, в отличие от других областей коры и гиппокампа, протоколы с синхронизацией пре- и постсинаптической активности независимо от их последовательности вызывают долговременную депрессию синаптической передачи.

5. Функциональное и морфологическое созревание возбуждающих синапсов в префронтально коре приматов происходит в онтогенезе в разное время.

Личный вклад автора. Планирование и выполнение экспериментов, обработка, анализ и подготовка результатов к публикации проводилось лично автором или совместно с сотрудниками Питтсбургского университета (США), университета Тринити-Колледж (Ирландия), ИЭФБ РАН (Россия) Н.В. Повышевой; D.A. Lewis; R. Anwyl, L.S. Krimer; G.

Gonzalez-Burgos; D. Rotary; Л.Г. Магазаником, Д.Б. Тихоновым, К.Х. Ким. Техническую помощь оказывали сотрудники Питтсбургского университета O. Krimer и J. Kosakowski.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Annual Meetings of Society for Neuroscience (Новый Орлеан, 2003; Сан-Диего, 2004; Вашингтон, 2005; Атланта, 2006; Вашингтон, 2008; Чикаго, 2009), FENS Forums of Neuroscience (Амстердам, 2010; Барселона, 2012), WPIC’s Fourth Annual Research Day (Питтсбург, 2004), WPIC’s Sixth Annual Research Day (Питтсбург, 2006), 3rd Annual Neuroscience Ireland Conference (Дублин, 2008), III съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), XIV Международного совещания и VII Школы по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), Восьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Ялта, 2012), II Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2012), XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), FENS Featured Regional Meeting (Прага, 2013).

Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 49 печатных работах, в числе которых 16 статей в журналах, включенных в систему цитирования Web of Science.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 278 страницах и состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, изложенных в 9 главах, заключения, выводов и списка литературы, включающего 590 источников. Диссертация иллюстрирована 116 рисунками и таблицами.

Глава 1. НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ И ЕЕ ФУНКЦИИ

(ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Критерии для определения префронтальной коры Префронтальной корой обычно называют участок коры, расположенный в передней части лобных долей мозга млекопитающих (спереди от моторной и премоторной коры), однако общепринятого определения префронтальной коры не существует. Границы префронтальной коры в зависимости от методологии исследования и используемых критериев определяют поразному:

на основе электрофизиологических данных. Префронтальная кора – это «молчащая»

область лобной коры, при ее электрической стимуляции не наблюдается двигательной активности. Это определение было предложено в конце XIX века, один из авторов шотландский невролог Дэвид Ферриер (цит. по [27]).

на основе цитоархитектонического строения. Префронтальная кора – это гранулярная область лобной коры, в отличие от агранулярной моторной и премоторной областей коры.

Определение было предложено Бродманом в 1909 году [28]. К префронтальной коре были отнесены поля 8-11, 44-47 (в основном расположены дорсолатерально) мозга человека, или поля 8-14, 45, 46 мозга макаки. Так как гранулярная лобная кора выражена только у приматов, то Бродман считал эту область коры присущей только приматам.

на основе таламических проекций. Префронтальная кора – это участок коры, получающий афферентные связи от медиодорсального ядра таламуса [29, 30]. Роуз и Вулси показали, что медиодорсальное ядро присутствует не только у приматов, поэтому корковые области гомологичные префронтальной коре приматов были показаны у кошек, овец и кроликов [31]. Кроме того, они показали, что у приматов проекции от медиодорсального ядра таламуса идут не только к гранулярной лобной коре, но и к агранулярной орбитальной коре. В 1964 году Экерт дополнил теорию Роуза и Вулси, подразделив префронтальную кору на три области в соответствии с иннервацией из трех зон медиодорсального ядра [32].

У приматов орбитальная префронтальная кора получает проекции от медиальной крупноклеточной зоны ядра, дорсолатеральная префронтальная кора, прилежащая к главной борозде (s. principal) – от латеральной мелкоклеточной зоны, а дорсолатеральная префронтальная кора рядом с арочной бороздой (s. arcuate) – от латеральной крупноклеточной мультиформной зоны ядра [32]. Аналогичные 3 зоны префронтальной коры были в дальнейшем найдены в мозге хищных и грызунов [33-35].

на основе дофаминергических афферентных связей со средним мозгом. В 1970-е гг. было обнаружено, что префронтальная кора приматов избирательно получает большое количество входов от дофаминергических ядер среднего мозга [36, 37]. Дивак и соавт.

выявили, что у многих млекопитающих дофаминергические волокна и афференты от медиодорсального ядра таламуса идут к одним и тем же корковым полям [38]. Однако позднее было показано, что дофаминергические проекции от стволовых ядер идут также к первичной моторной коре, премоторной области, передней области поясной извилины [39, на основе функций префронтальной коры. Префронтальная кора обеспечивает разные аспекты принятия решений и избирательного целенаправленного поведения, способность к программированию двигательных задач и способность к сличению результата с исходными намерениями. Хотя эти функции нельзя полностью локализовать в префронтальной коре, именно эта область мозга является организующим центром для этих Использование термина «префронтальная кора» в современной англоязычной литературе считается более предпочтительным по отношению к синонимичным терминам «лобная гранулярная кора» и «лобная ассоциативная кора» [1], так как лобная гранулярная кора, определяемая на основе цитоархитектоники, есть только у приматов, а слово «ассоциативная» имеет в английском языке несколько значений, затрудняющих однозначное понимание термина. В русскоязычной научной литературе обычно используется термин «лобная ассоциативная кора».

1.2. Функции префронтальной коры Первоначально функции префронтальной коры изучались путем ее удаления или перерезкой нервных волокон, идущих к данной области, у экспериментальных животных, а также наблюдением за людьми с соответствующими корковыми повреждениями. Первые же исследования выявили, что префронтальная кора является важнейшим интегративным центром, обеспечивающим перцептивный синтез и целевое поведение [41-44].

Удаление префронтальной коры у обезьян приводит к гиперактивности с повышенной локомоцией [45, 46]. Движения обезьян, однако, не являются спонтанными, а определяются их повышенной реакцией к внешним стимулам. Поэтому данная гиперактивность является скорее гиперреактивностью [1, 47]. У таких обезьян обнаружены также серьезные нарушения внимания и повышенная отвлекаемость на разные стимулы, незатормаживаемый ориентировочный рефлекс [48, 49].

У фронтальных крыс и кошек существенно меняется поведение: они становятся более прожорливыми и агрессивными [50, 51]. Небольшие же повреждения фронтальной коры, как правило, не вызывают увеличения аппетита и повышения агрессии, а, наоборот, ведут к противоположному эффекту [1]. У обезьян с удаленной префронтальной корой серьезно страдает социальное поведение, они становятся менее агрессивны, апатичны, у них теряются такие формы социального поведения, как грумминг, забота о потомстве, они не могут адекватно взаимодействовать с другими животными и, как правило, попадают в изоляцию [52].

Префронтальная кора необходима для организации целенаправленных действий во времени, она обеспечивает удержание в памяти недавних событий (сенсорных стимулов), концентрацию внимания на целевых стимулах и подготовку к выполнению будущих действий.

Так у обезьян с удаленной префронтальной корой или перерезкой путей к ней существенно затрудняется выполнение задач дифференцировки стимулов, если на один из стимулов надо давать двигательный ответ, а на другой нет (задача go/no go). Такие животные не могут подавить двигательную реакцию и дают двигательный ответ на оба стимула [1, 53]. С задачей, когда требуется выбрать один из двух стимулов при их одновременной подаче, фронтальные животные справляются легко, однако переучить их выбирать другой стимул из данной пары затруднительно [47, 54].

У животных с поврежденной префронтальной корой наиболее серьезно страдает выполнение задач, требующих удержания информации в оперативной памяти (working memory task). В тестах такого типа обезьянам показывают, в какой коробочке спрятана еда (стимул), затем закрывают данную область экраном на несколько секунд или минут (задержка), а после этого обезьяне дают возможность выбрать коробочку, где находится еда. Если коробочка выбрана правильно, то обезьяна может съесть еду. Животные с удаленной префронтальной корой очень долго учатся выполнять данные тесты, а время максимальной задержки существенно меньше чем у интактных животных [55-57].

Электрофизиологические исследования в значительной мере дополняют и расширяют представления о функциях префронтальной коры. Так, полевые регистрации и записи с одиночных нейронов подтверждают вовлеченность префронтальной коры в контроль двигательных актов и произвольного внимания, вовлеченность медиальной и орбитальной префронтальной коры в регуляцию эмоций и контроль ряда вегетативных функций [1].

В настоящее время среди различных исполнительных функций дорсолатеральной префронтальной коры, обеспечивающих целенаправленное действие и принятие решений, наиболее изучены нейронные механизмы оперативной памяти [58]. Первые достижения были получены в экспериментах с регистрацией нейронной активности у бодрствующих, свободно двигающихся животных, натренированных на выполнение задач, требующих удержания информации в оперативной памяти [59, 60]. Эти исследования показали, что некоторые нейроны префронтальной коры активизируется в течение периода задержки и, таким образом, являются клеточным коррелятом процесса удержания информации в памяти. Нейроны остаются активными в течение нескольких секунд, обычно до 15-20 секунд [61, 62], такие нейроны были названы клетками памяти.

