«Разнообразие и эволюция покровных структур у центрохелидных солнечников (Protista: Centrohelida) ...»

1.2 Покровные структуры За исключением представителей рода Oxnerella, клетка которых покрыта плазмалеммой без каких-либо дополнительных образований различимых на световом (рис. 2В) (Dobell, 1917; Cavalier-Smith, Chao, 2012) или электронно-микроскопическом (Cheng et al., 1997) уровне, у всех центрохелидных солнечников есть те или иные внеклеточные покровные структуры.

У представителей рода Chlamydaster поверхность клетки окружена мукополисахаридной капсулой (рис. 2Г). Поверхность капсулы может быть гладкой или нести бахрому из мельчайших выростов (Rainer, 1968). На её поверхности могут присутствовать адгезированные бактерии. Формирование капсулы предположительно осуществляется за счёт диктиосом аппарата Гольджи, которые, в отличие от других центрохелид, у представителей это рода занимают периферическое положение (Drrschmidt, Patterson, 1987a).

У представителей родов Heterophrys, Sphaerastrum и Marophrys в покрывающем клетку мукополисахаридном слое находятся спикулы.

Спикулами у центрохелид принято называть органические элементы, имеющие веретеновидную форму (Drrschmidt, Patterson, 1987b). Они могут быть ориентированы как тангентально (рис. 2А, 5А), так и радиально (рис. 2Б, 5Б) (Archer, 1869; Febvre-Chevalier, Febvre, 1984).

Химическая природа этих элементов никогда не была предметом специальных исследований, однако во многих источниках авторы называют их хитиновыми (Penard, 1904; Rainer, 1968). Спикулы Marophrys не окрашиваются ни тетраоксидом осмия, ни Рис. 2. Центрохелидные солнечники отряда Pterocystida. А.

Heterophrys myriopoda, общий вид. Б. Sphaerastrum fockii, общий вид.

В. Oxnerella maritima, общий вид. Г. Chlamydaser sterni, общий вид.

(По: Rainer, 1968 — А, Г; Archer, 1869 — Б; Dobell, 1917 — В).

уранилацетатом, ни цитратом свинца, однако на поверхности спикулы иногда присутствует филаментозный материал, который окрашивается рутениевым красным, что, вероятно, отвечает остаткам мукополисахаридного слоя, в который погружены спикулы (Bardele, 1975).

Также для представителей этого рода показано, что спикулы в сечении имеют крестообразную форму, а для морфогенеза спикул существуют так называемые формирующие спикулы органеллы (spicule-forming organelles). Они представляют собой инвагинации плазмалеммы, по форме повторяющие очертания спикулы (Bardele, 1975; Febvre-Chevalier, Febvre, 1984) (рис. 3), которые подстилаются вакуолью. В одной такой органелле могут одновременно формироваться сразу две спикулы.

Рис. 3. Формирующая спикулы органелла Marophrys marina. А. Вид сбоку. Б. Поперечный срез. в — вакуоль; п — плазмалемма; с — спикула. (По: Bardele, 1975).

Рис. 4. Centrohelida insertae sedis. А., Б. Parasphaerastrum marina. А.

Общий вид. Б. Чешуйка. В., Г. Raphidocystis lemani. В. Общий вид. Г.

Чешуйки. Д. Pseudoraphidiophrys formosa, общий вид. Е., Ж.

Pseudoraphidocystis glutinosa. Е. Общий вид. Ж. Чешуйки. З., И.

Heteroraphidiophrys australis. З. Общий вид. И. Чешуйки. (По: Mikrjukov, 1996 — А, Б; Siemensma, 1991 — В, Г, Е, Ж; Drrschmidt, 1985 — Д;

Микрюков, 2002 — З, И).

У большинства центрохелидных солнечников клетку покрывают чешуйки, состоящие из кремнезёма и также погружённые в мукополисахаридный матрикс. Кремнезёмная природа чешуек постулировалась на основании устойчивости их к действию концентрированной серной кислоты и растворению с помощью разбавленной фтористоводородной кислоты (Rainer, 1968). Позднее присутствие кремниевой минерализации было показано и с помощью энергодисперсионного анализа на примере рода Polyplacocystis (Kinoshita et al., 1995). Наиболее простые из элементов этой группы, напоминающие по форме спикулы, характерны для представителей рода Parasphaerastrum (рис. 4А, Б). Однако, в отличие от спикул, они устойчивы к концентрированной серной кислоте, что говорит о том, что они подвергаются минерализации и, вероятно, являются кремнезёмными (Ostenfeld, 1904).

У представителей других родов всегда присутствует слой пластинчатых кремнезёмных чешуек (plate-scales), большей частью ориентированных тангентально по отношению к поверхности клетки.

Кроме того, у ряда видов присутствуют радиальные кремнезёмные чешуйки (spine-scales) одного или нескольких типов, ориентированные по радиусам. Пластинчатые чешуйки нередко несут по краю полую маргинальную кайму (рис. 5В), хотя могут ее и не иметь (рис. 5Г).

Иногда встречаются воронковидные и трубковидные чешуйки (рис. 5Д, Е). Радиальные чешуйки, как правило, имеют уплощённое основание, обращённое к поверхности клетки (рис. 5Ж).

При морфогенезе кремнезёмных чешуек, как и в случае других протистов с кремнифицированными структурами (раковинные амёбы, ротосфериды), образуются кремний-депонирующие везикулы (silicon deposition vesicles), происхождение которых из какой-либо мембранной системы (Гольджи, ЭПР) не было показано для центрохелид (рис. 1) (Anderson, 1994). Процесс формирования чешуек был изучен Рис. 5. Разнообразие покровных структур. А. Тангентальные спикулы (Sphaerastrum fockei). Б. Радиальные спикулы (Heterophrys marina). В.

Тангентальная кремнезёмная чешуйка с полой маргинальной каймой (Raphidocystis tubifera). Г. Тангентальная кремнезёмная чешуйка без полой маргинальной каймы (Choanocystis rhytidos). Д., Е.

Воронковидные кремнезёмные чешуйки (Raphidocystis glabra). Ж.

Радиальная кремнезёмная чешуйка (Raineriophrys echinata). (По:

Микрюков, 2002 — А, Б; Siemensma, 1991 — В–Ж).

Паттерсоном и Дюршмит (Patterson, Drrschmidt, 1988) у Polyplacocystis ambigua. Они культивировали солнечников в среде, обеднённой кремнием. В таких условиях большинство клеток утрачивали чешуйки.

При добавлении в среду кремния через 4–6 часов чешуйки вновь появлялись на поверхности клеток. На ранних этапах созревания кремнезём накапливается в везикуле в виде губчатого материала.

Предполагают, что ионы кремния осаждаются на органическую матрицу, так как часть содержимого вакуоли устойчива к действию фтористоводородной кислоты. Однако нельзя утверждать, что такой же механизм характерен и для всех других солнечников с кремниевыми чешуйками. Об этом говорит наличие представителей, радиальные чешуйки которых по своей длине значительно превышают диаметр клетки, таких как Raphidocystis lemani (Penard, 1904) (рис. 4В). В этом случае должен иметь место механизм формирования кремниевых чешуек сходный с тем, по которому формируются спикулы, то есть внеклеточный.

В литературе также имеются данные о том, что при инцистировании солнечники могут формировать дополнительные типы чешуек. На ультраструктурном уровне процесс инцистирования описан Паттерсоном и Дюршмит у Polyplacocystis ambigua (Drrschmidt, Patterson, 1987b). В начале этого процесса на поверхности клетки появляется дополнительный слой более широких и массивных чешуек.

Диктиосомы мигрируют к периферии клетки, и клетка продуцирует органический материал стенки цисты. Стенку зрелой цисты составляют шесть слоёв. Снаружи находятся чешуйки трофической стадии, глубже - слой цистных чешуек, а к плазмалемме прилегают четыре слоя органического материала. Также Райнер (Rainer, 1968) на иллюстрации Acanthocystis penardi приводит отдельный рисунок вытянутых чешуек с ярко выраженным центральным ребром, которые обозначены как цистные чешуйки (Tangentialsklerite einer Cyste). Однако автор не приводит в тексте каких-либо сведений, о том, как были получены эти данные.

1.3 Эволюция покровных образований По мере описания разнообразия покровных структур центрохелидных солнечников сначала с помощью светового, а затем и с помощью электронного микроскопа в пределах Centrohelida наметилось разделение на три основные группы, которым придавался ранг семейств: Heterophryidae Poche, 1913 (органические спикулы, мукополисахаридная капсула или голая поверхность клетки), Raphidiophryidae Febvre-Chevalier et Febvre, 1984 (однотипные тангентальные кремниевые чешуйки) и Acanthocystidae Claus, (кремниевые чешуйки подразделяются на тангентальные и радиальные) (Drrschmidt, Patterson, 1987a; Mikrjukov, 1996a;

Микрюков, 2002). При этом авторы предлагали схему постепенного усложнения покровов (рис. 6), согласно которой наиболее Рис. 6. Гипотетическая схема эволюции покровных структур у центрохелид на основании морфологических данных. (По разным авторам).

примитивными являются солнечники, клетка которых покрыта только плазмалеммой – представители рода Oxnerella. Следующим этапом эволюции согласно этим представлениям было приобретение мукополисахаридной капсулы. Такой тип покровов мы наблюдаем у представителей рода Chlamydaster. Далее возникли спикулы, характерные для представителей родов Heterophrys, Sphaerastrum и Marophrys. За счёт минерализации спикул формируются кремниевые чешуйки, которые имеются у всех прочих центрохелидных солнечников. При этом можно выделить более примитивный вариант (роды Polyplacocystis, Raphidiophrys), когда в покровах присутствуют только тангентальные чешуйки. У более продвинутых представителей (роды Choanocystis, Acanthocystis, Pterocystis и др.) имеется как минимум два типа чешуек: пластинчатые, тангентально прилегающие к поверхности клетки и радиальные.