В опытах, где от обезьян требовалось удерживать в памяти, в какой области зрения находится целевой объект, было обнаружено, что нейроны памяти обладают «полем памяти», то есть разряжаются с максимальной частотой только когда животному надо запомнить положение объекта в определенной небольшой области пространства и снижают частоту разрядов ниже фонового уровня при нахождении объекта в другой области [62].

Предполагается, что в организации «полей памяти» важную роль играют ГАМКергические тормозные интернейроны, а применение блокатора ГАМКА рецепторов бикукуллина приводило к расширению «полей памяти» [63-68] Многие нейроны префронтальной коры генерируют потенциалы действия в течение нескольких этапов выполнения тестов на оперативную память: во время показа стимулов, периода задержки и во время ответа [69]. Поэтому различия, в какой из этапов выполнения теста будет активен нейрон, скорее всего зависят от морфологических особенностей нейронов и их связей с соседними нейронами, как это характерно для сложных нейронов зрительной коры [58]. Например, нейрон, активный в течение нескольких этапов выполнения теста, может иметь тесные связи с несколькими нейронами, которые активируются только в течение отдельных этапов [69].

Клетки памяти могут быть найдены во всех частях префронтальной коры, но особенно распространены в ее латеральных областях. Таким образом, центральный механизм сохранения информации в оперативной памяти состоит в реверберации нервных импульсов в специализированных нейронных сетях. Реверберация нервных импульсов может протекать на нескольких уровнях, как в локальных нейронных сетях префронтальной коры, так и в распределенных нейронных сетях с вовлечением нейронов префронтальной и затылочнотеменной и височной ассоциативной коры [1].

1.3. Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян Согласно одной из гипотез неокортекс млекопитающих возник из двух исходных компонентов, прилегающих соответственно к гиппокампу и пириформной коре. В процессе эволюции эти участки коры сильно разрастаются латерально и кзади и дифференцируются с появлением 6-слойной организации [70, 71]. Префронтальная кора как часть неокортекса также состоит из двух этих исходных компонентов, но кроме этого, филогенетически позднее, уже у приматов префронтальная кора увеличивается за счет дифференциации моторной коры. Таким образом, как было показано [72], префронтальная кора приматов развивается в результате конвергенции трех исходных компонентов: парагиппокампального, парапириформного (цингулярная кора) и части моторной коры.

Префронтальная кора значительно увеличивается в размерах в ходе эволюции, достигая наибольшего размера у приматов (Рис. 1). Это было выявлено как на основе палеонтологических данных, так и методами сравнительной анатомии [73-75]. Наиболее убедительно увеличение размеров префронтальной коры в ряду приматов показал Бродман [28]. Согласно его расчетам на основе цитоархитектонических критериев префронтальная кора у лемура занимает 8.5% площади, 11.5% - у гиббона и макак, 17% - у шимпанзе, 29% - у человека (цит. по [1]).

Рис. 1. Площадь префронтальной коры (выделена) у 6 видов млекопитающих [1].

Проследить филогенетические изменения префронтальной коры, сравнивая лишь ныне живущие виды в отсутствие общего предка [76, 77], очень сложно. Для определения гомологичных структур используются цито- и миелоархитектонические критерии, однако точно обосновать гомологию структур мозга удается не всегда [76, 77]. Морфология лобных долей столь различна у разных видов, что провести гомологию между бороздами и извилинами префронтальной коры можно достаточно условно. Так, s. proreal у хищных считается гомологом прямой борозды (s. rectus) полуобезьян, основной борозды (s. principalis) у макак и части нижней лобной борозды (s. frontalis inferior) у человека и высших обезьян [72].

Само наличие префронтальной коры у грызунов до сих пор остается дискуссионным вопросом, например, в двух обзорах с аналогичным названием «Есть ли префронтальная кора у крыс» [27, 78], авторы приходят к прямо противоположным выводам. Преусс [27] критически анализирует концепцию Роуза, Уилси [31] и Экерта [32] согласно которой префронтальная кора определяется как корковая проекция медиодорсального таламического ядра и рассматривает аргументы в пользу данной гипотезы. Разрушение участков лобной коры крыс не приводило к гибели нейронов в медиодорсальном ядре, как это происходит у хищных и приматов [79]. Однако разрушение медиодорсального ядра позволило проследить ход проекций от этого ядра, используя метод окраски дегенерирующих аксонов с помощью серебряной импрегнации [35, 79]. Леонард описала две основных области дегенерации таламических окончаний в коре: 1) область вдоль и сбоку от s. rhinal и 2) и на медиальной поверхности полушарий спереди от мозолистого тела (Рис. 2). Дальнейшие исследования с использованием авторадиографического метода и пероксидазы хрена подтвердили существование проекций медиодорсального ядра к этим корковым областям [80-84].

Рис. 2. Гомологичные области префронтальной коры у макаки (A) и крысы (Б) (вверху медиальная, внизу латеральная поверхности полушарий) согласно концепции Роуза, Уилси и Экерта. Дорсолатеральная область у макак и ее аналог у крыс заполнена точками, штриховкой показана орбитальная префронтальная кора. С изменениями из [27].

Однако есть ряд моментов, которые не позволяют сделать однозначный вывод в пользу гомологии этих корковых областей у грызунов и приматов. Обе области префронтальной коры крысы не имеют выраженного IV гранулярного слоя, характерного для префронтальной коры приматов. Эти области коры по некоторым характеристикам ближе к аллокортексу (лимбической коре), чем изокортексу. Эти анатомические особенности даже отражены в названии данных областей (например, прелимбическая и инфралимбическая кора).

Также в настоящее время выяснено, что у медиодорсального ядра приматов есть проекции к передней части поясной извилины, а также к некоторым областям премоторной и вторичной моторной коры, височной и теменной коры [78, 85-89]. Таким образом, специфичность взаимосвязей между медиодорсальным ядром и префронтальной корой ставится некоторыми авторами под сомнение, и они предполагают, что области коры, к которым идут проекции от медиодорсального ядра у грызунов, гомологичны не префронтальной коре, а скорее лимбической (поясная извилина) и премоторной коре приматов [27, 90, 91]. Чтобы в какой-то мере разрешить это противоречие Уилингс и Ван Иден [92] предложили относить к префронтальной коре только те корковые области, в которых реципрокные связи с медиодорсальным ядром таламуса выраженнее (больше количество связей и плотность терминалей), чем с другими таламическими ядрами. Однако даже использование количественного анализа пока не дает однозначного ответа [78].

Если вопрос о полной гомологии медиальной фронтальной коры грызунов и префронтальной коры приматов не может быть решен однозначно, то, принимая во внимание, что медиальная фронтальная кора грызунов по своим функциям, в частности, участию в процессах оперативной памяти, очень напоминает префронтальную кору приматов, эту область коры грызунов можно считать аналогом префронтальной коры приматов. В данном исследовании именно медиальная префронтальная кора крысы была использована для сравнения с латеральной префронтальной корой макаки.

1.4. Развитие и инволюция префронтальной коры в онтогенезе Гистогенез и созревание префронтальной коры идет аналогично другим областям коры и включает в себе миграцию нервных клеток, распределение их по слоям и дальнейшую дифференцировку и синаптогенез [73]. У грызунов послойная архитектура префронтальной коры продолжает формироваться после рождения [93], тогда как у человека послойная организация префронтальной коры практически завершается к седьмому месяцу внутриутробного развития [94]. После того, как послойная организация сформирована, начинается рост дендритов [95]. Апикальные дендриты формируются раньше базилярных. У человека дендриты пирамидных нейронов префронтальной коры рудиментарны при рождении, но быстро увеличиваются в размерах в течение первых двух лет жизни, а затем их рост замедляется [96]. Рост дендритов определяется внешними воздействиями, как было показано на крысах [97, 98].

Развитие префронтальной коры продолжается в онтогенезе длительный период. В целом созревание более глубоких слоев (4-6) происходит раньше, чем более поверхностных 2-3 слоев [73]. У человека дифференцировка пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры продолжается в подростковом возрасте [99, 100]. Следует отметить, что именно пирамиды слоя получают основные синаптические входы от других корковых отделов и от них же идут основные потоки к различным областям коры. Таким образом, этот слой наиболее важен для выполнения высших ассоциативных функций [1, 101].

Синаптогенез в префронтальной коре приматов происходит примерно в те же сроки, что и в остальных областях коры [102-104]. Плотность синапсов резко возрастает перед рождением остается наиболее высокой сразу после рождения. Затем часть синапсов элиминируется и количество синапсов стабилизируется к подростковому возрасту. В настоящее время остаются разногласия о том, как протекает элиминация синапсов во времени. Идет ли оно синхронно во всех областях коры мозга [102] или с некоторой задержкой в префронтальной коре [105, 106].

Предполагается, что у человека элиминация синапсов в префронтальной коре может по времени совпадать с манифестацией подростковой шизофрении [107].

Миелинизация волокон в префронтальной коре начинается намного позже, чем в других областях мозга и продолжается долгие годы [108, 109]. Как у человека [110], так и обезьян [111] миелинизация завершается в последнюю очередь во 2 и 3 слоях префронтальной коры.

Хронология миелинизации тесно связана с развитием функций коры.

Современные методы визуализации (магнитно-резонансная томография) также свидетельствуют о том, что созревание лобных долей мозга и в особенности префронтальной коры продолжается у человека до 20 лет или даже дольше [15-19]. Согласно большинству исследований развитие коры сопровождается уменьшением объема серого вещества, что связано с элиминацией избыточных синапсов и нейронов и увеличением доли белого вещества (миелинизацией). Эти нейробиологические данные хорошо соотносятся с тем, что высшие психические функции, напрямую связанные с работой префронтальной коры, такие как, принятие решений, планирование, языковые навыки достигают своего полного развития примерно в этот же возраст [1]. Морфологическое развитие коры сопровождается созреванием нейромедиаторных систем, при этом эти процессы могут не совпадать по времени, например, созревание моноаминергических систем происходит дольше [112-114].

В зрелом возрасте морфологических изменений в коре практически не наблюдается, однако, при старении наблюдается процесс дегенерации коры, сопровождающийся истончением и уменьшением объема серого вещества коры, уменьшением плотности нейронов [115, 116]. У обезьян в дорсолатеральной коре происходит сокращение числа синапсов [117] и уменьшение миелинизации волокон [118]. К 70-80 годам у человека размер, объем и плотность нейронов значимо уменьшаются в префронтальной коре [119, 120]. Изменения в размерах обусловлено уменьшением и исчезновением части дендритного дерева нейронов [120, 121].

Наряду с морфологическими изменениями при старении наблюдаются и изменения биофизических мембранных свойств нейронов [122, 123].

1.5. Цитоархитектоника префронтальной коры обезьян Интерес к морфологии префронтальной коры приматов сохраняется в течение многих десятилетий. Первые полные цитоархитектонические карты коры больших полушарий человека и обезьяны были опубликованы Кэмпбелом и Бродманом соответственно в 1905 год (цит. по [1]). В дальнейшем целым рядом исследователей было проведено детальное изучение цито- и миелоархитектоники коры с уточнением корковых полей [90, 124-131]. Так как префронтальная кора произошла как минимум из двух источников, то можно выделить отдельных тренда (дорсальный и вентральный) в которых прослеживается усложнение цитоархитектоники, с выделением 4 типов корковой организации. Наиболее примитивной является трехслойная кора (аллокортекс), непосредственно к ней примыкает периаллокортекс со слабо дифференцированными слоями. К периаллокортексу примыкает произокортекс с зарождающейся ламинарной организацией. Наиболее эволюционно продвинутой является новая кора (изокортекс) с хорошо выраженной шестислойной организацией [132]. Дорсальный (гиппокампальный) тренд происходит от медиального префронтального аллокортекса и включает в себя медальную и дорсолатеральную префронтальную кору. Вентральный (пириформный) тренд происходит от заднего орбитального аллокортекса и объединяет вентральную и вентролатеральную префронтальную кору.

Латеральная часть префронтальной коры макак (поля 8, 9, 10, 45, 46 и 47 [131, 133], Рис.

3) состоит из 6 хорошо различимых слоев клеток с выраженным внутренним гранулярным слоем (слой IV). Наличие четвертого слоя отличает префронтальную кору от других отделов лобной коры [32, 130, 134]. Этот слой становится толще по мере приближения к фронтальному полюсу, тогда как сама кора становится тоньше. В четвертом слое найдены малые пирамидные клетки, гранулярные клетки, малые клетки Гольджи II типа, обладающих значительным полиморфизмом. Наиболее распространенными являются звездчатые клетки с короткими дендритами, которые разветвляются в непосредственной близости от тела нейрона во всех направлениях, образуя сферическое дендритное дерево. Их аксоны также достаточно короткие, не покидают коры и формируют аксонные сети вокруг соседних пирамидных клеток.

Пирамиды III и V слоев тем больше по размеру, чем ближе они расположены к слою IV.

Пирамидные клетки увеличиваются в размере и при приближении к задней границе префронтальной области [1].

Префронтальная кора медиальной и орбитальной областей состоит из многочисленных цитоархитектонически различных областей [135, 136] (Рис. 3). Большинство этих полей, за исключением самой передней орбитальной области, не имеют 6-слойного строения. Их можно отнести к «агранулярной» или «дисгранулярной» коре. В этих полях хорошо выражены V и VI слои и практически отсутствует слой IV.

Рис. 3. Цитоархитектонические поля префронтальной коры (медиальная, дорсолатеральная и орбитальная поверхности). Приводится по [131].

Вертикальная организация префронтальной коры до сих пор остается малоизученной.

Аналогично сенсорным областям в префронтальной коре можно выделить идущие через определенные промежутки вертикально ориентированные ряды кортико-кортикальных волокон и таламических афферентов [137-139]. Кроме того в префронтальной коре апикальные дендриты пирамидных клеток VI слоя формируют характерные пучки [140].

1.6. Афферентные и эфферентные связи префронтальной коры у приматов Для понимания функций префронтальной коры необходимо знание афферентных и эфферентных связей этой области мозга с другими отделами. Использование современных методов с применением антероградных и ретроградных гистохимических трейсеров (авторадиографический метод, использование биотинизированных аминодекстранов, пероксидазы хрена, холеротоксина, некоторых флуоресцентных красителей, нейротропных вирусов (PRV, вирус герпеса)) позволило выявить огромное количество связей между префронтальной корой и другими областями мозга, которые в наибольшей степени выражены у приматов. Основные подкорковые афференты идут к префронтальной коре от медиодорсального ядра таламуса [32, 85, 87, 89, 141, 142]. Таламические проекции организованы топографически, хотя некоторые детали этой организации до сих пор не ясны [143].

У приматов медиодорсальное ядро состоит из двух цитоархитектонически различных частей: медиальная часть («магноцеллюлярная») состоит из клеток большого размера, тогда как латеральная часть («парвоцеллюлярная») содержит клетки малого размера [144, 145].

Магноцеллюлярная часть ядра проецируется в основном к орбитальной и медальной префронтальной коре (развивающейся раньше в онто- и филогенезе), тогда как парвоцеллюлярная часть проецируется к филогенетически более новой дорсолатеральной коре [32, 85, 87, 141]. Наиболее латеральная часть ядра, расположенная между мелкоклеточной частью и внутренней капсулой, проецируется к глазодвигательной зоне коры (8 область по Бродману) [32, 146], тем не менее все части медиодорсального ядра проецируются ко всем областям префронтальной коры в той или иной степени [147].

Кроме медиодорсального ядра к префронтальной коре идут проекции от вентрального переднего ядра, ростральных интраламинарных ядер таламуса, ядра подушки [10, 85, 87, 148], большинство этих проекций организованы топографически [87]. Несмотря на разнообразие таламических входов к префронтальной коре, большинство (80%) таламических нейронов, проецирующихся к префронтальной коре, расположены в медиодорсальном ядре [85]. Через медиодорсальное ядро таламуса префронтальная кора получает входы от многих подкорковых структур, при этом разные части медиодорсального ядра могут получать входы от разных структур. К настоящему времени описаны афференты от ретикулярной формации среднего мозга [12, 13], черной субстанции среднего мозга [14], от амигдалы [142, 149, 150], препириформной и нижней височной коры [142] Некоторые подкорковые и лимбические входы могут идти к префронтальной коре напрямую, минуя таламические ядра. Найдены прямые входы в кору от покрышки мозга [2], гипоталамуса [3-6], бледного шара [7], амигдалы [5, 8-10], гиппокампа [11]. Проекции от гиппокампа, амигдалы и других отделов лимбической системы идут в основном к медиальной и орбитальной областям префронтальной коры [4, 10, 151]. Поле 46 префронтальной коры получает входы от коры мозжечка [152] и вентральной части зубчатого ядра мозжечка [153].

Другие проекции от мозжечка к префронтальной коре идут через базальные ганглии и латеральные ядра таламуса [154]. Эти связи играют важнейшую роль во временной организации моторных действий. Также префронтальная кора получает регуляторные входы от базального крупноклеточного ядра Мейнерта, голубого пятна, вентральной покрышечной области, ядер шва – основных центров холинергической, норадренергической, дофаминергической и серотонинергической систем. Все эти ядра иннервируют в той или иной степени латеральную, медиальную и орбитальную области префронтальной коры [155-158].