В опубликованных молекулярно-филогенетических работах (Cavalier-Smith, Heyden, 2007; Cavalier-Smith, Chao, 2012) солнечники устойчиво делились на две клады. В первую (отряд Pterocystida) попадали все представители с чешуйками типа Raineriophrys / Pterocystis / Choanocystis, а во вторую (отряд Acanthocystida) – солнечники с чешуйками типа Acanthocystis. Солнечники без кремнезёмных чешуек разрозненно группировались с другими представителями на разных ветках обоих клад. Представители Chlamydaster, Heterophrys myriopoda, Sphaerastrum оказались в Pterocystida. Сиквенс Heterophrys marina оказался очень необычным за счёт наличия семи вставочных регионов, отсутствующих у других центрохелидных солнечников. Авторы перенесли его в новое семейство Marophryidae с единственным родом Marophrys и типовым видом M. marina. В отличие от других солнечников, лишённых кремнезёмных чешуек, он попадал в отряд Acanthocystina.

Авторы этих работ накладывают данные о морфологии покровных структур на топологию молекулярно-филогенетических деревьев (рис. 7). На этом основании они высказывают собственную гипотезу об эволюции покровных образований, в корне отличную от традиционных представлений. Согласно Кавалье-Смиту общий предок центрохелид уже имел как тангентальные, так и радиальные кремниевые чешуйки, и дальнейшие эволюционные преобразования сводятся лишь к утрате тех или иных покровных образований. Этот процесс может происходить лишь частично за счёт утраты минерализации. Тогда покровные структуры представляют собой Рис. 7. Наложение данных о строении покровных структур на данные молекулярно-филогенетического анализа. (По: Cavalier-Smith, von der Heyden, 2007; Cavalier-Smith, Chao, 2012).

исключительно органическую матрицу, которая более не кремнифицируется. Именно этот вариант строения покровов представляют собой спикулы Marophryidae и Heterophryidae. Если утрачиваются лишь радиальные чешуйки, то мы получаем вариант, наблюдающийся у солнечников семейства Raphidiophryidae, обладающих только тангентальными чешуйками. Наконец, в случае родов Oxnerella и Chlamydaster покровные элементы утрачиваются полностью и независимо.

На наш взгляд, данная гипотеза лишь частично обосновывается опубликованными данными. Для Heterophryidae, Oxnerella и Chlamydaster вторичный характер упрощения покровов напрямую явствует из топологии полученных деревьев – эти клады находятся глубоко внутри ветвей, содержащих представителей с полным набором кремниевых чешуек. Однако в пределах отряда Acanthocystida, как нам кажется, эволюция покровных структур может быть интерпретирована и вполне традиционным образом. Marophryidae, как наиболее базальная ветвь, могут быть лишены минерализации первично.

Кремниевые чешуйки в таком случае появляются у более продвинутых Raphidiophryidae и Acanthocystidae, при этом последние наряду с тангентальными приобретают радиальные чешуйки. При такой интерпретации эволюцию в двух отрядах центрохелид следует признать полностью параллельной, если не считать варианта Raphidiophryidae, который в пределах отряда Acanthocystida остаётся уникальным. Впрочем, из этого семейства был изучен только род Polyplacocystis, и монофилетичность этого семейства нуждается в проверке молекулярными методами.

1.4 Систематический обзор центрохелидных солнечников Класс Centrohelida Khn, Отряд Pterocystida Cavalier-Smith 2012 (рис. 2, 8) Центрохелидные солнечники с укороченным 18S геном, без вставочных сегментов, характерных для Acanthocystidae. Исходно – солнечники с тангентальными чешуйками без полой маргинальной каймы и c билатерально симметричными радиальными чешуйками.

Кремнезёмные чешуйки утрачивались дважды (Chlamydaster, Heterophrys).

Семейство Heterophryidae Poche, 1913 em. Cavalier-Smith et von der Heyden, Имеются спикулы, погружённые в мукополисахаридную капсулу.

18S ген лишён семи вставочных сегментов, характерных для Marophryidae.

Род Heterophrys Archer, 1869 (рис. 2А) Типовой вид H. myriopoda Archer, 1869. Спикулы имеют радиальную ориентацию.

Род Sphaerastrum Greeff, 1873 (рис. 2Б) Монотипный род с единственным представителем S. fockei (Archer, 1869) West, 1901. Спикулы имеют тангентальную ориентацию.

Семейство Oxnerellidae Cavalier-Smith et Chao, Лишены скелетных элементов и мукополисахаридной капсулы.

Род Oxnerella Dobell, 1917 (рис. 2В) Типовой вид Oxnerella maritima Dobell, 1917. Диагноз полностью совпадает с таковым семейства.

Семейство Pterocystidae Cavalier-Smith et von der Heyden, Кремниевые чешуйки подразделяются на тангентальные и радиальные. Последние имеют основание в виде капюшона или черпака. Если кремниевые чешуйки утрачиваются (Chlamydaster) то сохраняется мукополисахаридная капсула.

Род Chlamydaster Rainer, 1968 (рис. 2Г) Типовой вид C. sterni Rainer, 1968. Клетка окружена мукополисахаридной капсулой. Чешуйки отсутствуют.

Род Pterocystis Siemensma et Roijackers, 1988 (рис. 8А, Б, В) Типовой вид P. pteracantha (Siemensma, 1981) Siemensma et Roijackers, 1988. К поверхности клетки прилегают овальные пластинчатые чешуйки. Чешуйки наружного слоя ориентированы более или менее радиально. Каждая чешуйка состоит из ствола, с двух сторон от которого отходят уплощённые расширения (lateral wings).

Смыкаясь в проксимальной части чешуйки, они образуют воронковидное углубление.

Род Raineriophrys (Mikrjukov, 2001) Mikrjukov, 2002 (рис. 8Г, Д, Е) Типовой вид R. erinaceoides (Petersen et Hansen, 1960) Mikrjukov, 2001. К поверхности клетки прилегают овальные пластинчатые чешуйки. Чешуйки наружного слоя ориентированы более или менее радиально. Каждая чешуйка имеет ствол. С двух сторон от ствола отходят уплощённые расширения. В проксимальной части чешуйки имеется также базальное расширение (basal wing), которое хорошо отделимо от латеральных и ориентировано перпендикулярно по отношению к последним. Вместе латеральные и базальное расширения образуют углубление треугольной формы. У некоторых представителей это углубление отсутствует.

Семейство Choanocystidae Cavalier-Smith et von der Heyden, К поверхности клетки прилегают овальные пластинчатые чешуйки. Наружный слой представлен чешуйками с сердцевидным основанием.

Рис. 8. Центрохелидные солнечники отряда Pterocystida. А. – В.

Pterocystis pterocantha. А. Общий вид. Б. Тангентальная чешуйка. В.

Радиальная чешуйка. Г. – Е. Raineriophrys erinaceoides. Г. Общий вид.

Д. Тангентальная чешуйка. Е. Радиальная чешуйка. Ж. – И.

Choanocystis lepidula. Ж. Общий вид. З. Тангентальная чешуйка. И.

Радиальная чешуйка. (По: Siemensma, 1991).

В выемке сердцевидной пластинки берёт начало полый трубковидный ствол радиальной чешуйки.

Род Choanocystis Penard, 1904 (рис. 8Ж, З, И) Типовой вид C. lepidula Penard, 1904. Диагноз полностью совпадает с таковым семейства.

Отряд Acanthocystida Cavalier-Smith 2012 (рис. 9) Центрохелидные солнечники, 18S ген которых содержит 17- характерных вставочных регионов. Исходно – солнечники с овальными тангентальными чешуйками, нередко – с полой маргинальной каймой и радиальными чешуйками с круглым основанием. Кремнезёмные чешуйки отсутствуют у Marophrys.

Семейство Marophryidae Cavalier-Smith et von der Heyden, Имеются радиально ориентированные спикулы, погружённые в мукополисахаридную капсулу. 18S ген содержит 7 характерных вставочных сегментов.

Род Marophrys Cavalier-Smith et von der Heyden, 2007 (рис. 9А) Типовой вид M. marina (Hertwig et Lesser, 1874) Cavalier-Smith et von der Heyden, 2007. Диагноз полностью совпадает с таковым семейства.

Семейство Acanthocystidae Claus, 1874 em. Cavalier-Smith et von der Heyden, К поверхности клетки прилегают овальные пластинчатые чешуйки.

Наружный слой представлен чешуйками с круглым Рис. 9. Центрохелидные солнечники отряда Acanthocystida (А-Е) и incertae sedis (Ж, З). А. Marophrys marina. Общий вид. Б. – Г.

Acanthocystis turfacea. Б. Общий вид. В. Тангентальная чешуйка. Г.

Радиальная чешуйка. Д., Е. Polyplacocystis ambigua. Д. Общий вид. Е.

Чешуйка. Ж., З. Raphidiophrys elegans. Ж. Общий вид. З. Чешуйка. (По:

Hertwig, Lesser, 1874 – A; Siemensma, 1991 – Б – Г, З; Penard, 1904 – Д;

Drrschmidt, 1988 — Е; Rainer, 1968 — Ж).

основанием. Полый трубковидный ствол чешуйки берёт начало в центре круглого основания.

Род Acanthocystis Carter, 1863 (рис. 9Б, В, Г) Типовой вид A. turfacea Carter, 1863. Диагноз полностью совпадает с таковым семейства.

Семейство Raphidiophryidae Febvre-Chevalier, Febvre, Клетка покрыта тангентальными уплощёнными кремнезёмными чешуйками, погружёнными в мукополисахаридный матрикс. Чешуйки окружены полой маргинальной каймой.

Род Polyplacocystis Mikrjukov, 1996 (рис. 9Д, Е) Типовой вид P. symmetrica (Penard, 1904) Mikrjukov, 1996. Клетка покрыта более или менее однотипными чешуйками, ориентированными тангентально. Чешуйки окружены полой маргинальной каймой.

Полости, разделённые септами в толще чешуйки, отсутствуют.

Поверхность чешуек гладкая или ячеистая.

Centrohelida incertae sedis (рис. 4, 9) Род Raphidiophrys Archer, 1867 (рис. 9Ж, З) Типовой вид R. viridis Archer, 1867. Клетка покрыта более или менее однотипными чешуйками, ориентированными тангентально.

Чешуйки окружены полой маргинальной каймой. Внутри чешуйки имеются радиальные септы, между которыми находятся полости.

Род Parasphaerastrum Mikrjukov, 1996 (рис. 4А, Б) Монотипный род с единственным представителем P. marina (Ostenfeld, 1904) Mikrjukov, 1996. Клетка покрыта тангентально ориентированными стержневидными чешуйками одного типа.

Род Raphidocystis Penard, 1904 (рис. 4В, Г) Типовой вид R. lemani (Penard, 1891) Penard, 1904. Клетка покрыта чешуйками трёх типов. К поверхности клетки прилегают тангентально ориентированные пластинчатые чешуйки. Они окружены полой маргинальной каймой, могут быть гладкими или ячеистыми.

Также имеются радиально ориентированные воронковидные и трубковидные чешуйки.

Род Pseudoraphidiophrys Mikrjukov, 1997 (рис. 4Д) Типовой вид P. formosa (Drrschmidt, 1985) Mikrjukov, 1997. К поверхности клетки прилегают овальные пластинчатые чешуйки.

Чешуйки внешнего слоя тоже пластинчатые. Они имеют радиальные рёбра и одно центральное ребро.

Род Pseudoraphidocystis Mikrjukov, 1997 (рис. 4Е, Ж) Типовой вид P. glutinosa (Penard, 1904) Mikrjukov, 1997. К поверхности клетки прилегают овальные пластинчатые чешуйки.

Снаружи располагаются воронковидные чешуйки.

Род Heteroraphidiophrys Mikrjukov et Patterson, 2002 (рис. 4З, И) Монотипный род с единственным представителем H. australis Mikrjukov et Patterson, 2002. Клетка покрыта чешуйками двух типов. К поверхности клетки прилегают вытянутые чешуйки, их полая маргинальная кайма выражена не очень сильно, имеется центральное ребро. Снаружи располагаются более широкие чешуйки с хорошо развитой полой маргинальной каймой.

2.1 Пробы и штаммы, использованные в работе В ходе работы были использованы пробы, отобранные автором за время его многолетней работы на внутренних озёрах Валаамского архипелага и других водоёмах Северо-запада России (40 проб), а также пробы из различных пресноводных местообитаний Дании ( проб), Швейцарии (15 проб), Крайнего севера России (1 проба), Дальнего Востока России (15 проб), а также Южной Африки (13 проб), имевшиеся в распоряжении группы протистологии кафедры зоологии беспозвоночных СПбГУ.

Для отбора проб использовали стерильные пластиковые ёмкости, объёмом 300-400 мл. При отборе, погрузив контейнер в воду на глубину до 40-50 см, производили взмучивание прибрежного грунта. В местах с густой прибрежной или донной растительностью (мох, злаки, осоки, рдесты), брали также соскобы с поверхности подводных частей растений. В водоёмах с большим количеством сфагнума производились также выжимки из влажных, находящихся у воды «подушек».

Пробы высевали в чашки Петри диаметром 60 и 100 мм. Для более интенсивного развития живых организмов в высевы добавляли зерно риса или пшеницы. В других случаях пробы разбавляли питательной средой Прескотт-Джеймс + церофил 0,05 % (Prescott, James, 1955; Page, 1988). Высевы инкубировали при комнатной температуре и нерегулируемом освещении, просматривая несколько раз в течение месяца под инвертированным микроскопом (Nikon Eclipse TS 100 и Leica DMI 3000B). Обнаруженных солнечников высушивали на покровных стёклах для изучения в сканирующем электронном микроскопе с целью экспресс-идентификации. Затем солнечников, которые представляли интерес с точки зрения задач исследования, выделяли в клональную культуру. Клонировали, перенося клетки по одной в чашки Петри со свежей средой ПрескоттДжеймс + церофил, содержащей подросшую культуру кормового объекта – жгутиконосцев Bodo saltans (культура предоставлена А. П. Мыльниковым, Институт Биологии Внутренних Вод РАН). Перенос клеток осуществлялся с помощью стеклянных капилляров. В случаях, в которых установить клональные культуры не удавалось, солнечников изучали в накопительных культурах, где они могли жить до 6 месяцев, выдерживая 2–3 пересадки в свежую среду. При изучении таких солнечников обращали особое внимание на то, чтобы все исследуемые организмы принадлежали к одному морфологическому виду.

Всего в ходе работы было высеяно 97 проб, из которых в 30 были найдены солнечники. Из них 20 штаммов, относящихся к 17 видам и родам были выделены в чистую клональную культуру, два из них на настоящий момент депонированы в Коллекции Культур Водорослей и Простейших (CCAP, Institute of Freshwater Ecology, England). Ещё вида были исследованы в накопительных культурах (табл. 1). При длительном хранении штаммы содержали при +4 C, закрыв чашки лабораторной лентой Parafilm M (Sigma-Aldrich).

Таблица 1. Изученные штаммы Acanthocystis nichollsi Siemensma et архипелаг, Roijackers, 1988 Ладожское оз., Acanthocystis nichollsi Siemensma et Ненецкий а.о., Roijackers, 1988 Россия. Детрит Acanthocystis nichollsi Roijackers, Acanthocystis nichollsi Siemensma et количеством Roijackers, 1988 зелени, в горах Acanthocystis takahashii Acanthocystis takahashii Drschmidt, Восток, Россия.

Acanthocystis penardi Wailes, о. Средний, 33°40'04'' в. д.

Acanthocystis penardi Wailes, Валаамский 30°54'27'' в. д.

Acanthocystis turfacea Carter, Швейцария, 6°09'47'' в. д.

Acanthocystis trifurca Nicholls, Швейцария, 6°09'47'' в. д.

Acanthocystis Zlatogursky, ботанического 12 Acanthocystis оз. Симняховск 61°22'41'' с. ш. 30.09. Zlatogursky, 2010 архипелаг, Acanthocystis Acanthocystis Acanthocystis Acanthocystis Acanthocystis Polyplacocystis Raphidiophrys intermedia Raphidiophrys heterophryoidea Zlatogursky, Валаамский Choanocystis Zlatogursky, Валаамский 23 Choanocystis оз. Лещовое, 61°21'50'' с. ш. 30.09. Zlatogursky, 2010 архипелаг, Raineriophrys erinaceoides Mikrjukov 2001 Карелия, Примечание. Жирным шрифтом выделены названия видов, по которым получена полная последовательность гена 18S рРНК.

Подчёркнуты названия видов, которые были выделены в чистую клональную культуру.

2.2 Световая микроскопия Для наблюдения и фотографирования солнечников в чашках Петри использовали инвертированные микроскопы Nikon Eclipse TS и Leica DMI 3000B, снабжённые фазово-контрастной оптикой. С их помощью также осуществляли отбор организмов для культивирования и изготовления препаратов. Для детального изучения морфологии солнечников на временных препаратах, а также для изучения высушенных скелетных элементов на световом уровне использовали микроскоп Leica DM2500 с камерой Nikon DS-Fi1. Фотографирование производили с использованием штатных пакетов программного обеспечения, входивших в комплект поставки фотокамер.

Для приготовления препаратов скелетных элементов клетки высушивали на покровных стёклах. В большинстве случаев, чтобы избавиться от остатков клеточного тела, перед высушиванием клетки помещались в 10%-ный раствор Triton X-100. После высушивания стёкла со скелетными элементами отмывали в дистиллированной воде. Далее стекло вновь высушивали и изучали на светомикроскопическом уровне. Эти же препараты в дальнейшем использовали для изучения в сканирующем электронном микроскопе.

2.3 Электронная микроскопия и энергодисперсионный рентгеновский анализ Для изучения в сканирующем электронном микроскопе покровные стёкла прикрепляли к предметным столикам с помощью проводящего скотча и напыляли слоем платино-палладиевой смеси толщиной в 5нм. Микроскопирование осуществляли, используя микроскопы Zeiss Supra 40 VP, Zeiss Merlin и Tescan Mira3 LMU. Для энергодисперсионного рентгеновского анализа (Oxford Instruments INCAx-act) клетки высушивали на канцелярском скотче, чтобы избежать сигнала от кремния, содержащегося в стекле. Рентгеновские спектры измеряли минимум в 50 точках образца. Для сравнения также снимали несколько спектров в области столика, где образец отсутствует, чтобы отсечь фоновые сигналы.

Для изучения в просвечивающем электронном микроскопе солнечников высушивали на медных блендах с формваровой подложкой. Как и при высушивании на стёклах, клетку удаляли с помощью Triton X-100, затем скелетные элементы, закреплённые на подложке, прополаскивали в дистиллированной воде и опять высушивали. Далее бленды просматривали на электронных микроскопах Jeol JEM-1400 и Jeol JEM-2100HC без дополнительного контрастирования.