Таким образом, префронтальная кора прямо или через таламические ядра получает входы от большинства отделов ЦНС. Входы от гиппокампа могут быть критичны для обеспечения моторной памяти и активации памяти, входы от черной субстанции и некоторых нижележащих мозговых центров - для выполнения движений. Входы от среднего мозга, гипоталамуса, миндалины могут быть связаны организацией потребностей и мотивации.

Входы от мозжечка – с координацией движений.

Области префронтальной коры тесно связаны между собой и с другими корковыми областями. Организация связей внутри префронтальной коры хорошо согласуется с концепцией о ее происхождении из двух источников [132]. Связи внутри префронтальной коры организованы таким образом, что обеспечивают последовательное взаимодействие менее дифференцированных областей с более высокоорганизованными внутри каждого эволюционного тренда [147]. Предположительно такая организация обеспечивает пошаговую интеграцию между слабо дифференцированными медиальными и орбитальными областями и высоко дифференцированными латеральными областями [132].

Показано, что к префронтальной коре обезьян сходятся корково-корковые пути, которые начинаются в первичных соматосенсорных, слуховых, зрительных, обонятельных и вкусовых областях коры. Однако следует отметить, что к префронтальной коре практически не поступают прямые афференты от первичных сенсорных и моторных корковых областей, тогда как иннервация от вторичных и ассоциативных сенсорных и моторных областей очень существенна [159]. Количество синаптических передач по ходу каждого сенсорного пути к префронтальной коре и их значение до сих пор является предметом разногласий. Однако несомненно, что каждый уровень обеспечивает обработку того или иного аспекта сенсорной информации. Корковые сенсорные пути следуют относительно независимо друг от друга, пока они не достигнут префронтальной коры. Таким образом, префронтальная кора является важнейшим ассоциативным центром [1].

Дихотомический принцип организации префронтальной коры прослеживается и по организации проводящих путей, которые идут как к дорсальному, так и вентральному трендам префронтальной коры Другой важной особенностью является соблюдение топологического принципа в организации ассоциативных путей. Так, каждый проводящий пучок обеспечивает достаточно точное топологическое соответствие между сенсорными ассоциативными зонами и префронтальной корой. Например, между полем 7 и префронтальной корой [160, 161].

Эфферентные связи [162] префронтальной коры практически полностью совпадают с афферентными, поэтому большинство описанных выше путей являются реципрокными. Есть, однако, исключение из этого правила. Например, от префронтальной коры идут эфференты к базальным ганглиям, от которых они не получают прямой афферентации.

медиодорсальному ядру таламуса [144, 163-166], однако также описаны проекции к вентральному и интраламинарному ядрам таламуса [167, 168]. От вентральной (орбитальной) области префронтальной коры идут проекции к гипоталамусу, перегородке, среднему мозгу и мосту [141, 169-171]. Описаны многочисленные проекции от префронтальной коры к структурам лимбической системы, включая миндалину [172-174] и лимбическую кору [137, 175, 176]. Такие прямые реципрокные связи между префронтальной корой и миндалиной, медиальной корой височной доли вероятно обеспечивают запоминание новой информации [174] или воспоминание старой [10].

Подобно другим областям лобной доли коры, префронтальная кора посылает большое количество эфферентных волокон к базальным ганглиям: хвостатому ядру и скорлупе [10, 35, 137, 177, 178]. Эфференты от префронтальной коры идут также к бледному шару [167, 168, 172, 179], ограде [167, 180], черной субстанции [172, 173, 179]. Через ядра моста префронтальная кора посылает эфференты к мозжечку.

В настоящее время показано, что три корковых области: дорсолатеральная префронтальная кора, премоторная и двигательная кора вовлечены в контроль движений.

Анализ кортико-кортикальных связей в лобной доле, показывает, что от префронтальной коры начинается эфферентный каскад идущий к премоторной коре и дополнительной моторной коре (поле 6), а оттуда к первичной моторной коре (поле 4). Этот реципрокный каскад моторных связей топологически организован и достаточно хорошо изучен [175, 181-183]. При этом каждая корковая область образует относительно независимые связи с подкорковыми структурами и таким образом представляет собой субстрат для трехстадийного иерархического управления движениями. На самом высоком уровне префронтальная кора отвечает за организацию наиболее глобальных и абстрактных аспектов поведения, тогда как на уровне моторной коры идет регуляция элементарных аспектов двигательного акта [184, 185].

Таким образом, префронтальная кора получает и отдает огромное количество афферентных и эфферентных проекций от структур среднего и промежуточного мозга, лимбической системы. Префронтальная кора тесно связана с различными областями новой коры. Большинство связей префронтальной коры являются реципрокными за исключением связей с базальными ганглиями и некоторыми ядрами моста, к которым идут только эфференты от коры. Также следует отметить, что разные области коры имеют разный набор реципрокных связей, что явно выражено в мозге приматов. Орбитальная и медиальная префронтальная кора наиболее тесно связана с медиальным таламусом, гипоталамусом, миндалиной, лимбической и медиальной височной корой, включая гиппокамп. Этот комплекс тесно связанных структур представляет собой филогенетически старый, рано развивающийся в онтогенезе анатомический субстрат обеспечивающий эмоциональное, инстинктивное поведение. Латеральная кора в первую очередь связана с латеральными таламическими ядрами, дорсальной частью хвостатого ядра и неокортексом. Это эволюционно наиболее молодая система обеспечивает когнитивные функции и произвольное поведение [1].

1.7. Нейроны префронтальной коры и их основные характеристики Префронтальная кора в настоящее время привлекает внимание многих исследователей, однако на клеточном уровне эта область мозга гораздо менее изучена, чем гиппокамп или сенсорные зоны коры. Предполагается, что нейроны, образующие нейронные сети в разных зонах коры, в целом похожи, поэтому в данном обзоре используются данные, полученные в разных областях новой коры млекопитающих.

В настоящее время общепринятым является разделение всех нейронов коры на две большие группы [186]. Первая группа состоит из многочисленных, но относительно схожих по своим свойствам пирамидных нейронов, или главных клеток коры (principle cells). Каждая пирамидная клетка имеет ветвистые и густо покрытые шипиками апикальный и несколько базальных дендритов, получающих синаптические входы от нейронов коры и таламуса. В свою очередь аксоны пирамидных клеток идут как к клеткам коры, так и таламуса. Медиатором пирамидных нейронов является глутамат, поэтому эти нейроны обеспечивают передачу возбуждения в коре и от коры к таламусу [186].

Клеток второй группы в коре существенно меньше (20-30%), но они разнообразнее по морфологии, электрофизиологическим свойствам и содержанию биохимических маркеров [186-193]. Аксоны этих клеток обычно не выходят за пределы коры, и поэтому их называют интернейронами. Большинство интернейронов содержит ГАМК в качестве основного медиатора, и, соответственно, является тормозными клетками коры. Для ГАМКергических интернейронов характерны маловетвящиеся дендриты с незначительным количеством шипиков; приходящие возбуждающие синаптические контакты могут оканчиваться не только на их дендритах, но и прямо на теле интернейронов, что нетипично для пирамидных клеток.

Пирамидные клетки коры.

Пирамидные клетки коры в основном изучались в сенсорных и моторных областях коры [194-196], тогда как данные по префронтальной коре в литературе немногочисленны [197]. В настоящее время выявлено, что пирамидные клетки 6-го слоя в соматосенсорной коре подразделяются на 3 основных группы: два класса кортико-таламических пирамидных клеток и кортико-кортикальные пирамидные клетки. Первый класс кортико-таламических (вентропостериомедиальному ядру для соматосенсорной коры), второй класс кортикоталамических клеток - к ретикулярному ядру таламуса. Оба класса кортико-таламических пирамидных клеток, как правило, имеют хорошо выраженный апикальный отросток с многочисленными разветвлениями, аксонные разветвления обычно не поднимаются выше 4го слоя. У этих клеток аксоны не образуют длинных горизонтально идущих коллатералей. У кортико-кортикальных пирамидных нейронов апикальные дендриты обычно заканчиваются в глубоких слоях, а аксоны распространяются по горизонтали на большие расстояния [197].

Электрофизиологические исследования показали, что кортико-кортикальные пирамидные клетки характеризуются очень быстрой частотной адаптацией и в ответ на деполяризующий ток отвечают только 2-3 спайками. Кортико-таламические пирамидные клетки продолжают отвечать в течение всего действия деполяризующего тока, хотя частота потенциалов действия уменьшается. Кортико-кортикальные клетки в основном синаптически соединены с другими пирамидными клетками 5-6 слоев, их синаптические ответы характеризуются выраженной депрессией [198]. Вероятность нахождения синаптических связей с другими нейронами коры для кортико-таламических пирамидных клеток в 4 раза ниже, чем для кортико-кортикальных клеток, а амплитуда ВПСП меньше. Кортикоталамические пирамиды контактируют как с другими пирамидами, так и с интернейронами, для их постсинаптических ответов характерна фасилитация [199].

Пирамидные клетки 5 слоя проецируются как к другим клеткам коры, так и ряду неспецифические ядра таламуса, ядра четверохолмия, моста и спинного мозга.

Электрофизиологически пирамидные клетки 5 слоя подразделяют на два основных типа:

залповые нейроны (intrinsically burst firing) и регулярноразряжающиеся нейроны (regular spiking, RS) [200]. Залповые пирамидные нейроны разряжаются короткими высокочастотными пачками потенциалов действия. Обычно это крупные клетки с длинными апикальными дендритами [201, 202], аксоны этих клеток идут к четверохолмию или мосту [203].

одиночными потенциалами действия, частота которых в ходе ответа уменьшается [204]. Как правило, это небольшие клетки с короткими апикальными дендритами, их аксоны идут к корковым областям другого полушария, а так же к соседним пирамидным клеткам. Показано, что близкорасположенные пирамидные клетки 5-го слоя соматосенсорной коры молодых крыс образуют синаптические связи с вероятностью 10% [205]. Залповые пирамидные клетки 5-го слоя получают множество возбуждающих входов от пирамидных клеток 3-го слоя, тогда как небольшие регулярноразряжающиеся пирамиды практически не имеют синаптических входов от пирамид 3-го слоя [206].

Пирамидные нейроны 2-3 слоев коры в основном синаптически связаны с пирамидными нейронами 3-го слоя противоположного полушария [207]. В сенсорных областях к их базальным дендритам идут входы от соответствующих сенсорных ядер таламуса [208]. Аксоны пирамидных клеток 3-го слоя ветвятся во 2-3 слоях, а также спускаются к 5 слою, где также могут интенсивно ветвиться, в 4 слое аксоны практически не образуют разветвлений [209-211].

Электрофизиологически пирамидные клетки 3 слоя у грызунов довольно однородны и относятся к регулярноразряжающимся нейронам [212-215].

Интернейроны коры ГАМКергические интернейроны коры чрезвычайно разнообразны, однако большинство исследователей убеждено, что интернейроны можно разделить на отдельные классы, которые специализируются на выполнении той или иной функции в нейронных сетях [216, 217]. В идеале интернейроны одного класса должны быть сходны по своим морфологическим, электрофизиологическим, молекулярным и функциональным свойствам, однако в реальности интернейроны внутри одного класса могут существенно различаться по ряду признаков. Тем не менее, различия между классами будут более выраженными, чем внутри одного и того же класса [218]. На основе каких критериев следует выделять классы интернейронов является предметом многолетних дебатов. Эти критерии выбирались различными исследователями во многом произвольно, поэтому сравнение результатов, полученных в разных лабораториях часто затруднено. В 2008 году в родном городке Кахаля Петилья-де-Арагон (Испания) была проведена специальная конференция по выработке единых подходов к классификации интернейронов [218]. Согласно рекомендациям Петилья конференции описание любого класса интернейронов должно строится с учетом изучения их морфологических, молекулярных и электрофизиологических свойств (Таблица 1).

Таблица Основные характеристики, используемые для описания свойств интернейронов коры Критерии Основные характеристики Морфологический Тело (форма, размер, ориентация и др.) Аксоны (траектория и особенности ветвления, форма терминальных окончаний, форма синаптических бутонов, синаптические цели) Синапсы (электрические и химические, расположение и распределение) Биохимический Транскрипционные факторы Структурные белки, поверхностные маркеры, коннексины Транспортеры (мембранные, везикулярные) Физиологический Подпороговые мембранные свойства (потенциал покоя, постоянная времени мембраны, входное сопротивление, осцилляции и резонансные Свойства потенциала действия (амплитуда, порог, полуширина, следовые потенциалы, изменение формы в ходе пачечного ответа) Характеристики ответов на длительную деполяризацию (начальный ответ и ответ после адаптации, частотные характеристики) Постсинаптические ответы (спонтанные и вызванные, соотношение рецепторов разных типов, пространственная и временная суммация) Морфологические критерии Исторически, первые классификации интернейронов были сделаны исключительно на основе морфологических свойств при изучении препаратов мозга, окрашенных по методу Гольджи. Кахаль первым описал в коре классы интернейронов известные сейчас как нейроглиаформные клетки, клетки с двойным букетом, клетки Мартинотти [193]. Позднее Лоренцо де Но описал более десятка различных типов интернейронов в соматосенсорной коре мыши [219]. В дальнейшем многочисленные классы интернейронов были описаны в различных отделах коры у разных видов млекопитающих, при этом названия разных классов интернейронов, описанных в разных лабораториях, часто не совпадают [188, 220]. Появление методов, позволяющих окрасить отдельные нейроны путем внутриклеточного введения красителя, сделало возможным получение более детальных реконструкций нейронов. В настоящее время на сайте http://neuromorpho.org ведется работа по созданию банка трехмерных морфологических реконструкций нейронов, уже сейчас он включает сотни примеров корковых интернейронов [221].

Так как выделение классов интернейронов исходило из идеи, что разные интернейроны выполняют различные функции в коре, то практически сразу же стало ясно, что при классификации следует в первую очередь учитывать особенности ветвления аксона, горизонтальное и вертикальное распространение его коллатералей. Именно это определяет, какие клетки и какие их участки будет иннервировать данный интернейрон, а соответственно насколько эффективным будет оказываемое им торможение [218]. Так, коллатерали аксона у интернейронов из некоторых классов расположены весьма компактно и практически не выходят за пределы слоя и колонки, в котором располагается тело (например, это клеткиканделябры, нейроглиаформные клетки) и, таким образом, обеспечивают торможение только соседних с ними клеток. У других интернейронов коллатерали аксона идут в основном вертикально и проходят через все слои своей корковой колонки, но практически не заходят в соседние колонки (например, клетки с двойным букетом), или идут к первому слою коры и формируют там густое сплетение, распространяющееся на довольно большое расстояние, как у клеток Мартинотти. У многих корзинчатых интернейронов аксон находится в основном в том же слое, что и тело, при этом коллатерали могут идти горизонтально на большие расстояния, обеспечивая латеральное торможение соседних колонок [222]. Кроме этого описаны некоторые ГАМКергические нейроны, аксоны которых покидают кору и, таким образом, формально не могут считаться интернейронами [223].

Методом электронной микроскопии было выявлено, что разные интернейроны образуют синаптические контакты лишь с определенными частями постсинаптических клеток Некоторые классы интернейронов формируют синаптические контакты [186].

преимущественно на телах и проксимальных дендритах пирамидных клеток (корзинчатые интернейроны), другие на различных частях дендритов пирамидных клеток (клетки с двойным букетом, нейроглиаформные клетки), либо в основном на дистальных участках апикальных дендритов пирамидных клеток (клетки Мартинотти), на начальном сегменте аксона пирамидных клеток (клетки-канделябры), или на других интернейронах (некоторые вертикальноориентированные интернейроны) [190, 191].

Форма тела и дендритов гораздо реже используются для классификации интернейронов, так как могут быть очень похожи у представителей разных классов. В то же время, у интернейронов, относящихся к одному морфологическому классу, форма тела и дендритов могут различаться: например, есть корзинчатые клетки с мультиполярным телом и радиально расходящимися дендритами и интернейроны этот же класса с овоидным телом и вертикально идущими пучками дендритов. На основе дендро-соматической морфологии могут быть успешно опознаны только нейроглиаформные нейроны, для которых характерны сферическая форма тела с многочисленными (обычно более 10) тонкими, радиально расходящимися, слабо ветвящимися изогнутыми дендритами [26].

Молекулярные критерии Интернейроны содержат на своей мембране многочисленные ионотропные и метаботропные рецепторы, в их цитоплазме обнаружены различные кальцийсвязывающие белки, кроме того часть интернейронов в дополнение к основному медиатору ГАМК синтезирует нейромодуляторные пептиды (соматостатин, ВИП, холецистокинин, нейропептид Y и др.). Некоторые маркеры часто находятся в одном нейроне совместно, например, соматостатин и кальбиндин, ВИП и кальретинин, тогда как другие белки обычно не встречаются попарно: например, парвальбумин и соматостатин. По особенностям экспрессии молекулярных маркеров интернейроны можно разделить на несколько непересекающихся популяций. Например, почти все интернейроны соматосенсорной коры мыши подразделяются на 3 группы: парвальбумин-, соматостатин-положительные нейроны и интернейроны, экспрессирующие ионотропный серотониновый рецептор 5HT3a [224]. Интернейроны зрительной коры крысы делятся на три группы: содержащие парвальбумин, кальретинин или соматостатин. В префронтальной коре обезьян выявлены три непересекающиеся группы интернейронов, экспрессирующих соответственно один из кальцийсвязывающих белков парвальбумин, кальретинин или кальбиндин [225]. Однако молекулярные критерии, хорошо работающие у одного вида животных, могут не работать у другого вида, либо в другом отделе коры. Так, в коре крыс, в отличие от обезьян, в некоторых интернейронах парвальбумин и кальбиндин, либо кальретинин и кальбиндин могут экспрессироваться совместно [190, 226В настоящее время установлено, что разные морфологические классы интернейронов, как правило, содержат специфические для них маркеры, хотя обнаружено очень большое количество исключений [191]. У разных видов животных парвальбумин обычно выявляют в корзинчатых интернейронах и клетках-канделябров [190, 229, 230], однако есть корзинчатые клетки, содержащие холецистокинин вместо парвальбумина [228, 231], а у беличьих обезьян (саймири) описаны 2 субпопуляции клеток-канделябров, содержащих соответственно парвальбумин или кортикотропин-рилизинг-фактор [232]. Соматостатин чаще всего встречается у клеток Мартинотти [222, 231, 233], а кальретинин может быть найден у разных типов нейронов с вертикально идущими аксонами [188, 190, 191, 234, 235].