2.4 Морфометрия Основными параметрами для измерения были диаметр клетки, длина радиальных чешуек (или спикул), длина и ширина пластинчатых чешуек (рис. 10А, Б). Длину радиальных чешуек с ветвями или зубцами на конце измеряли от основания до воображаемый линии, соединяющей кончики этих образований (рис. 10В). В случае изогнутых радиальных чешуек измеряли длину прямой, соединяющей вершину и основание чешуйки (рис. 10Г). Измерения размеров клетки и скелетных элементов проводились на микрофотографиях с помощью программы Image Tool Ver. 3.0. При этом программу предварительно калибровали по фотографиям объект-микрометра, сделанным на том же увеличении светового микроскопа или по масштабным чертам на микрофотографиях с электронного микроскопа. Измерение диаметра клетки проводили на живых солнечниках, не придавленных покровным стеклом (в чашках Петри). В случае скелетных элементов при исследовании клональных культур для изготовления препаратов брали суспензию клеток, и чешуйки от отдельных индивидуумов перемешивались. Поэтому приводится только число измеренных скелетных элементов по каждому штамму без информации о числе исследованных особей. Полученные в Image Tool данные переносили в программу Excel (MS Office, 2003), c помощью которой вычисляли среднее значение и его стандартную ошибку. На выборках с n < какой-либо статистической обработки данных не проводили.

Рис. 10. Основные морфометрические параметры, использованные в работе. А. Общий вид клетки. Б. Пластинчатая чешуйка. В. Радиальная чешуйка с бифуркацией. Г. Изогнутая радиальная чешуйка. дк – диаметр клетки; дпч – длина пластинчатой чешуйки; дрч – длина радиальной чешуйки; шпч – ширина пластинчатой чешуйки. (По:

Siemensma, 1991, с изменениями).

2.5 Молекулярная филогения Геномная ДНК была изолирована из клеток с помощью гуанидинизотиоцианатного метода (Maniatis et al., 1982). Для этого клетки отбирали стеклянным капилляром в пробирку c гуанидинтиоцианатным буфером, после чего хранили до момента экстракции при температуре + 4C или сразу же переходили к экстракции.

Для изоляции ДНК клетки в буфере коротко вортексировали и выдерживали при температуре + 55C в течение 10 минут, после чего для осаждения ДНК к раствору прибавляли эквивалентный объём изопропанола. Смесь вновь вортексировали и оставляли при – 20 C не менее чем на полчаса. После этого пробирку центрифугировали на максимальной скорости в течение 15 минут, удаляли супернатант и добавляли 1 мл 70 % этанола. Затем пробирку центрифугировали на максимальной скорости 5 минут и, удалив супернатант, давали получившемуся пеллету подсохнуть в течение 10-15 минут до полного исчезновения запаха этанола. После этого ДНК растворяли в 50 мкл воды и хранили при температуре – 20 C. Концентрацию ДНК определяли при помощи нанофотометра Implen P300 по коэффициенту поглощения света с длиной волны 260 нм.

Ген малой субъединицы рРНК амплифицировали с использованием пары концевых праймеров Thx25F — Helio1979R (Cavalier-Smith, Heyden, 2007). В некоторых случаях в качестве альтернативы один из праймеров этой пары заменяли на s14R, 3f или RibA, разработанные в лаборатории Зоологии и Биологии животных Женевского университета (табл. 2). Праймеры были произведены компанией Cинтол (Москва).

Таблица 2. Праймеры, использованные для амплификации 18S рРНК Название Направле Последовательность 5’-3’ праймера ние Thx25F Прямой CATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCA Helio1979R Обратный CACACTTACWAGGAYTTCCTCGTTSA S14R Прямой AAGTTTCAGCCTTGCGACCA 3f Обратный AGGGTTCGATTCCGGAG RibA Прямой ACCTGGTTGATCCTGCCAGT Для проведения полимеразной цепной реакции использовался кит фирмы Fermentas (#EP0402) В реакционную смесь для амплификации, содержащую 67 мМ Tris - HCl (pH 8,8), 50 мM KCl и 6,7 мМ MgCl2, 1 мМ меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl, добавляли 2–50 нг тотальной геномной ДНК, по 100 пМ каждого праймера, 0,2 мМ каждого дНТФ и 1 ед. Taq ДНК - полимеразы. Объем смеси составлял 25 мкл.

Реакцию проводили в следующих условиях:

1. Денатурация 2 минуты при + 95C 2. 40 циклов амплификации:

Денатурация 30 сек. при + 95C Отжиг 1 мин. при + 55–+ 50C Элонгация 2 мин. при + 72C 3. Итоговая элонгация 5 мин. при + 72C В случае штаммов, которые исследовали в накопительных культурах, клетки по отдельности замораживали в ПЦР-пробирках с минимумом воды, после чего добавляли в них ПЦР-смесь вышеуказанного состава, но без ДНК. Далее ПЦР проводилась с использованием той же программы, за тем исключением, что время первичной денатурации (п. 1) увеличивали до 5 минут.

ПЦР-продукты, очищенные электрофорезом в агарозном геле или на колонке (Евроген, Clean Up Standard kit, # BC022) подвергали прямому секвенированию или клонировали при помощи вектора pТZ57R/T (Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit#K1213, #K1214) в бактериях Escherichia coli (штамм JM107). Колонии бактерий, содержащие плазмиды со вставкой требуемой длины, идентифицировали при помощи ПЦР с универсальными праймерами M13F и M13R. Очищенные плазмиды секвенировали по Сэнжеру с помощью капиллярных секвенаторов ABI Prism 310 или ABI Prism 3500 xl (Applied Biosystems, USA).

Полные последовательности реконструировали по совокупности перекрывающихся участков, секвенированных при помощи внутренних универсальных праймеров к 18S рРНК, с использованием программы Chromas Pro ver. 1.7.4. Полученные последовательности выравнивали вместе с другими последовательностями эукариотной малой субъединицы рРНК, взятыми из базы данных EMBL/Genbank.

Выравнивание проводили вручную при помощи программы SeaView (Gouy et al., 2010).

Реконструкцию филогенетических деревьев на основе набора выровненных последовательностей и их тестирование бутстрэпметодом проводили при помощи программ PhyML (Guindon, Gascuel, 2003) и МrBayes (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Использовали GTR invмодель с 4 (PhyML) или 6 (МrBayes) категориями. Тестирование топологий (PhyML) проводили методом бутстрепа с использованием 1000 реплик.

Как было указано выше, наиболее распростанёнными у центрохелидных солнечников являются два типа покровных структур:

разнообразные по форме кремниевые чешуйки или веретенообразные органические спикулы. Также чешуйки особого типа могут образовываться при инцистировании. Традиционно покровные структуры используются для описания и идентификации видов, а также для построения макросистемы центрохелид. Предложены различные сценарии эволюции этих образований. В нашей работе за счёт комплексного молекулярно-морфологического изучения клональных культур солнечников, мы рассматриваем различные аспекты применимости этого признака для решения подобных задач. Было показано, что цистные чешуйки на определённых стадиях жизненного цикла (после эксцистирования) могут сочтетаться с обычными чешуйками трофической стадии, что может вызывать трудности в идентификации. В то же время на остальных стадиях жизненного цикла чешуйки трофозоитов могут служить надёжным критерием видовой идентификации, так как при анализе ко-специфичных штаммов сравнение ультраструткуры чешуек и молекулярно-филогенетический анализ выявляют одни и те же совокупности. При описании и идентификации родов центрохелид морфология покровных структур также не всегда может служить универсальным критерием. Так, нам удалось показать, что в пределах родов Polyplacocystis и Acanthocystis солнечники обладают или кремниевыми чешуйками или спикулами. В роде Raphidiophrys один из описанных нами видов обладает одновременно и спикулами и кремниевыми чешуйками, тогда как другие описанные виды рода спикул не имеют. Наконец, семейства, выделенные на основании морфологии покровов, оказались не голофилетичны как это было показано Кавалье-Смитом и фон дер Хейден (Cavalier-Smith, von der Heyden, 2007) для семейств Heterophryidae и Acanthocystidae и нами в настоящей работе для семейства Raphidiophryidae. Пути эволюции покровных структур в двух отрядах центрохелид, вопреки традиционным взглядам в значительной степени параллельны и включают не только усложнение чешуек, но и утраты и упрощения покровных структур. Это делает центрохелид одной из интереснейших моделей для дальнейшего изучения явлений параллельной эволюции.

Разнообразие покровных структур центрохелидных солнечников в значительной мере остаётся недосточно изученным. На это указывает высокий процент среди исследованных нами штаммов новых для науки видов. Вероятно, весьма большой процент разнообразия центрохелид ещё только ждёт своего описания. Мы также сравнили штаммы более крупных симбиотнсодержащих и более мелких бесцветных солнечников, реизолировали солнечника Acanthocystis trifurca и пересмотрели статус этого вида. Оба этих случая демонстрируют, что необходимо не просто описание новых видов, а комплексный подход, включающий выделение чистых клональных культур, изучение их с помощью полного комплекса современных методов, грамотное сопоставление полученных данных с опубликованными данными по светомикроскопической морфологии, ультраструктуре и молекулярной филогении центрохелид. Только такой подход может привести тому, что представителей этой широко распространенной группы можно будет надёжно идентифицровать и учитывать в самых различных исследованиях.