Недавние исследования выявили значимые корреляции между экспрессией генов для ряда ионных каналов, биохимических маркеров и электрофизиологическими взаимоотношений показал, что существует всего 3 основных типа коэкспрессии генов ионных каналов в интернейронах коры, каждый из которых связан с одним из кальцийсвязывающих белков (парвальбумином, кальретинином или кальбиндином). Как правило, парвальбуминсодержащие интернейроны отвечают на деполяризацию частыми и очень короткими по длительности потенциалами действия без существенной частотной адаптации (быстроразряжающиеся (fast-spiking) нейроны), тогда как нейроны, содержащие другие маркеры, при сходной деполяризации отвечают с меньшей частотой разрядов, которая уменьшается в ходе ответа [235].

биохимические маркеры получила бурное развитие в последние годы. Методы генной инженерии позволяют создавать линии мышей, у которых экспрессия того или иного биохимического маркера сопровождается экспрессией флуоресцентного белка, что позволяет исследователям легко идентифицировать нужный интернейрон в срезе и, следовательно, эффективнее изучать его электрофизиологические свойства и синаптические связи. В году были опубликованы первые результаты такого рода на линии мышей GIN (GFP-expressing Inhibitory Neurons), у которой соматостатин-позитивные интернейроны коры и гиппокампа экспрессировали зеленый флуоресцентный белок [238], после этого была создана линия мышей (EGFP) с флуоресцентными парвальбумин-положительными нейронами [239], а затем линия мышей (GAD67-GFP) у которых все ГАМКергические нейроны содержали зеленый флуоресцентный белок [240]. К настоящему времени проведено систематическое изучение генетических маркеров у различных групп интернейронов и создано более 20 различных линий мышей на основе Cre driver, у которых избирательной флуоресценцией обладают практически все известные классы интернейронов мыши [241]. Однако и данный подход не решает полностью проблему пересекающихся классов, так как интернейроны могут экспрессировать одновременно несколько маркеров.

Нельзя не отметить, что избирательная экспрессия тех или иных маркеров у определенных классов интернейронов может быть использована для селективного воздействия на эти интернейроны. Этот подход получил очень широкое развитие с момента открытия двух светозависимых, ион-проницаемых бактериальных опсинов, которые можно с помощью лентавирусов экспрессировать в определенных классах интернейронов [242]. Каналородопсин 2 (ChR2) является катионным каналом, активирующимся при действии синего света. При экспрессии ChR2 на мембране нейрона освещение синим светов ведет к быстрой деполяризации нейрона и возникновению потенциала действия. Другой бактериальный опсин, галородопсин (NpHR) является хлорным каналом, который активируется при освещении желтым светом, что приводит к гиперполяризации мембранного потенциала нейронов. Таким образом, воздействуя светом с разной длиной волны можно активировать или ингибировать определенные популяции интернейронов.

Электрофизиологические критерии Электрофизиологические свойства нейронов обычно изучают, используя метод пэтчклампа в конфигурации целая клетка. На нейрон подают ступени гипер- и деполяризующего тока и регистрируют изменения мембранного потенциала. В ответ на деполяризующий ток, превышающий пороговое значение, клетки генерируют потенциалы действия. Первоначально все интернейроны относили к быстроразряжающимся клеткам в отличие от пирамидных клеток, относящихся к регулярноразряжающимся (regular-spiking) и залповым (burst-spiking) нейронам [243]. Быстроразряжающиеся интернейроны уже при пороговых значениях тока отвечают пачками спайков с частотой от 10-20 Гц, тогда как регулярноразряжающиеся нейроны на пороговую деполяризацию отвечают обычно одиночными потенциалами действия.

Залповые нейроны на пороговую стимуляцию отвечают 2-5 спайками высокой частоты (порядка 100 Гц) за которыми могут следовать одиночные потенциалы действия, очень напоминающие ответы регулярноразряжающихся нейронов.

Частота потенциалов действия возрастает при увеличении силы тока, однако у быстроразряжающихся нейронов частота спайков нарастает быстрее, чем у регулярноразряжающихся. Частота спайков в залпе незначительно меняется при увеличении силы тока, зато частота последующих одиночных спайков у залповых нейронов нарастает аналогично регулярноразряжающимся нейронам. Другое важное отличие между паттернами ответов нейронов - наличие частотной адаптации: у регулярноразряжающихся клеток частота спайков максимальна в самом начале ответа, а затем уменьшается, выходя на плато с более низкой частотой. Частотная адаптация может развиваться очень быстро в течение 100 мс (быстроадаптирующиеся нейроны), либо в течение более длительного времени 200-500 мс (медленноадаптирующиеся нейроны) [222]. У быстроразряжающихся нейронов частота спайков остается практически неизменной, поэтому их часто называют неадаптирующимися нейронами.

Очень скоро было выявлено, что интернейроны не являются однородной группой, а весьма разнообразны по своим спайковым ответам. Были описаны регулярноразряжающиеся интернейроны (regular-spiking non-pyramidal cell) и залповые интернейроны (burst-spiking nonpyramidal), напоминающие по своим характеристикам соответствующие типы пирамидных клеток [190, 244, 245]. Важной особенностью залповых интернейронов было то, что их спайки генерируются при более низких значениях мембранного потенциала, чем у других классов интернейронов, поэтому они также известны как низкопороговые (low-threshold-spiking) интернейроны. Также были описаны интернейроны с задержанным спайковым ответом на пороговую деполяризацию, или поздноразряжающиеся нейроны (late-spiking cell). Некоторые авторы в отдельную группу выделяют интернейроны с нерегулярным спайковым паттерном (irregular-spiking), такие интернейроны в начале ответа часто дают залп спайков высокой частоты за которым следуют отдельные потенциалы действия через неравные промежутки времени [187, 246].

Наряду с данной классификацией существует альтернативная схема описания электрофизиологических свойств интернейронов [189, 191], которая в настоящее время используется реже, но рекомендована к использованию Петилья конференцией [218]. Согласно этой схеме необходимо отдельно описывать начальный ответ (onset response) нейрона на деполяризацию и его поведение в ходе продолжительной деполяризации (steady-state response).

Начальный ответ может быть залповым (bursts), задержанным (delays) или обычным (classical или continuous). Спайковый паттерн в ходе продолжительной деполяризации может быть неадаптирующимся по частоте (non-accommodating), адаптирующимся (accommodating);

прерывистым (stuttering) и нерегулярным (irregular). Благодаря комбинациям этих ответов можно выделить до 15 электрофизиологических подклассов интернейронов [191].

Для количественного описания свойств интернейронов часто также используют характеристики отдельных потенциалов действия и ответы нейронов на подпороговую электрофизиологических характеристик требует специальных многомерных методов статистического анализа для выделения классов нейронов. Одним из наиболее широко используемых методов стало применение кластерного анализа с построением дендрограмм [234, 247-249], а также методов факторного и дискриминантного анализа [222, 250]. Как правило, многомерные статистические методы позволяют достоверно различить интернейроны и пирамидные клетки, а среди интернейронов выделить два непересекающихся электрофизиологических класса [247, 250]. К первому классу относятся быстроразряжающиеся характеризуются очень короткими по длительности потенциалами действия и большой по амплитуде быстрой следовой гиперполяризацией (fast afterhyperpolarization). Второй класс составляют адаптирующиеся интернейроны (adapting), у них длительность потенциалов действия несколько выше, а быстрая следовая гиперполяризация меньше по амплитуде. У интернейронов этого класса частота спайков уменьшается в ходе ответа, кроме того, они быстроразряжающиеся интернейроны. Адаптирующиеся интернейроны представляют собой неоднородную группу и могут быть подразделены на ряд подклассов, напоминающих регулярноразряжающиеся, залповые и нерегулярные интернейроны [250].

Важным классификационным критерием служат свойства возбуждающих и тормозных постсинаптических ответов интернейронов. Разные классы ГАМКергических нейронов различаются как по соотношению подтипов постсинаптических рецепторов, так и по кинетике самих ответов [218]. Кратковременная синаптическая динамика также различается у разных классов нейронов, например, повторная стимуляция возбуждающих входов парвальбуминпозитивных быстроразряжающихся интернейронов ведет к депрессии ВПСП, тогда аналогичная стимуляция соматостатин-содержащих низкопороговых интернейронов вызывает нейромодуляторов, таких как норадреналин, серотонин, ацетилхолин, эндоканнабиноиды, показано, что они оказывают избирательное воздействие на разные классы интернейронов [252-255].