3.1 Изучение цистных чешуек Raineriophrys erinaceoides и Raphidiophrys heterophryoidea В ходе нашего исследования на примере двух видов Raineriophrys erinaceoides и Raphidiophrys heterophryoidea удалось показать, что в пределах одной клональной культуры солнечники могут иметь различные, существенно отличающиеся наборы чешуек (сравн. рис. и рис. 13; рис. 14 и рис. 16). Это связано с тем, что у эксцистировавшихся особей в покровах некоторое время продолжают персистировать цистные чешуйки.

После нескольких недель культивирования в чашках Петри наблюдали цисты (рис. 12А, 15А). Они имели сферическую форму, и у обоих видов диаметр цист составлял около 14 мкм (табл. 3).

Поверхность цист как у одного, так и у другого вида покрыта чешуйками трофической стадии, формирующими внешний слой стенки цисты. Уже при исследовании цист на светомикроскопическом уровне удавалось обнаружить внутреннюю цистную стенку из отдельных чешуек (рис. 12Б; 15Б).

Эксцистировавшихся индивидуумов (рис. 12В, Г, Д, 15В, Г, Д) можно было наблюдать в более старых культурах и помимо цистных чешуек, присутствующих наряду с обычными чешуйками трофической стадии, каких-либо отличий от прочих трофозоитов выявлено не было.

В случае R. heterophryoidea были получены субклоны эксцистировавшихся индивидуумов, и клетки в культурах имели только чешуйки трофической стадии.

У R. erinaceoides наблюдали от 10 до 88 цистных чешуек на одного вышедшего из цисты индивидуума. Все чешуйки относились к одному типу – уплощённые многоугольные чешуйки. В то же время чешуйки этого типа скорее можно охарактеризовать как полиморфные.

Были обнаружены треугольные (рис. 13Б), четырёхугольные (рис. 13В) и пятиугольные (рис. 13Ж) чешуйки, а во многих случаях число углов определяется неявственно (рис. 13Д), нередко чешуйка имеет почти круглую форму (рис. 13Е). Другое распространённое отклонение – удлинённая и/или изогнутая форма чешуек. Иногда можно наблюдать чешуйки гантелевидной формы (рис. 13Г).

Каждая чешуйка имеет вогнутую и выпуклую стороны.

Поверхность вогнутой стороны гладкая, за исключением небольшого бугорка в центральной части (рис. 13В). Выпуклая часть обычно имеет многоугольное возвышение, которое может быть маленьким и занимать только самый центр чешуйки (рис. 13И, К) или сильно развитым, так что остаются лишь узкие края, не занятые им (рис. 13Д).

Иногда возвышение видно только на одной половине чешуйки или (редко) оно полностью отсутствует.

У R. heterophryoidea на одного вышедшего из цисты индивидуума приходилось от 1 до 30 цистных чешуек. В отличие от предыдущего вида, R. heterophryoidea имеет два типа цистных чешуек. Чешуйки первого типа в определённой степени напоминают чешуйки трофической стадии (рис. 16К). И те и другие имеют радиальные септы, но в отличие от трофических чешуек, цистные чешуйки первого типа окружены широкой уплощённой каймой. Все чешуйки первого типа имели почти идентичную овальную или слегка многоугольную форму.

Чешуйки второго типа устроены гораздо сложнее. Как и у R. erinaceoides чешуйки были многоугольными с различным числом углов и хорошо выраженными вогнутой и выпуклой сторонами. Край вогнутой поверхности несёт ряд треугольных зубов (рис. 16А).

Некоторые чешуйки второго типа были всё ещё соединены друг с другом, как в стенке цисты (рис. 16Б). Форма чешуек и их зубцов точно совпадает, и чешуйки соединяются в виде мозаики. Септы – характерная черта рода Raphidiophrys – также присутствовали на чешуйках второго типа, но их система гораздо более сложная, чем в чешуйках трофической стадии. В трофических чешуйках центральная часть занята сообщающимися полостями, которые разделяют септы (Siemensma, Roijackers, 1988a). В цистных чешуйках второго типа каждая полость полностью обособлена. Помимо центральной группы полостей имеются также несколько концентрических рядов более маленьких дополнительных камер. Некоторые ряды располагаются не концентрически, а переходят один в другой, образуя нерегулярную спираль. Некоторые ряды камер переходили с одной чешуйки на другую (рис. 16В). Центральная группа полостей гораздо менее правильная, чем в трофических чешуйках, и иногда имеет треугольную форму (рис. 16Е). По направлению к краю полости укорачиваются и, наконец, становятся практически округлыми. В некоторых полостях присутствовали очень короткие вторичные септы (рис. 16В). Обычно при рассмотрении со стороны выпуклой поверхности края цистной чешуйки второго типа кажутся гладкими, но на определённых участках они несут мелкие бугорки (рис. 16Е). Иногда под сцепленным цистными чешуйками второго типа виден слой чешуек первого типа (рис. 16Г).

Исследование раздавленных цист позволяет предположить наличие мозаичного слоя, подобного таковому у Raphidiophrys heterophryoidea и у Raineriophrys erinaceoides, однако у последнего вида, в отличие от предыдущего, не обнаружено зубцов, которые могли бы обеспечить соединение.

У Raphidiophrys heterophryoidea потенциальное число цистных чешуек, необходимых чтобы сформировать монослой на сфере диаметром 14 мкм (30 чешуек), хорошо согласуется с наблюдаемым (никогда не удавалось наблюдать более 30 чешуек). Однако, у Raineriophrys erinaceoides максимальное число цистных чешуек, которое наблюдали у индивидуальной клетки (88), было существенно выше ожидаемого (50). Это может свидетельствовать о том, что у этого вида цистные чешуйки частично перекрываются или, что в цисте присутствует более одного слоя цистных чешуек. Это соответствует и данным электронной микроскопии. В случае R. heterophryoidea очевидно, что вогнутые поверхности чешуек направлены к плазмалемме. Иначе сцепленные чешуйки не смогут сформировать сферический слой. Наличие хаотичного слоя чешуек первого типа под мозаичным слоем (рис. 16Г) позволяет нам предположить, что как минимум некоторые чешуйки первого типа расположены ближе к плазмалемме. У R. erinaceoides ситуация менее очевидна, так как механизм соединения непонятен и оба варианта ориентации (вогнутой или выпуклой стороной к клеточной поверхности) возможны.

Сложность мозаичного слоя у R. heterophryoidea говорит о том, что, по крайней мере, финальные стадии его формирования должны проходить на поверхности клетки. В противном случае задача соединения индивидуальных чешуек, сформированных по отдельности внутри клетки, представляется чересчур сложной. Так как чешуйки R. heterophryoidea (в особенности первого типа) напоминают чешуйки трофической стадии, возможно, что трофическая чешуйка служит матрицей для формирования цистной чешуйки. У R. erinaceoides мозаичный слой (если он и есть) менее сложен и чешуйки трофической стадии отличаются от цистных. Таким образом, нет запрета на формирование цистных чешуек в цитоплазме.

Формирование мозаичного слоя — это уникальный признак, который ранее не был описан ни для центрохелидных солнечников, ни для каких-либо других протистов. Формирование отдалённо похожих цистных чешуек было описано для актинофриидных солнечников, в частности для Actinophrys sol, но в этом случае чешуйки перекрывались и не образовывали мозаичного слоя (Patterson, 1979).

Идентификация и разделение видов у центрохелид ведётся на основании морфологии чешуек. Некоторые авторы определяют солнечников и/или описывают виды на основании отдельных чешуек, найденных в пробах (Wujek, 2002; 2003b; a; 2005; 2006; Wujek, Saha, 2006; Channing, Wujek, 2010; Wujek et al., 2010; Wujek et al., 2011;

Esteban et al., 2012). Но находка цистной чешуйки, имеющей совершенно необычную морфологию заставит в такой ситуации думать, что мы имеем дело с новым видом, и не позволит корректно идентифицировать организм. Именно поэтому точное описание всех типов чешуек, включая цистные чрезвычайно желательно для каждого вида центрохелидных солнечников. Таким образом, чешуйки трофических стадий не являются единственным и достаточным признаком для идентификации видов.

Таблица 3. Морфометрия изученных штаммов Roijackers, 1988, радиальных оз. Игуменское, чешуек архипелаг пластинчатых Roijackers, 1988, радиальных р. Лягэдей-Яха, чешуек Roijackers, 1988, радиальных оз. Гурре, Дания чешуек Roijackers, 1988, радиальных горный ручей, чешуек оз. Лещовое, радиальных р. Амур, Дальний радиальных penardi Wailes, клетки оз. Купальное, радиальных penardi Wailes, клетки Валаамский радиальных turfacea Carter, клетки trifurca, оз. Леман, клетки ботанического чешуек сада, СПб оз. Симняховское, радиальных Acanthocystis kirilli Диаметр 7,1 12,8 9,5±0,13 Zlatogursky, 2010 клетки Сергиевка, Санкт- радиальных Валаамский sp. nov. 4, ручей, клетки Валаамский архипелаг intermedia Penard, клетки Драконовых пластинчатых Валаамский пластинчатых heterophryoidea клетки оз. Никоновское, пластинчатых оз. Симняховское, радиальных оз. Лещовое, радиальных Raineriophrys Диаметр 10,7 22,7 16,6±0, erinaceoides клетки (Petersen et Диаметр цист 12,6 16,1 14,2±0, Mikrjukov 2001, радиальных оз. Лещовое, чешуек архипелаг пластинчатых Рис. 11. Raineriophrys erinaceoides, оз. Лещовое, Валаамский архипелаг. А. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка. Фазовый контраст. В. Радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Г. Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Д. Радиальная чешуйка. ТЭМ. Е. Пластинчатая чешуйка.

ТЭМ. Ж. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст.