Таким образом, в настоящее время при классификации интернейронов учитывается целый комплекс критериев. Такой подход позволил успешно выделить несколько больших достаточно четко ограниченных классов интернейронов у грызунов. В этих классах интернейронов наблюдается соответствие друг другу всех критериев. Однако данный подход практически не применялся при изучении интернейронов коры приматов. Как правило, классификации ГАМКергических клеток префронтальной коры приматов проводились только на основе морфологических критериев и ряда молекулярных маркеров [188, 220, 256-258], тогда как систематического электрофизиологического изучения нейронов до настоящего времени не проводилось.

1.8. Заключение по литературному обзору Префронтальная кора играет исключительно важную роль в организации психической деятельности человека, а нарушения ее нормального функционирования связывают с рядом таких тяжелых заболеваний, как шизофрения, депрессия и другие. Поэтому исследование механизмов работы префронтальной коры является одной из приоритетных задач современной нейрофизиологии. В настоящее время изучение функций префронтальной коры производится во многих лабораториях мира с использованием широкого арсенала методов. На наш взгляд, одним из перспективных подходов является изучение клеточных механизмов работы префронтальной коры, для чего требуется детальное знание характеристик и свойств разнообразных нейронов коры, а также особенностей их синаптических взаимодействий.

Анализ современной литературы показывает, что нейроны коры чрезвычайно гетерогенны, при этом их свойства могут различаться в разных отделах коры и у разных видов животных. В случае префронтальной коры эти факторы следует учитывать особо, так как в процессе эволюции млекопитающих значение префронтальной коры в организации поведения существенно нарастало, а ее относительные размеры выросли многократно.

В настоящее время получен достаточно обширный экспериментальный материал о морфологических, нейрохимических и электрофизиологических свойствах пирамидных нейронов и тормозных ГАМКергических интернейронах сенсорных и моторных отделов коры грызунов, начинает выясняться специфическая роль различных популяций нейронов в реализации тех или иных функций коры. Однако остается нерешенным вопрос, насколько возможно использование этих данных для понимания специфических функций нейронов префронтальной коры приматов? В современной литературе описано очень мало экспериментальных работ, посвященных изучению характеристик нейронов префронтальной коры приматов, в особенности ГАМКергических интернейронов. Это делает необходимым проведение экспериментального изучения нейронов префронтальной коры приматов. Поэтому целью данной работы стало комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки (Macaca fascicularis), выявление основных типов нейронов, их функций и особенностей взаимодействия, а также сравнение свойств нейронов префронтальной коры крысы и макаки, что позволит лучше понять особенности механизмов работы префронтальной коры приматов и роль отдельных типов нейронов в осуществлении функций.

2.1. Приготовление переживающих срезов коры мозга макаки и крысы Первая часть экспериментов была проведена на переживающих срезах префронтальной коры мозга половозрелых (3.5-6 кг, 3.5-5 лет) особей яванских макак (Macaca fascicularis). Эти эксперименты были выполнены в Питтсбургском университете (США) в соответствие с правилами по работе с лабораторными животными, разработанными Национальным Институтом Здоровья США. Биопсию ткани мозга с участком префронтальной коры производил профессор Д. Льюис. Биопсия осуществлялась по стандартной процедуре. Сначала животное получало кетаминовый наркоз (кетамина гидрохлорид, 25 мг/кг и дексаметазона фосфат, 0.5 мг/кг, внутримышечно; атропина сульфат, 0,05 мг/кг, подкожно). Для поддержания анестезии в трахею вводились эндотрахеальные трубки, в течение операции дыхание производилось смесью 1% галотана / 28% О2 в воздушной смеси. Далее животное помещалось в стереотаксическую установку, краниотомия проводилась в области черепа над дорсолатеральной префронтальной корой. Определение нужного участка коры производилось по стереотаксическим координатам и расположению борозд и извилин на поверхности мозга.

Для экспериментов извлекался участок коры содержащий латеральный и медиальный края основной борозды (s. principalis), поля 9 и 46 (Рис. 4).

После операции животным вводились антибиотик широкого спектра действия (хлорамфеникол (левомицетин); 15 мг/кг, внутримышечно) и анальгетик (гидроморфон, 0. мг/кг, внутримышечно) 3 раза в сутки в течение 3-х дней. Животные быстро восстанавливались, никаких видимых нарушений поведения у них не наблюдалось. Через 2- недели производилась вторая операция, в ходе которой производилась биопсия участка дорсолатеральной префронтальной коры другого полушария. После второй операции животное усыпляли.

Примерно у половины экспериментальных животных первая операция производилась на левом полушарии, а другой половины – на правом полушарии. Чтобы уменьшить возможный эффект компенсаторных реакций, развивающихся в контралатеральном полушарии, при второй биопсии участок мозга выбирался более рострально или каудально по отношению к участку, изъятому в ходе первой биопсии. Сравнение результатов экспериментов, полученных на срезах мозга после первой и второй биопсии, а также из разных полушарий не выявило никаких значимых различий, поэтому в дальнейшем все данные приводятся без учета этих факторов.

Рис. 4. Экспериментальная процедура приготовления переживающих срезов коры обезьяны и крысы. (А) Схематическое изображение мозга макаки, оранжевым отмечена область коры мозга, из которой осуществлялась биопсия. PS - основная борозда (s. principalis). (B) Схематическое изображение типичного среза префронтальной коры макаки. Цифрами отмечены корковые поля 9 и 46, WM – белое вещество. (С) Схематическое изображение типичного среза коры мозга крысы. Серой рамкой отмечена зона, в которой производились регистрации. PL - прелимбическая и IL -инфралимбическая кора.

Кусочек коры мозга сразу после биопсии помещался в ледяную искусственную спинномозговую жидкость (ИСМЖ) следующего состава, в мМ: 230 сахарозы, 1.9 KCl, 1. Na2HPO4, 33 NaHCO3, 6 MgCl2, 1 CaCl2, 10 глюкозы и 2 кинуреновой кислоты; pH 7.3–7.4;

раствор аэрировался газовой смесью 95% O2/5% CO2.

Вторая часть экспериментов была проведена на переживающих срезах медиальной фронтальной (прелимбической и инфралимбической) коры мозга крысы (Рис. 4C) в Питтсбургском университете (США), Тринити колледже Дублина (Ирландия) и Институте эволюционной физиологии и биохимии РАН (РФ). Для экспериментов использовались крысы линии Вистар в возрасте 14-120 дней. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами по работе с лабораторными животными.

Коронарные срезы коры мозга обезьян и крыс толщиной 300-350 мкм приготавливали на вибротоме (VT 1000S, Leica, Германия или на вибротомах других моделей) и инкубировали в течение часа при температуре 37 С, а затем при комнатной температуре до начала электрофизиологических опытов в ИСМЖ следующего состава, в мМ: 126 NaCl, 2.5 KCl, 1. Na2HPO4, 25 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 глюкозы; pH 7.3–7.4; раствор аэрировался газовой смесью 95% O2/5% CO2. ИСМЖ такого же состава обычно использовалась и при проведении электрофизиологических регистраций. Эксперименты на срезах коры крысы обычно продолжались в течение 4-6 часов после их изготовления, на срезах мозга макаки – в течение 12-16 часов, в течение этого срока существенного ухудшения качества срезов не происходило.

2.2. Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры Для регистрации электрофизиологических свойств нейронов срез помещался под микроскоп, в перфузируемую записывающую камеру общим объемом около 1-2 см3. В этой камере обеспечивался постоянный проток ИСМЖ, подогретой до 30-32 С и аэрируемой газовой смесью 95% O2/5% CO2. Скорость потока жидкости составляла не менее 1.5-3 мл/мин.

Визуализация нейронов обеспечивалась с помощью оптики Номарского (дифференционно-интерференционного контраста, DIC). На микроскопе для улучшения визуализации использовался инфракрасный (ИК) источник света, так как ИК свет меньше рассеивается в ткани мозга. Для визуализации нейронов использовался длиннофокусный водный иммерсионный объектив (40х). Изображение передавалось на камеру и демонстрировалось на мониторе. Такая комбинация методов визуализации позволяла хорошо различать форму нейронов и производить их первоначальную идентификацию (Рис. 5).

Регистрация токов и/или потенциалов производилась методом локальной фиксации потенциалов/токов (voltage clamp/current clamp) в конфигурации целая клетка (whole cell mode). Электроды изготавливались из боросиликатного стекла на пуллере (Sutter Instrument).