З. Радиальные и пластинчатые чешуйки. СЭМ. Масштабная черта: А.

15 мкм; Б.,В. – 3 мкм; Г., Ж. – 10 мкм; Д., Е., – 1 мкм; З. – 2 мкм.

Рис. 12. Raineriophrys erinaceoides, оз. Лещовое, Валаамский архипелаг. Светомикроскопические снимки цисты (A, Б) и эксцистировавшегося организма (В, Г, Д). Контраст Номарского (A, Г, Д) или фазовый контраст (Б, В). А. Интактная циста. Б. Циста, раздавленная покровным стеклом. В. Эксцистировавшийся организм под покровным стеклом. Г. Эксцистировавшийся организм, поверхность клетки и аксоподии. Д. Группа эксцистировавшихся организмов в чашке Петри. Масштабная черта: 10 мкм.

Рис. 13. Raineriophrys erinaceoides, оз. Лещовое, Валаамский архипелаг. СЭМ высушенных тотальных препаратов эксцистировавшихся особей. A. Общий вид. Б. – Ж.; И. – К. Отдельные цистные чешуйки. З. Чешуйки трофической стадии. Масштабная черта:

2 мкм.

Рис. 14. Raphidiophrys heterophryoidea, оз. Никоновское, Валаамский архипелаг. А. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Клетка под покровным стеклом. Фазовый контраст. В., Г. Агамные слияния. Д., Е.

Высушенный препарат чешуек. Д. Фазовый контраст. Е. СЭМ.

Масштабная черта: А., Г. – 50 мкм, Б., В., Д. – 10 мкм, Е – 5 мкм.

Рис. 15. Raphidiophrys heterophryoidea, оз. Никоновское, Валаамский архипелаг. Светомикроскопические снимки цисты (A, Б) и эксцистировавшегося организма (В, Г, Д). Контраст Номарского (А, Б, Г) и фазовый контраст (В, Д). A. Интактная циста. Б. Циста, раздавленная покровным стеклом. В. Эксцистировавшийся организм под покровным стеклом. Г. Эксцистировавшийся организм, поверхность клетки и аксоподии. Д. Эксцистировавшийся организм в чашке Петри.

Масштабная черта: 10 мкм.

Рис. 16. Raphidiophrys heterophryoidea, оз. Никоновское, Валаамский архипелаг. СЭМ высушенных тотальных препаратов эксцистировавшихся особей. A. Чешуйка второго типа, вид с вогнутой стороны. Б. Группа связанных чешуек второго типа. В. Цистные чешуйки обоих типов. Г. Группа связанных чешуек второго типа, подостланная слоем чешуек первого типа. Д. – И. Одиночные чешуйки второго типа. K. Отдельная чешуйка первого типа. * – вторичная септа.

Масштабная черта: 2 мкм.

3.2 Сравнение ко-специфичных штаммов из удалённых местообитаний Сравнение ко-специфичных штаммов из различных удалённых местообитаний было проведено на примере двух видов: Acanthocystis nichollsi и Acanthocystis takahashii.

В случае A. nichollsi было изучено 4 штамма – из оз. Игуменское – Валаамский архипелаг, Северо-запад России (рис. 18); из реки Лягэдей-Яха – Ямало-Ненецкий а. о., Крайний север России (рис. 19);

из оз. Гурре – Дания (рис. 20) и из горного ручья в Восточно-Капской провинции ЮАР (рис. 21).

Согласно оригинальному описанию, размеры клетки Acanthocystis nichollsi варьируют в пределах от 10 до 23 мкм. Клетки покрыты двумя типами радиальных и одним типом пластинчатых чешуек. Длина радиальных чешуек варьирует в пределах от 2 до 12 мкм, пластинчатых – от 2,5 до 3,8 мкм. Пластинчатые чешуйки имеют периферическую кайму и несут радиальные рёбрышки. Радиальные чешуйки подразделяются на два типа: более короткие и более длинные. Короткие чешуйки имеют воронковидное расширение, несущее продольные утолщения и соединяющие их тонкие перепонки.

Длинные чешуйки оканчиваются небольшим расширением, обрамлённым короной из мелких зубцов (Nicholls, 1983).

Морфометрические характеристики наших штаммов имели несколько больший размах варьирования, чем в оригинальном описании (к примеру, от 1,6 до 4 мкм по пластинчатым чешуйкам) что, вероятно, объясняется большей величиной исследованной нами выборки (табл. 3). Несмотря на это, средний размер чешуек разных типов и диаметр клетки хорошо укладывается в интервалы, приведённые в диагнозе. Морфология чешуек всех 5 штаммов полностью отвечает диагнозу вида – у всех солнечников имелись пластинчатые чешуйки с радиальными рёбрышками (рис. 18Ж, З, 19З, К, 20З, К, 21З, К, 22), малые радиальные чешуйки с воронковидным расширением (рис. 18Ж, З, 19Ж, К, 20Ж, К, 21Ж, К, 22Ж, К) и большие радиальные чешуйки с короной из зубцов (рис. 18З, 19Е, К, 20Е, К, 21Е, К). Всё это говорит о надёжности видовой идентификации. Вариации между штаммами из различных точек наблюдались лишь в незначительных различиях диапазонов размерных характеристик. Так, африканский штамм представлен более мелкими клетками, по сравнению с остальными. У штамма из Дании по сравнению с остальными пластинчатые чешуйки имеют большую длину (табл. 3).

Однако, в целом, морфологические характеристики и морфометрия несомненно указывают на ко-специфичность исследованных культур в рамках имеющейся морфологической концепции вида у центрохелидных солнечников.

Рис. 17. Байесовское дерево на основе сиквенсов гена 18S рРНК (GTRмодель, 1569 позиций) для 121 таксона центрохелидных солнечников, а также 32 близких внешних групп. 21 новый сиквенс выделен жирным шрифтом. Поддержка: слева – постериорная вероятность, справа – значение бутстрапа при анализе методом максимального правдоподобия, если клада отсутствовала при этом анализе справа стоит знак «-». Молекулярные клоны обозначены пометкой «Клон» с порядковым номером, остальные сиквенсы были получены прямым секвенированием ПЦР-продукта.

Рис. 18. Acanthocystis nichollsi, оз. Игуменское, Валаамский архипелаг.

А. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка.

Фазовый контраст. В. Малая радиальная чешуйка. Фазовый контраст.

Г. Большая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Д. Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Е. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. Ж. Малая радиальная чешуйка и пластинчатая чешуйка. ТЭМ. З. Радиальные и пластинчатые чешуйки. СЭМ. Масштабная черта: А. 15 мкм; Б.- Г., Ж., З. – 1 мкм, Д., Е. – 10 мкм.

Рис. 19. Acanthocystis nichollsi, р. Лягэдей-Яха, Ямало-Ненецкий а. о. А.

Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка.

Фазовый контраст. В. Малая радиальная чешуйка. Фазовый контраст.

Г. Большая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Д. Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Е. Большая радиальная чешуйка. ТЭМ. Ж. Малая радиальная чешуйка. ТЭМ. З.

Пластинчатая чешуйка. ТЭМ. И. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. К. Радиальные и пластинчатые чешуйки.

СЭМ. Масштабная черта: А. 10 мкм; Б.- К.– 1 мкм.

Рис. 20. Acanthocystis nichollsi, оз. Гурре, Дания. А. Общий вид клетки.

Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка. Фазовый контраст. В.

Малая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Г. Большая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Д. Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Е. Большая радиальная чешуйка. ТЭМ. Ж. Малая радиальная чешуйка. ТЭМ. З. Пластинчатая чешуйка. ТЭМ. И. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. К. Радиальные и пластинчатые чешуйки. СЭМ. Масштабная черта: А. 10 мкм; Б.- Г., Е.-З., К. – 1 мкм; Д., И. – 3 мкм.

Рис. 21. Acanthocystis nichollsi, горный ручей, ЮАР. А. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка. Фазовый контраст. В. Малая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Г.

Большая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Д. Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Е. Большая радиальная чешуйка. ТЭМ. Ж. Малая радиальная чешуйка. ТЭМ. З.

Пластинчатая чешуйка. ТЭМ. И. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. К. Радиальные и пластинчатые чешуйки.

СЭМ. Масштабная черта: А. 10 мкм; Б.- Г., Е.-З., К. – 1 мкм; Д., И. – мкм.

Мы изучили 2 штамма Acanthocystis takahashii из оз. Лещовое – Валаамский архипелаг, Северо-запад России (рис. 22) и р. Амур Дальний Восток России (рис. 23). Согласно оригинальному диагнозу, эти солнечники имеют радиальные чешуйки, несущие на вершине три ветви с мелкими зубчиками (2,5-10 мкм), а также пластинчатые чешуйки овальной или грушевидной формы с маргинальной каймой и центральным утолщением (2,5-3,2 х 1.5-1.8 мкм) (Drrschmidt, 1987a).

Изученные нами штаммы имели сходную морфологию чешуек.

Радиальные чешуйки незначительно отличались по длине – 0,91мкм. Морфометрические характеристики пластинчатых чешуек отвечают оригинальному диагнозу – в среднем – около 2,5 мкм. Таким образом, оба штамма относятся к одному и тому же морфологическому виду и могут быть надёжно идентифицированы как Acanthocystis takahashii.

Молекулярно-филогенетический анализ (рис. 17) подтвердил близкое родство ко-специфичных штаммов из различных местообитаний. Как Acanthocystis nichollsi так и Acanthocystis takahashii сформировали на дереве хорошо поддержанные клады. К кладе Acanthocystis nichollsi также занимает сестринское положение сиквенс AY749632, идентифицированный как Acanthocystis nichollsi из Великобритании (Cavalier-Smith, Heyden, 2007). К кладе Acanthocystis takahashii сестринское положение занимает не идентифицированный сиквенс AY749628 из Новой Зеландии, что может говорить о том, что это ещё один, третий, сиквенс Acanthocystis takahashii. Проверка молекулярными методами штаммов ко-специфичных согласно морфологической концепции вида показала, что оба метода выявляют одни и те же совокупности. Таким образом, при наличии уверенности, что мы имеем дело с чешуйками трофической стадии, а не с чешуйками цисты, описание и идентификация видов может осуществляться на основе морфологических данных.

Рис. 22. Acanthocystis takahashii, оз. Лещовое, Валаамский архипелаг.

А. Пластинчатая чешуйка. Фазовый контраст. Б. Радиальная чешуйка.

Фазовый контраст. В. Клетка, придавленная покровным стеклом.

Фазовый контраст. Г. Клетка, придавленная покровным стеклом.

Контраст Номарского. Д. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Е.

Радиальные и пластинчатые чешуйки. СЭМ. Ж. Радиальные и пластинчатые чешуйки. ТЭМ. Масштабная черта: А., Б. – 2 мкм; В. – Д.

– 10 мкм; Е. – 1 мкм; Ж. – 1,5 мкм.

Рис. 23. Acanthocystis takahashii, р. Амур, Дальний Восток, Россия. А.

Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка.

Фазовый контраст. В. Радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Г.

Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. Д.

Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Е.

Радиальные и пластинчатые чешуйки. СЭМ. Ж. Радиальные и пластинчатые чешуйки. ТЭМ. Масштабная черта: А., Б. – 2 мкм; В. – Д.

– 10 мкм; Е. – 1 мкм; Ж. – 1,5 мкм.

3.3 Сравнение симбионт-содержащих штаммов солнечников с бесцветными (Acanthocystis penardi Wailes, 1925; Acanthocystis turfacea Carter, 1863) Представители двух видов - Acanthocystis turfacea и Acanthocystis penardi являются одними из широко распространённых солнечников и, благодаря своим крупным размерам, часто отмечаются исследователями (Nicholls, 1983). В оригинальных описаниях обоих видов и в описаниях последующих находок часто отмечается наличие в цитоплазме солнечников симбиотических хлорелл (Carter, 1863;

Wailes, 1921; Siemensma, 1991). Однако были отмечены и находки бесцветных солнечников, которые имели сходную морфологию чешуек, но меньшие размеры (Rainer, 1968).

Acanthocystis turfacea, согласно литературным данным, обладает очень большим размахом вариабельности по диаметру клетки (от до 150 мкм), при этом, как отмечает Райнер, более крупные размеры (60-150 мкм) имеют солнечники, содержащие в цитоплазме симбиотических хлорелл. Бесцветные экземпляры, согласно этому автору значительно мельче. Также, согласно данным Райнера, солнечники с хлореллами обладали чешуйками большего размера.

Клетки изученного нами штамма не содержали симбионтов и имели от 8,9 до 14,0 (в среднем – 11,6 мкм) в диаметре. Клетку покрывали пластинчатые чешуйки овальной формы с неярко выраженной маргинальной каймой и центральным ребром (1,1-2,5 мкм) и радиальные чешуйки (2,1-6,0 мкм) с раздвоенной вершиной (рис. 26).

Таким образом, они были значительно мельче, чем описанные в литературе клетки с хлореллами (Carter, 1863; Penard, 1904).

Величина чешуек нашего штамма также отличалась в меньшую сторону от описанных в литературе (Siemensma, 1981; Nicholls, 1983;

Drrschmidt, 1985): размеры чешуек согласно электронномикроскопическим описаниям составляли 8-12 x 3,5-5,5 мкм (Nicholls, 1983) или 3,7-4,2 x 1,9- 2,2 мкм (Drrschmidt, 1985) для пластинчатых чешуек и 8-65 мкм (Nicholls, 1983) или 6-30 мкм (Drrschmidt, 1985) для радиальных чешуек. К сожалению, Дюршмит работала только с чешуйками и не приводит данных о наличии симбионтов и диаметре клетки, однако Николс указывает, что работал с симбионтсодержащими солнечниками.

Для Acanthocystis penardi в литературе отмечена сходная закономерность. Солнечники с хлореллами крупнее и обладают более крупными чешуйками (Rainer, 1968). Нами было изучено 2 штамма Acanthocystis penardi. Штамм из внутренних озёр Валаамского архипелага не удалось выделить в клональную культуру, и он был изучен в накопительной культуре. Согласно оригинальному описанию, солнечники этого вида имеют диаметр клетки 40-60 мкм. Клетка покрыта овальными пластинчатыми чешуйками и усечёнными на дистальном конце радиальными чешуйками. Длина радиальных чешуек составляет от одной трети до трёх четвертей от диаметра клетки (Wailes, 1921). Первое электронно-микроскопическое исследование было сделано Сиеменсмой (Siemensma, 1991), и показало, что на вершине каждой радиальной чешуйки располагается корона из мелких зубчиков. Овальные чешуйки гладкие.

Оба исследованных штамма имели как пластинчатые, так и радиальные чешуйки, морфологически отвечающие приведённому выше описанию. Морфометрические характеристики у двух изученных штаммов сильно отличались. У солнечников из оз. Чёрное на о. Валаам (Ладожское оз.) (рис. 25) пластинчатые чешуйки имели длину от 5,1 до 9,9 мкм, а радиальные чешуйки – от 10,9 до 24,7 мкм (в среднем – 15,3 мкм), клетки были крупнее (около 80 мкм) и содержали хлорелл. Солнечники из оз. Купальное на о. Средний (Белое море) (рис. 24) имели пластинчатые чешуйки длиной от 2,0 до 4,4 мкм и радиальные чешуйки длиной от 4 до 24 мкм (в среднем – 10,7 мкм), диаметр клетки не превышал 28 мкм. Солнечники не содержали хлорелл и были бесцветными. У солнечников Валаамского штамма был отмечен ещё один тип пластинчатых чешуек - крупные порядка 10 мкм округлые или многоугольные пластинки (рис. 25Г, Ж, З).

Дополнительный тип чешуек можно было бы идентифицировать как цистные, однако для этого вида уже описан другой тип цистных чешуек – изогнутые палочковидные чешуйки с центральным ребром (Rainer, 1968).

Молекулярно-филогенетический анализ (рис. 17) показывает близкое родство двух изученных штаммов Acanthocystis penardi, что может говорить как о ко-специфичности, так и о том, что исследованные солнечники относятся к двум близким видам.

По нашим данным симбионтсодержащие клетки Acanthocystis penardi имеют более крупные размеры клетки и чешуек. Аналогичная закономерность выявляется при сравнении наших данных по бесцветным Acanthocystis turfacea с литературными по симбионтсодержащим Acanthocystis turfacea (Rainer, 1968). Данный результат может говорить либо о том, что формы с симбионтами представляют собой самостоятельные виды (подобно Paramecium bursaria среди инфузорий) либо о том, что захват хлорелл у этих двух видов происходит факультативно и вызывает увеличение как диаметра клетки, так и размеров покровных структур. Для разрешения этого вопроса требуется выдление и комплексное изучение дополнительных штаммов обоих видов. Если симбионтсодержащие и бесцветные штаммы будут образовывать на молекулярно-филогенетических деревьях обособленные клады, то это будет говорить в пользу того, что это разные виды. В случае смешанного распределения зелёных и бесцветных солнечников наличие хлорелл и увеличение размеров следует считать факультативным внутривидовым явлением.

Рис. 24. Acanthocystis penardi, оз. Купальное, о. Средний. А. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка. Фазовый контраст. В. Радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Г. Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Д.

Радиальная чешуйка. ТЭМ. Е. Пластинчатая чешуйка. ТЭМ. Ж. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. З. Радиальные и пластинчатые чешуйки. СЭМ. Масштабная черта: А. 20 мкм; Б.,В.,З. – мкм; Г., Ж. – 10 мкм; Д., Е., З. – 1 мкм.

Рис. 25. Acanthocystis penardi, оз. Чёрное, Валаамский архипелаг. 4. А.

Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Хлореллы из цитоплазмы лопнувшей клетки. Контраст Номарского. В. Радиальные чешуйки.

Фазовый контраст. Г. – Е. Различные типы пластинчатых чешуек. Ж., З.

– Пластинчатые и радиальные чешуйки. СЭМ. Масштабная черта: А. – 80 мкм. Б. – З. – 10 мкм.

Рис. 26. Acanthocystis turfacea, оз. Леман, Швейцария. А. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Пластинчатая чешуйка. Фазовый контраст. В. Малая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Г.

Большая радиальная чешуйка. Фазовый контраст. Д. Клетка, придавленная покровным стеклом. Контраст Номарского. Е. Большая радиальная чешуйка. ТЭМ. Ж. Малая радиальная чешуйка. ТЭМ. З.

Пластинчатая чешуйка. ТЭМ. И. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. К. Радиальные и пластинчатые чешуйки.

СЭМ. Масштабная черта: А. 10 мкм; Б.-Г., Е.-З., К.– 1 мкм, Д., И. – мкм.

3.4 Статус Acanthocystis trifurca Nicholls, 1983 и A. myriospina Penard, В 1890 году Пенаром (Penard, 1890) был описан вид A. myriospina из материала стоячих вод в окрестностях Висбадена (Германия).