В зависимости от типа эксперимента и его задач сопротивление электродов менялось в диапазоне от 2 до 8 МОм. Преимущественно использовались электроды с низким сопротивлением (3-5 МОм), что позволяло уменьшить сопротивление доступа (access resistance) и улучшить характеристики записи. Однако в экспериментах, требующих морфологической реконструкции интернейронов обычно использовались электроды с более высоким сопротивлением (5-7 МОм), так как эти клетки имеют малые размеры и электроды с большим кончиком могут повредить клетку. В тех случаях, когда планировался иммуногистохимический анализ на наличие растворенных в цитоплазме белков, также использовали электроды с высоким сопротивлением, чтобы уменьшить скорость диализа. Для изготовления электродов использовались капилляры с внешним диаметром 1.5 мм и внутренним 0.86 мм, либо с внешним диаметром 1.0 мм и внутренним 0.58 мм.

Рис. 5. Микрофотография переживающего среза мозга дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки. Большая стрелка указывает на микроэлектрод, с помощью которого производится регистрация с пирамидного нейрона, маленькие стрелки указывают на другие пирамидные нейроны. Масштаб = 50 мкм.

В экспериментах, в которых регистрировались мембранные свойства нейронов обычно использовался внутриклеточный раствор следующего состава, в мМ: 114 глюконата калия, KCl, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 4 Mg-ATP, 0.3 GTP, pH 7.25. В экспериментах, в которых в дальнейшем проводилась морфологическая идентификация нейронов во внутриклеточный раствор добавлялся биоцитин (0.5%) либо один из флуоресцентных красителей группы Alexa (Alexa 350, Alexa 488, Alexa 546, Alexa568, Alexa 633) 0.1 мМ (Invitrogen, США).

В экспериментах, в которых регистрировались трансмембранные токи при позитивных значениях мембранного потенциала, глюконат калия заменялся на глюконат цезия или фторид цезия, чтобы заблокировать калиевую проводимость. Чтобы заблокировать потенциалзависимые натриевые каналы, во внутриклеточный раствор дополнительно добавляли 5 мМ QX314.

Пэтч-кламп нейронов осуществлялся по стандартной методике. Для пэтч-клампа обычно использовались нейроны, залегающие на глубине 20-60 мкм от поверхности. При выборе нейрона учитывались его морфологические признаки и функциональное состояние.

Пирамидные нейроны идентифицировали по характерной пирамидной форме и выраженному апикальному отростку. Интернейроны имели меньший размер, у них отсутствовал апикальный отросток. У всех нейронов, подходящих для пэтч-клампа, обычно была ровная гладкая поверхность мембраны, у таких нейронов не было видно ядро.

Сигналы от нейронов усиливались с помощью одного из усилителей MultiClamp 700A, MultiClamp 700B (Axon Instruments, США), Intracellular Electrometers IE-210 (Warner Instrument Corporation, США), фильтровались он-лайн с частотой 4-5 кГц и оцифровывались с частотой 10-20 кГц с помощью аналогово-цифрового преобразователя (АЦП) Power 1401 (CED, Великобритания), используя программу Signal или с помощью АЦП Digidata (Axon Instruments, США), используя программу pClamp того же производителя.

В работе проводилось несколько типов электрофизиологических экспериментов, которые можно разделить на 3 группы по предмету изучения:

1) изучение электрофизиологических мембранных свойств нейронов;

2) изучение свойств синаптической передачи;

3) изучение долговременной синаптической потенциации и депрессии.

2.2.1. Эксперименты по изучению электрофизиологических мембранных свойств Электрофизиологические свойства нейронов изучались при локальной фиксации токов (current clamp mode). На нейрон подавались гиперполяризующие или деполяризующие прямоугольные импульсы тока длительностью 500 мс в диапазоне от -100 до +300 пА.

Величина тока изменялась с каждым пробегом на 5, 10 или 20 пА, пробеги производились с частотой 0.2 Гц. На основе полученных записей анализировался ряд Электрофизиологических показателей:

ПП (мВ): потенциал покоя – стабильный мембранный потенциал, который регистрировался на нейроне через несколько минут после прорыва мембраны без приложения внешнего тока.

Характеристики подпороговых мембранных ответов:

Rin (МОм): входное сопротивление мембраны нейроны, измерялось как тангенс угла наклона линейного участка зависимости «смещение мембранного потенциала – сила Обычно измерялось в диапазоне подаваемых токов от -50 пА до -10 пА.

(мс): постоянная времени мембраны, определялась на основе аппроксимации изменений мембранного потенциала в ответ на гиперполяризующую ступеньку тока моноэкспоненциальной функции вида:

I0 (пА): Пороговый ток мембраны нейрона (реобаза) определялся как минимальный деполяризующий ток, необходимый для генерации потенциалов действия.

Sag (%): спад мембранного потенциала в ответ на гиперполяризующий ток, определялся как процент изменения между максимальной (Vhmax) и минимальной (Vhss) величиной мембранного потенциала в течение 500-миллисекундной прямоугольной гиперполяризующей ступени тока.

Для анализа использовали 3 градации: «0», если величина Sag составляла меньше гиперполяризующую ступень тока; «1», если величина Sag была меньше чем 50%, но больше, чем 20%; «2», если величина Sag была больше 50%.

Hump (%): кратковременный подъем мембранного потенциала (деполяризационный горб) в ответ на околопороговый деполяризующий ток, определялся как процент изменений между максимальной (Vdmax) и минимальной (Vdss) величиной околопороговой деполяризующей ступени тока.

Использовались те же градации, что и для Sag.

RD (%): возвратная следовая деполяризация (rebound depolarization), определялась по амплитуде деполяризации мембранного потенциала относительно ПП (Vrdmax), возникающей после отмены действия гиперполяризующего тока.

Для анализа использовалось 3 градации: «0», если величина RD составляла меньше 20% от амплитуды изменения потенциала мембраны в ответ на действие ступеньки гиперполяризующего тока. «1», если величина RD была больше 20%, но не вызывала потенциал(-ов) действия. «2», если RD вызывала потенциал(-ы) действия.

Характеристики потенциала действия (параметры рассчитывались для первого потенциала действия при стимуляции минимальным надпороговым током) Латентный период (мс), от начала действия деполяризующего тока до первого потенциала действия.

ISI1-2 (мс): межспайковый интервал (interspike interval), время между первым и вторым потенциалами действия при стимуляции минимальным надпороговым Порог возникновения потенциала действия (мВ), определялся как мембранный потенциал, при котором изменение потенциала действия (dV/dt) составляет > 10 мВ/ Амплитуда потенциала действия (мВ), измерялась от порога до пика потенциала Длительность потенциала действия (мс), измерялась на половине высоты потенциала 13) AHPA (мВ): амплитуда следовой гиперполяризации, определялась от порога потенциала действия до наиболее негативного мембранного потенциала после первого потенциала определялась от порога потенциала действия до мембранного потенциала, при котором скорость гиперполяризации (dV/dt) уменьшается до 5 мВ/1 мс.

mAHP (мВ): амплитуда промежуточного компонента следовой гиперполяризации, измерялась от окончания быстрого компонента следовой гиперполяризации до наиболее негативного мембранного потенциала после первого потенциала действия.

Длительность развития следовой гиперполяризации (мс), измерялась от начала следовой гиперполяризации до наиболее негативного мембранного потенциала после первого потенциала действия.

Характеристики паттернов разрядов (измерялись при стимуляции деполяризующим током величиной в 2 реобазы в течение 500 мс) fss (Гц): стабильная частота разрядов нейрона, рассчитывалась как величина обратная количеству потенциалов действия в течение последних 250 мс стимуляции.

kISIs (безразмерная величина): коэффициент вариации межспайковых интервалов, измерялся в течение последних 250 мс стимуляции.

FFA_late (в %): полная частотная адаптация, определялась как процент уменьшения частоты от первоначального уровня (величина обратная первому межспайковому интервалу) до стабильной частоты разрядов нейрона (fss).

FFA_early (в %): начальная частотная адаптация, определялась как процент уменьшения частоты разрядов после первого и второго потенциала действий;

частоты рассчитывались как величины обратные первому и второму межспайковому Изменение амплитуды потенциалов действия от первого к последнему в пачке (в %).

Изменение амплитуды следовой гиперполяризации от первого к последнему потенциалу действия в пачке (в %).

Характеристики функциональной зависимости частоты разряда от силы деполяризующего тока kfn (Гц/пА): коэффициент нарастания мгновенной частоты разрядов, рассчитывался как тангенс угла наклона линейного участка зависимости «частота разрядов – сила Коэффициенты определялись для мгновенных частот разрядов, вычисленных как обратные величины к первому, второму и т.д. межспайковым интервалам, а так же для стабильной частоты разрядов нейрона.

(Гц): начальная мгновенная частота разрядов, рассчитывалась на линейном участке зависимости «частота разрядов – сила тока» как значение функции при силе Характеристики потенциала действия, определяемые по фазовым диаграммам (dV/dt(V)).

На фазовых диаграммах показана скорость изменения мембранного потенциала (dV/dt) Дифференцирование мембранного потенциала было сделано в программе Signal 3.