Согласно оригинальному диагнозу клетки имели около 30 мкм в диаметре и были окружены тонкими прямыми радиальными чешуйками примерно равными диаметру клетки по длине. При этом чешуйки были очень многочисленны, что и отражено в видовом эпитете. Почти через 100 лет в 1983 году Николс (Nicholls, 1983) приводит электронномикроскопическое описание солнечников, собранных в Канаде и идентифицированных им как Acanthocystis myriospina, отмечая, что для этого вида характерны тупо срезанные на конце радиальные чешуйки.

В этой же работе описан новый вид Acanthocystis trifurca, характеризующийся тремя зубцами на вершинах радиальных чешуек.

Позднее Дюршмит (Drrschmidt, 1985) постулирует отсутствие типовых препаратов Acanthocystis myriospina, а также отмечает, что места, где были взяты пробы Пенара, сейчас, вероятно, уже уничтожены урбанизацией. Основываясь на материале по тотальным препаратам скелетных элементов солнечников из Чили, она фиксирует неотип Acanthocystis myriospina. Электронно-микроскопические данные Дюршмит показали, что на вершине радиальных чешуек находятся три зубца. Радиальные чешуйки имели длину 3,5-16 мкм. Кроме того были описаны яйцевидные пластинчатые чешуйки имевшие размеры 2,7х 1,5-2,2 мкм и снабжённые аксиальным утолщением. Сходные находки, сделанные Николсом и описанные под названием Acanthocystis trifurca, Дюршмит синонимизирует с A. myriospina. Также имеются и другие находки A. myriospina, основанные на электронномикроскопических данных, то есть на сходстве ультраструктуры скелетных элементов с таковыми, описанными Дюршмит (Croome, 1986; Siemensma, 1991; Микрюков, 1999; Леонов, Плотников, 2009;

Ермоленко, Плотников, 2013).

В статье Кавалье-Смита и фон дер Хейден (Cavalier-Smith, Heyden, 2007) приводятся фотографии скелетных элементов и 18S сиквенс (AY749629) солнечника, идентифицированного как Acanthocystis aff. myriospina. Авторы не приводят какого-либо морфологического описания, а фотографии скелетных элементов даны в очень мелком масштабе, что сильно затрудняет соотнесение этой находки с предыдущими находками Николса и Дюршмит. Ни из текста этой работы, ни из фотографий невозможно определить, имели ли чешуйки на вершине три зубца или были тупо срезаны.

Клетки исследованного нами штамма имели от 6,1 до 11,7 (в среднем – 9,3 мкм) в диаметре. Клетки покрывали пластинчатые чешуйки овальной формы с маргинальной каймой и центральным ребром (1,7-2,7 мкм) и радиальные чешуйки (1,3-7,0 мкм) оканчивающиеся тремя зубцами (рис. 27). Мы склонны идентифицировать этот штамм как A. trifurca ввиду совпадения морфологии и морфометрических параметров с диагнозом Николса.

Синонимизация A. trifurca с A. myriospina, предложенная Дюршмит, не кажется нам обоснованной. Пенар, давший оригинальный диагноз A. myriospina, работал только со светомикроскопическими данными. Поэтому для того, чтобы убедиться в том, что реизолированные солнечники относятся к этому виду, необходимо, по крайней мере, получить минимальный набор светомикроскопических данных. В работе Дюршмит такие данные не приводятся, более того автор прямо утверждает, что работа проводилась только со скелетными элементами. Что касается работы Николса, то и этот автор не приводит светомикроскопических снимков. Однако он утверждает, что диаметр клетки и размеры скелетных элементов в его описании соответствовали таковым в работе Пенара. Таким образом, Рис. 27. Acanthocystis trifurca, оз. Леман, Швейцария. А. Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Радиальная чешуйка. Фазовый контраст.

В. Пластинчатая чешуйка. Фазовый контраст. Г. Клетки, придавленные покровным стеклом. Контраст Номарского. Д. Радиальная чешуйка.

ТЭМ. Е. Пластинчатая чешуйка. ТЭМ. Ж. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. З. Радиальные и пластинчатые чешуйки. СЭМ. Масштабная черта: А., Г., Ж. – 10 мкм; Б., В., Д. – 2 мкм;

Е. – 1 мкм; З. – 5 мкм.

постулируемая реизоляция A. myriospina Николсом кажется более убедительной.

Работая не только с чешуйками, но и с живыми клетками, и сверяясь с оригинальным описанием Пенара, он, тем не менее, отнёс к A. myriospina солнечников с тупыми чешуйками, а солнечников с тремя зубцами на вершинах чешуек описал как новый вид.

По результатам молекулярно-филогенетического анализа (рис.

17) исследованный нами штамм A. trifurca группируется с кладой A.

takahashii, в то время как Acanthocystis aff. myriospina AY749629 в другой части дерева образует кладу c не идентифицированным сиквенсом из озера в парке Оксфордского университета (Великобритания) (AY749626).

3.5 Независимое возникновение солнечников только с тангентальными кремниевыми чешуйками Семейство Raphidiophryidae Febvre-Chevalier, Febvre, 1984, согласно последней системе (Cavalier-Smith, Heyden, 2007) объединяет роды Polyplacocystis и Raphidiophrys, обладающие только тангентальными кремниевыми чешуйками при полном отсутствии радиальных. Долгое время все эти формы рассматривались в пределах рода Raphidiophrys. Затем Микрюков (Mikrjukov, 1996a) разделил их, но в подавляющем большинстве более современных публикаций (Cavalier-Smith, Chao, 2003; Sakaguchi et al., 2007; Burki et al., 2009) это разделение не было признано. На основании молекулярно-филогенетических данных семейство Raphidiophryidae было отнесено к отряду Acanthocystida. Следует особо отметить, что такие базовые модусы покровных структур как спикулы или двойной слой кремниевых чешуек (радиальные и тангентальные) были обнаружены в обоих отрядах центрохелид – Pterocystida и Acanthocystida и только солнечники с тангентальными кремниевыми чешуйками, но без радиальных – семейство Raphidiophryidae, как считалось, возникали в эволюции только один раз (Cavalier-Smith, Heyden, 2007; Cavalier-Smith, Chao, 2012). Тем не менее, молекулярные данные по типовому роду семейства – Raphidiophrys – до настоящего времени отсутствовали. Они ограничивались только сиквенсами трёх видов из рода Polyplacocystis.

Мы секвенировали ген 18S рРНК Raphidiophrys, имеющих только тангентальные кремниевые чешуйки. Наш штамм по совокупности морфологических (рис. 28) и морфометрических (табл. 3) признаков был идентифицирован, как Raphidiophrys intermedia Penard, 1904. По результатам молекулярно-филогенетического анализа (рис. 17) этот штамм занял положение в кладе, представленной исключительно не идентифицированными сиквенсами, которая условно обозначалась предшествующими исследователями как NC3. Ближайшей группой с известной морфологией является семейство Choanocystidae. Как NC3, так и Choanocystidae относятся к отряду Pterocystida. Таким образом, данный модус покровных образований тангентальные кремниевые чешуйки, но без радиальных возник в двух отрядах центрохелид совершенно независимо и не является уникальным, как это было показано ранее и для других типов покровных структур.

Название Raphidiophryidae следует сохранить за кладой NC3, которая включает типовой род семейства. В основном она представлена не идентифицированными сиквенсами, которые требуют дополнения морфологическими данными. Пока семейство имеет в своём составе только один род, однако учитывая большое количество не идентифицированных сиквенсов, можно ожидать большего разнообразия в его составе после дальнейших исследований. Для клады, которая ранее обозначалась, как Raphidiophryidae, мы предлагаем новое название – Polyplacocystidae.

Рис. 28. Raphidiophrys intermedia, канава в Драконовых горах, ЮАР. А.

Общий вид клетки. Фазовый контраст. Б. Клетка, придавленная покровным стеклом. Фазовый контраст. В. То же, контраст Номарского.

Г. Пластинчатые чешуйки. Фазовый контраст. Д. Пластинчатые чешуйки. СЭМ. Е. Пластинчатая чешуйка. ТЭМ. Масштабная черта: А., Б – 25 мкм, В. - 10 мкм; Г. – 6 мкм; Д., Е. – 3 мкм.

3.6 Raphidiophrys heterophryoidea Zlatogursky, Согласно результатам, изложенным в предыдущем подразделе, род Raphidiophrys, для представителей которого характерны только тангентальные кремниевые чешуйки на филогенетических схемах оказывается глубоко внутри отряда Pterocystida, и его ближайшими родственниками являются представители рода Choanocystis, имеющие наряду с тангентальными радиальные чешуйки. В связи с этим особый интерес представляет один из описанных нами видов рода Raphidiophrys – R. heterophryoidea Zlatogursky, 2012, который демонстрирует переходный тип строения покровных структур между двумя этими родами. Помимо тангентальных кремниевых чешуек в состав его покровов входят также радиальные элементы веретеновидной формы (рис. 14).

Для того чтобы интерпретировать природу веретеновидных элементов в покровах R. heterophryoidea, мы провели энергодисперсионный рентгеновский анализ (рис. 29), так как элементы такой формы могут представлять собой как спикулы (подобные таковым Marophrys, Heterophrys), так и кремниевые чешуйки веретеновидной формы (как у представителей рода Parasphaerastrum) (Ostenfeld, 1904; Bardele, 1975; Febvre-Chevalier, Febvre, 1984).

Измерения на пластинчатых чешуйках во всех случаях показали спектр (рис. 29III), в котором присутствовали пики углерода, кислорода и кремния. На радиальных элементах был получен спектр (рис. 29II), в котором кремниевый пик отсутствовал. В редких случаях кремниевый пик был обнаружен и на радиальных элементах, но при этом всегда присутствовал контаминирующий материал (рис. 29I). При измерении чистых радиальных элементов кремниевый пик всегда отсутствовал.